øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøK

Transkript

I
EGE ÜNVERSTES FEN BLMLER ENSTTÜSÜ
(YÜKSEK LSANS TEZ )
NVERTAZ ENZMNN AFNTEYE DAYALI
TEKNKLER LE SAFLATIRILMASI
LKE YÜCEKAN
BYOKMYA ANABLM DALI
Bilim Dal kodu:405.05.01
Sunu Tarihi:17.07.2008
Tez Danman: Doç. Dr. Seçil ÖNAL
Bornova- ZMR
2008
II
III
Sayn ølke YÜCEKAN tarafndan Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan
‘‘øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøKLER øLE
SAFLAùTIRILMASI” baúlkl bu çalúma E.Ü.Fen Bilimleri Enstitüsü
E÷itim ve Ö÷retim Yönergesi’nin ilgili hükümleri uyarnca tarafmzdan
de÷erlendirilerek savunmaya de÷er bulunmuú ve ………… tarihinde
yaplan tez savunma snavnda aday oybirli÷i/oyçoklu÷u ile baúarl
bulunmuútur.
Jüri Üyeleri:
imza
Jüri BaúkanÕ :…………………………………
…………
Raportör Üye :…………………………………
…………
Üye
…………
:…………………………………
IV
V
ÖZET
øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøKLER øLE
SAFLAùTIRILMASI
Yücekan, øLKE
Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Anabilim Dal
Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Seçil ÖNAL
Temmuz 2008, 186 sayfa
ønvertazlar (ȕ-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz),
endüstriyel alanda özellikle gda sanayinde pek çok uygulama alanna
sahip enzimlerdir. Proteinler ve enzimlerin saflaútrlmasnda kullanlan
pek çok biyokimyasal izolasyon ve saflaútrma metodu mevcut olmasna
ra÷men son yllarda afiniteye dayal yeni tekniklerin (afinite çöktürmesi,
afinite membranlar, sulu ikili ve üçlü faz sistemleri gibi) özellikle
enzimlerin saflaútrlmasnda kullanlmaya baúlanmas oldukça dikkat
çekicidir.
Bu çalúmada, invertaz enzimi domatesten (Lycopersicon
esculentum) ekstrakte edilerek PEG/Tuz sulu ikili faz sistemi (ATPS) ile
ilk kez tarafmzdan saflaútrlmú ve karakterize edilmiútir. Bu çalúmada
sulu ikili faz sisteminin optimizasyonu ve enzim aktivitesine etki eden
VI
baz parametrelerin etkisi incelenerek kararllk testleri (termal, pH,
depo) yaplmútr. Enzim aktivitesi dinitrosalisilik asit (DNS) metodu ile,
protein tayini ise Bradford metodu ile gerçekleútirilmiútir.
% 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC)
kullanlarak hazrlanan sulu ikili-faz sisteminde invertaz enzimi PEG’ce
zengin üst fazda toplanmútr ve yaklaúk 6.7 kat saflaútrma elde
edilmiútir. Ayrca, son admda uygulanan ultrafiltrasyon iúlemi ile enzim
homojenata kyasla 31 kat saflaútrlmútr. Enzimin molekül kütlesi SDSPAGE ile yaklaúk 20 kDa olarak, optimum pH ve scakl÷ ise srasyla
5.0 ve 50oC olarak belirlenmiútir. Enzimin Km ve Vmax de÷erleri srasyla
48 mM ve 31 U olarak belirlenmiútir. Polimer-Tuz tabanl ATPS ile
saflaútrlan domates invertaz geniú bir pH ve scaklk aral÷nda oldukça
kararl bir enzim preparatdr. Geleneksel metodlara kyasla, invertazn
saflaútrlmasnda kullanlan bu tek adml ekstraksiyon metodu basit,
ekonomik ve etkili bir metod olup hazrlanan enzim preparat sahip
oldu÷u katalitik özellikleri bakmndan gda sanayinde kullanlabilecek
uygun bir enzim preparatdr.
Anahtar kelimeler: ønvertaz, Lycopersicon esculentum, Sulu økili
Faz Sistemi (ATPS), Saflaútrma, Karakterizasyon
VII
ABSTRACT
PURIFICATION OF INVERTASE ENZYME BY AFFINITY
TECHNIQUES
YUCEKAN, Ilke
Master of Science Thesis, Biochemistry Department
Supervisor: Ass. Prof. Dr. Seçil Önal
July, 2008, 186 pages
Invertases (ȕ-fructofuranosidase, E.C 3.2.1.26), (Sucrase), have
many applications in industrial area especially in food industry. In spite
of many biochemical isolation and purification methods for purification
of proteins and enzymes, new affinity techniques (affinity precipitation,
affinity membrane, aqueous two phase and aqueous three phase systems)
were begun to use in enzyme purification at last years.
The tomato (Lycopersicon esculentum) invertase was purified by
using an aqueous two-phase system (ATPS) composed of PEG / Salt for
the first time and characterized. In this study, the partitioning behavior of
tomato invertase in PEG / Salt aqueous two-phase systems was optimized
and several parameters that effect enzymatic activity were investigated.
Invertase activity and protein determination was performed by
Dinitrosalicylic (DNS) method and Bradford method, respectively.
VIII
In % 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC)
aqueous two-phase system invertase partitioned to the PEG-rich top
phase and about 6.7 fold purification was achieved. Ultrafilration was
carried out at the last step and 31 fold purification was achieved. The
enzyme has apparent molecular mass of 20 kDa by SDS-PAGE and its
optimum pH and temperature for sucrose hydrolysis were determined to
be 5.0 and 50oC, respectively. The Km ve Vmax values for sucrose were
48 mM and 31 U, respectively. Polymer-Salt based ATPS purified
tomato invertase showed very stable characteristic for large pH and
temperature range. Compared to multi-step conventional down stream
processing, ATPS is a single-step extraction process who has been
recognized as a simple, economical and effective method. According to
the catalytic properties this enzyme preparation can be used for industrial
applications.
Keywords: Invertase, Lycopersicon esculentum, Aqueous Two
Phase Systems (ATPS), Purification, Characterization
IX
TEùEKKÜRLER
Yüksek lisans çalúmamn her aúamasnda kymetli görüúlerinden,
deste÷inden ve yardmndan yararland÷m, en baúta danúmanm sayn
Doç. Dr. Seçil Önal’a, Biyokimya bölümü ö÷retim elemanlarna ve son
olarak, tüm destekleri ve cesaretlendirmeleri için aileme ve arkadaúlarma
teúekkürü bir borç bilirim.
Bu çalúma
desteklenmiútir.
Ege
Üniversitesi
Araútrma
Fonu
tarafndan
X
XI
øÇøNDEKøLER
Sayfa
ÖZET ................................................................................................. V
ABSTRACT ...................................................................................... VIII
TEùEKKÜR....................................................................................... IX
øÇøNDEKøLER ................................................................................. XI
ùEKøLLER DøZøNø .......................................................................... XV
ÇøZELGELER DøZøNø .................................................................... XIX
1.
1.1
GøRøù ........................................................................................ 1
Glikozidazlar ............................................................................. 2
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.1.5
1.1.6
2.
2.1
2.1.1
2.1.2
2.2
2.3
2.4
2.4.1
2.4.2
ønvertazlar ve invertazlarn biyokimyas................................... 5
ønvertazlarn etki mekanizmas ............................................... 14
ønvertazlarn izolasyonu ve saflaútrlmas.............................. 20
ønvertazlarn fiziksel özellikleri .............................................. 23
ønvertazlarn kinetik özellikleri ............................................... 26
ønvertazlarn fizyolojik önemi ve uygulama alanlar .............. 44
SULU øKøLø FAZ SøSTEMø (ATPS) ..................................... 50
Faz Diyagramlar..................................................................... 52
Binodiyal e÷ri.......................................................................... 54
Tie-line hatlar......................................................................... 56
Da÷lma Katsays (K)............................................................. 57
Da÷lma Mekanizmas ............................................................ 59
Protein Da÷lmn Etkileyen Parametreler ............................. 60
Polimer konsantrasyonu ve molekül kütlesinin etkisi............. 62
Tuz türü ve konsantrasyonunun etkisi..................................... 64
XII
øÇøNDEKøLER (devam)
2.4.3
pH etkisi ……………………………………………………..65
2.4.4
2.4.5
2.4.6
2.4.7
2.4.8
2.5
Scakl÷n etkisi .......................................................................66
Hidrofobik etkileúimler............................................................67
Protein konsantrasyonunun etkisi ............................................67
Zamann etkisi .........................................................................67
Düúük molekül kütleli maddelerin etkisi .................................68
Sulu økili Faz Sisteminin Uygulamala Alanlar.......................68
3.
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.5
3.5.1
3.5.2
3.6
3.6.1
3.6.2
MATERYAL VE METOD......................................................76
Materyal .................................................................................76
ønvertaz Aktivitesi Tayini ........................................................77
Protein Tayini (Bradford Metodu)...........................................80
Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDSPAGE) ve Moleküler Kütle Tayini..........................................81
Polimerizasyon protokolü ........................................................82
Örneklerin hazrlanmas ve elektroforez uygulanmas ............84
Protein bantlarnn boyanmas .................................................85
Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle ønvertazn Domatesten
(Lycopersicon esculentum) øzolasyonu ve Saflaútrlmas.......85
Sulu ikili faz sisteminin hazrlanmas......................................86
Da÷lma parametrelerinin belirlenmesi ...................................87
Domates
(Lycopersicon
esculentum)
ønvertaznn
Karakterizasyonu .....................................................................90
ønvertaz aktivitesine baz parametrelerin etkisi .........................90
Kararllk testleri ........................................................................92
XIII
øÇøNDEKøLER (devam)
4.
4.1
ve
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8
SONUÇLAR VE TARTIùMA ................................................. 94
ønvertazn Domatesten (Lycopersicon esculentum) øzolasyonu .
Ksmi Saflaútrlmas ............................................................... 94
Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle Domates (Lycopersicon
esculentum) ønvertaznn Saflaútrlmas ................................. 99
Tuz türünün belirlenmesi ……………………………….....100
PEG molekül kütlesinin belirlenmesi… ……………………103
PEG (3000) konsantrasyonun belirlenmesi…………………..106
Na2SO4 konsantrasyonunun belirlenmesi…………………...108
pH etkisinin belirlenmesi…………………………………….111
Kosolut tuz türü ve konsantrasyonun etkisinin belirlenmesi
(øyonik úiddetin etkisinin belirlenmesi)
………………….114
ønvertaz konsantrasyonun da÷lma etkisi ………………….120
Büyük ölçekli sulu ikili faz sistemi ………………………….122
Domates
(Lycopersicon
esculentum)
ønvertaznn
Karakterizasyonu................................................................... 125
4.3.1
ønvertaz aktivitesine pH etkisi............................................... 125
4.3.2
ønvertaz aktivitesine scakl÷n etkisi .................................... 126
4.3.3
ønvertaz aktivitesine substrat konsantrasyonunun etkisi ....... 128
4.3.4
ønkübasyon süresinin etkisi ................................................... 130
4.3.5
Efektör konsantrasyonunun etkisi ......................................... 131
4.4
Kararllk Testleri .................................................................. 132
4.4.1
ønvertazn termal kararll÷................................................... 132
4.4.2
ønvertazn pH kararll÷........................................................ 133
4.4.3
ønvertazn depo kararll÷ ..................................................... 135
4.5
Genel De÷erlendirme ............................................................ 136
KAYNAKLAR DøZøNø.......................................................................156
4.3
ÖZGEÇMøù…………………………………………………………..185
XIV
ùEKøLLER DøZøNø
ùekil
Sayfa
1.1 Genel reaksiyon mekanizmas ........................................................6
1.2 ønvertaz enziminin üç-boyutlu yaps .............................................10
1.3 Hücre duvar ve vakular invertazlarn aminoasit motifi .................12
1.4 Hücre duvar ve vakular invertazlarn filogenetik gösterimi ..........12
1.5 Glikozidazlarn retensiyon mekanizmas........................................15
1.6 Glikozidazlarn inversiyon mekanizmas........................................16
1.7 ønvertazn sükroz kataliz mekanizmas...........................................17
1.8 Arabidopsis thaliana invertaznn kristal yaps .............................19
1.9 Thermotoga maritima invertaznn kristal yaps ...........................20
1.10 ønvertazn do÷al substratlar.........................................................26
1.11 ønvertazlarn do÷al substratlar .....................................................30
1.12 Fruktozun yapsal analoglar.........................................................40
1.13 Schwanniomyces occidentalis invertaznn
transfruktozilleme reaksiyonu .....................................................47
1.14 Arthrobacter globiformis invertaznn transfruktozilleme
reaksiyonu.....................................................................................48
2.1 Faz diyagram .................................................................................53
2.2 Turbidometrik titrasyon ve “cloud-point” metotlar.......................55
2.3 Tie-line hatlar ................................................................................56
2.4 PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷lmas ....................62
2.5 Sulu ikili faz sistemi ile DNA izolasyonu ......................................71
2.6 Sulu ikili faz sistemiyle membran proteinin izolasyonu.................72
XV
ùEKøLLER DøZøNø (Devam)
2.7 Sürekli karútrmal kontaktör ........................................................ 74
3.1 DNS yönteminin prensibi............................................................... 77
3.2 Sükrozun invertaz tarafndan hidroliz reaksiyonu ......................... 78
3.3 Glukozun enol anyonuna dönüúüm reaksiyonu ............................. 79
4.1 Domates invertaznn SDS-Poliakrilamid jel elektroforezi............ 97
4.2 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül
kütlesinin protein da÷lma katsaysna (Kp) etkisi ....................... 105
4.3 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül
kütlesinin invertaz enziminin da÷lma katsaysna (Ke) etkisi ... 106
4.4 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde
invertaz ekstraksiyonuna ve da÷lmna etkisi ............................. 107
4.5 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG-Na2SO4 sisteminde
invertaz da÷lma katsaysna (Ke) etkisi ...................................... 108
4.6 Na2SO4 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz
ekstraksiyonuna ve da÷lmna etkisi ........................................... 109
4.7 % 15 PEG-Na2SO4 sisteminde Na2SO4 konsantrasyonunun
protein da÷lma katsaysna (Kp) etkisi ...................................... 110
4.8 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna
ve da÷lmna pH’n etkisi............................................................ 112
4.9 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’n invertaz da÷lma
katsaysna (Ke) etkisi .................................................................. 113
4.10 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’n protein da÷lma
katsaysna (Kp) etkisi.................................................................. 113
4.11 Kosolut olarak KCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi ................. 116
XVI
4.12 Kosolut olarak KCl’ün farkl konsantrasyonlarnn protein
da÷lma katsaysna (Kp) ve invertazn da÷lma katsaysna (Ke)
etkisi..............................................................................................116
4.13 Kosolut olarak KCl’ün farkl konsantrasyonlarnn selektivite
(Į) ve geri kazanma (R) etkisi ....................................................117
4.14 Kosolut olarak NaCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi................117
4.15 Kosolut olarak Na2CO3’n PEG-Na2SO4 sistemine etkisi ............118
4.16 Kosolut olarak MgSO4’n PEG-Na2SO4’nsistemine etkisi..........118
4.17 Kosolut olarak MnCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi..............119
4.18 Kosolut olarak MgCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi..............119
4.19 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl
sisteminde invertazn da÷lmna (Ke) ve selektivitesine (Į)
enzim miktarnn etkisi .................................................................121
4.20 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl
sisteminde invertaz saflaútrma katsays ve protein da÷lma
katsaysna enzim miktarnn etkisi ..............................................122
4.21 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz
enziminin saflaútrma sonuçlar ....................................................123
4.22 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin
saflaútrma sonuçlar .....................................................................124
4.23 10, 25 ve 50 ml’lik sistemlerde saflaútrlan invertaz enziminin
spesifik aktivite de÷erleri..............................................................124
4.24 ønvertaz aktivitesine pH’n etkisi..................................................126
4.25 ønvertaz aktivitesine scakl÷n etkisi) ..........................................127
XVII
4.26 Sükroz konsantrasyonunun invertaz aktivitesine etkisi ............... 129
4.27 ønvertaz enziminin Lineweaver-Burk diyagramlar ..................... 129
4.28 ønkübasyon süresinin invertazn aç÷a çkard÷ glukoz miktar ile
iliúkisi ........................................................................................... 130
4.29 ønvertazn termal kararll÷.......................................................... 133
4.30 ønvertazn pH kararll÷ ............................................................... 134
4.31 Domates invertaznn depo kararll÷ .......................................... 135
XVIII
ÇøZELGELER DøZøNø
Çizelge
Sayfa
1.1 Oligosakkarit yaplarnn aydnlatlmasnda kullanlan baz
ekzoglikozidazlar (Jacob and Scudder, 1994). ..............................5
1.2 Baz invertazlarn molekül kütleleri. ..............................................25
1.3 ønvertazlarn substrat spesifiklikleri. ..............................................28
1.4 Baz invertazlarn termal kararllklar............................................35
1.5 Baz invertazlarn optimum pH de÷erleri .......................................38
1.6 Çeúitli inhibitörlerin invertaz aktivitesine etkisi.............................42
4.1 ønvertaz enziminin da÷lmna faz bileúimi ve tuz türünün etkisi...102
4.2 ønvertaz enziminin da÷lmna PEG molekül kütlesinin etkisi. ......103
4.3 Çeúitli efektörlerin invertaz aktivitesine etkisi. ..............................131
1
1.
GøRøù
ønvertazlar (ȕ-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz), ȕ-Dfruktofuranozidlerin terminal indirgen olmayan ȕ-fruktofuranozid
artÕklarÕnÕn hidrolizini katalizleyen hidrolaz sÕnÕfÕ enzimlerdir. Do÷ada
oldukça yaygÕn olarak bulunan bu enzim pek çok bitkisel ve mikrobiyal
kaynaktan izole edilerek saflaútÕrÕlmÕútÕr. ønvertaz enzimi, kimli÷i ilk
belirlenen proteinler arasÕnda bulunmaktadÕr ve enzim kineti÷inin
prensiplerinin çÕkarÕlmasÕnda kullanÕlmÕútÕr (Michaelis and Menten,
1913).
ønvertazlar, endüstriyel alanda özellikle gÕda sanayinde pek çok
uygulama alanÕ bulmuú enzimler olup bu alanlara örnek olarak;
úekerleme sanayindeki uygulamalar, kamÕú melasÕnÕn etanole
fermantasyonu, sÕ÷Õr yemlerinin hazÕrlanmasÕ, invert úeker úuruplarÕnÕn
hazÕrlanmasÕ verilebilir. GÕda sanayinde invert úeker úuruplarÕnÕn
hazÕrlanmasÕnda ya asit hidrolizi yada enzimatik olarak sukrozun invertaz
ile hidrolizi gerçekleútirilmektedir. Asit hidrolizi oldukça yüksek úiddette
renkli ürünler, kül ve istenmeyen pek çok yan ürün oluúturdu÷u için
endüstriyel alanda enzimatik hidroliz tercih edilmektedir. Hidroliz
sonucu oluúan fruktoz, kolay kolay kristalize olmadÕ÷Õ ve daha tatlÕ
oldu÷u için gÕda sanayinde sukroza tercih edilmektedir. Bu tür
uygulamalarda hem sa÷lÕk hem de tat açÕsÕndan gÕda sanayinde
kullanÕlacak olan invertazÕn tolere edilebilir bir saflÕkta olmasÕ ve
ekonomik olmasÕ istenir.
Proteinler ve enzimlerin saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan pek çok
biyokimyasal izolasyon ve saflaútÕrma metodu mevcut olmasÕna ra÷men
2
son yÕllarda afiniteye dayalÕ yeni tekniklerin (afinite çöktürmesi, afinite
membranlarÕ, sulu ikili ve üçlü faz sistemleri gibi) özellikle enzimlerin
saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlmaya baúlanmasÕ oldukça dikkat çekicidir. Bu
çalÕúmada, domatesten izole edilen invertaz enzimi ikili sulu faz sistemi
(ATPS) kullanÕlarak ilk kez tarafÕmÕzdan saflaútÕrÕlmÕútÕr. ønvertaz
kayna÷Õ olarak seçilen domates, ülkemizde kolay temin edilebilmesi,
ekonomik bir kaynak olmasÕ, ayrÕca invertaz miktarÕ ve aktivitesi
açÕsÕndan zengin olmasÕ nedeniyle uygun bir enzim kayna÷ÕdÕr. økili sulu
faz sistemi (ATPS) olarak polimer-tuz (Polietilen glikol; PEG-Tuz)
sistemi seçilmiútir. ATPS ile invertaz enziminin saflaútÕrma koúullarÕ
optimize edilmiú ve bu amaçla uygun tuz türü, tuz konsantrasyonu, PEG
molekül kütlesi, PEG konsantrasyonu, pH gibi parametrelerin etkisi
incelenmiútir.
1.1 Glikozidazlar
ønvertazlar, glikozidazlarÕn bir alt sÕnÕfÕ olan hidrolitik enzimlerdir.
Glikozidazlar da glikozil bileúikleri üzerinde etkili olan oldukça geniú ve
önemli bir enzim grubudur. Basit glikozidler ile kompleks oligo- ve
polisakkaritlerdeki glikozidik ba÷larÕn hidrolizini katalizlerler.
Glikopiranozil
gruplarÕ
ile
glikozidik
ba÷larÕn
anomerik
konfigürasyonlarÕna karúÕ oldukça spesifik olan glikozidazlar,
hayvanlarda, bitkilerde ve mikroorganizmalarda oldukça yaygÕn olarak
bulunurlar. YaklaúÕk olarak 150 yÕldan bu yana araútÕrmacÕlar
glikozidazlarla ilgili farklÕ çalÕúmalar yapmÕúlardÕr. Uzun zamandan beri
biyokimyanÕn en ilginç araútÕrma konularÕndan birisi olmasÕna ra÷men
glikozidazlarÕn moleküler özellikleri ve etki mekanizmalarÕ hakkÕnda çok
az bilgi edinilebilmiú ve sadece birkaç tanesi kristalize edilebilmiútir.
3
Amilaz ve lizozim kristal formda elde edilen glikozidaz sÕnÕfÕ
enzimlerdendir.
GlikozidazlarÕn bir kÕsmÕ glikozil artÕklarÕnÕ oligosakkaritlere,
polisakkaritlere ve di÷er alkolik reseptörlere transfer ettikleri halde
hidrolaz sÕnÕfÕna dahil edilirler. Glikozidazlar, O-glikozil, N-glikozil ve
S-glikozil bileúiklerini hidrolizleyen enzimler (EC 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3)
olarak üç gruba ayrÕlÕrlar ve çok çeúitli glikozidik ba÷lar üzerinde
etkilidirler. Örne÷in; Į-amilaz (EC 3.2.1.1), ȕ-amilaz (EC 3.2.1.1), ekzo1,4-Į-D-glukozidaz (EC 3.2.1.3), sikloheptaglukanaz (EC 3.2.1.12) ve
siklohegzaglukanaz (EC 3.2.1.13) Į-1,4-glikozidik ba÷larÕ, amilopektin1,6-glukozidaz (EC 3.2.1.9), oligo-1,6-glukozidaz (EC 3.2.1.10) ve
dekstranaz (EC 3.2.1.11) Į-1,6-glikozidik ba÷larÕ, Į-galaktozidaz ise Į1,6-glikozidik ba÷larÕ hidrolizler. Temel olarak yüklü grup içermeyen
substratlarla ilgilidirler. Tüm belirleyici gruplar ya hidroksil gruplarÕ
yada hidrojen atomlarÕdÕr. Bu nedenle de spesifikleri bir model ile
belirlenmelidir. Genel olarak belirli bir monosakkarit halkasÕna
spesifiktirler, fakat ba÷lÕ aglikon grubu yüksek ya da düúük bir etkiye
sahiptir ve bazen de enzim bir aglikona spesifik olabilir. Glikozidazlar
özellikle úeker halkasÕnÕn konfigürasyonuna spesifiktirler. Örne÷in; Įgalaktozidazlar monosakkarit, oligosakkarit, glikopeptid ve fenole Įba÷lÕ terminal galaktoz artÕklarÕnÕ, ȕ-galaktozidazlar ise ȕ-1,6-, ȕ-1,4veya ȕ-1,3- ba÷lÕ terminal galaktoz artÕklarÕnÕ hidrolizleyebilirler.
Glikozidazlar, genel olarak endo- ve ekzoglikozidazlar olarak iki
gruba ayrÕlÕrlar. Glikoproteinler üzerinde etkili olan endoglikozidazlar;
endo- ȕ-galaktozidaz (EC 3.2.1.103), endoglikozidaz D (EC 3.2.1.96),
endoglikozidaz F (EC 3.2.1.96), endoglikozidaz H (EC 3.2.1.96) ve
glikopeptidaz F (EC 3.2.1.18) dir. Polisakkaritler üzerinde etkili olan
endoglikozidazlar; Į-amilaz (EC 3.2.1.1), selülaz (EC 3.2.1.4),
4
hyalurinidaz (EC 3.2.1.45), lizozim (EC 3.2.1.17) ve pullulanaz (EC
3.2.1.41) dÕr. Ekzoglikozidazlar ise sadece terminal artÕklar üzerinde
etkilidirler. Bunlar; ȕ-N-asetil-D-glukozaminidaz (EC 3.2.1.30), ȕ-amilaz
(EC 3.2.1.2), amiloglukozidaz (EC 3.2.1.3), ȕ-fruktofuranozidaz (EC
3.2.1.26), Į-L-fukozidaz (EC 3.2.1.51), Į-galaktozidaz (EC 3.2.1.22), ȕgalaktozidaz (EC 3.2.1.23), Į-glukozidaz (EC 3.2.1.20), ȕ-glukozidaz
(EC 3.2.1.21), ȕ-glukuronidaz (EC 3.2.1.31) ve nörominidaz (EC
3.2.1.18) dÕr (Önal Tatar, 1994; Agrawell and Bahl, 1968).
Glikozidazlar yapÕsal karakterizasyonlarda da kullanÕlan en önemli
enzim grubudur. Nükleer manyetik rezonans(NMR), hÕzlÕ atom
bombardmanÕ, elektrospray-kütle spektrometrisi gibi analitik metodlarÕn
geliúmesiyle beraber yapÕ tayinlerinde enzimlerin kullanÕmÕ büyük
olasÕlÕkla azalacaktÕr. Fakat bu tekniklerin elde edilemedi÷i durumlarda
enzimler hala oldukça güçlü ve etkili bir araç olmaya devam edecektir.
Oligosakkaritlerin yapÕlarÕnÕn aydÕnlatÕlmasÕnda kullanÕlan bazÕ
ekzoglikozidazlar Çizelge 1.1’de verilmiútir (Jacob and Scudder, 1994).
5
Çizelge 1.1 Oligosakkarit yapÕlarÕnÕn aydÕnlatÕlmasÕnda kullanÕlan bazÕ
ekzoglikozidazlar (Jacob and Scudder, 1994).
Enzim
Į-Mannozidaz-I
Hegsozaminidaz
ȕ-Galaktozidaz
Į-Fukozidaz
Į-Galaktozidaz
Į-Nörominidaz
Kaynak
A.saitoi
Baklagil tohumu
Baklagil tohumu
C.lampas
Kahve tohumu
A.ureafaciens
Domuz
Į-Glukozidaz-I karaci÷eri
Domuz
Į-Glukozidaz-II karaci÷eri
1.1.1
Hidrolizlenen Ba÷
ManĮ1–2 Man
GalNAc/GlcNAcȕ1–2,3,4,6
Galȕ1–3,4,6
FucĮ1-2GalGalȕ –3(FucĮ 1–
4)GlcNAc
GalĮ1–3,4,6
NeuAc/NeuGcĮ2–3/6Gal
GlcĮ1-2Glc
GlcĮ1-3Gl ve GlcĮ1-3Man
ønvertazlar ve invertazlarÕn biyokimyasÕ
ønvertazlar (ȕ-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz), do÷ada
oldukça yaygÕn olarak bulunan hidrolaz sÕnÕfÕ enzimlerdir. Çok sayÕda
Į1-ȕ2-glikozidik ba÷Õn hidrolizini katalizlerler (Guimarães et al., 2007;
Warchol et al., 2002; Janer et al., 2004; Nakamura et al., 1988; ÁlvaroBenito et al., 2007) :
1.
Disakkaritler; sükroz,
2.
Trisakkaritler; rafinoz, melibioz,
3.
Oligosakkaritler; rafinoz, stakiyöz, nistoz,
4.
Polisakkaritler; levan, inulin.
ùekil 1.1’de invertaz enziminin genel hidroliz reaksiyonu
verilmiútir.
6
ùekil 1.1 Genel reaksiyon mekanizmasÕ
ønvertazlar çok çeúitli kaynaklardan; mikroorganizmalar (Chavez et
al., 1997; L’Hocine et al., 2000; Nguyen et al., 2004; Belcarz et al.,
2001; Tanaka et al., 1998; Rubio et al., 2002; Tanaka et al., 1998) ve
bitkilerden (Vorster and Botha, 1998;
Hashizume et al., 2003; Isla
et al., 1998; Bosch et al., 2003; Zhang and Chi, 2003; Leigh et al., 1979;
Dreier et al., 1998; Morell and Copeland, 2006; Lingle and Dunlap,
1987; Liu et al., 2005; Rojo et al., 1998; Hsiao et al., 2001) farklÕ
biyokimyasal teknikler kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlmÕútÕr. Bu
saflaútÕrma çalÕúmalarÕnÕn yanÕnda invertazlarla yapÕlan immobilizasyon
çalÕúmalarÕ oldukça fazla sayÕdadÕr. Mikrobiyal kaynaklÕ invertazlarla
yapÕlan immobilizasyon çalÕúmalarÕ ise daha çok endüstriyel olarak
kullanÕm alanÕ bulmuútur (Tomotani and Vitolo, 2006; Bayramo÷lu et al.,
2002; Sanjay and Sugunan, 2004; Bagal and Karve, 2005; Gürsel et al.,
2003).
ønvertazlar çok geniú uygulama alanÕ olan enzimlerdir. Enzim
saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan metodlarda dikkate de÷er ölçüde bir geliúme
olmasÕna ra÷men kontamine glikozidazlarÕn ortamdan uzaklaútÕrÕlmasÕ
hala oldukça güç bir iúlemdir. E÷er hazÕrlanan invertaz preparatÕ di÷er
glikozidazlar tarafÕndan kontamine edilmiyorsa ve geniú bir aglikon
spesifikli÷ine sahipse, yapÕsal analizlerde ve kompleks karbohidratlarÕn
biyolojik fonksiyonlarÕnÕn belirlenmesinde (Frevert and Ballou, 1982;
7
Gómez and Villalonga, 2000; Kern et al., 1992; Zeng and Biemann,
1999), enzimatik sentezlerde (Rodriguez et al., 1996; Masayoshi and
Teruo, 1995), transglikozilasyon reaksiyonlarÕnda (Fernández et al.,
2004; Álvaro-Benito et al., 2007; Win et al., 2004) ve hayvanlar ile
insanlarda intestinal sistemde konstipasyon sorununun giderilmesini
sa÷layan oligosakkaritlerin sentezinde (Nguyen et al., 2005; Hidaka et
al., 1986) kullanÕlabilecek uygun bir preparattÕr.
uygulama alanÕ bulmuú enzimler olup bu alanlara örnek olarak;
úekerleme sanayindeki uygulamalar, kamÕú melasÕnÕn etanole
fermantasyonu, sÕ÷Õr yemlerinin hazÕrlanmasÕ, invert úeker úuruplarÕnÕn
hazÕrlanmasÕ verilebilir. Hidroliz sonucu oluúan fruktoz, kolay kolay
kristalize olmadÕ÷Õ ve daha tatlÕ oldu÷u için gÕda sanayinde sukroza tercih
edilmektedir. Bu tür uygulamalarda hem sa÷lÕk hem de tat açÕsÕndan gÕda
sanayinde kullanÕlacak olan invertazÕn tolere edilebilir bir saflÕkta olmasÕ
ve ekonomik olmasÕ istenir.
FarklÕ kaynaklardan saflaútÕrÕlan invertazlarÕn bir kÕsmÕnÕn
glikoprotein karakterinde oldu÷u tespit edilmiútir. Saccharomyces
cerevisiae (Bahar ve Tuncel, 2004), Rhodotorula glutinis (Rubio et al.,
2002), Aspergillus niger AS0023 (Hocine et al., 2000), Lactobacillus
reuteri CRL 1100 (Ginés et al., 1999), Candida utilis (Chávez et al.,
1997) Schizosaccharomyces pombe (Tanaka et al., 1998), mango
(Rahman et al., 2001), patates (Isla et al., 1998) ve tütün (Rojo et al.,
1998) invertazlarÕnÕn birer glikoprotein olduklarÕ belirtilmiútir.
Aspergillus nidulans invertazÕnÕn yüksek molekül a÷ÕrlÕklÕ Sinvertaz ve düúük molekül a÷ÕrlÕklÕ F-invertaz formlarÕnÕn glikoprotein
yapÕda oldu÷u ve her iki formun karbohidrat içeri÷inin sÕrasÕyla % 21.1
8
ve % 44.4 oldu÷u belirlenmiútir. S-ønvertaz’Õn karbohidrat kÕsmÕnÕn % 5
galaktoz, % 14.3 mannoz, % 0.9 N-asetilglukozamin ve % 1.9 glukozdan
ibaret oldu÷u fakat F-ønvertaz’Õn karbohidrat kÕsmÕnÕn % 29.5 galaktoz,
% 11.9 mannoz, % 0.3 N-asetilglukozamin ve % 2.7 glukoz içerdi÷i
belirtilmiútir (Chen et al., 1996).
Aspergillus niger IMI303386 invertazÕ 120–130 kDa molekül
kütleli homodimerik bir protein olup, molekül a÷ÕrlÕ÷ÕnÕn % 17’si
karbohidrattan oluúmuú bir glikoproteindir (Nguyen et al., 2004).
Son yÕllarda invertazlarla yapÕlan klonlama çalÕúmalarÕ da oldukça
büyük bir önem ve hÕz kazanmÕútÕr. SaflaútÕrÕlan enzimin oldukça büyük
miktarda üretilmesi ve enzimatik özelliklerinin geliútirilmesi için
invertazÕn cDNA klonunun izole edilerek dizisinin aydÕnlatÕlmasÕ
gerekmektedir. Bu amaçla yapÕlan çalÕúmalardan birisinde Japon armudu
asit invertazÕnÕn iki izoenzimini kodlayan cDNA’lar (PsS-AIV1 ve PsSAIV2) önce klonlanmÕú ve ardÕndan dizisi aydÕnlatÕlmÕútÕr. PsS-AIV1 646
aminoasitlik bir proteini, PsS-AIV2 ise 682 aminoasitlik bir proteini
kodlamaktadÕr. PsS-AIV1 ve PsS-AIV2 arasÕnda aminoasit dizilimi
bakÕmÕndan % 40 ve nükleotid dizilimi bakÕmÕndan ise % 46’lÕk bir dizi
benzerli÷i vardÕr. PsS-AIV1 cDNA’sÕ, Prunus ceranus ve “La France”
armudu cDNA’larÕ ile sÕrasÕyla % 72 ve % 98 benzerlik göstermektedir.
PsS-AIV2 cDNA’sÕ ise, Citrus unshiu ve “La France” armudu cDNA’larÕ
ile sÕrasÕyla % 60 ve % 98 benzerlik göstermektedir (Yamada et al.,
2006). ønvertaz cDNA’sÕ çok çeúitli kaynaklardan; Zymomonas mobilis,
Thermotoga maritima, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe gibi mikroorganizmalar yanÕnda Chenopodium rubrum, Ipomoea
batatas, Arabidopsis thaliana, Daucus carota, Lycopersicon esculentum,
Carica papaya gibi bitkilerin kök, yaprak, tohum gibi kÕsÕmlarÕndan
klonlanmÕútÕr (Roitsch and González, 2004 ve Yamada et al., 2006).
9
GlikozidazlarÕn sÕnÕflandÕrÕlmasÕ, aminoasit dizi benzerliklerine
dayanarak familyalar halinde yapÕlmaktadÕr. Bugüne kadar 112 tanesi
familya halinde sÕnÕflandÕrÕlmÕútÕr. BazÕ glikozidaz familyalarÕ evrimsel,
yapÕsal ve mekanistik olarak iliúkili olduklarÕndan yüksek hiyerarúik
düzeydeki, “klan” olarak tasvir edilen gruplarda gruplandÕrÕlmÕútÕr.
ønvertazlar, göstermiú olduklarÕ yüksek dizi homoloji derecesi ve amino
asit sÕrasÕna göre glikozidazlarÕn GH 32, GH 68 ve GH 100
familyalarÕnda yer almaktadÕr. GH 32 familyasÕ; invertaz (EC 3.2.1.26);
inulinaz (EC 3.2.1.7); 2,6-ȕ-fruktan 6-levanbiyohidrolaz (EC 3.2.1.64);
levanaz (EC 3.2.1.65); ekzo-inulinaz (EC 3.2.1.80); sukroz: sukroz 1fruktoziltransferaz (EC 2.4.1.99); fruktan: fruktan 1-fruktoziltransferaz
(EC 2.4.1.100); fruktan ȕ-(2,1)-fruktozidaz (EC 3.2.1.153); fruktan ȕ(2,6)-fruktozidaz (EC 3.2.1.154); sukroz: fruktan 6-fruktoziltransferaz
(EC 2.4.1.-), GH 68 familyasÕ; levansukraz (EC 2.4.1.10); ȕfruktofuranozidaz (EC 3.2.1.26); inulosukraz (EC 2.4.1.9) ve GH 100
familyasÕ ise; alkali ve nötral invertazdan (EC 3.2.1.26) oluúmaktadÕr.
GH 32 ve GH 68 familyalarÕ klan GH-J’de yer almaktadÕr. Bugüne kadar
GH 32 familyasÕ bitki, fungus ve bakteri orijinli yaklaúÕk olarak 743 tane
üye içermektedir (http://www.cazy.org/).
GH 32 familyasÕnda yer alan Thermotoga maritima invertazÕ,
Arabidopsis thaliana invertazÕ, Aspergillus awamori ekzo-inulinazÕ ve
Cichorium intybus 1-ekzohidrolazÕnÕn kristal yapÕlarÕ aydÕnlatÕlmÕútÕr. Üç
boyutlu yapÕlarÕ hakkÕnda yapÕlan çalÕúmalar sonucunda benzer
bimodüler düzenleme; N-terminal beú katlÕ ȕ-propeller (pervane) katalitik
modül ile ba÷lantÕlÕ C-terminal ȕ-sandviç modül, göstermektedirler
(ùekil 1.2) (Lammens et al., 2008). Beú katlÕ ȕ-propeller (pervane)
modülde merkezde katalitik aktif bölge bulunmaktadÕr ve bu bölge son
derece korunmuú amino asitlerden oluúan cep topolojisi sergilemektedir.
Tüm ȕ-propeller yapÕlarÕnda pervane kanadÕnÕ (blade) oluúturan tüm ȕ-
10
zincirleri birbirine zÕt yönde sÕralanmÕúlardÕr ve I bölgesi ile V bölgesi
arasÕnda yaklaúÕk 90° açÕ bulunmaktadÕr. ȕ-propeller (pervane) modulde
ȕ-zincirler arasÕndaki dönüúler 310-heliks yapÕsÕndadÕr. ȕ-sandviç modül,
6 tane ȕ-zincirin ikili tabaka úeklinde sÕralanmasÕndan oluúmaktadÕr ve 10
aminoasit artÕ÷Õndan oluúan lup ile katalitik module ba÷lanmaktadÕr. ȕsandviç modül enzimin karbohidrat tanÕmasÕnda rol oynamaktadÕr
(Alberto et al., 2004).
ùekil 1.2 ønvertaz enziminin üç-boyutlu yapÕsÕ (Lammens et al., 2008)
11
Bitkiler çözünürlükleri, hücresel lokalizasyonlarÕ, optimum pH ve
izoelektrik noktalarÕna göre; vakular (Inv-V), hücre duvarÕna ba÷lÕ (InvCW) ve nötral (Inv-N) invertazlar olmak üzere üç çeúit invertaz
izoenzimine sahiptirler (Roitsch and González, 2004).
Vakular invertazlar ve hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlar benzer
enzimatik ve biyokimyasal özelliklere sahiptirler. AyrÕca yüksek
derecede benzer dizi homolojileri ile birlikte iki tane korunmuú aminoasit
motifleri içerirler. Bu iki invertaz asidik optimum pH’a sahip olup ȕfruktofuranozidaz aktivitesi gösterir. Çünkü sukrozun ve di÷er ȕ-fruktoz
içeren oligosakkaritlerin fruktoz artÕklarÕna saldÕrarak hidrolizlerler.
Sükroz için Km de÷erleri düúük milimolar aralÕ÷ÕndadÕr. Bunun yanÕnda
bu iki invertaz izoenzimi birer N-ba÷lÕ glikoproteindir ve ço÷unlukla
molekül kütlesinin 55 ve 70 kDa arasÕ kÕsmÕnÕ karbohidrat kalÕntÕsÕ
oluúturur. ønvertaz aktivitesi sülfidril gruplarÕnÕ bloke eden ajanlar (Hg+
ve Ag+) tarafÕndan inhibe edilmektedir. Reaksiyon ürünleri tarafÕndan da
inhibe edilirler; glukoz yarÕúmasÕz inhibitör olarak, fruktoz ise yarÕúmalÕ
inhibitör olarak etki gösterir. ønvertaz izoenzimleri küçük gen aileleri (iki
tane vakular invertaz gen ailesi ve altÕ tane hücre duvarÕna ba÷lÕ invertaz
gen ailesi) tarafÕndan kodlanmaktadÕr. Genomik organizasyon ve intronekzon yapÕsÕ monokot ve dikot invertaz genleri arasÕnda korunmuútur.
Tüm bitki, bakteri ve fungus invertaz genlerinde var olan çok önemli bir
özellik; dokuz tane nükleotitten oluúan küçük bir ekzonun varlÕ÷ÕdÕr. Bu
ekzon, N-DPN-G/A kutusu úeklinde üç tane aminoasiti kodlamaktadÕr.
WECP/V aminoasit motifinde ise vakular invertazlar valin artÕ÷Õna, hücre
duvarÕna ba÷lÕ invertazlar ise valin yerine prolin artÕ÷Õna sahiptir (ùekil
1.3 ve ùekil 1.4). Bu tek aminoasit teki farklanma, hücre duvarÕna ba÷lÕ
invertazlarÕn vakular invertazlara göre daha asidik bir pH’a ve farklÕ
substrat spesifikli÷ine sahip olmasÕna neden olur (Roitsch and González,
2004; Goetz and Roitsh, 1999).
12
ùekil 1.3 Hücre duvarÕ ve vakular invertazlarÕn aminoasit motifi (Roitsch and
González, 2004)
ùekil 1.4 Hücre duvarÕ ve vakular invertazlarÕn filogenetik gösterimi (Goetz and
Roitsh, 1999)
Vakular invertazlar, vakuolda lokalize olup pH 5.0–5.5 arasÕ asidik
optimum pH’a sahiptirler. Vakuolar invertazlar, çözünür asidik
13
invertazlar olarak da adlandÕrÕlmaktadÕr. Vakulde depolanan sükrozun
seviyesinden ve metabolik prosesler için sükrozun yeniden
mobilizasyonundan sorumludurlar. AyrÕca meyve dokularÕnda ve olgun
yumrularda karbohidrat dengesinin regülasyonunda görevlidirler (Roitsch
and González, 2004).
Hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlar ise ekstraselüler, apoplazmik veya
periplazmik invertazlar olarak karakterize edilirler. Hücre duvarÕna ba÷lÕ
invertazlar düúük optimum pH’a (pH 3.5–5.0) ve yüksek izoelektrik
noktaya sahiptirler. Bu tip invertazlar hücre duvarÕna iyonik bir úekilde
ba÷lanÕrlar. Sükrozun floemde hidrolizini katalizleyerek yÕkÕm
ürünlerinin hücre duvarÕnda bulunan heksoz transporter proteinleri ile
floemden stoplazmaya geçmesini sa÷larlar (Roitsch and González, 2004).
Üçüncü tip invertazlar olan nötral invertazlar ise, alkali veya
stoplazmik invertazlar olarak adlandÕrÕlabilirler. Alkali denmesinin
sebebi optimum pH’larÕnÕn pH 6.8–8.0 arasÕnda olmasÕndan, sitoplazmik
denmesinin sebebi ise subselüler lokalizasyonun stoplazmada olmasÕndan
dolayÕdÕr. Bu tip invertazlar düúük enzim aktivitesine sahip olup
aktivitesini hÕzla kaybetti÷inden fizyolojik fonksiyonu hakkÕnda sÕnÕrlÕ
bilgi mevcuttur. Bugüne kadar ancak birkaç tane nötral invertaz
klonlanÕp karakterize edilmiútir. Asidik invertazlara karúÕ, nötral
invertazlar glikozillenmemiútir ve yalnÕzca sükrozu hidrolizlemektedir.
Bu sebeple, fruktofuranozidaz de÷ildirler. Nötral invertazlarÕn aktivitesi
yÕkÕm ürünlerinden güçlü bir úekilde inhibe olmaktadÕr fakat a÷Õr metal
iyonlarÕndan
etkilenmemektedir.
Nötral
invertazlar
sadece
siyanobakteriler ve bitkilerde bulunmaktadÕr (Roitsch and González,
2004).
14
1.1.2
ønvertazlarÕn etki mekanizmasÕ
Spesifik biyokatalizatörler olan enzimler aktivasyon enerjisini
düúürerek geçiú haline varmayÕ kolaylaútÕrÕrlar ve geçiú halinin
kararlÕlÕ÷ÕnÕ arttÕrarak reaksiyonu hÕzlandÕrÕrlar. Enzimler bunu substrat
ba÷lama merkezlerinin spesifikli÷i ve katalitik gruplarÕn optimal
düzenleniúi sayesinde baúarÕrlar. Enzimatik kataliz için asit-baz katalizi,
kovalent kataliz, metal iyonu katalizi, çözgen katalizi gibi çeúitli
mekanizma tipleri önerilmektedir (Uslan, 1997).
Ço÷u kaynaktan elde edilen invertazlarÕn kimyasÕ ve kineti÷i
hakkÕnda bilgilerin yetersizli÷inden dolayÕ invertaz etki mekanizmasÕna
ait çok az gerçek bilinmektedir.
Glikozidazlar, çok yaygÕn enzimlerden oluúan bir grup olup çeúitli
protein katlanmalarÕ ve substrat spesifiklikleri göstermektedirler.
GlikozidazlarÕn hepsinde olan ortak özellik; glikozidik ba÷Õn yÕkÕmÕndan
sorumlu katalizle ilgili mekanizmayÕ yapan, kritik bir yerde lokalize
olmuú iki tane asidik aminoasit artÕ÷Õna ortak olmalarÕdÕr. Bu de÷iúmez
aminoasitler, nükleofilik olarak davranan aspartat ve genel asit-baz gibi
davranan glutamattÕr. Glikozidik ba÷Õn enzimatik olarak hidrolizi iki tane
stereokimyasal yol (anomerik konfigürasyonun retansiyonu (tutma) yada
inversiyonu (tersine çevirme)) ile mümkün olur (Alberto et al., 2004).
Retansiyon mekanizmasÕna sahip glikozidazlar, ikili yer de÷iútirme
mekanizmasÕyla karbohidrat halkasÕndaki anomerik karbonun
konfigürasyonunu koruyarak glikolitik ba÷Õn hidrolizini katalizlerler
15
(ùekil 1.5). Bu enzimler bazen transglukozilleme yetene÷i gösterirler. Bu
enzimlerin katalitik mekanizmasÕ; karbohidratÕn bulundu÷u düzlemin iki
yanÕnda lokalize olmuú iki tane karboksilik artÕ÷Õn birbirinden ayrÕ
kimyasal reaksiyonu gerçekleútirmesine dayanmaktadÕr. ølk adÕmda
(glikolizleme); bir karboksilik grup genel-asit katalizi prensibine göre
ayrÕlacak grubun koparÕlmasÕnÕ sa÷lar ve hemen eú zamanlÕ olarak ikinci
karboksilik grup tarafÕndan nükleofilik bir atak sonucu glikozil-enzim
ara ürünü oluúturulur. økinci adÕmda (deglikozilleme); ilk artÕk, genel-baz
gibi davranarak gelmekte olan nükleofili (hidroliz reaksiyonu ise su
molekülü; transglikozilleme ise alkol) aktive eder ve sonunda karbohidrat
hidrolizlenmiú olur. øki karboksilik artÕk arasÕndaki mesafe yaklaúÕk
olarak 5 Å kadardÕr (Sinnot, 1990; McCarter and Withers, 1994).
ùekil 1.5 GlikozidazlarÕn retensiyon mekanizmasÕ
ønversiyon mekanizmasÕna sahip glikozidazlar, tek adÕmlÕ
nükleofilik yer de÷iútirme adÕmÕyla anomerik konfigürasyonun ters
16
çevrilmesine neden olurlar. Bu nedenle ȕ-glikozidik ba÷Õn hidroliziyle,
ürünler kÕsmÕnda Į-glikozidik ba÷ meydana getirirler veya belirtilenin
aksini gerçekleútirirler (ùekil 1.6). Bu katalitik mekanizmaya sahip olan
enzimler, ilk adÕmda genel-asit katalizi ile ayrÕlacak grubun ayrÕlmasÕnÕ
sa÷layan bir karboksilik artÕk ve ardÕndan genel-baz katalizi ile su
molekülünün nükleofilik olarak karbohidrat halkasÕnÕn karúÕ tarafÕna
ba÷lanmasÕnÕ sa÷layan ikinci karboksilik artÕ÷Õn yardÕmÕyla glikolitik
ba÷Õn
hidrolizini
gerçekleútirdikleri
belirtilmiútir.
ønversiyon
mekanizmasÕna sahip enzimlerde iki karboksilik artÕk arasÕndaki mesafe
retansiyon mekanizmasÕna sahip enzimlerden daha az kÕsÕtlanmÕútÕr ve bu
aralÕk 6.5–9.5 Å kadardÕr (Sinnot, 1990, McCarter and Withers, 1994).
ùekil 1.6 GlikozidazlarÕn inversiyon mekanizmasÕ
ønvertazlarÕn bulundu÷u GH 32 familyasÕ, retansiyon
mekanizmasÕna sahiptir (Alberto et al., 2004). Substrat olan karbohidratÕn
glikozidik oksijeni asit-baz katalisti(glutamat) tarafÕndan protonlanÕr ve
hemen ardÕndan anomerik karbona (fruktozun ȕ-anomerik karbonu)
ikinci katalistin (aspartat) nükleofilik ata÷Õ sonucu fruktoz-enzim ara
17
ürünü oluúur. Daha sonra, bu ara ürün hidrolizlenir ve fruktoz ile enzim
serbest kalÕr (ùekil 1.7) (Reddy and Maley, 1990).
ùekil 1.7 ønvertazÕn sükroz kataliz mekanizmasÕ
Enzimlerin reaksiyon mekanizmalarÕnÕn aydÕnlatÕlmasÕnda en
önemli adÕm aktif merkezinde yer alan aminoasit yan zincirlerinin ve
bunlarÕn konumlarÕnÕn belirlenmesidir. Bu aminoasitler ba÷lanma
merkezi ve katalitik merkezde aktif olarak görev alÕrlar. Ço÷u kez XÕúÕnlarÕ yöntemi uygundur fakat en çok kullanÕlan yöntem seçimli olarak
reaksiyon veren reaktiflerle yapÕlan modifikasyon çalÕúmalarÕdÕr (Uslan,
1997).
Maya kaynaklÕ invertazla yapÕlan CBE ajanÕyla afinite
iúaretlenmesi ve site-directed mutagenesis çalÕúmalarÕ sonucunda Asp–23
aminoasidi yerine asparagin aminoasidinin modifiye edilmesiyle enzimin
inaktive oldu÷u gözlenmiútir. Sonuç olarak aktif merkezde Asp–23
aminoasidinin bulundu÷u ve nükleofilik olarak etkidi÷i tespit edilmiútir
(Reddy and Maley, 1990). Bir baúka çalÕúmada ise yine ayni prosedür ile
maya invertazÕnÕn Glu–204 aminoasidinin, alaninle modifiye edilmesi
18
sonucunda katalitik aktivitenin 3000 kat azaldÕ÷Õ görülmüútür. Glu–204
artÕ÷ÕnÕn proton donorü olarak davranmasÕnÕn anlaúÕlmasÕ ile bu artÕ÷Õn
invertazÕn katalitik aktivitesi için esansiyel oldu÷u belirtilmiútir. AyrÕca
iyodin inaktivasyonuyla yapÕlan çalÕúmada Cys–205 artÕ÷ÕnÕn bloke
edilmesi hidroliz reaksiyonunu % 70 oranÕnda düúürmektedir. Bunun
sonucunda, Cys–205 artÕ÷ÕnÕn, Glu–204 artÕ÷Õna yakÕn olmasÕndan dolayÕ
katalize uygun bir çevre yaratabildi÷i ya da substrat ba÷lanmasÕnda görev
alabilece÷i belirtilmiútir (Reddy and Maley, 1996).
Arabidopsis thaliana hücre duvarÕ invertaz-1 (AtcwINV1)
mutantlarÕnÕn sükroz molekülü ile oluúturduklarÕ kompleksin kristal
yapÕsÕ X-ÕúÕnlarÕ ile yapÕlan çalÕúmada do÷al AtcwINV1 invertazÕnÕn aktif
bölgesi ile ilgili ayrÕntÕlarÕ daha iyi anlamada yardÕmcÕ olmuútur. E203Q
AtcwINV1 mutantÕnÕn yapÕsÕ yeni bir ba÷lama tarzÕnÕ ortaya koymuútur.
Di÷er enzim-sükroz komplekslerine kÕyasla fruktoz artÕ÷Õ neredeyse ayni
pozisyonda kalÕr iken glukoz altbiriminin oryantasyonunda farklÕlÕklar
oldu÷u görülmüútür. Buna göre D23A, E203A ve D239A aminoasitleri
aktif merkezde bulunmaktadÕr. Bunun yanÕnda W20, W47 ve W82 diye
adlandÕrÕlan üç tane triptofan aminoasiti hidrofobik bölgeyi, N22
(asparagin), D23 (aspartat), R148 (argin), E203(glutamat), D149 ve
D239 aminoasit artÕklarÕ ise ideal bir sükroz ba÷layan cebi
oluúturmaktadÕr. D239 artÕ÷Õ sükrozun glukoz artÕ÷Õ ile direkt olarak
ba÷lanÕrken, K242 (lizin) artÕ÷Õ indirekt bir yolla substrat stabilizasyonu
sa÷layarak D239 artÕ÷ÕnÕn substrat ba÷lamasÕ için onu uygun bir
pozisyonda tuttu÷u belirtilmiútir (ùekil 1.8) (Lammens et al., 2008).
19
ùekil 1.8 Arabidopsis thaliana invertazÕnÕn kristal yapÕsÕ
Thermotoga maritima invertazÕnÕn kristal yapÕsÕ X-ÕúÕnlarÕ
kristalografisi ile aydÕnlatÕlmÕútÕr. Aktif merkezinde glutamat, aspartat,
triptofan, serin, tirozin, arginin ve asparagin aminoasitlerinin bulundu÷u
belirlenmiútir (Alberto et al., 2004). Thermotoga maritima invertazÕnÕn
do÷al substratÕ olan rafinoz molekülü ile oluúturdu÷u kompleksin kristal
yapÕsÕ da aydÕnlatÕlmÕú ve 3-boyutlu yapÕ substrat spesifikli÷inin
anlaúÕlmasÕnda yardÕmcÕ olmuútur. Rafinoz molekülü ȕ-propeller modül
içerisinde -1, +1 ve +2 olarak adlandÕrÕlan ba÷lanma bölgelerine
ba÷lanmaktadÕr ve ȕ-fruktofuranozil birimi -1 bölgesinde katalize
girmektedir. Fruktoz artÕ÷Õ aktif merkezin -1 bölgesinin iç kÕsmÕna
lokalize olmuú ve Trp260, Trp41, Gln33, Asn16 ve Asp138 artÕklarÕnÕn
hidroksil gruplarÕ ile hidrojen ba÷Õ oluúturmuútur. Bu bölge substratÕn
ba÷lanmasÕndan ve fruktoz artÕ÷ÕnÕn koparÕlmasÕndan sorumludur.
Rafinozun Į-glukoz artÕ÷Õ +1 bölgesinde Trp65, Phe74 ve Trp260 aromatik
aminoasitleri tarafÕndan sarÕlmÕútÕr. Bu hidrofobik etkileúimler rafinozun
aktif merkeze ba÷lanmasÕnÕ adapte etmektedir. Rafinozun terminal
20
galaktoz birimi ise +2 bölgesinde yer almÕútÕr. Bu bölge aktif merkezin
proteinin yüzeyine yakÕn oldu÷u yerde yer almaktadÕr ve Glu101 ile Tyr92
artÕklarÕ bu bölgede sÕrasÕyla glukoz artÕ÷Õ ve su molekülleri ile hidrojen
ba÷larÕ oluúturmaktadÕr (ùekil 1.9) (Katalitik artÕklar sarÕ renk; aromatik
artÕklar mavi; di÷er artÕklar yeúil; Qw su moleküllerini; (- - -) ise hidrojen
ba÷larÕni göstermektedir) (Alberto et al., 2006).
ùekil 1.9 Thermotoga maritima invertazÕnÕn kristal yapÕsÕ
1.1.3
ønvertazlarÕn izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕ
Protein olarak enzimler çok çeúitli biyokimyasal teknikler
kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlabilirler. SaflaútÕrmanÕn amacÕ daha
sonraki çalÕúmalarda kullanÕlabilecek uygun bir protein preparatÕnÕn
hazÕrlanmasÕdÕr. Bunun için öncelikle gereksinim duyulan protein
miktarÕ, ne düzeyde bir saflÕk istendi÷i, ne düzeyde bir aktivite kaybÕnÕn
tolere edilebilece÷i, ne kadar zaman ve para harcanabilece÷i
belirlenmelidir. SaflaútÕrÕlacak olan enzim seçilen kaynakta hem kararlÕ
olmalÕ hem de bol miktarda bulunmalÕdÕr. AyrÕca kolay sa÷lanabilir, bol
21
ve ucuz kaynaklar daima tercih edilirler. Enzimlerin izolasyon ve
saflaútÕrÕlmasÕnda her zaman en etkili, en hÕzlÕ ve en ekonomik prosesler
belirlenmeye çalÕúÕlÕr. øzolasyon adÕmÕnda genellikle homojenizasyon ve
homojenatÕn separasyonu gerçekleútirilir. SaflaútÕrmanÕn ilk adÕmlarÕnda
daha çok deriútirme yöntemleri, daha sonra ise kromatografik teknikler
kullanÕlÕr (Telefoncu, 1996).
ønvertaz kayna÷Õ olarak mikrobiyal ve bitkisel kaynaklar seçilerek,
bilinen ekstraksiyon yöntemleri ile enzim izole edilip, saflaútÕrÕlmÕú ve
saflaútÕrÕlan bu enzim karakterize edilerek çeúitli uygulama alanlarÕna
sunulmuútur. ønvertazlar genellikle hücre içerisinde ve de di÷er çeúitli
glikozidazlarla bir arada bulunurlar. O nedenle bu aktiviteleri ço÷u kez
birbirinden ayÕrmak oldukça zor olmaktadÕr. øzolasyon ve saflaútÕrmada
kullanÕlan teknikler; amonyumsülfat ve organik çözgen ile
fraksiyonlama, ÕsÕ muamelesi, asidifikasyon, iyon de÷iúim, jel
kromatografisi ve izoelektirik fokuslama olarak sÕralanabilir. Oldukça
yüksek saflÕkta ve hemen hemen homojen bir invertaz preparatÕnÕn
hazÕrlanabildi÷i çok az çalÕúma mevcuttur. Enzimin ilk kristal formu,
termofilik bir bakteri olan Thermotoga maritima ’dan izole edilen
invertazdÕr (Alberto et al., 2004).
Literatürlerde verilen invertaz izolasyon, saflaútÕrma ve
karakterizasyon çalÕúmalarÕnda bitkisel kaynak olarak zambak (Singh and
Knox, 1983; Miller and Ranwala, 1994), úeker kamÕúÕ (Vorster and
Botha, 1998), armut (Hashizume et al., 2003), patates (Isla et al., 1998),
so÷an (Benkeblia et al., 2004), üzüm (Dreier et al., 1998), tütün (Rojo et
al., 1998), soya fasulyesi (Morell ve Copeland, 1983), kavun (Lingle and
Dunlap, 1987), bambu (Liu et al., 2006), úeker pancarÕ (Leigh et
al.,1978), papaya (Lopez et al.,1988), domates (Nakagawa et al.,1971),
enginar (Goupil et al., 1988), portakal (Schaffer, 1986), bu÷day
22
(Krishnan et al.,1985), Latin çiçe÷i (Isla et al. 1988), hint ya÷Õ bitkisi
(Prado et al., 1985), turp (Faye et al., 1981), yulaf (Pressey and Avants,
1980), havuç (Lee and Sturm, 1996), úeftali (Moriguchi et al., 1991),
arpa (Obenland et al., 1993), nohut (Asthir and Singh, 1997), mango
(Rahman et al., 2001), pirinç (Fu et al., 2003), mung bean (Yun et al.,
2002), semizotu (Abdou, 2004) ve elma (Pan et al., 2005), mikrobiyal
kaynak olarak Candida utilis (Chávez et al., 1997; Belcarz et al., 2000),
Lactobacillus reuteri (Ginés et al., 2000), Kluyveromyces fragilis
(Workman and Day, 1983), Aspergillus niger (L’Hocine et al., 2000),
Schwanniomyces occidentalis (Álvaro-Benito et al., 2007), Arthrobacter
globiformis (Win et al., 2004), Rhodotorula glutinis (Rubio et al., 2002),
Schizosaccharomyces pombe (Tanaka et al., 1998), Clostridium
perfringens (Ishimoto and Nakamura, 1997), Saccharomyces cerevisiae
(Bahar ve Tuncel, 2004; Bansal-Mutalik and Gaikar, 2005), Fusarium
oxysporum (Nishizawa et al., 1980), Pycnoporus sanguineus (Quiroga et
al., 1995), Aspergillus nidulans (Chen et al., 1996), Aspergillus
ochraceus (Ghosh et al., 2001) ve Bifidobacterium infantis (Warchol et
al., 2002) seçilmiútir.
Bu kaynaklardan izole edilen invertazlar, genellikle tuz çöktürmesi
(Vorster and Botha, 1998; Singh and Knox, 1983), organik çözgen ile
fraksiyonlama (Chávez et al., 1997; Bansal-Mutalik and Gaikar, 2005),
anyon yada katyon de÷iúim kromatografisi (Hashizume et al., 2003;
Ginés et al., 2000), afinite kromatografisi (Bahar ve Tuncel, 2004;
Rahman et al., 2001; Belcarz et al., 2000), jel filtrasyon kromatografisi
(L’Hocine et al., 2000; Álvaro-Benito et al.,, 2007) ve izoelektrik
fokuslama (Workman and Day, 1983; Liu et al., 2005) kullanÕlarak
saflaútÕrÕlmÕútÕr. SaflaútÕrÕlan invertazlar baúta biyoteknolojik prosesler
olmak üzere birçok alanda uygulama imkanÕ bulmuútur (Rubio et al.,
2002; Win et al., 2004).
23
1.1.4
ønvertazlarÕn fiziksel özellikleri
1.1.4.1 ønvertazlarÕn multimoleküler formlarÕ ve molekül
kütleleri
Genel olarak proteinlerin saflÕ÷ÕnÕn kontrolü, saf proteinin alt birim
yapÕlarÕnÕn incelenmesi ve molekül kütlesi tayini için poliakrilamid jel
elektroforezi (PAGE) yöntemlerinden yararlanÕlmaktadÕr. Poliakrilamid
jel elektroforezinin en yaygÕn olarak kullanÕlanÕ Laemmli tarafÕndan
geliútirilen Sodyum Dodesil Sülfat PoliAkrilamid Jel Elektroforezidir
(SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). SDS-PAGE ile proteinler biyolojik ve
biyokimyasal aktivitelerini yitirdikleri için bu durumda do÷al koúullar
altÕnda elektroforez (PAGE) tercih edilmektedir. Proteinlerin moleküler
kütlelerinin belirlenmesinde kullanÕlan SDS-PAGE’ne alternatif bir
metod da moleküler boyuta göre ayÕrma yapan jel filtrasyon
kromatografisidir (Zihnio÷lu, 1996).
ønvertazlarÕn moleküler kütleleri ve yapÕlarÕ kaynaktan kayna÷a ve
kullanÕlan tayin yöntemine ba÷lÕ olarak farklÕlÕk göstermektedir. Örne÷in;
mango invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyon kromatografisi ve SDSPAGE ile sÕrasÕyla 68 kDa ve 65.5 kDa olarak belirlenmiúir (Rahman et
al., 2001). Rhodotorula glutinis invertazÕnÕn molekül kütlesi SDS-PAGE
ile 47 kDa, jel fitrasyonu ile 100 kDa olarak bulunmuú ve enzimin iki
identik alt birime sahip oldu÷u belirtilmiútir (Rubio et al., 2002).
Woodfordia fruticosa invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyonu ile 280
kDa olarak bulunmuú ve enzimin SDS-PAGE ile 66 kDa, 43 kDa ve 40
kDa molekül kütlesine sahip heterotrimerik bir protein oldu÷u
belirlenmiútir (Weersaooriya and Yatawara, 2002). ùeker kamÕúÕ nötral
invertazÕnÕn 60 kDa molekül kütlesine sahip monomeri oldu÷u ve
24
monomer, dimer ve tetramer olarak katalitik aktivite gösterdi÷i tespit
edilmiútir (Vorster and Botha, 1998). Fusarium oxysporum invertazÕnÕn
invertaz P-1 ve invertaz P-2 olarak iki formu bulundu÷u ve bu iki
enzimin SDS-PAGE ile molekül kütleleri sÕrasÕyla 108 kDa ve 84 kDa
oldu÷u belirlenmiútir (Nishizawa et al., 1980). Ricinus communis ’dan
saflaútÕrÕlan invertazÕn ise homoheptamerik bir protein olup her bir alt
birimin 11 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel filtrasyonu ile 78
kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u belirlenmiútir (Prado et al., 1985).
Havuç invertazÕnÕn alkali invertaz ve nötral invertaz olmak üzere iki
formu mevcuttur. Alkali invertazÕ homotetramerik bir protein olup her bir
alt birimin 126 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel fitrasyonu
ile 504 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u hesaplanmÕútÕr. Nötral
invertazÕ ise homooktamerik bir protein olup her bir alt birimin 57 kDa
oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel filtrasyonu ile 464 kDa molekül
kütlesine sahip oldu÷u bulunmuútur (Lee and Sturm, 1996).
Çizelge 1.2’de çeúitli kaynaklardan izole edilerek saflaútÕrÕlan
invertazlarÕn molekül kütleleri verilmiútir.
Clostridium perfringens
Schizosaccharomyces pombe
Woodfordia fruticosa
Fusarium oxysporum
Ricinus communis
Daucus carota
Beta vulgaris
ønvertaz Kayna÷Õ
Candida utilis
Lactobacillus reuteri CRL 1100
Lilium auratum
ùeker kamÕúÕ
Armut
Aspergillus niger AS0023
Aspergillus niger IMI303386
Candida utilis
Rhodotorula glutinis
Solanum tuberosum
Nicotiana glauca
Bambusa edulis
Mango
37
1070
280
108 – 84
11
126 – 57
28
ønvertaz
ønvertaz P–1 ve ønvertaz P–2
Vakular invertaz
Alkali invertaz ve Nötral invertaz
Periplazmik invertaz
Molekül Kütlesi (kDa)
150
58
450
60
80 – 86
91
125
62 – 280
100
72 – 72
89,3
240 – 68
65
ønvertaz
Periplazmik ønvertaz
ønvertaz
ønvertaz–1 (sitoplazmik)
Nötral invertaz (SNI)
AIV I - AIV II
INV
ønvertaz
F-formu ve S-formu
ønvertaz
Vakular invertaz - ønvertaz I
Vakular invertaz
IT I - IT II
ønvertaz
Referans
Chávez et al., 1997
Ginés et al., 2000
Singh and Knox, 1983
Vorster and Botha, 1998
Hashizume et al., 2003
L’Hocine et al., 2000
Nguyen et al., 2005
Belcarz et al., 2002
Rubio et al., 2002
Isla et al., 1999
Rojo et al., 1998
Liu et al., 2006
Rahman et al., 2001
Weersaooriya
Jel filtrasyonu and Yatawara, 2002
SDS-PAGE Nishizawa et al., 1980
SDS-PAGE Prado et al., 1985
SDS-PAGE Lee and Sturm, 1996
Jel filtrasyonu Masuda et al., 1980
Ishimoto
Jel filtrasyonu and Nakamura, 1997
PAGE
Moreno et al., 1990
Yöntem
SDS-PAGE
SDS-PAGE
Jel filtrasyonu
Jel filtrasyonu
SDS-PAGE
SDS-PAGE
SDS-PAGE
PAGE
Jel filtrasyonu
Jel filtrasyonu
Jel filtrasyonu
Jel filtrasyonu
Jel filtrasyonu
Çizelge 1.2 BazÕ invertazlarÕn molekül kütleleri.
25
26
1.1.5 ønvertazlarÕn kinetik özellikleri
1.1.5.1 ønvertazlarÕn aktivitesine substrat konsantrasyonunun
etkisi ve substrat spesifiklikleri
ønvertazlarÕn enzimatik aktivitelerinin tayininde do÷al substratlar
kullanÕlmaktadÕr. Sükroz, rafinoz, metil-fruktofuranozid, benzilfruktofuranozid, stakiyöz ve verbaskoz gibi oligosakkaritler ve inulin gibi
polimerler invertaz aktivitesi tayininde kullanÕlan do÷al substratlardÕr.
ønvertazlar sükrozu, glukoz ve fruktoza hidrolizlerken rafinoz, stakiyöz
ve verbaskozun terminal indirgen olmayan fruktoz artÕ÷ÕnÕ da
hidrolizlemektedir (ùekil 1.10). ønvertazlar, fruktozun yarÕúmalÕ
inhibisyonu
ve
glukozun
non-kompetitif
inhibisyonu
ile
etkilenmektedirler.
ùekil 1.10 ønvertazÕn do÷al substratlarÕ
27
Genellikle glikozid substratlarÕnÕn tek bir atomundaki hidrojen ve
hidroksil gruplarÕnÕn konfigürasyonlarÕndaki de÷iúme, ilgili hidrolazÕn
hidrolitik karakterini ya tamamen inhibe eder yada hÕzÕ düúürür.
ønvertazlarda substratÕn hidroliz hÕzÕna etki eden iki faktör vardÕr.
Bunlardan birincisi, halka yapÕsÕ fruktofuranoid yapÕda olmalÕ, ikincisi
ise substratÕn H ve OH gruplarÕnÕn konfigürasyonu fruktoza benzerlik
göstermelidir.
Literatürlerde belirtildi÷i gibi invertazlarÕn substratlara olan
afinitesini (1/Km), substratlarÕn yapÕlarÕndaki de÷iúimlerle birlikte
invertazÕn aktif merkezinde substratÕn ba÷lanmasÕ ve glikozidik ba÷Õn
yÕkÕmÕndan sorumlu olan aminoasitlerin kompozisyonu da invertazÕn
substrat spesifikli÷ine ve kataliz hÕzÕna etki eden en önemli
faktörlerdendir. Neredeyse tüm invertazlarda çok yüksek derecede
korunmuú ve ortak olan NDPNG, EC ve RDP motifleri sÕrasÕyla aspartat,
glutamat ve aspartat aminoasitlerini barÕndÕrmaktadÕr ve bu aminoasitler
katalitik reaksiyonda çok önemli fonksiyona sahiptir. Fakat bu
aminoasitlerin çevresindeki artÕklarÕn pozisyonu da substrat
ba÷lanmasÕnda ve katalizde direk veya indirek olarak rol oynamaktadÕr
(Lammens et al., 2008).
Çizelge 1.3’de çeúitli kaynaklardan saflaútÕrÕlan invertazlarÕn
substrat spesifiklikleri ile ilgili sonuçlar verilmiútir.
Ekstraselüler invertaz
Ǻ-FFaz-E
Aspergillus ochraceus TS
Lycopersicon esculentum
Ǻ-FFaz-L
ønvertaz II
ønvertaz I
ønvertaz III
Beta vulgaris
Avena sativa
Nötral invertaz
ønvertaz I
Cicer arietinum
Lilium longiflorum
ønvertaz II
ønvertaz
ønvertaz
Substrat
Sükroz
ønulin
Rafinoz
Sükroz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Stakiyöz
Sükroz
Rafinoz
Stakiyöz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Km (mM)
64.0
19.0
15.0
14.2
1.0
1.6
6.4
10.8
6.6
13
2.4
2.9
14.0
6.7
17.0
25.0
1.33
4.0
3.5
4.5
2.17
20.4
3.7
10.6
Nakagawa et al., 1971
Ghosh et al., 2001
Masuda and Sugawara, 1980
Pressey and Avants, 1980
Asthir and Singh, 1997
Miller and Ranwala, 1994
Referans
Liebl et al., 1998
Çizelge 1.3 ønvertazlarÕn substrat spesifiklikleri.
ønvertaz Kayna÷Õ
Thermotoga maritima
28
ønvertaz
ønvertaz
ønvertaz
Asit invertaz
ønvertaz
øntraselüler invertaz
ønvertaz
ønvertaz
Asit invertaz
ønvertaz Kayna÷Õ
Ipomoea batatas
Pycnoporus sanguineus
Tropaeolum majus
Clostridium perfringens
Saccharomyces cerevisiae
Zymomonas mobilis
Woodfordia fruticosa
Rhodotorula glutinis
Saccharum officinarum
Substrat
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Rafinoz
Stakiyöz
Sükroz
Rafinoz
Stakiyöz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Km (mM)
10.69
32.19
4.89
9.3
18.8
5.3
17.0
25.0
0.05
41.2
42.0
160.0
227.0
67
Çizelge 1.3 (devam)
Ishimoto and Nakamura, 1997
Arruda and Vitolo, 1999
Ait-Abdelkader et al., 2000
Weersaooriya and Yatawara, 2002
Rubio et al., 2002
Batta et al., 1991
Isla et al., 1988
Quiroga et al., 1995
Referans
Huang et al., 2003
29
30
YapÕlan çalÕúmalarda, farklÕ kaynaklardan saflaútÕrÕlan invertazlarÕn
çeúitli substratlara karúÕ farklÕ spesifiklik gösterdikleri belirlenmiútir
(ùekil 1.11). Carica papaya invertazÕ oldukça geniú substrat
spesifikli÷ine sahiptir. Enzimin ȕ-metil fruktozid, rafinoz, sükroz ve
stakiyözu hidrolizleyebildi÷i belirlenmiútir (Lopez et al., 1988).
Pycnoporus sanguineus invertazÕ ise sükroz, rafinoz, stakiyöz, inulin ve
levanÕ hidrolizleyebilmektedir (Quiroga et al., 1995). Nicotiana tabacum
invertazÕ ise baúta sükroz olmak üzere rafinoz, melezitoz ve trehaloza
spesifiklik
gösterek
terminal
fruktozil
artÕklarÕndan
hidrolizleyebilmektedir (Nakamura et al., 1988). Aspergillus japonicus
TIT-KJ1 ȕ-fruktofuranozidazÕ sükroz, rafinoz, nistoz yanÕnda 1-kestozu
da hidrolizlemektedir (Duan et al., 1993).
ùekil 1.11 ønvertazlarÕn do÷al substratlarÕ
Bifidobacterium lactis DSM 10140T rekombinant ȕfruktofuranozidazÕnÕn çeúitli fruktooligosakkaritler üzerine etkisi
araútÕrÕlmÕútÕr. Enzim fruktoz artÕklarÕ arasÕndaki beta 2-1 glikozidik
31
ba÷larÕna yüksek ilgi göstermektedir. Raftiloz (ȕ-D-Fru-(1–2)-(ȕ-D-Fru)n
[n=5]), Raftilin LS (ȕ-D-Glu-(1–2)- (ȕ-D-Fru)n [n=10]) ve sükroza karúÕ
elde edilen Km de÷erleri sÕrasÕyla 0.12, 7.08 ve 8.37 mM olarak
bulunmuútur. Rafinoz (ȕ-D-Gal-(1–6)-ȕ-D-Glu-(1–2)-ȕ-D-Fru), Raftilin
HP (ȕ-D-Glu-(1–2)-(ȕ-D-Fru)n [n=23]) ve levan (ȕ-D-Fru-(2–6)-(ȕ-DFru)n) oligosakkaritlerine karúÕ ise oldukça düúük aktivite gösterirken
melezitoza (ȕ-D-Glu-(1–3)-ȕ-D-Fru-(2–1)-ȕ-D-Glu) karúÕ hiç aktivite
göstemedi÷i belirtilmiútir (Janer et al., 2004).
Zymomonas mobilis intraselüler invertazÕ (SacA) sükroz (glukozilĮ-1ĺ2-ȕ-fruktozid) ve rafinoza (galaktozil-Į-1ĺ6-glukozil-Į-1ĺ2-ȕfruktozid) karúÕ oldukça yüksek bir aktivite göstererek yapÕlarÕndaki ȕ2ĺ1 frukozil ba÷Õndan parçalamaktadÕr. Ancak maltoz (glukozil-Į-1ĺ4ȕ-glukozid) ve levan (ȕ-2ĺ6 polifruktozid) karbohidratlarÕnÕ
hidrolizleyemezken inulini (ȕ-2ĺ1 polifruktozid) çok düúük bir aktivite
ile hidrolizleyebilmektedir (Aït-Abdelkader et al., 2000).
Thermotoga maritima invertazÕ fruktozil artÕ÷Õ içeren sukrozun
yanÕnda rafinoz gibi oligosakkaritlerde ve inulin gibi polisakkaritlerde
terminal
indirgen
olmayan
fruktozil
artÕ÷ÕnÕ
kolaylÕkla
hidrolizleyebilmektedir. Ancak nistoz, kestoz ve inulin polimerinin
türevleri gibi yüksek zincirli fruktoz polimerleri enzimin aktif merkezine
ba÷lanamadÕ÷Õndan hidrolizlenememektedir (Alberto et al., 2006).
1.1.5.2 ønvertaz aktivitesi ve kararlÕlÕ÷Õna sÕcaklÕ÷Õn etkisi
Tüm kimyasal reaksiyonlar gibi, enzim katalizli reaksiyonlar da
sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕdÕr ve reaksiyonun hÕzÕ sÕcaklÕkla artÕú gösterir. Fakat bu
artÕú sürekli de÷ildir. Özellikle 40oC’nin üzerinde inkübasyon süresine
32
ba÷ÕmlÕ olarak önce bir duraklama daha sonrada gerileme gösterir. Ana
yapÕsÕ protein olan enzimler sÕcaklÕkla denaturasyona u÷rarlar. Belirli
çalÕúma koúullarÕnda farklÕ sÕcaklÕklarda enzimin maksimum aktivite
gösterdi÷i sÕcaklÕ÷a optimum sÕcaklÕk denir. Optimum sÕcaklÕk
inkübasyon süresine ba÷ÕmlÕ bir parametredir (Telefoncu, 1986).
ønvertazlar da kaynaklarÕna ba÷lÕ olarak çeúitli kararlÕlÕk dereceleri
gösterirler. Genellikle invertazlarÕn ço÷unun optimum sÕcaklÕk de÷eri 4050oC arasÕnda de÷iúmektedir. Fakat mikrobiyal kaynaklÕ termostabil
invertazlar için bu de÷er 50oC’nin çok üstüne de çÕkabilmektedir.
Örne÷in; Thermotoga maritima (Liebl et al., 1998), Candida utilis
(Belcarz et al., 2002), Corticium rolfsii (Sato and Kaji, 1976), Nicotiana
tabacum (Nakamura et al., 1988), Aureobasidium pullulans (Oliveira and
Park, 1995) için optimum sÕcaklÕk de÷erleri sÕrasÕyla 90, 70, 75, 60 ve
55oC olarak belirlenmiútir.
Thermotoga maritima invertazÕ, invertazlar arasÕnda bugüne kadar
bilinen en yüksek oranda termoaktif ve termokararlÕlÕ÷a sahip invertaz
olarak tanÕmlanmÕútÕr. Enzimin 30oC’nin altÕnda aktivite göstermezken,
60-98oC aralÕ÷Õnda inkübe edildi÷inde oldukça termostabil oldu÷u
gözlenmiútir. Enzimin optimum sÕcaklÕ÷Õ 90oC olarak belirlenmiútir. 98oC
ve üzerindeki sÕcaklÕklarda enzim inaktive olmaktadÕr. SÕcaklÕ÷Õn enzim
kararlÕlÕ÷Õna etkisi incelendi÷inde, 60oC’de 14 gün inkübasyon sonucu
enzim baúlangÕç aktivitesinin % 60’ÕnÕ, 70oC’de 14 gün inkübasyon
sonucu enzim baúlangÕç aktivitesinin % 76’ÕnÕ kaybetmektedir. 80 ve
85oC’de 5 saat inkübasyon sonucu enzim baúlangÕç aktivitesinin % 85’ini
koruyabilmektedir. Bu özelliklerinden dolayÕ Thermotoga maritima
invertazÕnÕn yüksek sÕcaklÕklarda çalÕúan prosesler içi uygun olabilece÷i
öne sürülmüútür (Liebl et al., 1998).
33
Corticium rolfsii invertazÕ için optimum sÕcaklÕk de÷eri 75oC olup
enzim pH 4.0’de kararlÕdÕr. 50oC’de aktivitesinin % 50’sini, 80oC’de ise
aktivitesinin % 70’ini göstermektedir. 65oC’de 10 dakika inkübasyona
maruz kaldÕ÷Õnda % 100 aktivitesini korurken, 70oC’de % 90’ÕnÕ
koruyabilmektedir (Sato and Kaji, 1976).
Candida utilis invertazÕnÕn S- ve F- formu için optimum sÕcaklÕk
70oC olarak belirlenmiútir. Her iki formuda 30-90oC arasÕndaki sÕcaklÕk
de÷iúimlerine karúÕ oldukça yüksek dayanÕklÕlÕ÷a sahiptir. 30oC’de Fformu baúlangÕç aktivitesinin % 80’ini, S-formu ise % 75’ini korurken,
80oC’de F-formu baúlangÕç aktivitesinin % 45’ini, S-formu ise yalnÕzca
% 2’sini kaybetmiútir (Belcarz et al., 2002).
Aspergillus japonicus TIT-KJ1 invertazÕ 40oC ve 70oC’de
baúlangÕç aktivitesinin % 30’unu korurken, optimum sÕcaklÕ÷Õ olan
60oC’de aktivitesinin % 100’ünü göstermektedir. pH 5.4 ve 37oC’de 2
saat boyunca kararlÕ iken pH 5.4 ve 56oC’de ancak 20 dakika kararlÕ
kalabilmektedir (Duan et al., 1993).
Cladosporium
cladosporioides
invertazÕ
40-75oC
sÕcaklÕk
aralÕ÷Õnda baúlangÕç aktivitesinin en az % 40’ÕnÕ korurken, 60 C’de 20
saat boyunca kararlÕlÕ÷ÕnÕ koruyabilmektedir (Ferreira et al., 1991).
o
Lilium longiflorum invertazlarÕndan invertaz I, invertaz II ve
invertaz III için optimum sÕcaklÕklar sÕrasÕyla 40, 50 ve 45oC olarak
belirlenmiútir. Bu enzimler 60oC’de 10 dakika süreyle inkübasyona
maruz bÕrakÕldÕ÷Õnda, invertaz I enzimi aktivitesini tamamen
kaybederken, invertaz II ve invertaz III enzimleri baúlangÕç
aktivitelerinin sÕrasÕyla % 25 ve % 40’ÕnÕ koruyabilmiúlerdir (Miller and
Ranwala, 1994).
34
Saccharum officinarum ve mango invertazÕnÕn 10-75oC arasÕnda
termal kararlÕlÕ÷a sahip olduklarÕ ve optimum sÕcaklÕklarÕnÕn sÕrasÕyla
40oC ve 75oC oldu÷u belirtilmiútir. Saccharum officinarum invertazÕ
50oC’ye kadar kararlÕlÕ÷ÕnÕ korurken, bu sÕcaklÕktan yüksek sÕcaklÕklarda
dönüúümü olmayan denaturasyona u÷ramaktadÕr. Mango invertazÕ ise
75oC’de 15 dakika inkübasyona maruz kaldÕ÷Õnda baúlangÕç aktivitesinin
% 95’ini koruyabilmiútir (Batta et al., 1991; Rahman et al., 2001).
Aspergillus niger AS0023 invertazÕnÕn 30-70oC aralÕ÷Õnda oldukça
termostabil oldu÷u gözlenmiútir. Enzimin optimum sÕcaklÕ÷Õ 55oC olarak
belirlenmiútir. Aspergillus niger AS0023 invertazÕ 65oC’de 2 saat inkübe
edildi÷inde baúlangÕç aktivitesinin % 80’ini koruyabilmektedir (L’Hocine
et al., 2000).
Rhodotorula glutinis invertazÕnÕn 60oC’de dahi ÕsÕya dayanÕklÕ bir
enzim oldu÷u ve de endüstriyel alanda úurup üretimi için gerekli ÕsÕ
úartÕnÕ sa÷ladÕ÷Õ için kullanÕmÕnÕn uygun oldu÷u belirtilmiútir (Rubio et
al., 2002).
Çizelge 1.4’de çeúitli invertazlarÕn termal kararlÕlÕklarÕ ile ilgili bazÕ
sonuçlar verilmiútir.
35
Çizelge 1.4 BazÕ invertazlarÕn termal kararlÕlÕklarÕ.
ønvertaz
Kayna÷Õ
Thermotoga
maritima
SÕcaklÕk (oC)
Zaman
Aktivite KaybÕ
(%)
60
14 gün
60
Corticium rolfsii
70
10 dk
10
Mango
Aspergillus niger
AS0023
75
15 dk
5
65
2 saat
20
Candida utilis
Bifidobacterium
infantis
80
15 dk
2
50
30 dk
10
Referans
Liebl et al.,
1998
Sato and Kaji,
1976
Rahman et al.,
2001
L’Hocine et al.,
2000
Belcarz et al.,
2002
Warchol et al.,
2002
1.1.5.3 ønvertaz aktivitesi ve kararlÕlÕ÷Õna pH’Õn etkisi
Enzimlerin aktivitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisi
pH’dÕr. ønkübasyon ortamÕnÕn pH’sÕ, protein molekülünün tamamÕnÕn
yük ve dissosiasyon durumu yanÕnda aktif merkezi de etkilemektedir. pH
etkisi özellikle úu sonuçlara neden olmaktadÕr; enzim proteinin tersinir
olmayan denaturasyonu ve optimum pH bölgesi dÕúÕnda koenzim veya
prostetik gruplarÕn aktif merkezden ayrÕlmasÕ. Enzimlerin maksimum
aktivite
gösterdikleri
pH,
optimum
pH’dÕr.
H+
iyonu
konsantrasyonundaki de÷iúme özellikle aktif merkezinde asidik veya
bazik gruplar taúÕyan enzimler, hidrolazlar için çok önemlidir ve enzimin
aktivite gösterdi÷i pH skalasÕ da oldukça dardÕr (Telefoncu, 1986).
ønvertazlarÕn optimum pH de÷erleri kullanÕlan enzim kayna÷Õna,
substrat, inkübasyon zamanÕ ve sÕcaklÕ÷Õna göre oldukça geniú bir
36
aralÕkta farklÕlÕk göstermektedir. BazÕ invertazlar iki optimum pH piki
verirken ço÷u tek bir optimum piki verir.
ønvertazlarÕn ço÷u oldukça geniú bir pH aralÕ÷Õnda (pH 2.0–9.0)
kararlÕdÕr. Vakular invertazlar pH 5.0–5.5, ekstraselüler invertazlar pH
3.5–5.0 ve alkali invertazlar ise pH 6.8–8.0 arasÕnda pH optimumu
verirler.
Aúa÷Õda çeúitli invertazlarla yapÕlan çalÕúmalar sonucu elde edilen
optimum pH ve pH kararlÕlÕk verileri sunulmuútur. ønvertaz aktivitesine
pH’nÕn etkisinin anlaúÕlmasÕ, bu pH etkisinin enzim kayna÷Õ ve substrata
göre de÷iúiminin incelenmesi açÕsÕndan oldukça önemlidir.
Daucus carota invertazlarÕndan nötral invertazÕ pH 4.8–8.0
aralÕ÷Õnda, alkali invertazÕ ise pH 7–9 aralÕ÷Õnda geniú bir optimuma
sahiptir (Lee and Sturm, 1996).
Lilium auratum invertazlarÕndan invertaz-1 pH 3-5.4 aralÕ÷Õnda,
invertaz-2 ise pH 4.8-7.4 gibi oldukça yaygÕn bir aralÕkta kararlÕdÕr.
ønvertaz-1 ve invertaz-2 enzimlerinin optimum pH’Õ ise sÕrasÕyla pH 4.0
ve pH 5.4 olarak belirlenmiútir (Signh and Knox, 1985).
Lycopersicon esculentum invertazlarÕndan sükrozun hidrolizini
katalizleyen formu pH 3.6’de optimum gösterirken pH 2.7–5.7 gibi
oldukça yaygÕn bir aralÕkta kararlÕdÕr. Rafinozun hidrolizini
gerçekleútiren di÷er formu ise pH 5.1’de optimum gösterirken pH 3.7-5.5
aralÕ÷Õnda oldukça kararlÕdÕr (Nakagawa et al., 1971).
Thermotoga maritima invertazÕnÕn optimum pH’sÕ rafinoz, inulin
ve sükroz için pH 5.5 olarak bulunmuútur. pH 4.2-7.1 aralÕ÷Õnda ise
37
baúlangÕç aktivitesinin en az % 50’sinden fazlasÕnÕ göstermektedir (Liebl
et al., 1998).
Çeúitli invertazlarÕn optimum pH de÷erleri Çizelge 1.5’de
verilmiútir.
1.1.5.4 ønvertaz aktivitesine çeúitli kimyasallar ve inhibitörlerin
etkisi
ønhibitörler enzimatik reaksiyonun hÕzÕnÕ azaltan maddelerdir.
Enzimatik reaksiyonlarÕn inhibisyonu incelendi÷inde oldukça önemli
bilgiler edinilebilmektedir. ønhibisyon yaratan maddelerin etki úeklinin
belirlenmesi, söz konusu enzimlerin metabolizmadaki önemlerini
aydÕnlatabilmek için inhibisyon çalÕúmalarÕna gerek duyulmaktadÕr. BazÕ
durumlarda inhibitörlerin yararlarÕ da göz ardÕ edilemez bir gerçektir.
Birçok enzim için spesifik inhibitörler üretilir ve bu inhibitörler
kontaminasyona neden olan, ana enzim preparatÕndan ayrÕlmasÕ güç veya
imkansÕz olan enzim aktivitelerinin ortadan kaldÕrÕlmasÕnda kullanÕlÕr
(Telefoncu, 1986).
ønvertazlarla yapÕlan inhibisyon çalÕúmalarÕnda kullanÕlan
inhibitörler genel olarak üç sÕnÕf altÕnda toplanmÕútÕr. Bunlar; grup
spesifik reaktifler, metal iyonlarÕ ve úekerler ile bu úekerlerin türevleridir.
Grup spesifik reaktiflerden sülfidril reaktifleri (örne÷in; pkloromerküribenzoat, N-etil maleimid ve iyodoasetamid) en çok
kullanÕlan inhibitörlerdir. ønhibitör olarak çok çeúitli metal iyonlarÕ da
(örne÷in; Ag+, Cu+2, Hg+2, Mg+2, Ni+2, Ba+2 gibi) kullanÕlarak
invertazlarÕn
inhibisyonu
incelenmiútir.
Nicotiana glauca
Zymomonas mobilis
Thermotoga maritima
Lactobacillus reuteri CRL1100
Pseudomonas fluorescens
Glycine max
Lilium auratum
Ricinus communis
Lycopersicon esculentum
Beta vulgaris
Bambusa eduli
Saccharomyces cerevisiae
Candida utilis
ønvertaz Kayna÷Õ
38
Vakular invertaz
S-Formu
F-Formu
Alkali invertaz
øzoenzim IT I
øzoenzim IT II
ønvertaz
ȕ-FFase-E
ȕ -FFase L
ønvertaz
ønvertaz
Alkali invertaz
ønvertaz-1
ønvertaz-2
ønvertaz
ønvertaz
Sükroz
Rafinoz
ønulin
Sükroz
Sükroz
Rafinoz
ønulin
Sükroz
Sükroz
Rafinoz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
Sükroz
3.8
6.5
8.0
4.0
7.5
3.5 ve 5.5
3.6
5.1
6.0
6.5
7.0
4.0
5.4
5.5
4.5
4.4
Rojo et al., 1998
Ait-Abdelkader et al., 2000
Liebl et al., 1998
Gines et al., 2000
Bugbee, 1984
Chen and Black, 1992
Signh and Knox, 1985
Prado et al., 1985
Nakagawa et al., 1971
Masuda et al., 1987
Liu et al., 2006
Gascón et al., 1968
Belcarz et al., 2002
Substrat Optimum pH Referans
Çizelge 1.5 BazÕ invertazlarÕn optimum pH de÷erleri
Asit invertaz
lbbetafruct2
lbbetafruct3
AIV I
AIV II
Ipomoea batatas
Pyrus pyrifolia
Sitoplazmik invertaz
ønvertaz I
ønvertaz II
ønvertaz
Nicotiana tabacum
Bifidobacterium lactis
Avena sativa
ønvertaz Kayna÷Õ
Sükroz
Rafinoz
Stakiyöz
Sükroz
Levan
Raftiloz
Sükroz
Melibioz
Rafinoz
Trehaloz
Sükroz
Selobiyoz
Maltoz
Laktoz
ønulin
Rafinoz
Stakiyöz
Sükroz
Stakiyöz
Rafinoz
Substrat
4.5
5.0
4.0
6.0
4.3
5.0
Optimum pH
Hashizume et al., 2003
Wang et al., 2005
Nakamura et al., 1988
Janer et al., 2004
Pressey and Avants, 1980
Referans
39
40
Son grup olarak úekerler ve úeker türevleri de invertazlarÕn inhibisyon
çalÕúmalarÕnda kullanÕlan önemli bir sÕnÕftÕr. ønvertazlarÕn en önemli, en
güçlü ve kompetitif inhibitörü olan fruktozun yapÕsal analoglarÕ (2,5anhidro-D-mannoz, 2,5-dideoksi-2,5-imino-D-mannitol) da invertaz için
inhibitör etkisi göstermektedir (ùekil 1.12) (Workman and Day, 1983,
Legler et al., 1993).
ùekil 1.12 Fruktozun yapÕsal analoglarÕ
Metal iyonlarÕnÕn invertaz aktivitesi üzerine etkisinin incelendi÷i
çalÕúmalarda metal iyonlarÕnÕn hangi tipte bir inhibisyon oluúturdu÷u
belirlenmiútir. Örne÷in; Saccharomyces cerevisiae invertazÕ K2PtCl3 ile
nonkompetitif olarak inhibe edilmektedir (Baseer and Shall, 1971).
Lycopersicon esculentum (domates) invertazÕ Ag+ ve Cu+2 iyonlarÕ
ve p-merküribenzoat (PCMB) ile önemli oranda bir inhibisyona
u÷ramaktadÕr (Nakagawa et al., 1971). Phytophthora megasperma
invertazÕ da 0.1 ve 1 mM Ag+ iyonu ile sÕrasÕyla aktivitesinin % 62 ve %
41
89’unu, 0.1 ve 1 mM Hg+2 iyonu ile de sÕrasÕyla aktivitesini % 44 ve %
96’sÕnÕ kaybederken, 0.1 mM p-merküribenzoat ile tamamen inhibe
olmaktadÕr. Bu sonuçlar do÷rultusunda Phytophthora megasperma
invertazÕnÕn yapÕsÕnda sülfidril grubu içerdi÷i ama bu sülfidril gruplarÕnÕn
aktivite için zorunlu olmadÕ÷Õ belirtilmiútir (West et al., 1980). Bambusa
edulis invertazÕnÕn IT I ve IT II izoformlarÕ Mg+2 ile etkilenmezken, Hg+2
ile çok yüksek bir oranda inhibe olmaktadÕrlar. IT I aktivitesinin 5 mM
pirodoksin, 0.5 mM p-merküribenzoat ve 15.0 mM anilin ile sÕrasÕyla %
48, % 62 ve % 66’sÕnÕn inhibe edildi÷i belirlenmiú ve bunun aktif
merkezinde sistein, asidik ve bazik aminoasitlerin varlÕ÷Õna iúaret etti÷i
ifade edilmiútir. IT II aktivitesi ise 5 mM iyodoasetamid, 15.0 mM anilin,
0.5 mM fenilmetilsilfonil florid, 5 mM pirodoksin ve 0.5 mM pmerküribenzoat ile sÕrasÕyla % 44, % 48, % 60, % 75 ve % 86’sÕnÕn
inhibe edildi÷i belirlenmiú ve bununda aktif merkezinde sistein, asidik ve
bazik aminoasitler ile serin ve tirozinin varlÕ÷Õna iúaret etti÷i ifade
edilmiútir (Liu et al., 2006). Tropaeolum majus invertazÕ úekerlerden
fruktoz, glukoz, turanoz ve maltoz ile kuvvetlice inhibe olurken
selobiyoz, galaktoz, laktoz, melezitoz, melibioz ve trehaloz ise çok zayÕf
bir etki yaratmaktadÕr (Isla et al., 1988). Daucus carota nötral ve alkali
invertazlarÕnÕn Hg+2 ile inhibe olmadÕ÷Õ belirlenmiú ve enzim aktif
merkezinde sülfidril grubunun olmadÕ÷Õ sonucuna varÕlmÕútÕr. Daucus
carota invertazÕnÕn her iki formu da fruktoz ile kompetitif tipte inhibe
olurken, glukoz ile yaratÕlan inhibisyon tipinin ise nonkompetitif tip
oldu÷u belirlenmiútir (Lee and Sturm, 1996).
Çizelge 1.6, çeúitli kaynaklara ait invertazlarÕ kuvvetli bir úekilde
inhibe eden inhibitörler ve bu inhibitörlerin enzim aktivitesine etkisi
verilmiútir.
reuteri CRL 1100
Lactobacillus
megasperma
Phytophthora
Avena sativa
ønvertaz Kayna÷Õ
42
0.002
0.004
PCMB
I2
Cd+2
Cu
1
1
10
ȕ-merkapto etanol
+2
10
34
10
5
0
0
4
1
0.1
56
11
38
0
79
45
0
Ba÷Õl Aktivite
(%)
0.01
DTT
PCMB
Hg+2
1
0.01
0.002
Hg+2
Ag
0.02
Ag+
+
ønhibitör
Konsantrasyonu (mM)
ønhibitör
Çizelge 1.6 Çeúitli inhibitörlerin invertaz aktivitesine etkisi.
2000
Ginés et al.,
1980
West et al.,
1980
Pressey and Avants,
Referans
ochraceus
Aspergillus
Tropaeolum
majus
edulis (IT II)
Bambusa
ønvertaz Kayna÷Õ
Hg
NEM
PCMB
+2
Cu
Fruktoz
Glukoz
Sükroz
PCMB
øyodoasetamid
Turanoz
Maltoz
Selobiyoz
Galaktoz
Laktoz
Melibioz
Trehaloz
Cd-asetat
1
10
10
1
2.5
2.5
1000
0.5
5
20
80
40
50
40
40
50
10
5
Ca+2
+2
ønhibitör
Konsantrasyonu (mM)
ønhibitör
0
0
10
15
30
28
62
14
56
0
60
78
90
83
87
77
50
16
Ba÷Õl Aktivite (%)
2001
Ghosh et al.,
Isla et al.,
1998
2006
Liu et al.,
Referans
43
44
1.1.6 ønvertazlarÕn fizyolojik önemi ve uygulama alanlarÕ
Bitkilerin en önemli özelliklerinden bir tanesi karbondioksidi,
güneú ÕúÕ÷Õ ve su varlÕ÷Õnda karbohidratlara indirgemesi ve özümlenen
karbonun bitkinin fotosentetik olmayan dokularÕna (kök, yumru, tohum
gibi) taúÕnmasÕdÕr. Pek çok bitkide taúÕnan karbohidrat sükrozdur.
Fizyolojik aktivite ve heterotrofik dokularÕn biyokimyasal ihtiyaçlarÕna
göre sükroz sinyal molekül olarak çeúitli yollar boyunca heterotrofik
dokulara yöneltilir. Enerji ihtiyacÕ için glikoliz veya sitrat çevrimine
girerek ATP ve NADH üretilmesini sa÷lar veya hücre büyümesi ve
geliúmesi için gerekli olan primer metabolitlerin biyosentezi için karbon
kayna÷Õ olarak kullanÕlÕr. Sükroz, uzun süreli depo amacÕyla niúasta,
triaçilgliseridler veya polipeptitler gibi polimerlere veya bitkinin, biotik
ve abiyotik stres faktörlerine karúÕ mücadele edebilmesi için sekonder
metabolitlere dönüútürülür. Sükroz ayrÕca çiçekli bitkilerin % 15’inde
bulunan fruktoz polimerleri olan fruktanlarÕn sentezinde baúlangÕç
moleküldür. Bitkiler bu iúlemleri gerçekleútirebilmek için etkili ve kesin
kontrol mekanizmalarÕna ihtiyaç duymaktadÕr (Sturm, 1999). Bu sebeple
sükrozu karbon ve enerji kayna÷Õ olarak kullanabilmek için Į1-ȕ2glikozidik ba÷Õn yÕkÕlmasÕ gerekmektedir. Bu reaksiyon ise bitkilerde iki
farklÕ enzim tarafÕndan katalizlenmektedir; invertaz (EC 3.2.1.26) ve
sükroz sentaz (EC 2.4.1.13). ønvertaz geri dönüúümü olmayan katalitik
bir reaksiyonla sükrozu glukoz ve fruktoza dönüútürür. Sükroz sentaz ise
geri dönüúümlü bir reaksiyon ile ba÷ enerjisini koruyarak glikozil artÕ÷ÕnÕ
uridin difosfata (UDP) transfer ederek sükrozu UDP-glukoz ve fruktoza
dönüútürür (Roitsch and González, 2004). ønvertazlar tercihan sükrozu
hidrolizler fakat ayni zamanda 1-kestoz, rafinoz ve stakiyöz gibi donör
substratlarÕn degradasyonunu da katalizler. ønulin veya levan gibi uzun
fruktanlara karúÕ ilgisi düúük olmasÕna ra÷men invertazlarÕn aktivite
45
gösterdi÷i belirtilmiútir. ønvertazlar bitkilerde karbohidrat transportu ve
katalizi, stres cevabÕ gibi hücresel proseslerde ve hücre farklÕlaúmasÕ ile
bitkinin büyümesinde hayati bir rol oynamaktadÕr. ønvertazlarÕn gen
ekspresyon seviyeleri ise patojen enfeksiyonu ve yaralanmalara karúÕ
ayarlanmaktadÕr (Lammens, W. et al., 2007).
Glikozidazlar, hem hidrolitik aktiviteleri nedeniyle glikozidik
ba÷larÕn hidrolizinde kullanÕlabilirler hem de transglikozilasyon
aktiviteleri nedeniyle karbohidrat yapÕlarÕnÕ çeúitli bileúiklerin hidroksil
gruplarÕna transfer edebilirler. GlikozidazlarÕn bu transglikolizasyon
aktivitesi çeúitli oligosakkaritlerin enzimatik sentezinde kullanÕlabilir
(Yanahira et al., 1998). ønvertazlar ortamdaki sükroz konsantrasyonu %
10 (w/v)’dan düúük oldu÷u durumda sükrozu, glukoz ve fruktoza
hidrolizler. Ancak bazÕ invertazlar ortamdaki sükroz konsantrasyonu %
10 (w/v)’dan yüksek oldu÷unda transfruktozilleme aktivitesi göstererek
fruktooligosakkaritlerin (FOS) sentezini katalizlemektedir. Bitkilerden ve
mikroorganizmalardan elde edilen ȕ-D-fruktoziltransferaz enzimi de
(FTase, EC 2.4.1.9) ayni aktiviteye sahiptir (Rubio et al., 2002).
Fruktooligosakkaritler (FOS), fruktozil birimlerinin sükroz molekülünün
ȕ-2,1-pozisyonuna ba÷lanmasÕyla oluúurlar. Fruktooligosakkaritler
genellikle; (1F(1-ȕ-D-fruktofrunazidaz)n-1 sükroz; GFn, n=2-4)
nistoz (GF3) ve 1Ffruktofuranozil nistozdan (GF4) oluúan fruktooligomerlerdir (L’Hocine et
al., 2000). AyrÕca fruktooligosakkaritler, inulin polimerinin enzimatik
veya kimyasal yolla degradasyonu ile de üretilirler. Neo-úekerler olarak
da adlandÕrÕlan fruktooligosakkaritlerin üretimi, mükemmel biyolojik ve
iúlevsel özelliklere sahip olmasÕ, intestinal mikrofloranÕn geliútirilmesi,
konstipasyon (kabÕzlÕk) sorununu azaltmasÕ, serumdaki total kolesterol ve
lipidleri düúürmesi, hayvanlarÕn büyümesini sa÷lamasÕ ve düúük kalorili
karsinojen olmayan tatlandÕrÕcÕlar olarak kullanÕlmasÕndan, dolayÕ son
molekülleridir.
Örne÷in;
1-kestoz
(GF2),
46
yÕllarda dikkat çekici bir alan olmuútur (Nguyen et al., 2004). Bu kadar
önemli özelli÷inden dolayÕ, pek çok bilim insanÕ FOS üretimi için dünya
çapÕnda yeni teknolojilerin geliútirilmesini araútÕrmaktadÕr: geliúmiú daha
iyi prebiyotik ve fizyolojik özelliklere sahip yeni fruktooligosakkaritlerin
ve FOS sentezleyen yeni enzimlerin keúfedilmesi gibi.
Aspergillus sp 27H’dan izole edilen invertazÕn reaksiyon
koúullarÕnÕn modifiye edilmesi ile hem hidrolitik hem de
transfruktozilasyon aktivitesi gösterdi÷i belirtilmiútir. Düúük sükroz
konsantrasyonunda (10 g/dm3) sükrozu, glukoz ve fruktoza
hidrolizlerken,
yüksek
sükroz
konsantrasyonunda
(216
g/dm3)
transfruktozil aktivitesinin arttÕ÷Õ gözlenmiútir. pH’Õn 5.5, sÕcaklÕ÷Õn 40
C, sükroz konsantrasyonunun 615 g/dm3 ve enzim konsantrasyonunun
20 ȕ-fructofuranozidaz birimi/g sükroz oldu÷u koúullar altÕnda
fruktooligosakkarit miktarÕ maksimum de÷eri olan 376 g/dm3 (234 g/dm3
o
kistoz ve 142 g/dm3 nistoz) ulaúmaktadÕr. Bu de÷erlere göre Aspergillus
sp 27H’dan izole edilen invertazÕn FOS sentezinde ticari olarak
kullanÕlabilece÷i belirtilmektedir (Fernández et al., 2004).
Schwanniomyces occidentalis invertazÕ transfruktozil aktivitesine
sahip bir baúka ȕ-fruktofuranozidaz olup transfruktozilleme reaksiyonu
sonucu iki tane fruktooligosakkarit (FOS) üretti÷i belirtilmiútir (ùekil
1.13). 1H, 13C ve 2D-NMR teknikleri sonucunda en fazla üretti÷i
ürününün prebiyotik trisakkarit olan 6-kestoz oldu÷u bulunmuútur. Bu
invertazÕn 6-kestoz üretim veriminin, bugüne kadar belirtilen di÷er 6kestoz üreten enzimlerin verimlerinden daha fazla oldu÷u tespit
edilmiútir (Benito et al., 2007).
47
ùekil 1.13 Schwanniomyces occidentalis invertazÕnÕn transfruktozilleme
reaksiyonu
Arthrobacter
globiformis’den
saflaútÕrÕlan
invertazÕn
transfruktozilleme reaksiyonuyla, sükroz donör, selobiyoz veya selotrioz
ise akseptör olarak kullanÕlarak, iki tane yeni indirgen olmayan
oligosakkarit sentezlenmiútir (ùekil 1.14). YapÕlan spektrometrik
analizler sonucunda O-ȕ-D-glukopiranozil-(1ĺ4)-Į-D-glukopiranozil(1ĺ2)-Į,ȕ-D-fruktofuranozid ve O-ȕ-D-glukopiranozil(1ĺ4)-ȕ-Dglukopiranozil-(1ĺ4)-Į-D-glukopiranozil-(1ĺ2)-Į, ȕ-D-fruktofuranozid
olarak tanÕmlanmÕútÕr. Her iki oligosakkaritin 100oC’de 30 dk boyunca
kararlÕ oldu÷u ve pH 2’de degradasyona u÷ramadÕ÷Õ belirtilmiútir. Bu
özellikleri nedeniyle bu oligosakkaritlerin, gÕda ve farmasötik alanda
meydana gelen Maillard reaksiyonlarÕnÕ engellemek için kullanÕlabilece÷i
belirtilmiútir (Win et al., 2004).
48
ùekil 1.14 Arthrobacter globiformis invertazÕnÕn transfruktozilleme reaksiyonu
uygulama alanÕ bulmuú enzimlerdir. ùeker endüstrisinde invertazlar, bir
disakkarit olan sukrozu glukoz ve fruktoza hidrolize eder. Sukroz
polarize ÕúÕk düzlemini sa÷a (+66.5, dekstrorotatori), hidroliz sonucu
meydana gelen úeker karÕúÕmÕ ise polarize ÕúÕk düzlemini sola (-33.3,
levorotatori) çevirir. Bu nedenle, bu iúlem inversiyon, hidroliz ürünü de
invert úeker olarak adlandÕrÕlÕr. Sukrozun tatlÕlÕk derecesi 100 olarak
kabul edildi÷inde, invert úekeri oluúturan glukoz ve fruktozun tatlÕlÕk
dereceleri sÕrasÕyla 70 ve 180’dir. Bu nedenle invert úeker eúde÷er
miktardaki sukrozdan daha fazla tatlÕlÕk sa÷lar ve úekerli ürünlerin
49
hazÕrlanmasÕnda yaygÕn olarak kullanÕlÕr. ønvert úekerin di÷er bir
kullanÕm amacÕ da kristalizasyon kontrolüdür. Sukrozun hidrolizi sonucu
oluúan invert úekerdeki glukoz ve fruktozun sudaki toplam
çözünürlükleri sukrozun tek baúÕna çözünürlü÷ünden daha fazladÕr.
Kristalizasyonun azalmasÕnda sukroz konsantrasyonun azalmasÕ da
etkilidir. Bu sebeple úekerli ürünlerde invert úeker içeri÷i çok önemlidir.
Örne÷in; lokumda invert úeker içeri÷inin fazla olmasÕ lokum dilimlerinin
birbirine yapÕúmasÕna ve depolama sorunlarÕna, yetersiz olmasÕ ise
kristallenmeye ve pürüzlü yapÕya neden olmaktadÕr. ønversiyon çikolata
kaplÕ sÕvÕ veya krem dolgulu úekerlemelerin üretiminde de
kullanÕlmaktadÕr. KalÕplama ve kaplama iúlemleri dolgu kÕsÕm katÕ iken
yapÕlÕr. Daha sonra dolguya verilen invertaz enzimi sukrozu invert úekere
dönüútürür ve çözünürlükteki de÷iúimle dolguda yumuúama veya
sÕvÕlaúma görülür. ùeker endüstrisinde, kamÕú melasÕnÕn etanole
fermantasyonu, sÕ÷Õr yemlerinin ve invert úeker úuruplarÕnÕn
hazÕrlanmasÕ, likör, yapay bal ve dondurulmuú tatlÕ ve benzeri üretimlerin
yapÕlmasÕnda kullanÕlan biyoteknolojik proseslerde invertaz enzimleri
kullanÕlmaktadÕr (SaldamlÕ, 2005). Biyoteknolojik uygulama alanlarÕ
nedeniyle invertazlar oldukça önemli ve de÷erli bir enzim grubudur.
50
2.
SULU øKøLø FAZ SøSTEMø (ATPS)
Rekombinant proteinlerin ve enzimlerin üretimi için makul fiyata
yeterli saflaútÕrmayÕ gerçekleútiren teknolojilerin geliúmesine ihtiyaç
duyulmaktadÕr. Bu sebeple bilim insanlarÕ daha ekonomik protein
saflaútÕrma teknikleri geliútirmek için u÷raúmaktadÕrlar. Son elli yÕlda,
araútÕrmacÕlar protein geri kazanÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕ için sÕvÕ-sÕvÕ
ekstraksiyon sistemlerine ilgi duymaktadÕrlar. Normalde sÕvÕ-sÕvÕ
ekstraksiyonu organik çözgenlerin kullanÕmÕnÕ içermektedir. Ancak
proteinler organik çözgenlerde çözünememekte ve denaturasyona
u÷ramaktadÕr. SÕvÕ-sÕvÕ ikili faz sistemleri iki polimer veya polimer / tuz
çözeltileri kullanÕlarak da oluúturulabilmektedir. Bu olgu ilk kez 1896
yÕlÕnda Beijerinck tarafÕndan agar ve niúasta veya jelatinin
karÕútÕrÕlmasÕyla oluúan ikili fazÕ gözlemlemesi ile tanÕmlamÕútÕr. Bu ikili
sistemler, sulu ikili faz sistemi olarak isimlendirilmiú ve ilk kez 1956
yÕlÕnda Albertsson tarafÕndan biyomoleküllerin geri kazanÕmÕnda
uygulanmÕútÕr. Albertsson bu çalÕúmalarÕ ile mikroorganizmalarÕn, hücre
duvarlarÕnÕn, kloroplast ve di÷er biyolojik moleküllerin fazlar arasÕnda
seçimli olarak da÷ÕldÕ÷ÕnÕ ortaya koymuútur. Daha sonraki çalÕúmalarÕnda
ise farklÕ polimerlerin konsantrasyonlarÕnÕn ve molekül a÷ÕrlÕklarÕnÕn
etkilerini inceleyerek birkaç farklÕ sistemin faz diyagramlarÕnÕ
oluúturmuútur. Chlorella ve Aerobacter türlerinin hücre duvarlarÕnÕn
izolasyonunu
bu
sistemleri
kullanarak
gerçekleútirmiútir
(Balasubramaniam, 2003).
Sulu ikili faz sistemleri (Aqueous Two Phase Systems: ATPS)
biyolojik moleküllerin (örne÷in; protein, hücre, organel ve biyolojik
membranlar) ekstraksiyonu ve saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan seçimli ve
etkin bir metoddur. Genellikle yapÕsal olarak farklÕ ve hidrofilik
51
polimerlerin (polietilen glikol (PEG) ve dekstran) ya da bir polimer ile
inorganik tuzun (sülfat, fosfat, sitrat vb.) oluúturdu÷u polimer-polimer
veya
polimer-tuz
sistemleridir.
Bu
komponentlerin
kritik
konsantrasyonlarÕ üzerinde kendili÷inden ikili faz oluúur. Polimerpolimer sisteminde her bir faz kendisini oluúturan polimerce zengindir.
Polimer-tuz sisteminde ise fazlardan bir tanesi sistemi oluúturan
polimerce, di÷er faz ise tuzca zengindir. PEG / Dekstran sistemleri küçük
ölçekte makromoleküllerin, membranlarÕn, hücre partiküllerinin ya da
hücrelerin ayrÕlmasÕnda kullanÕlÕrken PEG / Tuz sistemleri daha çok
büyük ölçekteki ekstraksiyonlarda kullanÕlÕrlar. PEG / Tuz sistemleri,
PEG / Dekstran sistemlerine göre daha düúük viskozite ve maliyete sahip
olduklarÕndan daha avantajlÕdÕrlar. Her iki sistemde biyouyumludur ve
% 70–90 gibi oldukça yüksek su içeri÷inden dolayÕ biyomoleküller için
toksik olmayan ÕlÕmlÕ bir çevre oluúturmaktadÕr. AyrÕca polimerlerin
protein ve enzim aktivitesi ve yapÕsÕna stabilize edici etkileri vardÕr. Sulu
ikili faz sistemlerinin bilinen ayÕrma ve saflaútÕrma tekniklerine
(kromatografi, filtrasyon, santrifüjleme ve elektroforez) göre bazÕ
avantajlarÕ vardÕr. Sulu ikili faz ayÕrma tekni÷i özellikle tek adÕmda
saflaútÕrma için uygundur. Bir adÕmdan oluúan bir iúlemle istenilen
proteinin deriútirilmesi ve saflaútÕrmasÕnÕ gerçekleútirebilmektedir. Sulu
ikili faz sisteminin bir baúka üstünlü÷ü ise ölçek büyütmenin kolayca
mümkün olmasÕdÕr. Yöntemin di÷er avantajlarÕ ise; ara yüzey geriliminin
düúük olmasÕ nedeniyle biyomoleküllerin degradasyonunu minimize
etmesi, proses zamanÕ ve enerji tüketiminin düúük olmasÕ, yüksek
rezolusyon ve verimlilikte ayÕrÕmÕn gerçekleútiriliebilmesi ve maliyetin
düúük olmasÕ olarak sÕralanabilir (Yue et al., 2007; Negrete et al., 2007).
Faz sisteminin ve moleküllerin genel karakteristik özellikleri ve
ortamdaki etkileúimlerine ba÷lÕ olarak moleküller iki faz arasÕnda seçimli
olarak da÷ÕlÕrlar. Fazlar arasÕnda küçük moleküller tarafsÕzca da÷ÕlÕrken,
52
makromoleküllerin da÷ÕlÕmÕ de÷iúkendir. Pek çok bilim adamÕ
proteinlerin neye göre da÷ÕldÕ÷ÕnÕ modelleme yapmaya çalÕúmÕúsa da bu
çok güçtür. Bu sebeple yol gösterecek geniú kapsamlÕ bir teori veya
kuram yoktur. Biyomoleküllerin fazlara da÷ÕlÕmÕnÕ açÕklamak için
genellikle sistematik araútÕrma yapmak gerekmektedir. Da÷ÕlÕmÕ
etkileyen faktörlerin belirlenmesi ve bu faktörlerden lehte olanlarla bir
veya daha fazla set varyasyonlar oluúturularak en iyi ayrÕmÕ veren koúul
elde edilmeye çalÕúÕlmaktadÕr.
Sulu ikili faz sistemi iki adÕmdan oluúan bir iúlemdir. ølk adÕm
dengeleme ve son adÕmda faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúmesidir. Dengeleme;
sistemi oluúturan komponentlerin (protein ekstraktÕ, polimer ve tuz) ilave
edilmesi ve karÕútÕrÕlmasÕ ile iki fazÕn kendili÷inden dengeye gelmesi için
dispersiyonunu içerir. Dengeleme adÕmÕ ço÷u zaman hÕzlÕ bir prosestir
(25oC ’de 2–3 dk hafif vorteksleme ve 15 dk bekletme). Faz ayrÕmÕ adÕmÕ
ise, iki faz arasÕndaki ayrÕmÕn belirgin olma aúamasÕdÕr. Fazlar arasÕndaki
yo÷unluk ve viskoziteleri arasÕndaki küçük farklanmalardan dolayÕ birkaç
dakikadan birkaç saate kadar de÷iúen aralÕklarda santrifüj iúleminin yer
aldÕ÷Õ operasyon basama÷ÕdÕr (4000 rpm *10 dk).
2.1
Faz DiyagramlarÕ
Faz diyagramlarÕ, sulu ikili faz sistemleri için muhtemel çalÕúma
alanlarÕnÕ ifade etmektedir. Bu nedenle faz diyagramlarÕ belirtilen
sÕcaklÕk, pH ve tuz konsantrasyonu gibi koúullar altÕnda her bir sulu ikili
faz sisteminin oluúmasÕ için ayÕrÕcÕ bir özelliktedir (ùekil 2.1). Faz
diyagramlarÕ, sulu ikili faz sistemi oluúturmak için gerekli olan faz
oluúturucu komponentlerin (PEG ve tuz gibi) konsantrasyonlarÕ, alt ve
53
üst fazlardaki di÷er faz komponentlerinin konsantrasyonu ve faz
hacimlerinin oranlarÕ hakkÕnda bilgi edinmeyi sa÷lar.
ùekil 2.1 Faz diyagramÕ
Faz diyagramÕ binodiyal e÷ri ve “tie-line” diye adlandÕrÕlan özel
ba÷lantÕlÕ hatlar içermektedir. Binodiyal e÷ri, faz diyagram bölgesini
ikiye bölmektedir. E÷rinin üstündeki bölgede birbiri içerisinde karÕúmaz
iki sulu fazÕn meydana geldi÷ini, e÷ride ve e÷rinin altÕndaki bölgede ise
tek fazÕn oluútu÷unu belirtmektedir. OlmasÕ muhtemel tüm sulu ikili faz
sistemleri binodiyal e÷ri üzerinde birbiri ile ba÷lantÕlÕ iki nod arasÕnda
çizilen
ve
“tie-line”
olarak
adlandÕrÕlan
hatlar
üzerinde
koordinatlandÕrÕlmÕútÕr. Tie-line hatlarÕ, alt ve üst fazdaki
kompononentlerin olmasÕ gereken en son konsantrasyonlarÕnÕ
göstermektedir (T ve B). Ayni tie-line hatlarÕnÕn koordinatlarÕ üzerinde
54
gidildi÷inde alt ve üst fazdaki kompononentlerin son konsantrasyonlarÕ
de÷iúmezken, sistemlerin total kompozisyonlarÕ ve faz hacimleri farklanÕr
(A1, A2 ve A3). Binodiyal e÷ri ve üzerinde her iki fazÕn total
kompozisyonu ile hacimlerinin eúit oldu÷u noktalara “kritik nokta (Cp)”
denilmektedir. Kritik nokta tie-line hattÕnÕn orta noktalarÕnÕn ekstrapole
edilmesi ile belirlenmektedir (Hatti-Kaul, 2000).
2.1.1
Binodiyal e÷ri
Sulu ikili faz teknolojisinde hazÕrlÕk aúamalarÕnda kullanÕlmak
üzere binodiyal e÷ri oluúturmak için sistem parametrelerinin seçilmesi
gerekir. Ancak PEG / Dekstran ve PEG / Tuz sistemleri için de÷iúen PEG
molekül kütlelerinde faz diyagramlarÕ yayÕnlanmÕútÕr. Bu metodlardan bir
tanesi ile polimer / polimer veya polimer / tuz sistemleri için binodiyal
e÷ri geliútirilebilmektedir. Binodiyal e÷ri oluúturmak için iki metot;
turbidometrik titrasyon metodu (1) ve “cloud-point metodu” (2)
mevcuttur (ùekil 2.2).
Turbidometrik titrasyon metodu (1) en hÕzlÕ ve yaygÕn olan
metottur. Bu metot ile bilinen total kompozisyon ve kütledeki faz
komponentleri karÕútÕrÕlarak hazÕrlanan bulanÕk sistem serileri, su veya
di÷er çözgenler ile karÕúÕm açÕk ve tek bir faz oluúuncaya kadar
seyreltilir. BulanÕklÕktan berraklÕ÷a geçiú olan noktada faz kompozisyonu
hesaplanÕr ve e÷ride iúaretlenir. Cloud-point metodu (2) da ayni prensibe
dayanmaktadÕr. Konsantrasyonu bilinen polimer çözeltisi bir test tüpüne
konulur. Daha sonra konsantrasyonu bilinen ikinci bir polimer ya da tuz
çözeltisi test tüpüne damla damla ilave edilir ve karÕútÕrÕlÕr.
55
ùekil 2.2 Turbidometrik titrasyon ve “cloud-point” metotlarÕ
ølk baúlarda karÕúÕm berraktÕr ancak ilave edilen ikinci çözeltinin belirli
bir de÷erin üzerine çÕkmaya baúlandÕ÷Õ kritik noktadan (cloud-point)
itibaren karÕúÕm bulanÕklaúmaya ve iki faza ayrÕlmaya baúlar. Bu
karÕúÕmÕn kütlesi hesaplanÕr ve oluúan ikili fazÕn kompozisyonu
hesaplanÕr ve e÷ride iúaretlenir. Bu karÕúÕm tekrar seyreltilir ve prosedür
tekrarlanÕr. Bu metodlar Dekstran / metilselüloz sistemi gibi polidispers
polimerler ile çalÕúÕldÕ÷Õnda hatalÕ sonuçlar vermektedir (Hatti-Kaul,
2000).
56
2.1.2
Tie-line hatlarÕ
Tie-line hatlarÕnÕn uzunluklarÕnÕn birimi komponentlerin
konsantrasyonlarÕ gibi % w/w ile ifade edilir. Tie-line hatlarÕnÕn
uzunlu÷u ve fazlarÕn kütlesi aúa÷Õdaki denklem ile ba÷lantÕlÕdÕr;
Vüst ȡüst / Valt ȡalt= DF / ED
“V” ve “ȡ” ifadeleri üst ve alt fazlarÕn sÕrasÕyla hacim ve yo÷unluklarÕnÕ
ve DF ile DE ise gösterilen tie-line hatlarÕnÕn uzunluklarÕnÕ ifade
etmektedir (ùekil 2.3). Tie-line hatlarÕ genellikle paraleldir bu sebeple
tie-line hattÕnÕn e÷imi di÷erlerinin çizilmesinde kullanÕlmaktadÕr. Faz
kompozisyonlarÕ analizi ve her bir fazdaki polimer ve tuz
konsantrasyonlarÕnÕn belirlenmesi boyut dÕúlamalÕ kromatografi,
gravimetrik analiz, refraktif indeks ölçümü, optik rotasyon ve iletkenlik
ölçümleri ile kullanÕlarak yapÕlmaktadÕr.
ùekil 2.3 Tie-line hatlarÕ
57
Faz diyagramlarÕ ayrÕca istenilen seviyede saflaútÕrma yapabilmek
için optimum sistem kompozisyonlarÕnÕn belirlenmesini sa÷lamaktadÕr.
Protein saflaútÕrmak için en uygun sulu ikili faz sistemini seçmek için
hedeflenen proteinin selektivitesinin di÷er proteinlerden yüksek olmasÕ
gerekmektedir. Selektivite (Į) aúa÷Õdaki formulle;
Į =KP / KC
ifade edilmektedir. KP, hedeflenen proteinin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ iken KC
di÷er proteinlerin da÷ÕlÕm katsayÕsÕdÕr.
Ayni tie-line hattÕ üzerinde proteinlerin da÷ÕlÕm katsayÕlarÕ ayni
kaldÕ÷Õndan istenilen proteinin seçimlili÷i de belirli bir tie-line hattÕ
üzerinde iken tüm faz kompozisyonlarÕnda sabittir. Sabit bir seçimlili÷iin
önemi saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin saflaútÕrma faktörünün faz
oranlarÕnÕn çeúitlendirilmesi ile iyileútirilmesini sa÷lamasÕdÕr. Faz oranÕ;
Faz OranÕ = Üst Faz Kütlesi / Alt Faz Kütlesi = DF / ED
úeklinde ifade edilmektedir. Düúük faz oranÕ yüksek saflaútÕrma faktörü
demektir. ED uzunlu÷undaki yükselme faz oranÕnÕ düúürmektedir. Faz
oranÕnÕn azalmasÕyla istenilen proteinin verimi de düúmektedir. Bu
nedenle, verim ve saflaútÕrma faktörü arasÕndaki dengeyi sa÷layan
optimum faz oranÕ seçilmelidir (Balasubramaniam, 2003).
2.2
Da÷Õlma KatsayÕsÕ (K)
Sulu ikili faz sisteminde moleküllerin fazlar arasÕndaki da÷ÕlÕmÕ
da÷Õlma katsayÕsÕ (K) ile:
58
K= Cüst / Calt
úeklinde karakterize edilir. Cüst ve Calt sÕrasÕyla üst ve alt fazdaki protein
konsantrasyonlarÕnÕ simgelemektedir. Da÷Õlma katsayÕsÕ fazlarÕn,
materyallerin ve sÕcaklÕ÷Õn özelliklerinin bir fonksiyonudur. Çözünen
konsantrasyonundan ve fazlarÕn hacim oranlarÕndan ba÷ÕmsÕzdÕr.
Proteinin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ belli bir tie-line hattÕndaki tüm sistemler için
sabittir. Da÷Õlma iúlemi pek çok faktör tarafÕndan etkilenmektedir. Uygun
bir da÷Õlma katsayÕsÕnÕ sa÷lamak için bu faktörlerin deneysel çalÕúma ile
optimize edilmesi gerekmektedir. Da÷Õlma katsayÕsÕ ve onu etkileyen
faktörler aúa÷Õdaki gibi birkaç terim ile birlikte logaritmik olarak ifade
edilebilmektedir:
ln K = ln Ko + ln Kelec + ln Khfob + ln Kbiosp + ln Kbüy + ln Kkonf + ….
Burada Kelec; proteinin net yükü, pH; iyon da÷ÕlÕmÕ ve polimerin yükü
tarafÕndan belirlenen elektrostatik etkileri, Khfob; hidrofobikli÷i, Kbiosp;
sistemin içinde bulunan ligandla olan afiniteye dayalÕ etkileúimleri, Kbüy;
protein ve polimerin büyüklü÷ünü, Kkonf; konformasyonal etkileri ve Ko
ise hesaba katÕlmayan di÷er faktörleri simgelemektedir. FarklÕ faktörler
her ne kadar da birbirlerinden bir nebze ba÷ÕmsÕz olsalar da, büyük bir
ihtimalle tamamen ba÷ÕmsÕz de÷ildirler. Örne÷in; faz oluúturan
polimerlerden birinde hidrofobik grubun ortaya çÕkmasÕ, iyonlarÕn
da÷ÕlÕmÕ ile elektrik potansiyelini biraz da olsa etkileyecektir (Hatti-Kaul,
2000).
59
2.3
Da÷Õlma MekanizmasÕ
Da÷ÕlmayÕ kontrol eden mekanizma genellikle bilinmemektedir.
Fazda yer alan partikül kendisini çevreleyen moleküllerle hidrojen ba÷Õ,
hidrofobik ve elektrostatik etkileúimler ve van der Waals gibi zayÕf
güçler oluúturarak etkileúim halindedir. Bu etkileúimlerin katkÕlarÕnÕ
tahmin etmek oldukça zordur ancak muhtemelen net etkileri iki fazda
farklÕ olmaktadÕr. Dengedeki bir sistemde, bir partikülün bir fazdan di÷er
faza hareketi için gerekli olan enerji (ǻE) ile da÷Õlma katsayÕsÕ arasÕndaki
iliúki;
C1 / C2 = eǻE/kT
olarak ifade edilir. C1 ve C2 sÕrasÕyla faz 1 ve faz 2 deki partiküllerin
konsantrasyonlarÕdÕr, “k” Boltzman sabiti ve “T” ise mutlak sÕcaklÕktÕr.
AçÕkça görülüyor ki, ǻE da÷Õlan partikülün büyüklü÷üne ba÷lÕ
olmaktadÕr. Yani ne kadar büyük olursa kendisini çevreleyen fazla
birlikte o kadar fazla atomla iliúkiye girecektir. Brønsted da÷Õlma ile ilgili
olarak aúa÷Õdaki eúitli÷i;
C1 / C2 = eȜM/kT
önermektedir. M moleküler a÷ÕrlÕk ve Ȝ ise moleküler a÷ÕrlÕk dÕúÕndaki
özelliklere ba÷lÕ faktördür. Küresel bir partikül için ise eúitlikte M yerine
partikülün yüzeysel alanÕ (A) ifade eden eúitli÷in;
C1 / C2 = eȜA/kT
60
dikkate alÕnmasÕnÕ gerekti÷ini belirtmektedir. Bu durumda Ȝ yüzeysel
alan dÕúÕndaki özelliklere ba÷lÕ faktörü göstermektedir. Yüzeysel
özellikler yüzey gerilim, birim alandaki yüzey serbest enerjisi ile ifade
edilmelidir. Bundan dolayÕ hem büyüklük hem de yüzey alanÕ özellikleri
da÷ÕlmayÕ belirlemede büyük öneme sahiptirler.
Ayni zamanda partikülün net yüküde (Z) da÷ÕlmayÕ
etkilemektedir. E÷er ki fazlar arasÕnda U1-U2 úeklinde bir elektrik
potansiyel farkÕ bulunuyorsa eúitlikte Z (U1-U2) enerji terimi de
olmalÕdÕr;
C1 / C2 = exp ((ȜA + Z (U1-U2)) / kT)
Eúitlikte Ȝ büyüklük ve net yük dÕúÕndaki faktörleri göstermektedir.
Böylelikle, da÷ÕlmayÕ etkileyen toplam etki büyüklük, hidrofobisite,
yüzeyin yükü ve partikülün ya da makromolekülün konformasyonu gibi
faktörlere bölünmektedir (Albertsson, 1986).
2.4
Protein Da÷ÕlÕmÕnÕ Etkileyen Parametreler
Proteinler, hücrelerin en geniú fraksiyonunu oluúturmaktadÕr.
Proteinler, katalitik aktiviteye sahip enzimler, yapÕsal komponentler veya
hücre içi ve/veya dÕúÕna spesifik sinyal veya madde taúÕnmasÕndan
sorumlu taúÕyÕcÕlar gibi çok yönlü özelli÷e sahip biyomoleküllerdir.
Proteinlerin fizikokimyasal özellikleri çok iyi bilinmektedir ve nükleik
asit, polisakkarit veya lipitlere göre daha kolay karakterize ve izole
edilebilmektedir.
61
Faz sisteminin ve moleküllerin genel karakteristik özelliklerine ve
ortamdaki etkileúimlerine ba÷lÕ olarak moleküller iki faz arasÕnda seçimli
olarak da÷ÕlÕrlar. Sistem komponentlerinin tipi, polimerin molekül
a÷ÕrlÕ÷Õ, pH, sistemde bulunan iyonlarÕn türü ve konsantrasyonu gibi
proteinlerin da÷ÕlmasÕnÕ etkileyen faktörler hakkÕnda çok geniú bilgi
mevcuttur. Proteinin kendi da÷ÕlÕmÕnÕ etkileyen özellikleri ise;
hidrofilik/hidrofobiklik karakteri ile yüküne etkiyen molekül kütlesi ve
yüzeyinde yer alan amino asit artÕklarÕdÕr. Ancak farklÕ sistemlerde, tüm
bu yüzey özelliklerinin proteinin da÷ÕlÕmÕna ne gibi katkÕda bulunaca÷Õna
dair çok az úey bilinmektedir (Berggren et al., 1999). Sulu ikili faz
sistemlerinde proteinlerin da÷ÕlmasÕnda sÕcaklÕk, pH, tuz türü ve
konsantrasyonu, polimer türü ve molekül a÷ÕrlÕ÷Õ gibi parametreler de
etkilidir.
PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕnÕ etkileyen
temel mekanizma úematik olarak ùekil 2.4’de gösterilmiútir. PEG / Tuz
sistemlerinde biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕ üst fazdaki polimerin “hacimsel
dÕúlama etkisi” ile alt fazÕ oluúturan tuz fazÕnÕn “salting-out” etkisine
ba÷lÕdÕr (ùekil 2.4a). Üst fazda polimer tarafÕndan iúgal edilen hacim
polimerin deriúiminin artmasÕ ile artmaktadÕr (ùekil 2.4b). Ancak
polimerin zincir uzunlu÷u veya molekül kütlesinin artmasÕ ile üst fazda
biyomoleküller için yeterince yer kalmayaca÷Õndan biyomoleküller alt
faza do÷ru da÷Õlma e÷iliminde olacaklardÕr (ùekil 2.4c). Bu etki
“hacimsel dÕúlama etkisi” olarak adlandÕrÕlmaktadÕr. Alt fazda
biyomoleküllerin çözünebilirli÷i tuz konsantrasyonun artmasÕ ile
azalmaktadÕr. Bunun sonucunda biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕ üst faza do÷ru
olmaktadÕr ve bu etki “salting-out etkisi” olarak adlandÕrÕlÕr (ùekil 2.4d).
Yüksek polimer konsantrasyonu ve molekül kütlesi ile yüksek tuz
konsantrasyonu içeren sulu ikili faz sisteminde ise biyomoleküllerin
62
da÷ÕlÕmÕ fazlarÕn ayrÕldÕ÷Õ kesitte birikimi ile sonuçlanÕr (ùekil 2.4e)
(Babu et al., 2007).
ùekil 2.4 PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷ÕlmasÕ
2.4.1
Polimer konsantrasyonu ve molekül kütlesinin etkisi
Polietilen glikol (PEG) ve dekstran ikili faz sistemlerinde en çok
kullanÕlan polimerlerdir. Her iki polimerde toksik etki göstermez ve bu
nedenle gÕda ve farmasötik uygulamalarda kullanÕlmaktadÕr. økili sulu faz
sistemlerinde çok sayÕda polimerle çalÕúÕlmÕútÕr; Dekstran / PEG,
Dekstran / Fikol, PEG / Fikol, PEG / Tuz sistemleri. Bu sistemlerle ilgili
faz diyagramlarÕ pek çok literatürde bulunmaktadÕr. Endüstriyel
uygulamalar için yüksek saflÕktaki dekstran oldukça pahalÕdÕr ve bu
63
nedenle bu uygulamalar için PEG/tuz sistemleri daha uygun proseslerdir
(Synder et al., 1992).
Genellikle polimer konsantrasyonunun artmasÕ ile proteinlerin
da÷ÕlÕmÕ tek taraflÕ olacaktÕr; bu da da÷Õlma katsayÕsÕnÕn birin yukarÕsÕna
çÕkmasÕ ya da birin altÕna düúmesi demektir. E÷er bir polimer türü
kendisinden daha düúük molekül kütleli polimer türü ile yer de÷iútirirse,
proteinlerin da÷ÕlÕmÕ polimeri içeren faza do÷ru olacaktÕr. Bu sebeple
genelde yüksek molekül kütleli ve düúük konsantrasyona sahip
polimerler tercih edilmektedir. Polimer konsantrasyonun artmasÕ ile
yo÷unluk, refraktif indeks ve fazlar arasÕndaki viskozite yükselecektir
(Albertsson, 1986).
Polietilen glikol (PEG) hidrofobik karaktere sahip bir polimerdir.
Bu nedenle molekül kütlesinin artmasÕ ile hidrofobik karakteri de
artacaktÕr (Vaidya et al., 2006). PEG’in molekül kütlesinin protein
da÷ÕlÕmÕna etkisi Flory Huggins teorisi temel alÕnarak açÕklanmaktadÕr.
PEG ve protein arasÕndaki tercihli iliúki PEG’in molekül kütlesindeki
artÕúÕn bir noktadan sonra proteini dÕúlamaya baúladÕ÷Õ andan itibaren
azalmaktadÕr. Bu dÕúlama etkisi ile proteinler tuz fazÕna do÷ru yönelirler.
Bu nedenle yüksek molekül kütlesine sahip PEG türleri, protein
saflaútÕrÕlmasÕnda saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin verimini
düúürece÷inden pek tercih edilmezler (Klomklao et al., 2005). Düúük
moleküler kütleye sahip PEG türleri ise neredeyse sistemdeki tüm
proteinleri üst faza çekecektir. Bunun sonucunda ise kontamine
proteinlerden dolayÕ çok etkisiz bir ayÕrma ve saflaútÕrma meydana
gelecektir. Bu yüzden genellikle orta dereceli PEG molekül kütleleri
tercih edilmektedir. PEG’in hidrofobik karakteri artÕkça hidrofobik
karakterdeki proteinlerde üst faza daha kuvvetli gitme e÷ilimindedir.
64
Ancak seçimli bir ayrÕm ve saflaútÕrma iúlemi için optimum bir PEG
konsantrasyonu ve molekül kütlesi seçilmelidir (Su and Chiang, 2006).
2.4.2
Tuz türü ve konsantrasyonunun etkisi
Sulu ikili faz sistemlerinde genellikle (NH4)2SO4, Na2SO4,
KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, Na3C6H5O7 ve MgSO4 gibi tuzlar faz
oluúturmada kullanÕlÕr. Tuzlar sulu ikili faz sisteminde genellikle fazlar
arasÕndaki hidrofobisiteyi artÕrarak PEG ve protein arasÕndaki hidrofobik
etkileúimi daha da artÕrÕr ve bunun sonucunda daha iyi bir ekstraksiyon
gerçekleúmiú olur (Su and Chiang, 2006).
Sulu ikili faz sistemlerinde tuz türü ve konsantrasyonu biyolojik
moleküllerin da÷Õlma davranÕúÕnÕ ve ekstraksiyon verimliliklerini
etkilemektedir. Sulu ikili faz sistemlerinde tuzlarÕn da÷Õlmaya etkisi alt
ve üst faz arasÕnda tuz iyonlarÕnÕn eúit olmayan bir úekilde da÷ÕlmasÕ ve
bunun sonucunda meydana gelen elektrik akÕmÕndaki farklÕlaúma
úeklindedir. Bu farklÕlaúmadan dolayÕ pek çok durumda alt faz negatif
yüklü, üst faz ise pozitif yüklüdür. Bunun sonucunda negatif yüklü
proteinler elektrostatik itme kuvvetleriyle üst faza gitmektedir (Han and
Lee,1997).
Da÷Õlmaya etki eden tuzlarÕn hidrofobik karakteri, fazlar arasÕndaki
elektrik potansiyeli, moleküllerin büyüklü÷ü ve konformasyonu gibi
faktörlerden en dominant faktör hidrofobik karakteristikliktir. Hidrofobik
etki moleküllerin apolar kalÕntÕlarÕnÕn su ile olan etkileúimi olarak
açÕklanmaktadÕr. AyrÕca, bir materyalin hidrofobisitesi sulu ortamdaki
hidrojen ba÷Õ, van der Waals, elektrostatik etkileúim gibi bütün
65
etkileúimlerinin ölçümü olarak da tanÕmlanabilmektedir (Vailaya and
Horváth, 1996).
PEG / Tuz sistemlerinde tuz türü ve konsantrasyonu proteinler ve
hidrofobik ortam arasÕndaki hidrofobik etkileúimlere etki eder. Tuz
iyonlarÕ protein üzerindeki kendisine zÕt yüklü iyonlarla etkileúerek çift
katlÕ iyon gruplarÕ oluúturur. Sonuçta proteini saran tuzlarÕn etrafÕndaki
su molekülleri uzaklaúÕr ve proteinlerin hidrofobik bölgeleri tuz
konsantrasyonunun artmasÕyla kademeli olarak açÕkta kalmaya baúlar
(Bonomo et al., 2006). Tuz iyonlarÕnÕn proteinin davranÕúÕna etkisi
genellikle Hofmeister serisindeki pozisyonlarÕyla iliúkilidir. Hofmeister
serisi anyonlar için; SO4-2 > HPO4-2 > CH3COO- > Cl- > Br- > I- > SCNve katyonlar için; Li+ > Na+ > K+ > NH+4> Mg+2 úeklinde etki etmektedir.
Yüksek tuz konsantrasyonlarÕnda serilerin sol tarafÕndaki iyonlar
“salting-out” etkisiyle proteinlerin çözünürlüklerini düúürerek hidrofobik
etkileúimlerini artÕrÕrlar. Bu yüzden ço÷u protein tuzca fakir PEGce
zengin üst faza gitmeyi tercih eder (Silva et al., 2007).
Yüksek tuz konsantrasyonlarÕ, proteinlerin üst faza da÷ÕlmasÕ,
saflaútÕrmanÕn verimi, proteinlerin çökelmesi, enzimlerin aktivitesinin
kaybolmasÕ gibi pek çok soruna neden olabilmektedir. Bu nedenle tuz
türü ve konsantrasyonu saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin iyi bir
saflaútÕrma katsayÕsÕ ve geri kazanÕmla saflaútÕrÕlabilmesi için kritiktir ve
en uygun optimum koúullarÕ belirlenmelidir (Klomklao et al., 2005).
2.4.3
pH etkisi
økili sulu faz sistemlerinde proteinlerin da÷ÕlÕmÕ sistemin pH’Õna da
ba÷lÕdÕr. Spesifik bir sistemdeki proteinin da÷Õlma katsayÕsÕndaki
66
de÷iúimler ve pH aralÕ÷Õ iyonik kompozisyon tarafÕndan etkilenmektedir.
Sulu ikili faz sisteminin pH’Õ proteinin iyonize olabilen gruplarÕnÕ ve
yüzeyindeki yüklere etki etmektedir. pH’Õn de÷iútirilmesiyle proteinlerin
net yükü düúük pH’da pozitif, yüksek pH’da ise negatif olmaktadÕr.
Proteinler izoelektrik noktadaki pH’da net sÕfÕr yüke sahiptir ve bu
noktada protein da÷ÕlÕmÕ pH’dan ba÷ÕmsÕz olarak hareket etmekte olup
ço÷unlukla PEG ve tuzun protein üzerindeki hidrofobik etkileúimleri
kuvvetlidir. øzoelektrik noktanÕn üstündeki pH de÷erlerinde ise iyonik
etkileúimler hidrofobik da÷ÕlÕmÕndan üstün gelecektir ve negatif yüklü
proteinler/enzimler pozitif yüklü üst faza do÷ru da÷ÕlacaktÕr (Johansson,
1985; Vaidya et al., 2006; Babu et al., 2007).
2.4.4
SÕcaklÕ÷Õn etkisi
Son zamanlarda yapÕlan çalÕúmalarda ifade edildi÷i gibi polimertuz etkileúimleri endotermik yani ÕsÕ alan etkileúimlerdir ve bu nedenle
sÕcaklÕ÷Õn artmasÕ bu reaksiyonun gerçekleúmesini daha da istemli
kÕlacaktÕr (Carvalho et al., 2007). SÕcaklÕk iki fazÕn kompozisyonunu
etkileyerek proteinin da÷ÕlÕmÕna etki edece÷inden ve ayrÕca polimerin ve
tuzlarÕn sudaki çözünürlükleri sÕcaklÕkla farklanaca÷Õndan dolayÕ önemli
bir parametredir. Faz oluúumu için sistem sÕcaklÕ÷Õ polimer ve tuzlarÕn
kritik sÕcaklÕ÷ÕnÕn üzerinde olmalÕ ve sÕcaklÕ÷Õn sabit tutulmasÕ
gerekmektedir. AyrÕca proteinler faz oluúturan polimerlerin varlÕ÷Õnda
denaturasyona karúÕ daha dayanÕklÕ olduklarÕndan yüksek sÕcaklÕklarda
bile proteinlerin da÷ÕlÕmÕ gerçekleúebilmektedir (Bamberger et al., 1985).
67
2.4.5
Hidrofobik etkileúimler
Polimerlerden bir tanesine hidrofobik gruplarÕn kovalent
ba÷lanmasÕyla hidrofobik etkileúimler artÕrÕlabilmektedir. E÷er bir
protein yüzeyinde veya aktif merkezinde hidrofobik gruplar varsa
da÷Õlma katsayÕsÕ de÷iútirilebilmektedir. Bu iúleme afinite da÷ÕlÕmÕ da
denilmektedir. Yöntem hücrelerin veya hücre partiküllerinin hidrofobik
özelliklerini karakterize etmekte ve hidrofobikli÷e ba÷lÕ olarak ayÕrmada
kullanÕlabilmektedir (Albertsson, 1986).
2.4.6
Protein konsantrasyonunun etkisi
Protein konsantrasyonu doygunluk sÕnÕrÕna yaklaútÕkça, sistemde
doygun hal durumu gözlenecektir. Protein konsantrasyonunun bu sÕnÕrÕn
üzerine çÕkarÕlmasÕ proteinin çökmesine neden olacak ve sonuçta da geri
kazanÕmÕ düúük olacaktÕr. Bu nedenle, sulu ikili faz sisteminde protein
konsantrasyonu doygunluk sÕnÕrÕnÕn altÕnda olmalÕdÕr. Genellikle bir
gramlÕk bir ikili faz sistemine 1 mg protein konsantrasyonu optimumdur.
2.4.7
ZamanÕn etkisi
Küçük damlalarÕn karÕútÕrma sÕrasÕnda bütünleúerek büyük damlalar
oluúturmasÕ ve en sonunda da sistemin disperse halden homojen bir hal
almasÕ için belli bir zamanÕn geçmesi gerekmektedir. FazlarÕn farklÕ
yo÷unluk ve viskozite özelliklerinden dolayÕ faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúmesi
sistemden sisteme farklÕ zamanlarda gerçekleúir. PEG/dekstran ve
PEG/tuz sistemleri en kÕsa zamanda oluúan sistemlerdir (Albertsson,
1986).
68
2.4.8
Düúük molekül kütleli maddelerin etkisi
øyonik olmayan polimerlerden oluúan sistemler 0.1–1 M arasÕndaki
úeker veya NaCl, KCl, Na2CO3, NaClO4 gibi tuzlarÕn ilavesinden oldukça
etkilenmektedir. Bu maddelerin eklenmesiyle faz diyagramÕ ve kritik
nokta çok fazla etkilenmemektedir. Faz sistemi sadece 1 M’dan yüksek
tuz konsantrasyonlarÕndan etkilenmektedir (Albertsson, 1986). Sulu ikili
faz sistemine faz oluúturucu tuzun yanÕnda ikinci bir tuzun sisteme
eklenmesi spesifik proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕnÕ de÷iútirme olana÷ÕnÕ
arttÕrÕr (Yue et al., 2007).
2.5
Sulu økili Faz Sisteminin Uygulamala AlanlarÕ
Protein gibi biyolojik moleküller genellikle çok seyreltik
solüsyonlarda bulunmaktadÕr ve bu yüzden geri kazanÕmÕnda genellikle
ilk adÕm deriútirme iúlemi olmaktadÕr. Özellikle rekombinant DNA
uygulamalarÕnÕn artmasÕ protein üretiminde geleneksel proseslere ve
ürünlerin geri kazanÕmÕna yeni bir bakÕú açÕsÕ oluúturmuútur. Geleneksel
yöntemlerde saflaútÕrma iúlemi santrifügasyon, filtrasyon ve deriútirme
gibi birkaç adÕmdan oluúmaktadÕr. Ço÷u zaman proses sayÕsÕnÕn veya
adÕmlarÕnÕn artmasÕ hem zaman kaybÕna yol açmakta hem de ürün
kaybÕnÕ artÕrmaktadÕr. Sulu ikili faz sistemi, geleneksel yöntemlerdeki bu
eksikliklerin üstesinden gelmektedir. Uygun bir optimizasyona sahip sulu
ikili faz sistemi, berraklaútÕrma, deriútirme ve kÕsmi saflaútÕrma
adÕmlarÕnÕn entegre oldu÷u tek adÕmlÕ bir saflaútÕrma prosesi sa÷layarak
hem ürün verimini geliútirmekte hem de ürün geri kazanÕm maliyetini
azaltmaktadÕr. Uygun faz kompozisyonlarÕ seçilerek bir yada daha fazla
adÕmlÕ sulu ikili faz sistemleri kullanÕlarak biyolojik moleküllerin
saflaútÕrÕlmasÕ gerçekleútirilebilmektedir. Örne÷in; Rhodotorula glutinis
69
fenilamonyak liyaz (PAL, EC 4.1.3.5) enzimi geleneksel tuz çöktürme
yöntemleri ile 1.32–2.5 kat arasÕnda saflaútÕrÕlÕrken, yöntemin verimi %
52.8–80.0 arasÕnda de÷iúmektedir. Enzim sulu ikili faz sistemi ile önce %
11.0 PEG-1000 / % 14.0 Na2SO4 ve daha sonra ikinci adÕmda % 11.0
PEG-1000 / % 14.0 Na2SO4 / % 5.3 Na2CO3 sistemi ile 9.3 kat
saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 80.6 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Yue et al.,
2007). Tavuk yumurtasÕ lizozim (EC 3.2.1.17) enzimi % 16.1 PEG–6000
/ % 12 Na2SO4 / 500 mM NaClO4 (25oC ve pH 10.0) sulu ikili faz sistemi
sayesinde oldukça verimli ve ekonomik bir úekilde (7.6 kat ve % 70
verim ile) saflaútÕrÕlmÕútÕr (Su and Chiang, 2006). Bacillus pumilus alkali
ksilanaz (EC 3.2.1.32) enzimi % 22 PEG–6000 / %10 K2HPO4 / % 12
NaCl sulu ikili faz sistemi ile 33.1 kat ve % 98 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr
(Bim and Franco, 2000). Tuna dalak proteinaz enzimi ise % 15 PEG1000 / % 20 MgSO4 sistemi ile 6.61 kat ve % 69 verim ile
saflaútÕrÕlmÕútÕr (Klomklao et al., 2005).
Sulu ikili faz sistemi ayrÕca bitki dokularÕndan enzimlerin verimli
bir úekilde saflaútÕrÕlmasÕnda da kullanÕlmaktadÕr. Örne÷in; Sesbania
marginata bitkisine ait bakla tohumundan Į-galaktozidaz (EC 3.2.1.22)
enzimi % 13 PEG-4000 / % 13 fosfat / % 6 NaCl (pH 5.0) sulu ikili faz
sistemi ile 5.4 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 144 verim ile
kontaminatlarÕn ço÷undan ayrÕlarak ikinci adÕmda planlanan iyonde÷iúim kromatografisi için uygun bir enzim preparatÕ elde edilmiútir
(Falco et al., 2000). Patates yumrusundan polifenol oksidaz (PPO, EC
1.14.18.1) enzimi % 5 PEG–8000 / % 28.5 fosfat (pH 7.0) sistemi ile
15.7 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 97 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Vaidya
et al., 2006). Ipomoea palmetta bitkisinin yapraklarÕndan peroksidaz
(POD, EC 1.11.1.7) enzimi PEG / amonyum sülfat sistemi ve ardÕndan
jel fitrasyon kromatografisi ile saflaútÕrÕlmÕútÕr. % 24 PEG-6000 / % 7.5
(NH4)2SO4 / % 2.0 NaCl sistemi kullanÕlarak ekstrakt hacminde istenen
70
deriútirme sa÷lanmÕú ve enzim 0.042 da÷Õlma katsayÕsÕ, 2.18 saflaútÕrma
katsayÕsÕ, % 91.5 verim ve % 57.5 hacim azalmasÕ ile deriútirilerek
saflaútÕrÕlmÕútÕr (Srinivas et al., 1999).
Sulu ikili faz sistemi, DNA izolasyonunda geleneksel yöntemler
olarak bilinen izopropanol ve amonyum sülfat çöktürmelerine gerek
duyulmadan tek adÕmda ve hÕzlÕ bir úekilde DNA izolasyonunun
gerçekleúmesini sa÷lamaktadÕr (ùekil 2.5). Kaotropik ajan ve deterjan
içeren PEG/Tuz sistemleri ile alt fazda nükleik asit da÷ÕlÕmÕ oldukça
yüksek bir verimle sa÷lanmaktayken istenmeyen proteinler ve di÷er
hücresel materyaller üst faza da÷ÕlmaktadÕr. Örne÷in; Escherichia coli
hücrelerinin lizisi ile açÕ÷a çÕkan alkali lizatta yer alan plazmid DNA’sÕ
(pDNA) % 19 PEG-600 / % 16.5 sodyum sitrat-amonyum sülfat / % 20
lizat (pH 6.9) sistemi ile tuzca zengin alt fazda % 91.1 verim ve % 17.2
saflÕkta izole edilmektedir. Sulu ikili faz sisteminin birkaç adÕmda
tekrarlanmasÕyla pDNA üst fazda daha yüksek saflÕkta elde edilmiútir
(Gomes et al., 2008). Bir baúka çalÕúmada ise 6.1 kbp’lÕk plazmid DNA
(pDNA) vektörü % 35 PEG-600 / % 6 (NH4) 2SO4 sistemi ile istenmeyen
pek çok RNA ve proteinden uzaklaútÕrÕlarak 3.0 kat ve % 100 geri
kazanÕm ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Trindade et al., 2005).
71
ùekil 2.5 Sulu ikili faz sistemi ile DNA izolasyonu
Membran proteinlerinin izolasyonu normalde oldukça zor ve
zaman isteyen bir prosedürdür. Ancak sulu ikili faz sistemi kullanÕlarak
bu sorunun üstesinden gelmek mümkündür. Non-iyonik deterjanlar
(Örne÷in; Triton X-114 gibi) kullanÕlarak yüksek sÕcaklÕklarda kompleks
biyolojik sistemlerden integral membran proteinlerince zengin
preparatlar hazÕrlanabilmektedir. Örne÷in; Nocardia rhodochrous
kolesterol oksidaz (EC 1.1.3.6) enzimi etoksilenmiú non-iyonik C1218E05 deterjanÕ ile oluúturulmuú sulu ikili faz sistemi ile 20 saatlik bir
prosedür kullanÕlarak 4.0 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 85’lik verimle
saflaútÕrÕlabilmiútir (Minuth et al., 1997). 11-ȕ-hidroksistreoid
dehidrogenaz membran proteini ilk adÕmda Tween 20 / Dekstran 500
sistemi ile in-situ olarak % 75 geri kazanÕmla üst fazda (deterjan fazÕ)
toplanmÕútÕr. Ancak protein yeterli saflÕkta olmadÕ÷Õ için alt faz (polimer
fazÕ) atÕlmÕú ve ikinci adÕmda sisteme metal afinite reçinesi içeren bir
polimer ilave edilerek son adÕmda alt fazda membran proteinin seçimli
72
bir úekilde saflaútÕrÕlmasÕ sa÷lanmÕútÕr (ùekil 2.6) (Roobol-Bóza et al.,
2004).
ùekil 2.6 Sulu ikili faz sistemiyle membran proteinin izolasyonu
Sulu ikili faz sistemi ile aminoasit, peptid gibi düúük molekül
kütleli biyomoleküllerin ekstraksiyonunun yapÕlabildi÷i de çeúitli
çalÕúmalarda ifade edilmiútir. økili faz sistemleri ile aminoasitlerin
hidrofobik karakterleri arttÕrÕlarak çok verimli bir ekstraksiyonla PEGce
zengin üst fazda toplanmalarÕ sa÷lanmÕútÕr. ArdÕndan ekstraktta PEG
so÷utularak çöktürülmüú ve oldukça temiz bir çözelti elde edilmiútir. Bu
çalÕúmalar kompleks proteinlerin sulu ikili faz sistemlerindeki
davranÕúlarÕnÕ anlamada da yardÕmcÕ olmaktadÕr (Eiteman and Gainer,
1990). Örne÷in; Polipropilen glikol (PPG425) / MgSO4 sulu ikili faz
73
sisteminde D-alanin, L-valin ve L-lösin aminoasitlerinin da÷ÕlÕmÕ
incelenmiútir (Salabat et al., 2007). PEG / Dekstran sistemi ile glutamik
asitin,
fenilalanin
ve
triptofan
aminoasitlerinden
ayrÕlmasÕ
gerçekleútirilmiútir (Zhai et al., 2001). Aminoasitlerin rasemik
karÕúÕmlarÕndan
enzimatik
olarak
üretilen
L-aminoasitlerin
saflaútÕrÕlmasÕnda PEG-600 / Potasyum fosfat sulu ikili faz sistemi
kullanÕlmÕútÕr (Hollander et al., 1999).
Hiç úüphe götürmez ki biyoteknoloji alanÕnda en fazla ilgiyi ham
materyallerden protein izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕnÕ sa÷layan sulu ikili
faz sistemleri çekmektedir. Sulu ikili faz sistemleri sanayide büyük
ölçeklerde protein geri kazanÕmÕ için de kullanÕlmaktadÕr. Örne÷in; %
12.5 PEG–1000 / % 12.5 K2HPO4 sistemi ile laboratuvar ortamÕnda 500
ml’de 176 mg kadar saflaútÕrÕlan lizozim ve miyoglobin, 6.25 litreye
büyütülmüú sistemde 2.2 gr kadar saflaútÕrÕlmaktadÕr (Sutherland et al.,
2008). Escherichia coli homojenatÕndan ZZ-kutinaz-(WP)4 proteini iki
adÕmlÕ sulu ikili faz sistemi (EO50PO50 / Amilopektin - EO50PO50 / C1218EO5) ile 500 litrelik bir fed-batch reaktöründe yaklaúÕk konsantrasyonu
2.36 gr/lt olacak úekilde elde edilmiútir (Kepka et al., 2003). PEG-4000 /
CaCl2 sistemi ile Zea mays mÕsÕr bitkisinin maltÕndan Į- ve ȕ-amilazlarÕn
130 kat saflaútÕrma katsayÕsÕna sahip sürekli bir ekstraksiyon sistemi ile
saflaútÕrÕldÕ÷Õ belirtilmiútir (Biazus et al., 2007). Sürekli karÕútÕrmalÕ
kontaktör (ùekil 2.7) içerisinde Clostridium perfringens Tip A
mikroorganizmasÕnÕn bulundu÷u ham materyalden PEG / Fosfat sulu ikili
faz sistemi kullanÕlarak Į-toksin ekstraksiyonu 2.4 kat saflaútÕrma
katsayÕsÕ ile gerçekleútirilmiútir (Cavalcanti et al., 2007). Ancak, sulu
ikili faz sisteminin sahip oldu÷u bütün iyi özelliklere ra÷men da÷Õlma
mekanizmasÕ tam olarak bilinmedi÷inden büyük sistemdeki çalÕúmalarÕn
deneysel olarak optimize edilmesi gerekmektedir ve bu sebeple ölçek
büyütme çalÕúmalarÕ henüz çok sÕnÕrlÕdÕr.
74
ùekil 2.7 Sürekli karÕútÕrmalÕ kontaktör
Sulu ikili faz sistemleri sadece biyoteknolojik alanda de÷il ayni
zamanda analitik uygulamalara da sahiptir. Sulu ikili faz sisteminde
moleküllerin da÷ÕlmasÕ faz komponentlerinin etkilerinin yanÕnda
kendilerinin yüzeysel ve konformasyonel özelliklerinden de
kaynaklandÕ÷Õndan analitik analizler yapÕlabilmektedir. Sulu ikili faz
sistemleri hücre fragmanlarÕnÕ alt populasyonlara ayÕrarak yük ve
yüzeysel hidrofobik özellikleri hakkÕnda ve ayni zaman da tuz ve pH
koúullarÕnÕn de÷iútirilmesi ile proteinlerin izoelektrik noktalarÕnÕn
belirlenmesini sa÷lamaktadÕr (Hatti-Kaul, 2000). Örne÷in; PEG–8000 /
Fosfat sulu ikili faz sistemi E. coli hücresinin fragmanlarÕndan inklüzyon
parçalarÕnÕ fraksiyonlara ayÕrmÕútÕr (Walker and Lyddiatt, 1998).
Çevresel sorunlarÕn çözülmesinde de sulu ikili faz sistemlerinden
yararlanÕlmaktadÕr. Endüstriyel alanda kesim, delim, ezme gibi
proseslerde kullanÕlan su bazlÕ so÷utucu sÕvÕlarda meydana gelen
75
mikrobiyal büyümenin biyodegrasyonunu sa÷lamak zordur ayrÕca
operatorler için mesleki riskler taúÕmaktadÕr. Sulu ikili faz sistemi bu
so÷utucu sÕvÕlardan mikroorganizmalarÕn ve inorganik partiküllerin
uzaklaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlabilmektedir. AyrÕca tekstil de kullanÕlan
boyalar, çevre kirlili÷ine yol açan metal iyonlarÕ ve organik maddeler,
ham petroldeki aromatiklerin uzaklaútÕrÕlmasÕ gibi atÕklarÕn
de÷erlendirilmesinde sulu ikili faz sistemlerinin kullanÕlabilece÷i
düúünülmektedir (Hatti-Kaul, 2000).
76
3.
MATERYAL VE METOD
3.1 Materyal
Bu çalÕúmada kullanÕlan cihazlar ve yöntemlere ait bilgiler ilgili
bölümlerde ayrÕntÕlÕ olarak verilmiútir.
KullanÕlan
kimyasal
maddeler;
D(+)-glukoz
monohidrat
(C6H12O6.H2O), Polietilen Glikol (PEG 1000, 2000, 3000, 4000, 6000 ve
8000)
ve
Sükroz
(C12H22O11)
Fluka-Biochemika’dan,
Amonyum
Sülfat
((NH4)2SO4),
HCl,
Magnezyum Sülfat (MgSO4), Sodyum Sülfat (Na2SO4), Potasyum Klorür
(KCl), Sodyum Klorür (NaCl), Sodyum Karbonat (Na2CO3),
Magnezyum Klorür (MgCl2), Baryum Klorür (BaCl2.2H2O), Kalsiyum
Klorür (CaCl2), Mangan Sülfat (MnSO4.H2O), Çinko Sülfat
(ZnSO4.7H2O), Demir Klorür (FeCl3.6H2O), E. Merck (Darmstad-
FRG)’den, Tris Hidroksi Amino Metan, Sodyum Dodesil Sülfat (SDS),
Akrilamid,
N,N'-Metilenbisakrilamid,
N,N,
N',N'
–
Tetrametilenetilendiamin
(TEMED),
Amonyum
persülfat,
2merkaptoetanol, Glisin ve Coomasie-Brilliant Blue Bio-Rad
laboratuarlarÕ, (Richmond CA) ve BDH Ltd. (Poole,UK)’den temin
edilmiútir. Na/K Tartarat(C4H4KNaO6.4H2O), Sodyum hidroksit, Etanol,
Fosforik asit, BakÕr Sülfat (CuSO4.5H2O), Mangan Klorür (MnCl2.4H2O)
ve Asetik asit Riedel-de Haën’den, Sodyum Asetat, 3,5-Dinitrosalisilik
Asit, SÕ÷Õr Serum Albumini (Albumin Fraksiyon V) ve Sigma Molecular
Weight Marker (M.W. 14,000–66,000) Sigma Chemical Co. (St. Louis,
CA)’den temin edilmiútir. KullanÕlan di÷er kimyasallar analitik
saflÕktadÕr.
77
ønvertaz kayna÷Õ olarak kullanÕlan domatesler (Lycopersicon
esculentum) lokal marketlerden satÕn alÕnmÕútÕr. YapÕlan ön çalÕúmalar
do÷rultusunda halk arasÕnda salkÕm domates olarak bilinen ve Salih
Öztim adlÕ üretici tarafÕndan øzmir’in øncirliova bölgesinde yetiútirilen
domateslerin uygun enzim kayna÷Õ olaca÷Õ belirlenmiútir.
3.2 ønvertaz Aktivitesi Tayini
ønvertaz enziminin aktivite tayininde esas, substrat olarak Sükroz
kullanÕlarak enzimatik reaksiyon sonucunda açÕ÷a çÕkan invert úekerin
miktarÕnÕn Dinitrosalisilik (DNS) asit metodu ile belirlenmesidir.
Aktivite tayininde inkübasyonlar Stuart Scientific çalkalamalÕ su
banyosunda (SBS–35), spektrofotometrik ölçümler ise Perkin Elmer
marka cihazla gerçekleútirilmiútir. DNS metodunun esasÕ indirgen
úekerlerdeki serbest karbonil gruplarÕnÕn (C=O) varlÕ÷ÕnÕ test etmekdir.
Bununla birlikte glukozdaki fonksiyonel aldehit grubu ile fruktozun
fonksiyonel keton gruplarÕnÕn oksidasyonunu ve ayni anda alkali koúullar
altÕnda 3,5-Dinitrosalisilik asitin 3-amino,5-nitrosalisilik asite
indirgenmesini içermektedir (ùekil 3.1). Aúa÷Õdaki reaksiyon úemasÕ bir
mol úekerin bir mol 3,5-Dinitrosalisilik asit ile reaksiyona girdi÷ini
göstermektedir. Oluúan nitroaminosalisilik asit boyar maddesinin
konsantrasyonu 546 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülebilmektedir.
Aldehit grubu
oksidasyon
o karboksil grubu
3,5-Dinitrosalisilik asit o 3-amino,5-nitrosalisilik asit
indirgenme
ùekil 3.1 DNS yönteminin prensibi
78
ønvertaz enzimi ùekil 3.2’de gösterilen reaksiyon ile sükrozun
hidrolizini katalizler. Bu hidroliz reaksiyonu sonucu oluúan monosakkarit
karÕúÕmÕna “invert úeker” denir ve açÕ÷a çÕkan glukoz ile fruktoz indirgen
úekerdirler ve bazik bir çözeltide aldehit ve keton oluútururlar.
ùekil 3.2 Sükrozun invertaz tarafÕndan hidroliz reaksiyonu
YapÕlarÕndaki anomerik karbonu açÕkta olan úekerler indirgen
úekerdir. Bunlar kimyasal olarak düz zincirli olabilecekleri gibi halka
yapÕsÕnda da bulunabilmektedir ve bu iki yapÕ formu kendi aralarÕnda
dengededir. Hemi-asetal veya hemi-ketal gruplarÕ boúta olduklarÕnda
indirgen úekerler alkali koúullar altÕnda ortamda bulunacak oksitleyici
etkenler (Örne÷in; Cu+2) karúÕsÕnda indirgeyici bir madde haline
gelmektedir; úekerin karbonil grubunun oksijen molekülü ile yükseltgen
arasÕnda oluúan olan redoks tepkimesi yükseltgeni indirgemektedir. Bir
úeker oksitlendi÷i zaman onun karbonil gruplarÕ (Örne÷in; aldehit ve
keton gruplarÕ) karboksil grubuna dönüúmektedir. Örne÷in; glukoz
kimyasal olarak sulu çözeltide glukopiranoz formu ile dengede olan
aldehit formunda bir aldoheksozdur. Fizyolojik pH’da glukopiranoz
yapÕsÕ üstün úekildir. Aldehit endiol dengesi, glukozun kolaylÕkla
indirgenmesini ve yükseltgenmesini sa÷lar. Yani glukozun formülü
aldehit ya da kÕsa ömürlü reaktif tür olan enol úeklinde yazÕlabilir.
Aúa÷Õda ùekil 3.3’de belirtildi÷i gibi alkali çözeltilerde enol anyonuna
79
dönüúüm tercih edilmektedir. Çifte ba÷Õn varlÕ÷Õ ve enol anyonundaki
negatif yük, glukozu bakÕr (Cu+2) ve demir (Fe+3) gibi orta derecede
oksitleyici etkenlerle oksitlenebilen aktif bir redükleyici madde (indirgen
úeker) haline getirir. SÕcak alkali çözeltide glukoz, Cu+2 (küprik)
iyonlarÕnÕ hemen Cu+1 (küproz) iyonlarÕna indirger.
ùekil 3.3 Glukozun enol anyonuna dönüúüm reaksiyonu
DNS reaktifinin hazÕrlanÕúÕ; 1 g DNS 20 ml 2 N NaOH çözeltisine
eklenir, ÕsÕtÕlarak çözülür ve son hacim distile su ile 50 ml’ye tamamlanÕr.
Daha sonra üzerine 30 g Na/K Tartarat ilave edilir ve karÕútÕrÕlarak
toplam hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlanÕr.
ønvertazÕn aktivite ölçümünde reaksiyon karÕúÕmÕ; 0,6 ml, 0,2 M,
sodyum asetat tamponu (pH 5,0), 0,2 ml, 0,5 M sükroz (asetat
tamponunda hazÕrlanmÕú) ve 0,2 ml uygun oranda seyreltilmiú enzim
çözeltisi içerir. Reaksiyon karÕúÕmÕ, 37oC’de 30 dakika boyunca lineer
karÕútÕrmalÕ su banyosunda (SBS–35, Stuart Scientific, UK) çalkanalarak
inkübe edilir. ønkübasyondan sonra reaksiyon ortamÕndan alÕnan 1 ml
örnek üzerine 1 ml DNS reaktifi ilave edilerek kaynar su banyosunda 10
dk inkübe edilir. KarÕúÕm so÷utulduktan sonra 10 ml bidestile su ilave
edilerek vorteks ile karÕútÕrÕlÕr ve açÕ÷a çÕkan invert úeker miktarÕ 546
80
nm’de spektrofotometrik olarak belirlenir. Kör; 0,2 ml enzim çözeltisi
yerine 0,2 M, sodyum asetat tamponu (pH 5,0) içerir. Enzim aktivite
miktarlarÕnÕn hesaplanmasÕnda 1–10 ȝmol glukoz konsantrasyon aralÕ÷Õ
ile hazÕrlanan standart grafi÷i kullanÕlÕr.
Bir invertaz aktivite birimi, yukarÕda belirtilen koúullar altÕnda
dakikada 1 ȝmol glukoz açÕ÷a çÕkaran enzim miktarÕ olarak
tanÕmlanmÕútÕr (IU/ml).
3.3 Protein Tayini (Bradford Metodu)
ønvertaz preparatlarÕnÕn protein konsantrasyonlarÕnÕn tayini
Bradford (Bradford, 1976) metodu ile gerçekleútirilmiútir. Boya ba÷lama
temelli yöntemlerin en yaygÕnÕ, Bradford tarafÕndan geliútirilen ve
Coomassie Brillant Blue G–250 boyasÕnÕn kullanÕldÕ÷Õ yöntemdir.
Yöntem, organik boyalarÕn asidik gruplarÕ ile proteinlerin bazik
gruplarÕnÕn (Lys, Arg) etkileúerek renk oluúturmasÕnÕ esas almaktadÕr.
SÕ÷Õr serum albümininin (BSA), distile suda hazÕrlanmÕú 1
mg/ml’lik stok standart çözeltisinden 0,02–0,25 mg/ml konsantrasyon
aralÕ÷Õ ile hazÕrlanan standart grafi÷i kullanÕlarak örnek protein
konsantrasyonlarÕ hesaplanmÕútÕr.
Protein tayini için gerekli olan Bradford reaktifi: 40 mg Coomassie
Brillant Blue G250, % 95’lik 50 ml etanolde çözülür, üzerine 55 ml %
88’lik fosforik asit ilave edilerek distile su ile 1 lt’ye tamamlanÕp filtre
edilir.
81
Her bir örne÷in (standartlar ve bilinmeyen protein örnekleri)
protein miktarÕ aúa÷Õdaki prosedüre göre belirlenmiútir:
a) 0,1 ml standart protein, bilinmeyen protein örne÷i
ve distile su (kör için) tüplere pipetlenir.
b) 2 ml Bradford reaktifi eklenir ve vorteks ile
karÕútÕrÕlÕr.
c) Tüm tüpler oda sÕcaklÕ÷Õnda 10 dakika bekletilir
d) Her bir örne÷in 595 nm’de absorbansÕ okunur.
Protein konsantrasyonlarÕ, hazÕrlanan standart grafi÷i (0,02-0,2
mg/ml BSA standartlarÕ) kullanÕlarak hesaplanÕr.
ønvertazlarÕn izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕ ile ilgili iúlemler
sÕrasÕnda gerekli protein tayinleri bu yönteme göre yapÕlmÕútÕr.
3.4. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi
(SDS-PAGE) ve Moleküler Kütle Tayini
SDS-PAGE, poliakrilamid jel elektroforezinin en yaygÕn olarak
kullanÕlanÕ olup, protein karÕúÕmlarÕnÕn özelliklerini analizlemek
açÕsÕndan önemlidir. Protein saflÕk kontrolünün bir ölçüsüdür ve proteinin
molekül boyutuna göre bir ayrÕm yapmasÕ nedeniyle ba÷Õl molekül
kütlesi tayininde de kullanÕlÕr. O nedenle, domatesten izole edilen
invertaz preparatÕnÕn saflÕ÷ÕnÕ kontrol etmek ve molekül kütlesini
belirlemek için SDS-PAGE kullanÕlmÕútÕr.
Poliakrilamid jel elektroforezi % 0,1 SDS varlÕ÷Õnda plaka jel
cihazÕnda Laemmli (Laemmli, 1970) tarafÕndan geliútirilen metoda göre
gerçekleútirilmiútir. Yöntem heterojen tampon sistemi temeline dayanÕr.
AyÕrma kapasitesi oldukça iyi olan bu yöntemde, çalÕúÕlan proteinler
82
yürütücü jele girmeden önce düzenleyici jelde, elektroforez tamponu ve
jel arasÕndaki pH ve iyonik úiddet vasÕtasÕyla dengelenerek konsantre
edilirler.
Tayin için gerekli olan çözeltiler:
Akrilamid/bis
30 g Akrilamid ve 0.8 g bis-N, N¢-Metilenbis(A/B) :
akrilamid çözülerek 100 ml’ye tamamlanÕr,
filtre edilir ve kahverengi úiúede 4oC’de saklanÕr.
Alt Tris (LT):
18.2 g Tris hidroksi aminometan, 2 ml % 20 SDS
distile suda çözülür, pH’sÕ deriúik HCl ile 8,8’e
ayarlanÕr ve distile su ile 100 ml’ye tamamlanarak
4oC’de saklanÕr.
Üst Tris (UT) :
:
6.06 g Tris, 2 ml % 20’lik SDS distile suda çözülür,
pH’sÕ deriúik HCl ile 6,8’e ayarlanÕr ve distile su ile
100 ml’ye tamamlanarak 4oC’de saklanÕr.
Amonyum
persülfat(AP) :
Rezervuar
tamponu
20 mg/ml’lik sulu çözeltisi, taze hazÕrlanÕr.
15 g Tris, 72 g glisin ve 5 g SDS 5 litre distile suda
çözülerek hazÕrlanÕr.
3.4.1 Polimerizasyon protokolü
Poliakrilamid jeller akrilamid monomerlerinin bir çapraz ba÷layÕcÕ
ajan ile kopolimerizasyonu sonucu oluúur. Poliakrilamid jeller için en
çok kullanÕlan çapraz ba÷layÕcÕ ajan da N,Nc-metilenbisakrilamid (Bis)
dir. Akrilamid polimerizasyonu serbest radikal katalize bir örnektir.
Reaksiyon, amonyum persülfat ve N,N,Nc,Nc-tetrametiletilendiamin
(TEMED) ile baúlatÕlÕr. TEMED, persülfat iyonunun dekompozisyonunu
katalizleyerek serbest bir radikal oluúumunu sa÷lar. Aktif monomer,
aktiflenmemiú monomer ile reaksiyon verir ve polimer zincirin uzamasÕ
83
baúlar. Uzayan polimer zincir çapraz ba÷lÕ metilen bisakrilamid ile
birlikte yapÕlanÕr. Oksijen, serbest radikalleri uzaklaútÕrdÕ÷Õndan ve
polimerizasyonu engelledi÷inden tüm jel çözeltileri kullanÕlmadan önce
vakumla oksijen uzaklaútÕrÕlmalÕdÕr.
Kaliteli bir SDS-PAGE için úu faktörlere dikkat etmek gerekir:
Oldukça yüksek saflÕktaki reaktifler, do÷ru baúlangÕç konsantrasyonlarÕ
(yürütücü jel için % 0,04 ve düzenleyici jel için % 0,1), sÕcaklÕk
(polimerizasyon için genellikle 23oC), çözeltilerin gazsÕzlaútÕrÕlmasÕ
(oksijen polimerizasyonun inhibitörüdür) ve jel oluúturma tamponlarÕnÕn
pH’sÕ.
Domates invertazÕnÕn SDS-PAGE için % 10’luk akrilamid
monomeri kullanÕlmÕútÕr. Polimerizasyon protokolü (iki jel için) aúa÷Õda
verilmiútir:
Çözelti 1, 2 ve 3 karÕútÕrÕlarak oda sÕcaklÕ÷Õna getirilir. 5 dakikalÕk
gazsÕzlaútÕrma iúleminin ardÕndan çözelti 4 ve 5 sÕrasÕyla eklenerek,
yavaúça karÕútÕrÕlÕr. Yürütücü jel dökülerek 1–1,5 saat bekletilir.
1)
2)
3)
4)
5)
Reaktif
Yürütücü Jel (%10) Düzenleyici Jel
Distile su (ml)
19
12,7
AB (ml)
25
2,0
LT (ml)
15
5,0
AP (ml)
0,9
0,3
20
20
TEMED (Pl)
(%3)
84
3.4.2 Örneklerin hazÕrlanmasÕ ve elektroforez uygulanmasÕ
SDS-PAGE’de ayrÕlacak tüm örnekler do÷ru protein yüklemesi
yapabilmek için önce 0,1 M Tris/HCl (pH 6,8) ile seyreltilir. Seyreltilmiú
örnekler 2:1 oranÕnda ön iúlem tamponu ile karÕútÕrÕlÕr. Bu tampon; 200
Pl Tris/Bromfenol mavisi, 200 Pl % 60’lÕk sukroz, 400 Pl % 20’lik SDS
ve 200 Pl 2-merkaptoetanol içerir. Merkaptoetanol proteinin tersiyer
yapÕsÕnÕ birarada tutan disülfit ba÷larÕnÕ indirger. SDS; proteini denature
ederek kuvvetlice bir SDS molekülü her bir iki aminoasit artÕ÷Õna
ba÷lanarak yük maskelenir. Bromfenol mavisi; iyonize olabilen bir
boyadÕr ve elektroforezin kolay izlenebilmesi için ortama ilave edilir.
Sükroz ise örnek çözeltiye bir yo÷unluk kazandÕrÕr ve örne÷in
elektroforez tamponunda kolayca çökmesi sa÷lanÕr.
50 Pl örnek, 25 Pl örnek tamponu ile karÕútÕrÕlÕp 100oC’lik su
banyosunda 3 dakika kaynatÕlÕr. Genel olarak yürütücü jelin her aralÕ÷Õna
50 Pl örnek uygulanÕr. Boú aralÕklar ise, elektroforez sÕrasÕnda
proteinlerin da÷ÕlmasÕnÕ önlemek için 50 Pl 0,1 M Tris/HCl (pH 6,8) ve
ön iúlem tamponu ile doldurulur.
Anod ve katod reservuarlarÕndaki Tris/glisin/SDS tamponu ile
elektroforez yürütülür. Proteinlerin elektroforezinde düzenleyici jelde 25
mA/jel ve yürütücü jelde 35 mA/jel akÕm uygulanÕr. Bromfenol
mavisinin oluúturdurdu÷u bant jele ulaúmadan 0,5 cm önce elektroforez
iúlemine son verilir.
85
3.4.3 Protein bantlarÕnÕn boyanmasÕ
Jellerin boyanmasÕnda Coomasie-Brilliant Blue metodu
kullanÕlmÕútÕr. Bu boyama metodunda esas, boyanÕn asidik pH’da
proteinlere ba÷lanmasÕdÕr. Jeller, Coomasie Blue (% 45 metanol/ % 9
asetik asitte hazÕrlanmÕú % 25’lik çözeltisi) çözeltisi ile 1 saat boyunca
yavaúça çalkalanÕr. Jelde oluúan mavi zemin, jelin % 10 metanol ve % 14
asetik asitten oluúan sulu çözeltisi ile gece boyunca yÕkanarak boyadan
temizlenir.
3.5
Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle ønvertazÕn
Domatesten (Lycopersicon esculentum) øzolasyonu ve SaflaútÕrÕlmasÕ
ønvertaz (EC 3.2.1.26) enzim kayna÷Õ olarak, ülkemizde oldukça
bol bulunan, ekonomik ve yüksek enzim aktivitesi içeren domates
(Lycopersicon esculentum) seçilmiútir. Bir çok invertaz çalÕúmasÕnda
enzim, bitkisel ve mikrobiyal kaynaktan bilinen genel izolasyon ve
saflaútÕrma metodlarÕ kullanÕlarak izole edilip, saflaútÕrÕlarak, fiziksel ve
kimyasal özellikleri belirlenmiútir (Vaidya et al., 2006; Srinivas et al.,
1999; Yue et al., 2007).
ønvertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕ oldukça zor ve masraflÕ bir
iúlemdir. AyrÕca, sonuçta elde edilen enzim genellikle yüksek aktiviteli
fakat çok az miktardÕr. Bu nedenle, bu çalÕúmada daha sonraki amacÕmÕza
uygun bir enzim preparatÕ hazÕrlamak için invertaz enzimi basit
tekniklerle domatesten izole edilerek kÕsmi olarak saflaútÕrÕlmÕútÕr.
Enzimin
izolasyonu
ve
kÕsmi
saflaútÕrÕlmasÕnda
sÕrasÕyla
homojenizasyon, santrifüjleme, amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz
iúlemleri yapÕlmÕútÕr. Bu preparat sulu ikili faz sisteminde kullanÕlmÕútÕr.
86
Domatesin dÕú kabuklarÕ uzaklaútÕrÕldÕktan sonra küçük parçalar
halinde do÷ranmÕútÕr. ArdÕndan bir litre 1 M NaCl içeren pH 5,0, 0,2 M
sodyum asetat tamponu ile önce bir blender (Braun, Almanya) ve
sonrasÕnda bir homojenizatör (Silverson STL 2, UK) yardÕmÕ ile
homojenize edilmiútir. Homojenat, domatesin kendi yapÕsÕndan gelen lif
ve çekirdekleri uzaklaútÕrmak için bir tülbent bezinden süzülmüútür.
FiltratÕn pH’sÕ pH 5,7–6,0 arasÕnda ayarlanarak 10000 rpm’de 15 dakika,
+4oC’de santrifüjlenmiútir (Hettich 30RF, FRG). Daha sonra santrifüjata
% 85’lik amonyum sülfat çöktürmesi yapÕlÕp gece boyunca +4oC’de
bekletilmiútir. 10000 rpm’de, +4oC’de 30 dakika santrifüjlenen amonyum
sülfatlÕ enzim çözeltisinden enzimatik aktivite içeren çökelek ayrÕlmÕútÕr.
Çok az miktarda pH 5,0, 0,2 M sodyum asetat tamponu ile çözülen
çökelek gece boyu +4oC’de tampona karúÕ diyalizlenmiútir. Diyaliz
adÕmÕnda, diyaliz suyu ilk bir saat sonunda ve sonrasÕnda birkaç kez
de÷iútirilerek gece boyunca bÕrakÕlmÕútÕr. Daha sonra diyalizat sonraki
çalÕúmalarda kullanÕlmak üzere derin dondurucuda (U÷ur, Nazilli) 20oC’de saklanmÕútÕr. HazÕrlanan bu preparat hem protein miktarÕ hem de
invertaz aktivitesi açÕsÕndan sulu ikili faz sistemi için oldukça uygun bir
preparattÕr. Daha sonraki çalÕúmalarda kullanÕlacak olan domates
invertazÕnÕn protein miktarÕ, aktivitesi ve spesifik aktivite de÷erleri ilgili
bölümlerde yeri geldikçe verilmiútir.
3.5.1
Sulu ikili faz sisteminin hazÕrlanmasÕ
Stok PEG (% 50, w/w), amonyum sülfat (% 50, w/w), magnezyum
sülfat (% 30, w/w) ve sodyum sülfat (% 30, w/w) çözeltileri bidestile su
ile hazÕrlanmÕútÕr. Sulu ikili faz sistemi uygun PEG ve tuz miktarlarÕ ile
0,5 ml invertaz diyalizatÕ ilave edilerek 15 ml’lik santrifüj tüplerinde
hazÕrlanmÕútÕr. PEG molekül a÷ÕrlÕ÷ÕnÕn (PEG 1000, 2000, 3000, 4000,
87
6000 ve 8000) ve tuzlarÕn ((NH4)2SO4, MgSO4 ve Na2SO4) invertaz
enziminin da÷ÕlÕmÕna etkisini incelemek için farklÕ konsantrasyonlarda
karÕútÕrÕlmÕútÕr. Sistemlerin faz kompozisyonlarÕ ilgili makalelerde (Yue
et al., 2007; Salabat, 2006; Su and Chiang, 2006; Klomkloa et al., 2005;
Antov et al., 2006) mevcut olan faz diyagramlarÕna dayanmaktadÕr. 10 gr
olan son sistem a÷ÕrlÕ÷ÕnÕ ayarlamak için bidestile su kullanÕlmÕútÕr.
Sistemin pH’Õ NaOH veya HCl kullanÕlarak ayarlanmÕútÕr. Fazlar 2–3
dakika hafif bir vorteks ile karÕútÕrÕlmÕú ve faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúmesi
için oda sÕcaklÕ÷Õnda 15 dakika bekletildikten sonra 4000 rpm’de 10
dakika santrifüjlenmiútir (Hettich 30RF, FRG). Alt ve üst fazlar pasteur
pipeti ile dikkatlice birbirinden ayrÕldÕktan sonra hacimleri
kaydedilmiútir. Her bir fazda enzimatik aktivite ve protein miktarÕ
tayinleri yapÕlmÕútÕr. Sulu ikili faz sistemi parametrelerinin analizi için
tüm denemeler oda sÕcaklÕ÷Õnda (25±2oC’de) çift çalÕúÕlmÕútÕr. Sulu ikili
faz sisteminin optimizasyonunda kullanÕlan koúullar sonuçlar ve tartÕúma
bölümünde detaylÕ olarak açÕklanmÕútÕr.
3.5.2 Da÷Õlma parametrelerinin belirlenmesi
Hedef biyomolekülün etkili bir ayrÕmÕnÕn yapÕlabilmesi için fazlar
arasÕndaki
da÷ÕlÕm
davranÕúlarÕ
aúa÷Õdaki
parametrelerin
de÷erlendirilmesi ile mümkündür:
Faz hacim oranÕ (VR); üst fazdaki hacmin (VÜst) alt fazÕn hacmine
(VAlt) oranÕdÕr:
VR
Vüst
Valt
88
Proteinlerin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ (Kp); sÕrasÕyla üst ve alt fazdaki
protein miktarlarÕnÕn oranÕ úeklinde tanÕmlanmaktadÕr:
Kp
Püst
Palt
Püst; üst fazdaki protein konsantrasyonunu, Palt; alt fazdaki protein
konsantrasyonunu ifade edilmektedir.
ønvertaz enziminin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ (Ke); sÕrasÕyla üst ve alt
fazdaki invertaz enziminin aktivitelerinin oranÕ úeklinde belirtilmektedir:
Ke
Aüst
Aalt
Aüst; üst fazdaki invertaz aktivitesini, Aalt; alt fazdaki invertaz aktivitesini
sembolize etmektedir.
Spesifik aktivite (SA); her bir fazdaki enzimatik aktivitenin (U/ml)
yine her fazdaki protein konsantrasyonuna (mg/ml) oranÕ olarak ifade
edilir ve U/mg protein olarak gösterilir:
SA
Bir fazdaki enzimatik aktivite
O fazdaki protein konsantrasyonu
SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF); ise üst fazdaki spesifik aktivitenin
(SA) diyalizatÕn spesifik aktivitesine oranÕ ile hesaplanmaktadÕr ve;
PF
Üst fazdakiSA
DiyalizatÕn SA
89
olarak belirtilmektedir.
ønvertaz enziminin geri kazanÕmÕ (% R); üst fazdaki invertazÕn
enzimatik aktivitesinin sisteme ilave edilen invertazÕn baúlangÕç
aktivitesine oranÕdÕr ve;
R (%)
Üst fazdaki enzimatik aktivite
Sisteme ilave edilen toplam aktivite
úeklinde gösterilir.
Sulu ikili faz sisteminde üst fazÕn verimi (% Y); aúa÷Õdaki ifade ile
hesaplanÕr:
Y (%)
100Vüst K e
Vüst K e Valt
ønvertaz enziminin selektivitesi (Į); ise Ke ve Kp’nin birbirine
oranÕdÕr:
Selektivite (D )
Ke
Kp
90
3.6
Domates
Karakterizasyonu
(Lycopersicon
esculentum)
ønvertazÕnÕn
3.6.1 ønvertaz aktivitesine bazÕ parametrelerin etkisi
3.6.1.1 pH etkisi
Enzimler protein yapÕsÕndaki moleküller olduklarÕ için katalitik
aktiviteleri çevre koúullarÕndan önemli oranda etkilenmektedir.
Bunlardan birisi de ortamÕn pH’sÕdÕr. Enzim aktivitesine pH’Õn etkisi
genellikle optimum pH e÷rileri çizilerek izlenir. Bu grafik ba÷Õl
aktivitenin pH ile de÷iúimini gösterir. pH’nÕn enzim aktivitesine etkisini
incelemek için inkübasyon tamponunun pH’sÕ pH 4,0 ve pH 8,0 arasÕnda
de÷iútirilerek standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü. ønkübasyon
karÕúÕmlarÕnÕn içerdi÷i tampon türü ve pH de÷erleri: asetat (pH 4,0-5,5)
ve fosfat (pH 6,0-8,0) olarak seçildi. Enzim aktivitesi (% Ba÷Õl Aktivite)
ile pH arasÕnda çizilen grafikten enzimin optimum pH de÷eri belirlendi.
Her bir pH de÷eri için iki örnek ve bir kör deneme yapÕlmÕútÕr.
3.6.1.2 SÕcaklÕk etkisi
Enzimlerin katalitik aktivitesi sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕdÕr. Belirli sÕcaklÕk
de÷erlerinin üzerinde enzim proteinin denaturasyonundan dolayÕ
aktivitede düúme gözlenir. Enzim aktivitesine sÕcaklÕ÷Õn etkisi genellikle
optimum sÕcaklÕk e÷risi çizilerek izlenir. Bu grafik ba÷Õl aktivitenin
sÕcaklÕk ile de÷iúimini gösterir. Genellikle inkübasyon süresi arttÕkça
termal denaturasyon nedeniyle optimum sÕcaklÕk düúer.
91
ønvertaz enziminin aktivitesinin sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕlÕ÷ÕnÕ incelemek
ve optimum sÕcaklÕ÷Õ belirlemek amacÕyla inkübasyon sÕcaklÕ÷Õ 4-70oC
sÕcaklÕk aralÕ÷Õnda de÷iútirilerek (4, 22, 37, 44, 50, 60, 70oC) enzim
aktivitesi ölçüldü. Enzim aktivitesi (% Ba÷Õl Aktivite) ile sÕcaklÕk
arasÕnda çizilen grafikten enzimin optimum sÕcaklÕk de÷eri belirlendi.
Her bir deneme seti çift çalÕúÕldÕ.
3.6.1.3 Substrat konsantrasyonu etkisi
Doygunluk substrat konsantrasyonunu ve Km ile Vmax de÷erlerini
belirlemek için düzenlenen deney setinde, 0,2 M asetat tamponunda (pH
5,0) hazÕrlanmÕú 2 M stok sükroz çözeltisi kullanÕlarak farklÕ sükroz
konsantrasyonlarÕnda (0,01–2 M) enzim aktivitesi tayin edildi. Substrat
(Sükroz) konsantrasyonu ile aktivite arasÕnda çizilen grafikten substrat
doygunluk konsantrasyonu belirlendi. 1/S ile 1/V arasÕnda çizilen
Lineweaver-Burk diyagramÕndan Km ve Vmax de÷erleri hesaplandÕ. Her
bir konsantrasyon için iki deneme yapÕldÕ.
3.6.1.4 ønkübasyon süresi
ønkübasyon süresinin enzim aktivitelerine etkisini incelemek için
düzenlenen deney setinde enzim, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 dakika süreyle
37oC’de inkübe edilerek standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü. Her bir
deney seti çift çalÕúÕldÕ.
92
3.6.1.5 Efektör konsantrasyonunun etkisi
Bir enzimin aktivitesi yalnÕzca fiziksel etmenlerden de÷il kimyasal
etmenlerden de etkilenmektedir. Bu etkiler aktiviteyi artÕrÕcÕ (aktivasyon)
veya düúürücü (inhibisyon) yönde olabilir.
NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, MgSO4.7H2O, BaCl2.2H2O, CaCl2,
MnSO4.H2O, ZnSO4.7H2O, Na2CO3, CuSO4.5H2O, FeCl3.6H2O ve
MnCl2.4H2O’ un farklÕ konsantrasyonlarÕ (0,1-1,0-2,5 mM) reaksiyon
ortamÕna eklenerek enzim aktiviteleri üzerine etkileri incelendi.
FarklÕ konsantrasyonlardaki efektörler 0,2 M, pH 5,0 asetat
tamponunda çözülerek örnek tüplerine 0,6 ml ilave edildi. Üzerlerine
sÕrasÕyla 0,2 ml 0,5 M sükroz (asetat tamponunda) ve uygun oranda
seyreltilmiú enzim preparatÕndan 0,2 ml enzim eklenip 37oC’de 30 dakika
inkübe edilerek standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü.
3.6.2 KararlÕlÕk testleri
Enzim
preparatlarÕ
özellikle
endüstriyel
proseslerde
kullanÕlacaklarsa en önemli kriterlerden birisi bu preparatlarÕn
kararlÕlÕ÷ÕdÕr. Enzimin kararlÕlÕ÷Õndan anlaúÕlan belirli çalÕúma
koúullarÕnda enzim aktivitesinin zamana ba÷lÕ olarak korunmasÕdÕr. Bu
sÕradaki enzim aktivite kaybÕ çeúitli nedenlere dayanÕr. Bunlar,
mikrobiyal yÕkÕm ve termik, pH veya kimyasal inaktivasyon olarak
sÕralanabilir. Domatesten saflaútÕrÕlan invertaz enziminin kararlÕlÕ÷ÕnÕ
belirlemek için termal, pH ve depolama kararlÕlÕklarÕ incelenmiútir.
93
3.6.2.1 Termal kararlÕlÕk
Enzimler protein yapÕda olduklarÕ ve ÕsÕya karúÕ kararlÕ
olmadÕklarÕndan, sÕcaklÕk yükseldikçe inkübasyon süresine ba÷ÕmlÕ
olarak aktivite kaybÕ hÕzlanÕr. SÕcaklÕk sabit tutulsa bile yalnÕz
inkübasyon süresinin uzamasÕ bile denaturasyon sonucu aktivite kaybÕna
neden olur.
Termal kararlÕlÕk tayininde, ayni miktarda protein içeren enzimler
önce 30 dakika boyunca farklÕ sÕcaklÕklarda (4, 22, 37, 44, 50, 60, 70oC)
inkübe edildikten sonra standart aktivite ölçüm koúullarÕnda (37oC’de)
aktivite tayinleri yapÕldÕ. Her bir sÕcaklÕk için örnekler çift çalÕúÕlmÕútÕr.
3.6.2.2 pH kararlÕlÕ÷Õ
OrtamÕn pH’sÕnÕn enzim aktivite ve kararlÕlÕ÷Õna etkisini incelemek
amacÕyla düzenlenen deney setinde enzim, farklÕ pH’daki tamponlarda
(asetat: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5, fosfat: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0) 6 saat boyunca
4oC’de bekletildi. ArdÕndan ortamÕn pH’sÕ 5,0’e ayarlanarak standart
koúullarda aktiviteleri ölçüldü. Her bir deneme çift çalÕúÕlmÕútÕr.
3.6.2.3 Depo kararlÕlÕ÷Õ
Depo kararlÕlÕ÷Õ, enzim uygulamalarÕnÕ ilgilendiren önemli bir
parametre olup uzun süre saklama durumunda enzimin aktivite kaybÕnÕn
bir ölçüsüdür. Depo kararlÕlÕ÷ÕnÕ belirlemek için 4 oC’de saklanan
enzimden 2 ay boyunca belirli zaman aralÕklarÕnda örnekler alÕnarak
aktiviteleri optimum koúullarda tayin edildi.
94
4. SONUÇLAR VE TARTIùMA
4.1 ønvertazÕn Domatesten
øzolasyonu ve KÕsmi SaflaútÕrÕlmasÕ
(Lycopersicon
esculentum)
ønvertaz enziminin çok çeúitli uygulama alanlarÕndan dolayÕ, bu
enzimin farklÕ kaynaklardan izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕ son yÕllarda
oldukça büyük önem kazanmÕútÕr. Enzim; bitkisel (Benkeblia et al., 2004;
Fotopoulos, 2005; Lopez et al., 1988; Ishikawa et al., 1989; Nakagawa et
al., 1971; Schaffer, 1986; Krishnan et al., 1985; Singh and Knox, 1984;
Masuda and Sugawara, 1980; Lee and Sturm, 1996; Moriguchi et al.,
1991; Tang et al., 1996; Weil and Rausch, 1990; Obenland et al., 1993;
Miller and Ranwala, 1994; Batta et al., 1991; Rojo et al., 1998; Asthir
and Singh, 1997; Weersaooriya and Yatawara, 2002; Hashizume et al.,
2003; Abdou, 2004; Liu et al., 2006) ve mikrobiyal (Ettalibi and Baratti,
1987; De Rezende and Felix, 1999; Duan et al., 1993; Neumann and
Lampen, 1967; Ishimoto and Nakamura, 1997; Meachum et al., 1971;
Boddy et al., 1993; Ferreira et al., 1991; Moreno et al., 1990; Chen et al.,
1996; Quiroga et al., 1995; De Gines et al., 2000; Liebl et al., 1998;
Chavez et al., 1997; De la Vega et al., 1991; De Aguiar Oliveira and
Park, 1995; Rubio and Maldonado, 1995; Nadkarni et al., 1993; Belcarz
et al., 2002; Ait-Abdelkader et al., 2000; Ghosh et al., 2001; Warchol et
al., 2002; Nguyen et al., 2005) kaynaklardan bilinen izolasyon ve
saflaútÕrma teknikleri kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlmÕú ve
karakterizasyonu yapÕlarak uygulamaya sunulmuútur. ønvertaz, úeker
endüstrisinde (SaldamlÕ, 2005), karbohidrat yapÕ çalÕúmalarÕ ile biyolojik
fonksiyonlarÕn belirlenmesinde (Frevert and Ballou, 1982; Gómez and
Villalonga, 2000; Kern et al., 1992; Zeng and Biemann, 1999),
immobilizasyon çalÕúmalarÕnda (Tomotani and Vitolo, 2006; Bayramo÷lu
95
et al., 2002; Sanjay and Sugunan, 2004; Bagal and Karve, 2005; Gürsel
et al., 2003), transglikozilasyon reaksiyonlarÕnda (Rubio et al., 2002;
Nguyen et al., 2004; L’Hocine et al., 2000; Yanahira et al., 1998) ve
hayvanlar ile insanlarda intestinal sistemde konstipasyon sorununun
giderilmesini sa÷layan oligosakkaritlerin sentezi gibi enzimatik
sentezlerde (Nguyen et al., 2005; Hidaka et al., 1987) önemli uygulama
alanlarÕ bulmuú bir enzimdir. Her ne kadar oldukça yüksek saflÕkta ve
hemen hemen tamamen homojen bir invertaz preparatÕnÕn
hazÕrlanabildi÷i çok az sayÕda çalÕúma mevcut ise de, önemli olan daha
sonraki çalÕúmalarda kullanÕlabilecek amaca uygun bir protein
preparatÕnÕn hazÕrlanmasÕdÕr. ønvertazlar genellikle hücre içerisinde ve
di÷er çeúitli glikozidazlarla bir arada bulunurlar. Bu nedenle ço÷u kez bu
aktiviteleri birbirinden ayÕrmak oldukça zor olmaktadÕr. E÷er hazÕrlanan
enzim preparatÕ di÷er glikozidazlarca kontamine edilmiyor ve geniú bir
aglikon spesifikli÷ine sahip ise yukarÕda belirtilen bir çok kullanÕm alanÕ
için uygun olacaktÕr.
Bu çalÕúmada, enzim kayna÷Õ olarak domates (Lycopersicon
esculentum) seçilmiútir. ønvertaz enzimini içeren farklÕ bitkisel kaynaklar
(domates, karpuz, kavun, havuç, elma, armut, üzüm, turp, patates, soya
filizi) protein miktarlarÕ, aktivite ve spesifik aktivite de÷erleri açÕsÕndan
kÕyaslanmÕútÕr. Enzim kayna÷Õ tarama çalÕúmasÕ sonucunda, domatesin
di÷er enzim kaynaklarÕna göre dikkate de÷er oranda daha yüksek bir
invertaz aktivitesine sahip olmasÕ ve di÷er pek çok kaynakta mevcut
úeker oranÕnÕn domatese kÕyasla oldukça yüksek olmasÕ ve bu nedenle de
özellikle aktivite tayin aúamalarÕnda giriúime sebep olmalarÕ nedeniyle
sulu ikili faz sistemi ile invertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda domatesin
daha uygun bir kaynak olaca÷Õna karar verilmiútir. AyrÕca domates,
ülkemizde her mevsim kolaylÕkla temin edilebilen, ucuz ve bol bulunan
bir kaynak olmasÕ, invertaz aktivitesinin bu kaynakta yüksek oranda
96
bulunmasÕ ve güneú altÕnda yetiúen domatesteki enzimlerin termal
kararlÕlÕ÷ÕnÕn genellikle yüksek olmasÕndan dolayÕ da tercih edilmiútir.
Enzim, “Materyal ve Metod” bölümünde açÕklandÕ÷Õ gibi bilinen genel
yöntemler kullanÕlarak domatesten izole edilip, çalÕúmanÕn amacÕna
yönelik uygun kÕsmi saf preparat hazÕrlanmÕútÕr. ÇalÕúmada kullanÕlan
invertaz preparatÕnÕn protein içeri÷i, aktivite ve spesifik aktivite de÷erleri
ilgili bölümlerde ve çizelgelerde verilmiútir.
Domates homojenatÕndan (0,177 mg protein/ml, 22 U/mg protein)
yola çÕkarak sÕrasÕyla % 85’lik amonyum sülfat çöktürmesi (2,17±0,08
mg protein/ml, 56±5 U/mg protein), sulu ikili faz sistemi (% 15 PEG–
3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 1,25 ml enzim) (0,0812 mg
protein/ml, 377 U/mg protein) ve ultrafiltrasyon (0,291 mg protein/ml,
677 U/mg protein) ile enzim homojenata kÕyasla 31 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr.
ønvertazÕn saflÕ÷ÕnÕn kontrolü ve molekül kütlesi tayini % 10’luk SDSPAGE ile gerçekleútirilmiútir. Elektroforez sonrasÕ jel, Coomasie
Brilliant-Blue metodu ile boyanmÕútÕr. Enzimin saflÕ÷ÕnÕn kontrolü ve
molekül kütlesinin tayini için yapÕlan elektroforez sonucu ùekil 4.1’de
verilmiútir. Elektroforegramdan görüldü÷ü gibi, domatesten izole
edilerek hazÕrlanan enzim preparatÕ oldukça homojen bir band
vermektedir. Domates invertazÕnÕn molekül kütlesi Vilber Lournat
ønfinity Capt Software Ver. 12,8 programÕ ile 19,53 kDa olarak
hesaplanmÕútÕr.
97
ùekil 4.1 Domates invertazÕnÕn SDS-Poliakrilamid jel elektroforezi
A-B) ATPS sonrasÕ invertaz enzim preparatÕ (a; 15 ȝL ve b; 25 ȝL örnek uygulanmÕútÕr)
C) % 85’lik amonyum sülfat çöktürmesi sonrasÕ enzim diyalizatÕ (20 ȝL örnek
uygulanmÕútÕr)
D) Sigma Moleküler kütle standartlarÕ (SÕ÷Õr albumini; 66 kDa, yumurta albumini; 45
kDa; tavúan kasÕ G–3-P DH enzimi; 36 kDa, sÕ÷Õr karbonik anhidrazÕ; 29 kDa, sÕ÷Õr
pankreas tripsinojen; 24 kDa, soya fasulyesi tripsin; 20 kDa, sÕ÷Õr sütü Į-lactalbumini;
14 kDa)
98
ønvertazlarÕn moleküler kütleleri ve yapÕlarÕ kaynaktan kayna÷a ve
kullanÕlan tayin yöntemine ba÷lÕ olarak farklÕlÕk göstermektedir. Örne÷in;
mango invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyon kromatografisi ile 68
kDa, SDS-PAGE ile 65,5 kDa olarak bulunmuútur (Rahman et al., 2001).
ùeker kamÕúÕ invertazÕnÕn molekül kütlesinin SDS-PAGE ile 28 kDa
oldu÷u belirtilmiútir (Masuda and Sugawara, 1980). Woodfordia
fruticosa invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyonu ile 280 kDa olarak
bulunmuú ve enzimin SDS-PAGE ile 66 kDa, 43 kDa ve 40 kDa molekül
kütlesine sahip heterotrimerik bir protein oldu÷u belirlenmiútir
(Weersaooriya and Yatawara, 2002). ùeker kamÕúÕ nötral invertazÕnÕn 60
kDa molekül kütlesine sahip monomeri oldu÷u ve monomer, dimer ve
tetramer olarak katalitik aktivite gösterdi÷i tespit edilmiútir (Vorster and
Botha, 1998). Fusarium oxysporum invertazÕnÕn invertaz P-1 ve invertaz
P-2 olarak adlandÕrÕlan iki formu bulundu÷u ve bu iki enzimin SDSPAGE ile molekül kütlelerinin sÕrasÕyla 108 kDa ve 84 kDa oldu÷u
belirlenmiútir (Nishizawa et al., 1980). Ricinus communis ’dan
saflaútÕrÕlan invertazÕn ise homoheptamerik bir protein olup her bir alt
birimin 11 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel filtrasyonu ile
enzimin molekül kütlesi 78 kDa olarak belirlenmiútir (Prado et al., 1985).
Havuç invertazÕnÕn alkali invertaz ve nötral invertaz olmak üzere iki
formu vardÕr. Alkali invertazÕ homotetramerik bir protein olup her bir alt
birimin 126 kDa’luk oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenmiú, jel fitrasyonu ile
enzimin 504 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u belirtilmiútir. Nötral
invertazÕ ise homooktamerik bir protein olup her bir alt birimin 57 kDa
oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenmiú ve jel filtrasyonu ile enzimin 464 kDa
molekül kütlesine sahip oldu÷u bulunmuútur (Lee and Sturm, 1996).
Pseudomonas fluorescens invertazÕnÕn SDS-PAGE ile yapÕlan analiz
sonucu biri 19 kDa ve di÷eri 21 kDa olan iki tane protein bandÕ
görülmüútür (Bugbee, 1984). Equisetum giganteum L invertazÕ
homopentamerik bir protein olup 18 kDa’luk her bir alt birim 91 kDa
99
molekül kütlesine sahip enzimi oluúturmaktadÕr (Leal et al., 1999).
Domates invertazÕnÕn molekül kütlesi, bitkisel kaynaklÕ di÷er
invertazlarla ilgili literatür verileri ile uyum içerisindedir. Genellikle
bitkisel kaynaklÕ invertazlarÕn molekül kütlesi 11–100 kDa arasÕnda
de÷iúmektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.2).
4.2 Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle Domates (Lycopersicon
esculentum) ønvertazÕnÕn SaflaútÕrÕlmasÕ
Domatesten izole edilerek amonyumsülfat çöktürmesi ile
deriútirilen invertaz enziminin (2,17 mg protein/ml; 56,5 U/mg)
saflaútÕrÕlmasÕnda sulu ikili faz sistemlerinden polimer-tuz sistemi
kullanÕlmÕútÕr. Bu amaçla, polimer olarak polietilenglikol (PEG) ve tuz
olarak farklÕ sülfat tuzlarÕ tercih edilmiútir. ATPS’de faz oluúturan
bileúenlerin seçimi en önemli noktalardan birisidir. Bu sistemlerde
moleküllerin fazlar arasÕndaki da÷ÕlÕm davranÕúlarÕ hidrofobik
etkileúimler, hidrojen ba÷larÕ, yük, sterik etkiler ve biyomoleküllerin
özellikleri gibi çeúitli faktörlerden dolayÕ oldukça kompleks bir olaydÕr.
Bir baúka ifadeyle, uygun sistemlerin seçimi ve dizaynÕna yol gösterecek
kapsamlÕ ve mekanistik bir teori mevcut de÷ildir. Bu yüzden, bu metodun
uygulamalarÕnda biyomoleküllerin optimum da÷ÕlÕmÕnÕ sa÷layan en
uygun ve iyi bir sistemin hazÕrlanabilmesi için deneysel optimizasyon
çalÕúmalarÕna ihtiyaç duyulur. Bu çalÕúmada, tercih edilen sulu ikili faz
sistemleri (PEG-Tuz) yüksek seçimlilik, düúük maliyet ve düúük
viskoziteden dolayÕ birçok sisteme kÕyasla daha avantajlÕ sistemlerdir.
ATPS’de faz oluúturucu polimer olarak PEG’in seçilmesindeki ana
kriter; düúük maliyet ve dengeye çok hÕzlÕ ulaúmasÕdÕr. Bu sistemlerde
di÷er önemli bir bileúen tuzdur. ATPS sistemlerinin oluúturulmasÕnda
farklÕ türde tuzlar (fosfat, sitrat, sülfat gibi) kullanÕlabilmektedir. Bu
100
çalÕúmada, polimer-tuz sistemlerinin hazÕrlanmasÕnda sÕklÕkla kullanÕlan
tuzlardan birisi olan sülfat tuzlarÕ tercih edilmiútir.
ønvertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlacak ikili sulu faz
sistemini (PEG-sülfat) optimize etmek ve böylece enzimi iyi bir verimle
yüksek oranda saflaútÕrmak için sistemi etkileyen temel parametreler
(PEG molekül kütlesi ve konsantrasyonu, tuz türü ve konsantrasyonu,
pH, kosolut varlÕ÷Õ, türü ve konsantrasyonu) incelenmiútir. 10 ml’lik sulu
ikili faz sistemi, 15 ml’lik dereceli santrifüj tüpleri kullanÕlarak uygun tür
ve konsantrasyonlardaki PEG ve tuzlar ile bölüm 3.5.1’de açÕklandÕ÷Õ
gibi hazÕrlanmÕútÕr.
4.2.1 Tuz türünün belirlenmesi
PEG–2000 ve çeúitli sülfat tuzlarÕnÕn [(NH4)2SO4, MgSO4 ve
Na2SO4] farklÕ konsantrasyonlarÕ ile hazÕrlanan sulu ikili faz
sistemlerinde domates invertazÕnÕn da÷ÕlÕmÕ gerçekleútirilmiú ve sonuçlar
Çizelge 4.1’de verilmiútir.
Çizelge 4.1’den görüldü÷ü gibi domates invertazÕ yukarÕdaki faz
kompozisyonlarÕnÕn ço÷unda da÷Õlabilmektedir. Faz ayrÕmÕndan sonra iki
faz oluúur; PEG’ce zengin üst faz ile tuzca zengin alt faz. Sulu ikili faz
sistemleri çalÕúmalarÕnda invertaz enzimi ço÷unlukla seçimli bir úekilde
PEG’ce zengin üst faza da÷ÕlmaktadÕr. ønvertazÕn alt fazdan geri
kazanÕmÕ oldukça düúüktür. Genellikle, negatif yüklü proteinler PEG/Tuz
sistemlerinde üst faza, pozitif yüklü proteinler ise alt faza seçimli olarak
da÷ÕlmaktadÕr (Isable and Otero, 2003). Bu nedenle üst faza da÷Õlan
invertaz enziminin negatif yüklü olmasÕ muhtemeldir. En yüksek spesifik
aktivite (SAüst) ve saflaútÕrma faktörü (PF) de÷erleri Na2SO4 tuzu ile
101
hazÕrlanan sistemlerden elde edilmiútir. (NH4)2SO4 ve MgSO4 varlÕ÷Õnda
invertaz enzim aktivitesi azalmaktadÕr. AyrÕca Na2SO4 tuzu, (NH4)2SO4
ve MgSO4 tuzlarÕna göre daha kolay faz oluúturmasÕnÕn yanÕnda
proteinler arasÕndaki hidrofobik etkileúimleri çok daha fazla arttÕrma
yetene÷ine sahip oldu÷undan invertaz enzimini daha kuvvetli bir úekilde
PEG fazÕna yönlendirmektedir (Silva et al., 2007; Yue et al., 2007).
PEG/Na2SO4 sistemi invertaz enziminin ço÷unu üst faza
yönlendirdi÷inden enzimin sulu ikili faz sisteminde da÷ÕlÕmÕ hidrofobisite
ile etkilenmektedir. Fazlar arasÕndaki hidrofobik farkÕn arttÕrÕlmasÕ PEG
ve protein molekülleri arasÕndaki hidrofobik etkileúimlerin olma
olasÕlÕ÷ÕnÕ daha da arttÕraca÷Õndan daha iyi bir saflaútÕrmaya neden
olacaktÕr. Bu nedenle daha sonraki çalÕúmalarda tuz olarak Na2SO4
kullanÕlarak PEG / Na2SO4 sistemi hazÕrlanmÕútÕr. Sülfat tuzlarÕ proteinler
arasÕndaki hidrofobik etkileúimleri destekleme yetene÷ine sahip olmasÕ
ve ayrÕca proteinlerin yüzeyinden tercihen uzaklaútÕrmasÕ nedeniyle
tercih edilmektedir (Su and Chiang, 2006).
% 15 PEG–2000 ve % 15 Na2SO4 faz sistemi en yüksek saflaútÕrma
(3,3 kat) ve geri kazanÕm (% 152) de÷erlerini vermektedir. Sistem en
yüksek Kp de÷erine sahip olmasÕna ra÷men fazlarÕn ayrÕldÕ÷Õ kesitte
protein çökelmesi meydana gelmektedir. Bu nedenle invertaz enziminin
da÷ÕlÕmÕna PEG molekül kütlesinin etkisinin incelenmesinde protein
çökelme olasÕlÕ÷ÕnÕ minimumda tutmak için % 12,5 PEG (2000) / % 12,5
Na2SO4 ile hazÕrlanan sistem kullanÕlmÕútÕr.
102
Çizelge 4.1 ønvertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna faz bileúimi ve tuz türünün etkisi.
Faz Kompozisyonu (%, w/w)
VR
SAüst SAalt
Kp
PF
R (%)
% 10 PEG–2000 + % 10 (NH4) 2SO4*
--
--
--
--
--
--
% 10 PEG–2000 + % 15 (NH4) 2SO4
0,3
27
0,13
0,31
0,48
11,6
% 15 PEG–2000 + % 10 (NH4)2SO4*
--
--
--
--
--
--
% 15 PEG–2000 + % 15 (NH4) 2SO4
0,56
29
0,11
0,5
0,53
18
% 10 PEG–2000 + % 10 MgSO4*
--
--
--
--
--
--
% 10 PEG–2000 + % 15 MgSO4
2,3
42
11
1,14
0,74
62
% 15 PEG–2000 + % 10 MgSO4*
--
--
--
--
--
--
% 15 PEG–2000 + % 15 MgSO4
1,63
29
10
0,79
0,53
0,18
% 10 PEG–2000 + % 10 Na2SO4
0,3
38
91
0,28
0,68
13,3
% 10 PEG–2000 + % 15 Na2SO4
0,72
36
12
1,15
0,64
24
% 15 PEG–2000 + % 10 Na2SO4
1,5
74
35
1,31
1,32
76
% 15 PEG–2000 + % 15 Na2SO4
0,67
185
10
1,87
3,3
152
* Bu faz kompozisyonlarÕnda faz oluúumu gözlenmemiútir.
103
4.2.2
PEG molekül kütlesinin belirlenmesi
Sulu ikili faz sistemleriyle gerçekleútirilen ekstraksiyonlarda
seçimli bir úekilde saflaútÕrma sa÷layan optimum sistemi bulmak
hedeflenir. Bundan dolayÕ sulu ikili faz sisteminin optimizasyonunda en
uygun polimer molekül kütlesinin seçimi anahtar noktalardan bir
tanesidir. Polimer molekül kütlesi materyalin da÷ÕlÕmÕnda önemlidir: Ya
faz diyagramÕnÕ de÷iútirerek (örne÷in faz bileúimine etki ederek) yada
polimer-enzim etkileúimlerinin sayÕsÕnÕ de÷iútirerek materyalin fazlara
da÷ÕlÕmÕnÕ etkiler (Antov et al., 2006). PEG molekül kütlesinin faz
hacimlerinin oranÕna (VR), enzimin da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke), proteinlerin
da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp), saflaútÕrma katsayÕsÕ ve enzimin geri
kazanÕmÕna etkisi % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sistemi kullanÕlarak
incelenmiú ve sonuçlar Çizelge 4.2’de verilmiútir.
Çizelge 4.2 ønvertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna PEG molekül kütlesinin etkisi.
PEG
MW
VR
Ke
Kp
PF
R
(%)
1000
0,43
0,35
0,76
0,62
25,8
2000
0,43
0,16
0,51
0,45
13,8
3000
0,45
1,11
0,42
2,37
68,2
4000
0,41
0,51
0,42
1,39
37,9
6000
0,33
0,62
0,27
2,05
38,7
8000
0,33
0,15
0,23
0,55
9,25
ønvertaz enziminin PEG/Na2SO4 sisteminde da÷ÕlÕmÕ PEG’in
molekül kütlesine ba÷lÕdÕr. Bu özellik genelde PEG’in zincirleri ve
104
biyomateryalin hidrofobik alanÕ arasÕndaki hidrofobik etkileúimlere
dayandÕrÕlmaktadÕr. Genellikle PEG molekül kütlesinin artmasÕ ile
ekstraksiyon verimi azalmaktadÕr. Yüksek molekül kütlelerinde PEG ve
protein domaini arasÕndaki etkileúim düúmektedir ve bunun sonucunda
Ke düúmektedir. Bunun sebeplerinden bir tanesi polimerin molekül
a÷ÕrlÕ÷Õndaki artÕúÕn polimerin dÕúlama etkisini yükseltmesidir. Bunun
sonucunda polimer kendi içerisinde oluúturdu÷u intramoleküler
hidrofobik etkileúimler ile daha sÕkÕ bir konformasyon kazanÕr ve bu
yüzden biyomolekülün üst faza da÷ÕlÕmÕnÕ engeller. Buda yüksek
viskozite ve düúük tekrarlanabilirlik ile sonuçlanÕr (Mohamadi et al.,
2007). Düúük molekül a÷ÕrlÕ÷Õna sahip polimerlerde dÕúlama etkisi
azalaca÷Õndan istenilen protein yanÕnda istenmeyen proteinler de üst faza
geçecek ve elveriúli bir ayrÕm gerçekleútirmek için yetersiz kalacaktÕr
(Cascone et al., 1991). Bu yüzden genellikle orta seviyede molekül
kütlesine sahip PEG türleri sulu ikili faz sistemi için en iyi seçim
olacaktÕr (Su and Chiang, 2006).
Çizelge 4.2’den görüldü÷ü gibi dengeden sonra sistemdeki faz
hacim oranlarÕ (VR) 0.45-0.33 arasÕnda çok az de÷iúmektedir. Bu nedenle
da÷Õlma parametrelerindeki farklanmanÕn PEG molekülünün boyutuna
ba÷lÕ oldu÷u açÕktÕr. ùekil 4.2’den görüldü÷ü gibi PEG molekül
kütlesinin PEG-1000’den PEG-8000’e artmasÕ ile polimerin dÕúlama
etkisi de arttÕ÷Õndan proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) giderek
azalmaktadÕr. PEG–1000 düúük molekül a÷ÕrlÕ÷Õna sahip oldu÷undan ve
dÕúlama etkisi di÷er PEG molekül a÷ÕrlÕklarÕna daha göre az oldu÷undan
istenilen protein yanÕnda istenmeyen proteinleri de üst faza çekmektedir
ve bu yüzden de en yüksek Kp de÷erine sahiptir. Pek çok protein için
benzer davranÕúa çeúitli PEG/Dekstran ve PEG/Tuz sistemlerinde
rastlanmaktadÕr (Engel et al., 2000; Albertsson et al., 1990; Schmidt et
al., 1994).
105
0,8
0,7
0,6
Kp
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1000 2000 3000 4000 6000 8000
Protein da÷Õlma 0,76 0,51 0,42 0,42 0,27 0,23
katsayÕsÕ (Kp)
PEG molekül kütlesi
ùekil 4.2 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül kütlesinin protein
da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp) etkisi
ùekil 4.3’den görüldü÷ü gibi, PEG’in molekül kütlesi artÕkça
hidrofobik karakteri de artmakta ve invertaz enzimi daha seçimli
da÷ÕlmaktadÕr. PEG molekül a÷ÕrlÕ÷Õ 1000’den 3000’e arttÕ÷Õnda enzimin
da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) yaklaúÕk 3,1 kat artmaktadÕr ve PEG–3000
molekül a÷ÕrlÕ÷Õnda en yüksek saflaútÕrma katsayÕsÕ (2,37 kat) ve geri
kazanÕm de÷erine (% 68,2) ulaúÕlmaktadÕr. PEG–6000 de yüksek bir
saflaútÕrma katsayÕsÕ (2,05 kat) göstermektedir. Ancak, PEG-4000’den
itibaren ortamÕn viskozlu÷u artmaktadÕr. PEG 3000, 4000 ve 6000’de en
yüksek Ke de÷erlerine ulaúÕlmÕútÕr ve bu sonuçlar di÷er literatürlerle
benzerlik göstermektedir (He et al., 2005; Mohamadi et al., 2007; Engel
et al., 2000). PEG–8000 ise, çok yüksek molekül a÷ÕrlÕklarda karúÕlaúÕlan
dÕúlama etkisi ile invertaz enziminin üst faza yönelimini
engellenmektedir (Mohamadi et al., 2007; Engel et al., 2000). PEG
molekül kütlesinin enzimin da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke), proteinlerin
106
da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp), saflaútÕrma katsayÕsÕ(PF) ve enzimin geri
kazanÕmÕna etkisi kÕyaslandÕ÷Õnda PEG–3000’in sistem için uygun
polimer molekül kütlesi oldu÷una karar verilmiútir.
1,2
1
Ke
0,8
0,6
0,4
0,2
0
ønvertaz
enziminin
da÷Õlma
katsayÕsÕ (Ke)
1000 2000 3000 4000 6000 8000
0,35
0,16
1,11
0,51
0,62
0,15
PEG molekül kütlesi
ùekil 4.3 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül kütlesinin invertaz
enziminin da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke) etkisi
4.2.3
PEG (3000) konsantrasyonunun belirlenmesi
ønvertaz enziminin PEG/Na2SO4 sisteminde da÷ÕlÕmÕna PEG
konsantrasyonunun etkisini incelemek amacÕyla PEG’in farklÕ
konsantrasyonlarÕ (% 10-20) ve % 12,5 Na2SO4 kullanÕlmÕú ve sonuçlar
ùekil 4.4’de gösterilmiútir.
107
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
10
12,5
15
17,5
20
SaflaútÕrma
KatsayÕsÕ
0,54
2,37
2,66
1,31
1,68
Protein da÷Õlma
katsayÕsÕ (Kp)
0,3
0,42
0,63
0,8
0,86
Verim (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
4
33
67,5
55
81
PEG-3000 Konsantrasyonu (%, w/w)
ùekil 4.4 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz
ekstraksiyonuna ve da÷ÕlÕmÕna etkisi
Genellikle polimer konsantrasyonun artmasÕ ile fazlar arasÕnda
hidrofobik fark artacaktÕr. Bunun sonucunda protein ve PEG molekülleri
arasÕndaki hidrofobik etkileúimler artacak ve proteinler üst faza do÷ru
yönelecektir (Vaidya et al., 2006). ùekil 4.4’den görüldü÷ü gibi polimer
konsantrasyonun artmasÕ ile alt fazda bulunan proteinler üst faza do÷ru
yönelmektedirler. PEG konsantrasyonundaki bu artÕú ile Kp de÷erleri
0,3’den 0,86’ya ve verim ise % 4’ten % 81’ye kadar çÕkmaktadÕr.
Polimer konsantrasyonu invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕnda çok etkilidir.
Ancak % 20 PEG–3000 konsantrasyonunda % 81’lik bir verim elde
edilmesine ra÷men üst fazda invertaz enzimi yanÕnda istenmeyen di÷er
proteinlerde
bulundu÷undan
çok
iyi
bir
saflaútÕrma
gerçekleútirilememektedir. Fakat invertaz enzimi polimer (PEG–3000)
108
konsantrasyonu arttÕkça özellikle % 10’dan % 15’e geçildi÷inde üst faza
yaklaúÕk 27,2 kat daha seçimli bir da÷ÕlÕm göstermekte (ùekil 4.5) ve en
yüksek saflaútÕrma katsayÕsÕna (2,66 kat) sahip olmaktadÕr. Bu nedenle en
uygun PEG konsantrasyonu saflaútÕrma katsayÕsÕ açÕsÕndan % 15 olarak
seçilmiútir.
6
5
Ke
4
3
2
1
0
ønvertaz
da÷Õlma
katsayÕsÕ
(Ke)
10
12,5
15
17,5
20
0,13
1,11
3,54
1,83
5,46
PEG-3000 Konsantrasyonu (% ,w/w)
ùekil 4.5 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG-Na2SO4 sisteminde invertaz da÷Õlma
katsayÕsÕna (Ke) etkisi
4.2.4
Na2SO4 konsantrasyonunun belirlenmesi
ønvertaz enziminin PEG/Na2SO4 sisteminde da÷ÕlÕmÕna tuz
konsantrasyonunun etkisini incelemek için tuzun farklÕ konsantrasyonlarÕ
(% 10–16) ve % 15 PEG-3000 kullanÕlmÕú ve sonuçlar ùekil 4.6’ da
verilmiútir.
160
3
140
2,5
120
PF
3,5
100
2
80
1,5
60
1
40
0,5
20
0
10
11 11,5 12 12,5 13
14
15
16
G eri k a za n Õm (% )
109
0
SaflaútÕrma katsayÕsÕ 0,47 1,41 2,74 3,33 2,66 2,25 1,82 1,88 1,3
(PF)
Geri kazanÕm (%) 16,7 53,2 106 134 116 110 94 97 70
Na2SO4Konsantrasyonu(%, w/w)
ùekil 4.6 Na2SO4 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna
ve da÷ÕlÕmÕna etkisi
Sulu ikili faz sistemlerinde tuz konsantrasyonu enzimin yüzey
özelliklerini de÷iútirmekden sorumludur. Tuz konsantrasyonun artmasÕ
ile proteinler daha hidrofobik olaca÷Õndan da÷ÕlÕmlarÕ üst faza gitme
e÷iliminde olacaktÕr. Bununla birlikte tuz konsantrasyonunun artmasÕ ile
proteinler üst fazdan geri çevrilmektedir ve proteinlerin aúÕrÕsÕ faz
ayrÕmÕnÕn gerçekleúti÷i yerde çökmektedir. AyrÕca, enzimler yüksek tuz
konsantrasyonunun “salting-out” etkisi ile denatüre olduklarÕndan
aktiviteleri ve geri kazanÕmlarÕ düúmektedir(Vaidya et al., 2006;
Klomklao et al., 2005; Yue et al., 2007). Bu nedenle tuz
konsantrasyonun belirlenmesi invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕ ve geri
kazanÕmÕ açÕsÕndan kritiktir. ùekil 4.6’den görülece÷i üzere Na2SO4
110
konsantrasyonu % 10’dan % 12’ye arttÕrÕldÕ÷Õnda saflaútÕrma katsayÕsÕ
yaklaúÕk 7,1 kat artarak 0,47’den en yüksek de÷eri olan 3,33’e çÕkmakta,
enziminin geri kazanÕmÕ % 134 olmaktadÕr. Tuz konsantrasyonunun %
12’nin üzerine çÕkmasÕ ile enzimin aktivitesi ve geri kazanÕm de÷erleri
azalmaktadÕr. AyrÕca % 15–16 gibi yüksek Na2SO4 konsantrasyonunda
invertaz enziminin fazlarÕn ayrÕldÕ÷Õ kesitte çöktü÷ü gözlenmiútir. Benzer
davranÕúa literatürlerde pek çok enzim için rastlanmÕútÕr (Yue et al.,
2007). ùekil 4.7’da görüldü÷ü gibi tuz konsantrasyonun % 10’dan %
16’ya arttÕrÕlmasÕ protein da÷Õlma katsayÕsÕnÕ (Kp) 0,48’den 1,12’ye
arttÕrmaktadÕr. Bunun nedeni, tuz konsantrasyonun artmasÕ ile alt fazda
bulunan proteinlerin hidrofobisitesinin giderek artmasÕ ve yönelimlerinin
hidrofobik üst faza do÷ru olmasÕdÕr. Sonuç olarak, enzimin da÷Õlma
katsayÕsÕ (Kp), saflaútÕrma katsayÕsÕ ve geri kazanÕmÕ açÕsÕndan
çalÕúmanÕn devamÕnda optimum Na2SO4 konsantrasyonu % 12 olarak
seçilmiútir.
Kp
1,5
1
0,5
0
10
11 11,5 12 12,5 13
14
15
16
0,48 0,52 0,54 0,56 0,63 0,78 0,96 1,05 1,12
Proteinlerin
da÷Õlma katsayÕsÕ
(Kp)
Na2SO4 konsantrasyonu (%, w/w)
ùekil 4.7 % 15 PEG-Na2SO4 sisteminde Na2SO4 konsantrasyonunun protein da÷ÕlÕma
katsayÕsÕna (Kp) etkisi
111
4.2.5
pH etkisinin belirlenmesi
Sulu ikili faz sisteminde biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕnÕ etkileyen bir
baúka önemli faktör sistemin pH’sÕdÕr. Biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕ
sistemde bulunan iyonlarÕn türü ve konsantrasyonu ile belirlenmektedir.
pH, saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin ve iyon kompozisyonunun
yüküne, kontaminantlarÕn yüzey karakteristi÷ine etki eder ve fazlar
arasÕnda da÷ÕlÕmÕn farklÕlaúmasÕna sebep olur (Mohamadi et al., 2007).
PEG / Tuz sistemlerinde genellikle asidik izoelektrik noktaya (pI) sahip
negatif yüklü proteinlerin büyük bir kÕsmÕ üst faza ve pozitif yüklü
proteinler ise alt faza gitmektedir. pH’Õn yükselmesi ile proteinler negatif
yüklü hale gelecektir ve beklenildi÷i gibi PEGce zengin üst faz ile
proteinler arasÕndaki etkileúimler daha kuvvetli olacak ve proteinlerin
da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) büyüyecektir (Albertsson, 1986; Rito-Palomares,
2004; Hatti-Kaul, 1999).
PEG/ Na2SO4sisteminde invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna pH’Õn
etkisini incelemek için sistemin pH’sÕ 4.5-7.5 arasÕnda de÷iútirilmiú ve
sonuçlar ùekil 4.8’de verilmiútir. ùekilden görüldü÷ü gibi, pH 4.5’da
enzim % 73 verim ile 4.4 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. Bu pH de÷erinin altÕnda ve
üstündeki pH de÷erlerinde saflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) farklanÕrken verim
hemen hemen hiç de÷iúmemiútir. ùekil 4.9’den görüldü÷ü gibi, invertaz
enziminin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) çok kararsÕzdÕr. Bitkisel kaynaklÕ
invertazlarÕn izoenzimlerinin izoelektrik noktasÕ (pI) 4.8–7.4 arasÕnda
farklÕlÕk göstermektedir. Bu yüzden sulu ikili faz sistemlerinde sistemin
pH’Õ, invertazlarÕn da÷ÕlÕmÕna düzensiz etki etmektedir. Benzer bir durum
patates polifenol oksidaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕ sÕrasÕnda da
görülmektedir (Vaidya et al., 2006). øzoelektrik noktanÕn üstündeki pH
de÷erlerinde, iyonik etkileúimler hidrofobik da÷ÕlÕmÕndan üstün gelecek
112
5
PF
4
3
2
1
0
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
80
70
60
50
40
30
20
10
0
V erim (% )
ve invertaz enzimi üst fazda kalma e÷ilimi gösterecektir. ùekil 4.10’dan
görüldü÷ü gibi pH’Õn yükselmesiyle proteinler negatif yüklü hale geçerek
PEGce zengin üst faza hareket etmekte ve proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕ
(Kp) 0,47’den 0,74’e çÕkmaktadÕr. Sonuç olarak, PEG/ Na2SO4 sulu ikili
faz sistemi ile invertazÕn saflaútÕrÕlmasÕnda en uygun pH 4.5 olarak
belirlenmiútir.
3,3 4,4 3,3 3,8 3,6 3,1 2,7 1,3
SaflaútÕrma
katsayÕsÕ (PF)
Verim (%) 69,9 73,4 65 71 70 72 73 60
pH
ùekil 4.8 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷ÕlÕmÕna
pH’Õn etkisi
113
4,5
4
3,5
Ke
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
ønvertaz enziminin
da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke)
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
3,5
4,1
3,5
3,7
3,6
3,9
4
2,3
pH
ùekil 4.9 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’Õn invertaz da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke)
Kp
etkisi
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
Protein da÷ÕlÕm 0,47 0,48 0,56 0,58 0,59 0,63 0,68 0,74
katsayÕsÕ (Kp)
pH
ùekil 4.10 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’Õn protein da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp)
etkisi
114
4.2.6
Kosolut tuz türü ve konsantrasyonun
belirlenmesi (øyonik úiddetin etkisinin belirlenmesi)
etkisinin
Sulu ikili faz sistemlerinde tuzlar genellikle proteinlerin da÷ÕlÕmÕnÕ
geliútirmek için kullanÕlÕrlar. FarklÕ iyonlar fazlara karúÕ farklÕ ilgi
gösterdiklerinden fazlar arasÕnda meydana gelen itici güç sebebiyle
iyonlarÕn da÷ÕlÕmÕ düzensiz olacaktÕr. Bu elektrokimyasal itici güç her bir
fazdaki elektrostatik potansiyel farkÕn olmasÕndan dolayÕ oluúmaktadÕr.
Bu potansiyel fark, iki faz için iyonlarÕn farklÕ afiniteleri tarafÕndan
oluúturulmaktadÕr. Sonuçta elektrostatik potansiyel farklanma
proteinlerin da÷ÕlÕmÕnÕ etkilemektedir. Sulu ikili faz sistemlerinde
iyonlarÕn da÷ÕlÕmÕ Hofmeister serisini takip etmektedir; kaotropik
(hidrofobik) karakterdeki iyonlar hidrofobik karakterdeki faza do÷ru
da÷ÕlmaktadÕr (Persson et al., 1999b).
KCl, NaCl, Na2CO3, MgSO4, MnCl2 ve MgCl2 tuzlarÕ % 15 PEG–
3000 / % 12 Na2SO4 (pH 4,5) sistemlerine çeúitli konsantrasyonlarda
ilave edilerek iyonik úiddetin invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna etkisi
incelenmiútir. Sisteme ilave edilen kosolut türü ve konsantrasyonuna
ba÷lÕ olarak saflaútÕrma katsayÕsÕ ve verinm de÷erlerinin de÷iúimi ùekil
4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.17 ve 4.18’de verilmiútir.
ùekil 4.17 ve ùekil 4.18’den görüldü÷ü gibi MnCl2 ve MgCl2
tuzlarÕnÕn farklÕ konsantrasyonlarÕ kullanÕlarak hazÕrlanan sistemlerde
invertaz enziminin saflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) 0,5–1,8 arasÕnda
de÷iúmektedir. AyrÕca bu iki tuz ile elde edilen maksimum verim MnCl2
(% 1) için % 63 ve MgCl2 (% 2,5) için % 43 dür. Bu nedenle bu iki tuzun
varlÕ÷ÕnÕn enzimin da÷ÕlÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕna önemli bir etkisi
olmamÕútÕr. Benzer bir úekilde NaCl (ùekil 4.14), Na2CO3 (ùekil 4.15) ve
115
MgSO4 (ùekil 4.16) tuzlarÕnÕn sisteme eklenmesi ile enzimin
saflaútÕrÕlmasÕnda çok etkili olmadÕ÷Õ görülmüútür. Ancak bu tuzlar ile
elde edilen saflaútÕrma katsayÕsÕ ve verimler di÷er iki tuza (MnCl2 ve
MgCl2) kÕyasla daha yüksektir. % 1’lik NaCl ile % 75 verimle 3,8 kat,
% 1’lik Na2CO3 ile % 69 verimle 3,8 kat ve % 7.5’lik MgSO4 ile % 71
verimle 4,09 katlÕk bir saflaútÕrma sa÷lanmÕútÕr. Benzer sonuçlara
literatürde de rastlanmÕútÕr (Yue et al., 2007). ùekil 4.11’de invertazÕn
da÷ÕlÕmÕna KCl’ün etkisi gösterilmiútir. Enzim % 5’lik KCl varlÕ÷Õnda %
88 verimle 5.5 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. KCl tuzunun varlÕ÷ÕnÕn enzimin
da÷ÕlÕmÕna (Ke) etkisi oldukça belirgin olup (ùekil 4.12) enzimin alt
fazdan üst faza do÷ru yönelmesini sa÷lamÕútÕr. Bununla birlikte ùekil
4.12’de sulu ikili faz sisteminde etkili bir saflaútÕrma için önemli bir
baúka nokta gözlenmektedir; kontamine proteinler saflaútÕrÕlmasÕ
hedeflenen enzimle ayni fazda ekstrakte edilmemelidir. Bu yüzden en iyi
sistem en düúük Kp ve en yüksek Ke de÷erlerine sahip olmalÕdÕr. % 15
PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 sistemiyle elde edilen protein
da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5
KCl sistemi ile 0,48’den 0,35’e düúmekte ve sistemin Ke de÷eri ise
4,1’den 11’e çÕkmaktadÕr. ùekil 4.13, sulu ikili faz sisteminde kosolut
olarak KCl tuzunun invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕnda ne kadar seçimlilik
sa÷ladÕ÷Õ (D=31) ve geri kazanÕm de÷erinin (R; % 154) ne kadar yüksek
oldu÷unu göstermektedir. KCl tuzunun bazÕ sulu ikili faz sistemlerinde
oldukça seçimli saflaútÕrma yaptÕ÷Õna dair pek çok literatür
bulunmaktadÕr (Engel et al., 2000; Franco et al., 1996; Zaslavsky et al.,
1988). Özetle, en iyi ve seçimli invertaz da÷ÕlÕmÕ % 15 PEG–3000 / % 12
Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl sa÷lanmÕútÕr.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6
5
PF
4
3
2
1
0
0,5
1
2,5
5
7,5
SaflaútÕrma
katsayÕsÕ (PF)
4,1
5,3
5,1
5,5
2,7
Verim (%)
63
Verim (%)
116
75
79
88
74
KCl konsantrasyonu (%, w/w)
0,6
12
0,5
10
0,4
8
0,3
6
0,2
4
0,1
2
0
0,5
1
2,5
5
7,5
Protein da÷Õlma katsayÕsÕ
(Kp)
0,31
0,28
0,33
0,35
0,52
ønvertaz enziminin
da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke)
2,6
4,5
5,2
11
5,8
Ke
Kp
ùekil 4.11 Kosolut olarak KCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi
0
ùekil 4.12 Kosolut olarak KCl’ün farklÕ konsantrasyonlarÕnÕn protein da÷Õlma
katsayÕsÕna (Kp) ve invertazÕn da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke) etkisi
117
35
160
30
150
140
130
20
120
15
110
10
100
5
0
R
Selektivite (Į)
25
90
0,5
1
2,5
5
7,5
Selektivite (Į)
8,3
15,8
16
31
11,1
Geri kazanÕm (R, %)
104
125
135
154
80
98
ùekil 4.13 Kosolut olarak KCl’ün farklÕ konsantrasyonlarÕnÕn selektivite (Į) ve
4
3,5
3
PF
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,5
0,75
1
1,5
2,5
5
SaflaútÕrma katsayÕsÕ
(PF)
3,1
2,9
3,8
2,5
2,9
2,9
Verim (%)
66
67
75
60
75
NaCl konsantrasyonu(%, w/w)
88
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ùekil 4.14 Kosolut olarak NaCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi
Verim (%)
geri kazanÕma (R) etkisi
80
70
3
60
2,5
50
PF
4
3,5
2
40
1,5
30
1
20
0,5
10
0
0,5
0,75
1
1,5
2,5
5
Verim (%)
2,1
2,5
SaflaútÕrma
katsayÕsÕ (PF)
46
50
3,8
2
3,5
2,5
69
52
71
60
Verim(%)
118
0
Na 2CO3 Konsantrasyonu(%, w/w)
ùekil 4.15 Kosolut olarak Na2CO3’Õn PEG-Na2SO4 sistemine etkisi
PF
4
60
50
3
40
30
20
2
1
0
SaflaútÕrma
katsayÕsÕ (PF)
Verim (%)
0,5
1
2,5
5
7,5
10
3,49
2,49
2,48
3,5
4,09
4,05
40
10
0
36
42
57
71
62
MgSO4 konsantrasyonu (%, w/w)
ùekil 4.16 Kosolut olarak MgSO4’Õn PEG-Na2SO4’Õnsistemine etkisi
Verim (%)
80
70
5
119
70
2
PF
50
40
1
30
20
0,5
Verim(%)
60
1,5
10
0
0,5
1
2,5
5
SaflaútÕrma
katsayÕsÕ (PF)
0,5
1,83
1,61
0,6
Verim (%)
28
63
52
38
MnCl2 Konsantrasyonu(%, w/w)
0
2
PF
1,5
1
0,5
0
SaflaútÕrma
katsayÕsÕ (PF)
Verim (%)
0,5
1
2,5
5
1,51
0,54
1,83
1,04
35
10
43
30
MgCl2 Konsantrasyonu(%, w/w)
ùekil 4.18 Kosolut olarak MgCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Verim (%)
ùekil 4.17 Kosolut olarak MnCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi
120
4.2.7
ønvertaz konsantrasyonunun da÷ÕlÕma etkisi
Hedef molekülün ayrÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕnda ATPS sistemine
yüklenen protein miktarÕ özellikle büyük ölçekli prosesler için çok
önemlidir (Antov et al., 2006). Protein konsantrasyonu doygunluk
sÕnÕrÕna yaklaútÕkça, sistemde doygun hal durumu gözlenir. Protein
konsantrasyonunun bu sÕnÕrdan daha yükse÷e arttÕrÕlmasÕ proteinin
çökelmesine neden olur ve sonuçta da geri kazanÕm düúük olur. Bu
nedenle sulu ikili faz sisteminde protein konsantrasyonu doygunluk
sÕnÕrÕnÕn altÕnda olmalÕdÕr. Genellikle her bir gramlÕk sisteme 1 mg
protein konsantrasyonu optimaldir (Engel et al., 2000).
Domatesten % 85 (NH4) 2SO4 tuz çöktürmesiyle hazÕrlanan
invertaz ekstraktÕ (2.17 mg/ml) % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5
/ % 5 KCl sistemine farklÕ miktarlarda (0,25-1 ml) ilave edilerek enzim
konsantrasyonunun invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna etkisi incelenmiú ve
sonuçlar ùekil 4.19 ve ùekil 4.20’da gösterilmiútir.
Elde edilen sonuçlara göre, invertaz enzimi ve di÷er proteinlerin
konsantrasyonlarÕ da÷ÕlÕma önemli derecede etki etmektedir. % 15 PEG–
3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 0,25 ml enzim sisteminde
invertaz enzimi üst faza karúÕ en yüksek Ke ve selektiviteye sahiptir
(ùekil 4.19). Ancak saflaútÕrma katsayÕsÕ (4,1 kat) en düúük olandÕr (ùekil
4.20). Enzim konsantrasyonu de÷iútikçe Ke, Kp, D ve PF de÷erleri
farklanmaktadÕr. Sisteme yüklenen enzim miktarÕ, hem faz hacim oranÕnÕ
hem de faz bileúimini de÷iútirerek enzimlerin da÷ÕlÕmÕna etki eder (Antov
et al., 2006). Ancak % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl /
0,5 ml enzim sistemi saflaútÕrma katsayÕsÕ (5,5 kat) ve proteinlerin
121
25
60
20
50
40
15
30
10
20
5
0
Į
Ke
da÷Õlma katsayÕsÕ (0,35) açÕsÕndan en optimal sonuçlarÕ vermiú
oldu÷undan en ideal sistem olarak seçilmiútir (ùekil 4.20).
10
0,25
0,5
0,75
1
ønvertaz enziminin
da÷Õlma katsayÕsÕ
(Ke)
22
11
14
13
Selektivite (Į)
55
31
33
Enzim miktarÕ (ml)
0
28
ùekil 4.19 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl sisteminde invertazÕn
da÷ÕlÕmÕna (Ke) ve selektivitesine (Į) enzim miktarÕnÕn etkisi
6
5
PF
4
3
2
1
0
0,25
0,5
0,75
1
SaflaútÕrma
KatsayÕsÕ (PF)
4,1
5,5
4,5
5,1
Protein da÷Õlma
katsayÕsÕ (Kp)
0,4
0,35
0,41
0,46
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Kp
122
Enzim miktarÕ (ml)
ùekil 4.20 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl sisteminde invertaz
saflaútÕrma katsayÕsÕ ve protein da÷Õlma katsayÕsÕna enzim miktarÕnÕn etkisi
4.2.8
Büyük ölçekli sulu ikili faz sistemi
Son on yÕldan fazla bir süredir sulu ikili faz sistemleri ile büyük
ölçekli
sistemlerde
protein
saflaútÕrÕlmasÕ
baúarÕyla
gerçekleútirilmektedir. Bu yenili÷in getirmiú oldu÷u en önemli
özelliklerden bir tanesi kimya endüstirisinde rutin organik temelli
ekstraksiyon yöntemlerinin yerini alabilece÷inin öngörülmesidir ancak
faz oluúum ve protein da÷ÕlÕmÕnÕn tam olarak anlaúÕlamamasÕ gibi
nedenlerden dolayÕ sulu ikili faz sistemlerinin uygulanabilmesi hala çok
sÕnÕrlÕdÕr (Hatti-Kaul, 2000).
123
8
PF
6
4
2
0
10
25
50
SaflaútÕrma
KatsayÕsÕ (PF)
5,5
6,7
4,4
Proteinlerin
Da÷Õlma KatsayÕsÕ
(Kp)
0,36
0,46
0,47
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Kp
PEG molekül kütlesi ve konsantrasyonu, tuz türü ve
konsantrasyonu, pH, kosolut türü ve konsantrasyonu, protein miktarÕ gibi
koúullarÕn optimize edildi÷i sulu ikili faz sistemi (% 15 PEG–3000 / %
12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 0,5 ml enzim) 10, 25 ve 50 ml’lik
sistemlerde hazÕrlanmÕú ve invertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda
kullanÕlabilecek büyük ölçekli sistemler (25 ve 50 ml’lik)
de÷erlendirilmiútir. ùekil 4.21 ve 4.22’den görüldü÷ü gibi 25 ml’lik
sistem ile enzim % 90 verim ve % 214 geri kazanÕmla 6.7 kat
saflaútÕrÕlmÕútÕr. SaflaútÕrÕlan enzimin spesifik aktivitesi 377 U/mg olarak
belirlenmiútir (ùekil 4.23).
Sistem hacmi (ml)
ùekil 4.21 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin saflaútÕrma
sonuçlarÕ (saflaútÕrma katsayÕsÕ ve protein da÷Õlma katsayÕsÕ)
124
90,5
90
200
89,5
150
89
100
88,5
Verim (%)
Geri kazanÕm (%)
250
88
50
0
87,5
10
25
50
Geri KazanÕm
(%)
154
214
151
Verim (%)
88
90
Sistem hacmi (ml)
90
87
ùekil 4.22 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin saflaútÕrma
Spesifik aktivite (üst) (U/mg protein)
sonuçlarÕ (geri kazanÕm ve verim)
400
300
200
100
0
Spesifik
aktivite üst
10
25
50
308
377
324
Sistem hacmi (ml)
ùekil 4.23 10, 25 ve 50 ml’lik sistemlerde saflaútÕrÕlan invertaz enziminin
spesifik aktivite de÷erleri.
125
Son adÕmda enzimin bulundu÷u PEG fazÕndan PEG’i
uzaklaútÕrmak ve enzimi deriútirmek için preparat 10 000 MW’lik
membrandan ultrafiltre edilmiútir. Deriútirilen enzimin protein miktarÕ
0,291 mg/ml, spesifik aktivitesi 677 U/mg olarak hesaplanmÕútÕr.
Ultrafiltrasyon sonrasÕnda elde edilen enzim preparatÕ homojenata kÕyasla
31 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. Enzimin saflÕ÷ÕnÕ kontrol etmek ve molekül
kütlesini belirlemek için SDS-PAGE yapÕlmÕú enzim karakterize
edilmiútir.
4.3
Domates
Karakterizasyonu
(Lycopersicon
esculentum)
ønvertazÕnÕn
4.3.1 ønvertaz aktivitesine pH etkisi
Enzimlerin aktivitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisi pH
etkisidir. Bir enzimin pH optimumu, reaksiyon süresi, sÕcaklÕk, substrat
yapÕsÕ ve konsantrasyonu, kullanÕlan tampon türü ve konsantrasyonu,
ortamÕn iyonik úiddeti, enzimin saflÕ÷Õ gibi birçok deneysel parametreye
ba÷ÕmlÕ bir de÷iúkendir. Biyokimyasal reaksiyonlar, in vivo koúullarda,
sulu ortamda gerçekleúti÷inden pH enzimin yük durumunu dolayÕsÕyla
aktivitesini çok etkiler. ønvertaz aktivitesine pH’Õn etkisi ve optimum pH
bölüm 3.6.1.1’de açÕklandÕ÷Õ gibi belirlenerek ùekil 4.24’de verilmiútir.
Bunun için inkübasyon tamponunun pH’sÕ 4,0–8,0 arasÕnda
de÷iútirilerek enzimin aktivitesi standart koúullarda ölçülerek
belirlenmiútir. ùekil 4.24’den görüldü÷ü gibi domates invertazÕnÕn
optimum pH’sÕ 5,0 olarak bulunmuútur. Bitkisel kaynaklÕ asidik
invertazlarÕn optimum pH de÷erleri genellikle 3,5–6,5 arasÕnda
126
de÷iúmektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.5) (Belcarz et al., 2002; Liu et al.,
2006; Rojo et al., 1998).
120
Ba Õl Aktivite (% )
100
80
60
40
20
0
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
pH
ùekil 4.24 ønvertaz aktivitesine pH’Õn etkisi (optimum pH) (Substrat: Sükroz, SÕcaklÕk:
37oC, Tamponlar: pH; 4,0–5,5; Asetat, 6,0–8,0 Fosfat)
4.3.2 ønvertaz aktivitesine sÕcaklÕ÷Õn etkisi
Enzimlerin katalitik aktivitesi sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕdÕr. Ba÷Õl
aktivitenin sÕcaklÕk ile de÷iúimini gösteren optimum e÷rilerinden enzimin
optimum sÕcaklÕk de÷eri belirlenir. SÕcaklÕ÷Õn invertaz aktivitesine etkisi
bölüm 3.6.1.2’de açÕklandÕ÷Õ gibi enzimin aktivitesinin farklÕ
sÕcaklÕklarda standart koúullarda ölçülmesiyle belirlenmiú ve bu iliúki
ùekil 4.25’de verilmiútir.
127
120
BaÕl Aktivite (% )
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
o
SÕcaklÕk ( C)
ùekil 4.25 ønvertaz aktivitesine sÕcaklÕ÷Õn etkisi (optimum sÕcaklÕk) (Substrat: Sükroz;
ønkübasyon süresi: 30 dakika)
ùekil 4.25’den görüldü÷ü gibi enzim için optimum sÕcaklÕk de÷eri
50 C olarak bulunmuútur. Enzimler protein yapÕdaki büyük ve oldukça
komplike moleküllerdir. Aktivitenin korunmasÕ için üç boyutlu yapÕsÕ
korunmalÕdÕr. Aktiviteye etki eden önemli parametrelerden biri de
sÕcaklÕktÕr. Reaksiyon hÕzÕ sÕcaklÕk arttÕkça artar. Fakat belirli sÕcaklÕktan
sonra enzim proteinin denaturasyonundan dolayÕ aktivitede düúme olur.
Enzimin maksimum aktivite gösterdi÷i sÕcaklÕk (optimum sÕcaklÕk)
özellikle operasyonel bir parametre olmasÕ açÕsÕndan önemlidir.
Genellikle bitkisel kaynaklÕ invertazlarÕn optimum sÕcaklÕ÷Õ kayna÷a ve
inkübasyon süresine ba÷lÕ olarak 37-60oC arasÕnda de÷iúmektedir (De
o
Ginés et al., 2000; Fernández et al., 2004; Belcarz et al., 2002).
128
4.3.3 ønvertaz aktivitesine substrat konsantrasyonunun etkisi
ønvertazlarÕn kinetik sabitleri genellikle kaynaklarÕna ve
substratlarÕna ba÷lÕ olarak oldukça geniú bir aralÕkta de÷iúmektedir.
Domates invertazÕnÕn Km de÷eri (substrat: sükroz) bitkisel kaynaklÕ
birçok invertaz ile benzerlik göstermektedir. Literatür çalÕúmalarÕna
bakÕldÕ÷Õnda enzimin substrata afinitesini yansÕtan Km de÷erinin ço÷u kez
ya çok az de÷iúti÷i ya da hiç de÷iúmedi÷i görülmektedir.
Domates invertazÕnÕn kinetik parametreleri do÷al substratlardan
sükroz kullanÕlarak bölüm 3.6.1.3’de açÕklandÕ÷Õ gibi test edilerek
belirlenmiútir (ùekil 4.26). Doygunluk substrat konsantrasyonunu ve Km
ile Vmax de÷erlerini belirleyebilmek için 0,01–2 M sükroz konsantrasyon
aralÕ÷Õ kullanÕlarak enzimlerin aktiviteleri standart koúullarda (37oC’de
30 dakika inkübasyon) ölçülmüútür. ùekil 4.26’dan görüldü÷ü gibi
doygunluk substrat (sükroz) konsantrasyonu invertaz için 0,75 M olarak
belirlenmiútir. Bu de÷erlerin üzerindeki konsantrasyonlarda aktivitede
belirgin bir de÷iúiklik gözlenmemektedir. Sükroz ile ilgili LineweaverBurk diyagramÕ Sigma Plot programÕyla çizilerek ùekil 4.27’de
verilmiútir. Sükrozun substrat oldu÷u koúullarda invertaz için çizilen
Lineweaver-Burk diyagramÕndan (1/S’a karúÕ 1/V) Km ve Vmax de÷erleri
sÕrasÕyla 48 mM ve 31 U olarak belirlenmiútir.
129
ùekil 4.26 Sükroz konsantrasyonunun invertaz aktivitesine etkisi (substrat [S]: Sükroz,
sÕcaklÕk: 37oC, inkübasyon süresi: 30 dakika) (Michaelis Menten grafi÷i)
ùekil 4.27 ønvertaz enziminin Lineweaver-Burk diyagramlarÕ (substrat [S]: Sükroz,
sÕcaklÕk: 37oC, inkübasyon süresi: 30 dakika)
130
ønvertazlarÕn kinetik sabitleri genellikle kaynaklarÕna ve
substratlarÕna ba÷lÕ olarak oldukça geniú bir aralÕkta de÷iúmektedir.
Domates invertazÕnÕn Km de÷eri (Substrat: Sükroz) bitkisel kaynaklÕ
birçok invertaz ile benzerlik göstermektedir. Literatür çalÕúmalarÕna
bakÕldÕ÷Õnda enzimin sükroz afinitesini yansÕtan Km de÷erleri 0.05–227
mM arasÕnda farklÕlÕk gösterdi÷i görülmektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.3)
(Liebl et al., 1998; Huang et al., 2003; Weersaooriya and Yatawara,
2002).
4.3.4 ønkübasyon süresinin etkisi
ønkübasyon süresinin invertaz aktivitesi üzerine etkisi Bölüm
3.6.1.4’ te açÕklandÕ÷Õ gibi 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 60 dakika boyunca
37oC’de inkübe edilerek standart koúullarda aktivitesinin ölçülmesiyle
belirlenmiútir. ùekil 4.28’de inkübasyon süresinin enzim reaksiyonuna
etkisi verilmiútir. ùekilden görüldü÷ü gibi invertaz enzimi için uygun
reaksiyon süresi 30 dakika olarak belirlenmiútir.
Glukoz Konsantrasyonu
(mol/mg)
250
200
150
100
50
0
0
10
20
30
40
50
60
70
nkübasyon süresi (dakika)
ùekil 4.28 ønkübasyon süresinin invertazÕn açÕ÷a çÕkardÕ÷Õ glukoz miktarÕ ile iliúkisi
(substrat: Sükroz, sÕcaklÕk: 37oC)
131
4.3.5 Efektör konsantrasyonunun etkisi
Bölüm 3.6.1.5’ te açÕklandÕ÷Õ gibi bazÕ metal iyonlarÕnÕn ve
maddelerin farklÕ konsantrasyonlarÕnÕn enzim aktivitesi üzerine etkisi
incelenmiútir. Çizelge 4.3’ de domatesten elde edilen enzim preparatÕ için
metal konsantrasyonlarÕnÕn invertaz aktivitesine etkisi belirtilmiútir.
Çizelge 4.3’den görüldü÷ü gibi domatesten elde edilen invertazÕn
aktivitesi metal iyonlarÕnÕn etkisine karúÕ dirençlidir. MnSO4.H2O ve
Mn+2 iyonlarÕ 1 mM konsantrasyonlarÕnda aktivatör etkisi
göstermektedir. Cu+2 iyonu 2,5 mM konsantrasyonda invertaz aktivitesini
yaklaúÕk % 48.6 oranÕnda inhibe etmektedir. BunlarÕn yanÕ sÕra 0,1, 1–2,5
mM konsantrasyonlardaki di÷er efektörlerin enzimi çok düúük oranda
inhibe etti÷i belirlenmiútir.
Çizelge 4.3 Çeúitli efektörlerin invertaz aktivitesine etkisi.
Efektör
0,1 mM
1 mM
2,5 mM
Kontrol
100,0
100,0
100,0
NaCl
98,1
97,8
97,5
KCl
101,3
96,2
96,1
MgCl2.6H2O
96,1
95,6
92,7
MgSO4.7H2O
97,4
95,7
90,4
BaCl2.2H2O
103,5
95,3
95,8
CaCl2
97,7
96,2
84,1
MnSO4.H2O
112,2
161,3
120,9
ZnSO4.7H2O
92,5
93,7
72,3
Na2CO3
90,6
89,8
82,7
CuSO4.5H2O
84,6
79,6
48,6
FeCl3.6H2O
99,4
93,2
97,6
MnCl2.4H2O
123,8
150,3
138,4
Türü/Konsantrasyonu
132
4.4
KararlÕlÕk Testleri
Enzim preparatlarÕnÕn kararlÕlÕ÷Õ, belirli çalÕúma koúullarÕnda enzim
aktivitesinin zamana ba÷ÕmlÕ olarak korunmasÕdÕr. Enzimlerin kararlÕlÕ÷Õ
denince genellikle proteinin konformasyonel kararlÕlÕ÷Õndan söz edilir.
Enzimin termal, pH ve depo kararlÕlÕklarÕ büyük ölçüde konformasyonel
kararlÕlÕ÷Õ ile belirlenir ve denaturasyon sonucu da inaktivasyon
gerçekleúir. Bir enzimin kararlÕlÕ÷Õ; sÕcaklÕk, pH, iyon úiddeti, tampon
türü, substratÕn varlÕ÷Õ ve yoklu÷u, enzim konsantrasyonu, inkübasyon
zamanÕ, aktivatör ya da inhibitörlerin varlÕ÷Õ ve yoklu÷una ba÷lÕ olarak
de÷iúim gösteren önemli bir parametredir. Çünkü enzimler oldukça
karmaúÕk yapÕlÕ proteinlerdir. Enzimin üç boyutlu yapÕsÕna etki edecek
bir faktör, enzimin aktivitesini de etkiler (Telefoncu, 1997). Domatesten
saflaútÕrÕlan invertazÕn kararlÕlÕklarÕ ile ilgili sonuçlar ilgili bölümlerde
grafiklerle açÕklanmÕútÕr.
4.4.1 ønvertazÕn termal kararlÕlÕ÷Õ
Enzimlerin kararlÕlÕ÷Õna etki eden parametrelerden en önemlisi
sÕcaklÕktÕr. Genellikle enzimler düúük sÕcaklÕklarda daha kararlÕ olurken
yüksek sÕcaklÕklarda hÕzla termal denaturasyon gerçekleúir. ønvertazÕn
termal kararlÕlÕ÷Õ bölüm 3.6.2.1’de açÕklandÕ÷Õ gibi belirlenmiútir (ùekil
4.29). Bunun için enzim önce farklÕ sÕcaklÕklarda (4-70oC) inkübe
edildikten sonra standart koúullarda aktiviteleri ölçülmüútür.
133
120
BaÕl Aktivite (%)
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
o
SÕcaklÕk ( C)
ùekil 4.29 ønvertazÕn termal kararlÕlÕ÷Õ (Substrat: Sükroz; SÕcaklÕk: 37oC; ønkübasyon
süresi: 30 dakika)
ùekil 4.29’dan görüldü÷ü gibi enzimin termal kararlÕlÕ÷ÕnÕn 4-50oC
arasÕnda oldukça iyi oldu÷u, 50oC’de enzimin aktivitesinin % 54’sini
korudu÷u belirlenmiútir. 50oC’nin üstündeki sÕcaklÕklarda, enzim
aktivitesini hÕzlÕ bir úekilde kaybetmektedir. ønvertaz enzimi kayna÷a
ba÷lÕ olarak çeúitli kararlÕlÕk dereceleri göstermektedir (bakÕnÕz Çizelge
1.4) (Weersaooriya and Yatawara, 2002; Warchol et al., 2002; Rahman
et al., 2001).
4.4.2 ønvertazÕn pH kararlÕlÕ÷Õ
Tüm enzimler birer protein olup, kararlÕlÕklarÕna etki eden her
faktör proteinin sekonder, tersiyer ve/veya kuarter yapÕlarÕnÕ
etkileyecektir. Ço÷u enzim aúÕrÕ asidik ya da bazik koúullarda tersinmez
denaturasyona u÷rar. Bir enzimin pH kararlÕlÕ÷Õ birçok faktör
(inkübasyon koúullarÕ, sÕcaklÕk, inkübasyon süresi, tampon türü ve
134
konsantrasyonu, substrat konsantrasyonu, iyonik úiddet gibi) ile modifiye
edilebilir. ønvertazlarÕn pH kararlÕlÕ÷Õ bölüm 3.6.2.2’de açÕklandÕ÷Õ gibi
belirlenmiútir (ùekil 4.30). Bunun için enzim farklÕ pH’lardaki
tamponlarda 6 saat boyunca bekletilmiú ve ardÕndan ortamÕn pH’sÕ 5.0’ya
ayarlanarak standart koúullar altÕnda aktiviteleri ölçülmüútür.
ùekil 4.30’dan görüldü÷ü gibi invertaz, pH 4,0–6,5 arasÕnda
oldukça kararlÕdÕr. pH 4,0–6,5 arasÕnda aktivitesini yaklaúÕk % 97,2
oranÕnda korumaktadÕr. ønvertazlarÕn ço÷u oldukça geniú bir pH
aralÕ÷Õnda kararlÕdÕr (Belcarz et al., 2002; Gines et al., 2000; Rojo et al.,
1998).
120
BaÕl Aktivite (%)
100
80
60
40
20
0
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
pH
ùekil 4.30 ønvertazÕn pH kararlÕlÕ÷Õ (Substrat: Sükroz; SÕcaklÕk: 37oC; Tamponlar: pH
4,0–5,5; Asetat, pH 6,0–8,0; Fosfat; ønkübasyon süresi: 30 dakika)
135
4.4.3 ønvertazÕn depo kararlÕlÕ÷Õ
Depo kararlÕlÕ÷Õ, özellikle enzimlerin uygulama alanÕ ile ilgili
önemli bir faktördür. Enzimin saklanma koúullarÕna ba÷lÕ bir
parametredir. ATPS sistemi ile saflaútÕrÕlan invertazÕn depo kararlÕlÕ÷Õ
bölüm 3.6.2.3’ de belirtildi÷i gibi ölçülmüú ve sonuçlar ùekil 4.31’de
verilmiútir. ùekilden görüldü÷ü gibi domates invertazÕnÕn depo kararlÕlÕ÷Õ
oldukça iyi olup enzim 59 gün sonunda baúlangÕç aktivitesinin % 53’ünü
korumaktadÕr.
120
BaÕl Aktivite (% )
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
Depolama süresi (gün)
ùekil 4.31 Domates invertazÕnÕn depo kararlÕlÕ÷Õ
70
136
4.5 Genel De÷erlendirme
ønvertaz (EC 3.2.1.26) enzimi ile ilgili izolasyon, saflaútÕrma ve
karakterizasyon çalÕúmalarÕ çok eski yÕllardan beri devam etmektedir. Bir
çok farklÕ tür kaynaktan; bitkisel (Benkeblia et al., 2004; Fotopoulos,
2005; Weersaooriya and Yatawara, 2002; Hashizume et al., 2003;
Abdou, 2004; Liu et al., 2006) ve mikrobiyal (Belcarz et al., 2002; AitAbdelkader et al., 2000; Ghosh et al., 2001; Warchol et al., 2002;
Nguyen et al., 2005) bilinen genel izolasyon ve saflaútÕrma teknikleri
kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlan enzimin, karakterizasyonu yapÕlarak
uygulamaya sunulmuútur. Bölüm 1.1.6’da ayrÕntÕlÕ bir olarak açÕklandÕ÷Õ
gibi enzim bir çok alanda uygulama olana÷Õ bulmuútur. ønvertaz, úeker
endüstrisinde (SaldamlÕ, 2005), karbohidrat yapÕ çalÕúmalarÕ ile biyolojik
fonksiyonlarÕnÕn belirlenmesinde (Frevert and Ballou, 1982; Gómez and
Villalonga, 2000; Kern et al., 1992; Zeng and Biemann, 1999),
immobilizasyon çalÕúmalarÕnda (Tomotani and Vitolo, 2006; Bayramo÷lu
et al., 2002; Sanjay and Sugunan, 2004; Bagal and Karve, 2005; Gürsel
et al., 2003), transglikozilasyon reaksiyonlarÕnda (Rubio et al., 2002;
Nguyen et al., 2004; L’Hocine et al., 2000; Yanahira et al., 1998) ve
hayvanlar ile insanlarda intestinal sistemde konstipasyon sorununun
giderilmesini sa÷layan oligosakkaritlerin sentezi gibi enzimatik
sentezlerde (Nguyen et al., 2005; Hidaka et al., 1987) önemli uygulama
alanlarÕ bulmuú bir enzimdir. Her ne kadar oldukça yüksek saflÕkta ve
hemen hemen tamamen homojen bir invertaz preparatÕnÕn
hazÕrlanabildi÷i çok az sayÕda çalÕúma mevcut ise de, önemli olan daha
sonraki çalÕúmalarda kullanÕlabilecek amaca uygun bir protein
preparatÕnÕn hazÕrlanmasÕdÕr. ønvertazlar genellikle hücre içerisinde ve de
di÷er çeúitli glikozidazlarla bir arada bulunurlar. Bu nedenle ço÷u kez bu
aktiviteleri birbirinden ayÕrmak oldukça zor olmaktadÕr. E÷er hazÕrlanan
137
enzim preparatÕ di÷er glikozidazlarca kontamine edilmiyor ve geniú bir
aglikon spesifikli÷ine sahip ise yukarÕda belirtilen bir çok kullanÕm alanÕ
için uygun olacaktÕr.
Rekombinant proteinlerin ve enzimlerin üretimi için makul fiyata
yeterli saflaútÕrmayÕ gerçekleútiren teknolojilerin geliúmesine ihtiyaç
duyulmaktadÕr. Bu sebeple bilim insanlarÕ daha ekonomik protein
saflaútÕrma teknikleri geliútirmek için u÷raúmaktadÕrlar. Son elli yÕlda,
araútÕrmacÕlar protein geri kazanÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕ için sÕvÕ-sÕvÕ
ekstraksiyon sistemlerine ilgi duymaktadÕrlar. Normalde sÕvÕ-sÕvÕ
ekstraksiyonu organik çözgenlerin kullanÕmÕnÕ içermektedir. Ancak
proteinler organik çözgenlerde çözünememekte ve denaturasyona
u÷ramaktadÕrlar. SÕvÕ-sÕvÕ ikili faz sistemleri iki polimer veya polimer /
tuz çözeltileri kullanÕlarak da oluúturulabilmektedir.
Sulu ikili faz sistemleri (Aqueous Two Phase Systems: ATPS)
biyolojik moleküllerin (örne÷in; protein, hücre, organel ve biyolojik
membranlar) ekstraksiyonu ve saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan seçimli ve
etkin bir metoddur. Sulu ikili faz sistemleri biyo-uyumlulu÷a sahiptir ve
% 70–90 gibi oldukça yüksek su içeri÷inden dolayÕ biyomoleküller için
toksik olmayan ÕlÕmlÕ bir çevre oluúturmaktadÕr. AyrÕca polimerlerin
protein ve enzim aktivitesi ve yapÕsÕna stabilize edici etkileri vardÕr. Sulu
ikili faz sistemleri bilinen ayÕrma ve saflaútÕrma tekniklerine
(kromatografi, filtrasyon, santrifüjleme ve elektroforez) göre bazÕ
avantajlarÕ vardÕr. Sulu ikili faz ayÕrma tekni÷i özellikle tek adÕmda
saflaútÕrma için uygundur. Bir adÕmdan oluúan bir iúlemle istenilen
proteinin deriútirilmesi ve saflaútÕrmasÕnÕ gerçekleútirebilmektedir. Sulu
ikili faz sisteminin bir baúka üstünlü÷ü ise ölçek büyütmenin kolayca
138
mümkün olmasÕdÕr. Yöntemin di÷er avantajlarÕ ise; ara yüzey geriliminin
düúük olmasÕ nedeniyle biyomoleküllerin degradasyonunu minimize
etmesi, proses zamanÕ ve enerji tüketiminin düúük olmasÕ, yüksek
rezolusyon ve verimlilikte ayÕrÕmÕn gerçekleútiriliebilmesi ve maliyetin
düúük olmasÕ olarak sÕralanabilir (Yue et al., 2007; Negrete et al., 2007).
Bu çalÕúmada, tomates invertazÕnÕn sulu ikili faz sistemi ile
saflaútÕrÕlmasÕ amaçlanmÕútÕr. Enzim kayna÷Õ tarama çalÕúmasÕ
sonucunda, domatesin di÷er enzim kaynaklarÕna göre dikkate de÷er
oranda daha yüksek bir invertaz aktivitesine sahip olmasÕ ve di÷er pek
çok kaynakta mevcut úeker oranÕnÕn domatese kÕyasla oldukça yüksek
olmasÕ ve bu nedenle de özellikle aktivite tayin aúamalarÕnda giriúime
sebep olmalarÕ nedeniyle sulu ikili faz sistemi ile invertaz enziminin
saflaútÕrÕlmasÕnda domatesin daha uygun bir kaynak olaca÷Õna karar
verilmiútir. AyrÕca domates, ülkemizde her mevsim kolaylÕkla temin
edilebilen, ucuz ve bol bulunan bir kaynak olmasÕ, invertaz aktivitesinin
bu kaynakta yüksek oranda bulunmasÕ ve güneú altÕnda yetiúen
domatesteki enzimlerin termal kararlÕ÷ÕnÕn genellikle yüksek olmasÕndan
dolayÕ da tercih edilmiútir.
ønvertaz enzimi domatesten ekstrakte edilerek % 15 PEG–3000, %
12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) sulu ikili faz sistemi ile
saflaútÕrÕlmÕú ve karakterize edilmiútir. Bu amaçla, enzim aktivitesine etki
eden bazÕ parametrelerin (inkübasyon süresi, pH, sÕcaklÕk, substrat
miktarÕ, efektör türü ve konsantrasyonu) etkisi incelenerek kararlÕlÕk
testleri (termal, pH, depo) yapÕlmÕútÕr. Enzim aktivitesi dinitrosalisilik
asit (DNS) metodu ile, protein tayini ise Bradford metodu ile
gerçekleútirilmiútir.
139
% 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC)
kullanÕlarak hazÕrlanan sulu ikili-faz sisteminde invertaz enzimi PEG’ce
zengin üst fazda toplanmÕútÕr. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile
yaklaúÕk 20 kDa olarak, optimum pH ve sÕcaklÕ÷Õ ise sÕrasÕyla 5,0 ve
50oC olarak belirlenmiútir. Enzimin Km ve Vmax de÷erleri sÕrasÕyla 48
mM ve 31 U olarak belirlenmiútir. Polimer-Tuz tabanlÕ ATPS ile
saflaútÕrÕlan domates invertazÕ geniú bir pH ve sÕcaklÕk aralÕ÷Õnda oldukça
kararlÕ bir enzim preparatÕdÕr. Geleneksel metodlara kÕyasla, invertazÕn
saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan bu tek adÕmlÕ ekstraksiyon metodu basit,
ekonomik ve etkili bir metod olup hazÕrlanan enzim preparatÕ sahip
oldu÷u katalitik özellikleri bakÕmÕndan gÕda sanayinde kullanÕlabilecek
uygun bir enzim preparatÕdÕr.
140
KAYNAKLAR DøZøNø
Abdou, H.M., 2004, Purification and properties of invertase from
Portulaca oleracea plant, Egypt Journal of Biotechnology, 16: 317330.
Agrawell, K.M.L., Bahl, O.P., 1968, Glycosidases of Phaseolus
vulgaris II: isolation and general properties, The Journal of
Biological Chemistry, 243: 13-18.
Ait-Abdelkader, N., De Caro, A., Guzzo, J., Michel, G.P.F., Baratti,
J.C., 2000, The intracellular sucrase (SacA) of Zymomonas mobilis
is not involved in sucrose assimilation, Biotechnology Letters, 22:
461-467.
Alberto, F., Bingon, C., Sulzenbacher, G., Henrissat, B., Czjzek, M.,
2004, The three-dimensional structure of invertase (ȕ-fructosidase)
from Thermotoga maritima reveals a bimodular arrangement and
an evolutionary relationship between retaining and inverting
glycosidases, The Journal of Biological Chemistry, 279: 1890318910.
Alberto, F., Jordi, E., Henrissat, B., Czjzek, M., 2006, Crystal
structure of inactivated Thermotoga maritima invertase in complex
with the trisaccharide substrate raffinose, The Biochemical Journal,
395: 457-462.
Albertsson, P.A., 1985, Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems,
Academic press, New York, 1-8p.
141
KAYNAKLAR DøZøNø (devam)
Ålbertsson, P.Å., 1986, Partition of cell particles and macromolecules,
3rd ed. Wiley, New York.
Albertsson, P.A., Johansson, G., Tjerneld, F., 1990, Separation
Process in Biotechology, Editor J.A. Asenjo, New York, 287p.
Álvaro-Benito, M., De Abreu, M., Fernández-Arrojo, L., Plou, F.J.,
Jiménez-Barbero, J., Ballasteros, A., Polaina, J., FernándezLobato, M., 2007, Characterization of a ȕ-fructofuranosidase from
Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity
yielding the prebiotic 6-kestose, Journal of Biotechnology, 132: 7581.
Antov, M.G., Periþin, D.M., Dašiü, M.G., 2006, Aqueous two-phase
partitioning of xylanase produced by solid-state cultivation of
Polyporus squamosus, Process Biochemistry, 41: 232-235.
Arruda, L.M.O., Vitolo, M., 1999, Characterization of invertase
entrapped into calcium alginate beads, Applied Biochemistry and
Biotechnology, 81: 23-33.
Asthir, B., Singh, R., 1997, Purification and characterization of neutral
invertase from chickpea nodules, Indian Journal of Biochemistry &
Biophysics, 24: 529-534.
Babu, B.R., Rastogi, N.K., Raghavarao, K.S.M.S., 2008, Liquid–liquid
extraction of bromelain and polyphenol oxidase using aqueous twophase system, Chemical Engineering and Processing, 47: 83–89.
142
Bagal, D., Karve, M.S., 2006, Entrapment of plant invertase within
novel composite of agarose-guar gum biopolymer membrane,
Analytica Chimica Acta, 555: 316-321.
Bahar, T., Tuncel, A., 2004, Concanavalin A carrying reactive beads for
yeast invertase purification, Reactive & Functional Polymers, 61:
203–210.
Balasubramaniam, D., 2003, Lysozyme separation from tobacco extract
by aqueous two-phase extraction,
http://scholar.lib.vt.edu/theses/available/etd-02192003164258/unrestricted/final_thesis.pdf
Bamberger, S., Seaman, G.V.F., Brown, J.A., Brooks D.E., 1984, The
partition of sodium phosphate and sodium chloride in aqueous
dextran poly(ethylene glycol) two-phase systems, Journal of
Colloid and Interface Science, 99: 187-193.
Bansal-Mutalik, R., Gaikar, V.G., 2005, Purification and recovery of
enzymes from baker’s yeast by reverse micellar solutions, Process
Biochemistry, 41 (1): 131-141.
Baseer, A., Shall, S., 1971, Properties of the internal invertase of yeast,
Saccharomyces cerevisiae, Biochimica et Biophysica Acta, 250:
192-202.
143
Batta, S.K., Singh, J., Sharma, K.P., Singh, R., 1991, Kinetic
properties and inhibition of soluble acid invertase from sugarcane
juice, Plant Physiology and Biochemistry, 29: 415-419.
Bayramo÷lu, G., Akgöl, S., Bulut, A., Denizli, A., ArÕca, M.Y., 2003,
Covalent immobilisation of invertase onto a reactive film
composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glycidyl
methacrylate: properties and application in a continuous flow
system, Biochemical Engineering Journal, 14 (2):117-126.
Belcarz, A., Ginalska, G., Lobarzewski, J., Penel, C., 2002, The novel
non-glycosylated invertase from Candida utilis (the properties and
the conditions of production and purification), Biochimica et
Biophysica Acta, 1594: 40-53.
Benkeblia, N., Onodera, S., Yoshihira, T., Kosaka, S., Shiomi, N.,
2004, Effect of temperature on soluble invertase activity and
glucose, fructose and sucrose status of onion bulbs (Allium cepa) in
store, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 55 (4):
325-331.
Berggren, K., Nilsson, A., Johansson, G., Bandmann, N., Nygren, P.,
Tjerneld, F., 2000, Partitioning of peptides and recombinant
protein–peptide fusions in thermoseparating aqueous two-phase
systems: effect of peptide primary structure, Journal of
Chromatography B, 743: 295–306.
144
Beúel, E., 2003, Use of Triton X-114 aqueous two phase system for
recovery of mushroom (Agaricus bisporus) polyphenoloxidase,
http://etd.lib.metu.edu.tr/upload/1262971/index.pdf
Biazus, J.P.M., Santana, J.C.C., Souza, R.R., Jordão, E., Tambourgi
E.B., 2007, Continuous extraction of Į- and ȕ-amylases from Zea
mays malt in a PEG4000/CaCl2 ATPS, Journal of Chromatography
B, 858: 227-233.
Bim, M.A., Franco, T.T., 2000, Extraction in aqueous two-phase
systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its
application in kraft pulp bleaching, Journal of Chromatography B:
Biomedical Sciences and Applications, 743: 349-356.
Boddy, L.M., Berges, T., Barreau, C., Vainstein, M.H., Dobson, M.J.,
Ballance, D.J., Peberdy, J.F., 1993, Purification and
characterization of an Aspergillus niger invertase and its DNA
sequence, Current Genetics, 24: 60-66.
Bonomo, R.C.F., Minim, L.A., Coimbra, J.S.R., Fontan, R.C.I., Da
Silva, L.H.M., Minim, V.P.R., 2006, Hydrophobic interaction
adsorption of whey proteins: effect of temperature and salt
concentration and thermodynamic analysis, Journal of
Chromatography B, 844: 6-14.
Bosch, S., Grof, C.P.L, Botha, F.C., 2004, Expression of neutral
invertase in sugarcane, Plant Science, 166:1125–1133.
145
Bradford, M.M., Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-254.
Brenda, The Comprehensive
fructofuranosidase,
Enzyme
Information
System,
ȕ-
http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26
Bugbee, W.M., 1984, Partial purification and properties of an invertase
from Pseudomonas fluorescens, Canadian Journal of
Microbiology, 30: 1326-1329.
Carvalho, C.P., Coimbra, J.S.R., Costa, I.A.F., Minim, L.A., Silva,
L.H.M., Maffia, M.C., 2007, Influence of the temperature and
type of salt on the phase equilibrium of PEG1500/potassium
phosphate and PEG1500/sodium citrate aqueous two-phase
systems, Journal of Chemical & Engineering Data, 52: 351.
Cascone, O., Andrews, B.A., Asenjo, J.A., 1991, Partitioning and
purification of thaumatin in aqueous two-phase systems, Enzyme
and Microbial Technology, 13: 629-635.
Cavalcanti, M.T.H., Carneiro-da-Cunha, M.G., Brandi, I.V., Porto,
T.S., Converti, A., Lima Filho, J.L., Porto, A.L.F., Pessoa A.,
2007, Continuous extraction of Į-toxin from a fermented broth of
Clostridium perfringens Type A in perforated rotating disc
contactor using aqueous two-phase PEG–phosphate system,
Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, In
Press.
146
Cazy, Carbohydrate-Active Enzymes, Glycoside Hydrolase.
http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html
Chávez, F.P., Rodriguez, L., Díaz, J., Delgado, J.M., Cremata, J.A.,
1997, Purification and characterization of an invertase from
Candida utilis: comparison with natural and recombinant yeast
invertases, Journal of Biotechnology, 53: 67-74.
Chen, J.Q., Black, C.C., 1992, Biochemical and immunological
properties of alkaline invertase isolated from sprouting soybean
hypocotyls, Archives of Biochemistry and Biophysics, 295: 61-69.
Chen, J., Saxton, J., Hemming, F.W., Peberdy, J. F., 1996,
Purification and partial characterization of the high and low
molecular weight form (S- and F-form) of invertase secreted by
Aspergillus nidulans, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology, 1296 (2): 207-218.
Da Silva, C.A.S., Coimbra, J.S.R., Rojas, E.E.G., Minim, L.A., Da
Silva, L.H.M., 2007, Partitioning of caseinomacropeptide in
aqueous two-phase systems, Journal of Chromatography B, 858:
205–210.
De Aguiar Oliveira, I.M., Park, Y.K., 1995, Screening of betafructofuranosidase producing microorganisms for production of
fructooligosaccharides and studies of some enzyme properties,
Revista de Microbiologia, 26: 125-129.
147
De Ginés, S.C., Maldonado, M.C., De Valdez, G.F., 2000, Purification
and Characterization of invertase from Lactobacillus reuteri CRL
1100, Current Microbiology, 40: 181-184.
De la Vega, M.G., Cejudo, F.J., Paneque, A., 1991, Purification and
properties of an extracellular invertase from Azotobacter
chroococcum, Enzyme and Microbial Technology, 13: 267-271.
De Rezende, S.T., Felix, C.R., 1999, Production and characterization of
raffinose-hydrolysing and invertase activities of Aspergillus
fumigatus, Folia Microbiologica, 44: 191-195.
Den Hollander, J.L., Wong, Y.W., Luyben, K.Ch.A.M., Van der
Wielen, L.A.M., 1999, Non-separating effects in a centrifugal
partition chromatographic reactor for the enzymatic production of
L-amino acids, Chemical Engineering Science, 54: 3207-3215.
Dreier, L.P., Hunter, J.J., Ruffner, H.P., 1998, Invertase activity,
grape berrry development and cell compartmentation, Plant
Physiology and Biochemistry, 36: 865-872.
Duan, K.J., Sheu, D.C., Chen, J.S., 1993, Purification and
characterization of beta-fructofuranosidase from Aspergillus
japonicus TIT-KJ1, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry,
57: 1811-1815.
148
Eiteman, M.A., Gainer, J.L., 1991, Partition of isomeric dipeptides in
poly(ethylene glycol)/magnesium sulfate aqueous two-phase
systems, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects,
1073: 451-455.
Engel, S., Barak, Z., Chipman, D.M., Merchuk, J. C., 2000,
Purification of acetohydroxy acid synthase by separation in an
aqueous two-phase system, Journal of Chromatography B:
Biomedical Sciences and Applications, 743: 281-286.
Ettalibi, M., Baratti, J.C., 1987, Purification, properties and comparison
of invertase, exoinulinase and endoinulinase of Aspergillus ficuum,
Applied Microbiology and Biotechnology, 26: 13-20.
Faye, L., Berjonneau, C., Rollin, P., 1981, Studies on beta-fructosidase
from radish seedlings: purification and partial characterization,
Plant Science Letters, 22: 77-87.
Falco, A.L.P., Durrant, L.R., Franco, T.T., 2000, Purification of Įgalactosidase from seeds of Sesbania marginata, Brazilian Journal
of Chemistry, 17: 4-7.
Fernández, R.C., Maresma, B.G., Juárez, A., Martínez, J., 2004,
Production of fructooligosaccharides by ȕ-fructofuranosidase from
Aspergillus sp 27H, Journal of Chemical Technology and
149
Ferreira, M.S.S., de Andrade, A.V.M., Kennedy, J.F., 1991,
Properties of a thermostable nonspecific fructofuranosidase
produced by Cladosporium cladosporioides cells for hydrolysis of
Jerusalem artichoke extract,
Applied
Biochemistry
and
Fotopoulos, V., 2005, Plant invertases: structure, function and regulation
of a diverse enzyme family, Journal of Biological Research, 4:
127-137.
Franco, T.T., Andrews B.A., Asenjo, A.J., 1996, Use of chemically
modified proteins to study the effect of a single protein property on
partitioning in aqueous two-phase systems: effect of surface
hydrophobicity, Biotechnology and Bioengineering, 19: 300-308.
Frevert, J., Ballou, C.E., 1982, Yeast invertase polymorphism is
correlated with variable states of oligosaccharide chain
phosphorylation, Proc. Nad. Acad. Sci., 79: 6147-6150.
Fu, R.-H., Wang, Y.-L., Sung, H.-Y., 2003, Cloning, characterization
and functional expression of a new beta-D-fructofuranosidase
(Osbetafruct2) cDNA from Oryza sativa, Biotechnology Letters,
25: 455-459.
Gascon, S., Neumann, N.P., Lampen, J.O., 1968, Comparative study of
the properties of the purified internal and external invertases from
yeast, Journal of Biological Chemistry, 243: 1573-1577.
150
Ghosh, K., Dhar, A., Samanta, T.B., 2001, Purification and
characterization of an invertase produced by Aspergillus ochraceus
TS, Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 38: 180-185.
Goetz, M., Roitsch, T., 1999, The different pH optima and substrate
specificities of extracellular and vacuolar invertases from plants are
determined by a single amino acid substitution, The Plant Journal,
20 (6): 707-711.
Gomes, G.A., Azevedo, A.M., Aires-Barros, M.R., Prazeres, D.M.F.,
2008, Purification of plasmid DNA with aqueous two phase
systems of PEG 600 and sodium citrate/ammonium sulfate,
Separation and Purification Technology, In Press.
Gómez, L., Villalonga, R., 2000, Functional stabilization of invertase by
covalent modification with pectin, Biotechnology Letters, 22:
1191–1195.
Goupil, P., Croisille, Y., Croisille, F., Ledoigt, G., 1988, Jerusalem
artichoke invertases -immunocharacterization of a soluble form and
its putative precursor, Plant Science, 54: 45-54.
Guimarães L.H.S., Terenzi H.F., Polizeli M.L.T., Jorge J.A., 2007,
Production and characterization of a thermostable extracellular ȕD-fructofuranosidase produced by Aspergillus ochraceus with
agroindustrial residues as carbon sources, Enzyme and Microbial
Technology, 42: 52-57.
151
Gürsel, A., Alkan, S., Toppare, L., Ya÷cÕ, Y., 2003, Immobilization of
invertase and glucose oxidase in conducting H-type
polysiloxane/polypyrrole block copolymers, Reactive & Functional
Polymers, 57: 57-65.
Han, J.H., Lee, C.-H., 1997, Effects of salts and poly(ethylene glycol)palmitate on the partitioning of proteins and Bacillus subtilis
neutral protease in aqueous two-phase systems, Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, 9(1-2): 109-116.
Hashizume, H., Tanase, K., Shiratake, K., Mori, H., Yamaki, S.,
2003, Purification and characterization of two soluble acid
invertase isozymes from Japanes pear fruit, Phytochemistry, 63:
129-129.
Hatti-Kaul, R., 2000, Aqueous Two-Phase Systems, Methods and
Protocols, Humana Press Inc., New Jersey, Editor: R., Hatti-Kaul,
440p.
He, G.-Q., Zhang, X.-Y., Tang, X.-J., Chen Q.-H., Ruan, H., 2005,
Partitioning and purification of extracellular ȕ-1,3-1,4-glucanase in
aqueous two-phase systems, Journal of Zhejiang University
Science, 6B(8): 825-831.
Hidaka, H., Eida, T., Adachi, T., Sito, Y., 1987, Industrial production
of fructooligosaccharides and its application for human and
animals, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 61: 915-923.
152
Hsiao, C.-C., Fu, R.-H., Sung, H.-Y., 2002, A novel bound form of
plant invertase in rice suspension cells, Bot. Bull. Acad. Sin, 43:
115-122.
Huang, W.C., Wang, A.Y., Wang, L.T., Sung, H.Y., 2003, Expression
and characterization of sweet potato invertase in Pichia pastoris,
Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51: 1494-1499.
Isabel D.V.M., Otero, C., 2003, Biphasic aqueous media containing
polyethylene glycol for the enzymatic synthesis of oligosaccharides
from lactose, Enzyme and Microbial Technology, 33: 118–126.
Ishikawa, N., Nakagawa, H., Ogura, N., 1989, Isoforms of invertase in
grape berries, Agricultural Biology and Chemistry, 53: 837-838.
Ishimoto, M., Nakamura, A., 1997, Purification and properties of betafructofuranosidase from Clostridium perfringens, Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry, 61: 599-603.
Isla, M.I., Vattuone, M.A., Gutierrez, M.I., Sampietro, A.R., 1988,
Acid invertase from Tropaeolum leaves, Phytochemistry, 27: 19931998.
Isla, M.I., Vattuone, M.A., Ordóñez, R.M., Sampietro, A.R., 1999,
Invertase activity associated with the walls of Solanum tuberosum
tubers, Phytochemistry, 50: 525-534.
153
Jacob, G.S., Scudder, P., 1994, Glycosidases in structural analysis,
Methods in Enzymology, Academis Pres, New York, 230: 280p.
Janer, C., Rohr, L. M., Peláez, C., Laloi, M., Cleusix, V., Requena,
T., Meile, L., 2004, Hydrolysis of oligofructoses by the
recombinant ȕ-fructofuranosidase from Bifidobacterium lactis,
Systematic and Applied Microbiology, 27: 279-285.
Johansson, G., 1985, Aqueous two-phase systems in protein
purification, Journal of Biotechnology, 3: 11–18.
Kepka, C., Collet, E., Persson, J., Ståhl, Å., Lagerstedt, T., Tjerneld,
F., Veide, A., 2003, Pilot-scale extraction of an intracellular
recombinant cutinase from E. coli cell homogenate using a
thermoseparating aqueous two-phase system, Journal of
Kern, G., Schulke, N., Schmid, F.X., Jaenicke, R., 1992, Stability,
quaternary structure, and folding of internal, external and coreglycosylated invertase from yeast, Protein Science, 120-131.
Klomklao, S., Benjakul, S.,Visessanguan, W., Simpson, B.K.,
Kishimura, H., 2005, Partitioning and recovery of proteinase from
tuna spleen by aqueous two-phase systems, Process Biochemistry,
40(9): 3061-3067.
154
Krishnan, H.B., Blanchette, J.T., Okita, T.W., 1985, Wheat invertases:
characterization of cell wall-bound and soluble forms, Plant
Physiology, 787: 241-245.
Laemmli, U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227: 680-685.
Lammens, W., Le Roy, K., Van Laere, A., Rabijns, A., Van den
Ende, W., 2008, Crystal structure of Arabidopsis thaliana cell-wall
invertase mutants in complex with sucrose, Journal of Molecular
Biology, 377: 378-385.
Leal, D.P., Isla, M.I., Vattuone, M.A., Sampietro A.R., 1999, A
hysteretic invertase from Equisetum giganteum L, Phytochemistry,
52: 1009-1016.
Lee, H.S., Sturm, A., 1996, Purification and characterization of neutral
and alkaline invertase from carrot, Plant Physiology, 112: 1513-
1522.
Legler, G., Korth, A., Berger, A., Ekhart, C., Gradnig, G., Stutz,
A.E., 1993, ,5-Dideoxy-2,5-imino-D-mannitol and -D-glucitol:
two-step bio-organic syntheses from 5-azido-5-deoxy-Dglucofuranose and -L-idofuranose; evaluation as glucosidase
inhibitors and application in affinity purification and
characterisation of invertase from yeast, Carbohydrate Research,
250: 67-77.
155
Leigh, R.A., Rees, T., Fuller, W.A., Banfield, J., 1979, The location of
acid invertase activity and sucrose in the vacuoles of storage roots
of beetroot (Beta vulgaris), Journal of Biochemistry, 178: 539-547.
L’Hocine, L., Wang, Z., Jiang, B., Xu, S., 2000, Purification and partial
characterization of fructosyltransferase and invertase from
Aspergillus niger AS0023, Journal of Biotechnology, 81: 73-84.
Liebl, W., Brem, D., Gotschlich, A., 1998, Analysis of the gene for ȕfructosidase (invertase, inulinase) of the hyperthermophilic
bacterium Thermotoga maritima, and characterisation of the
enzyme expressed in Escherichia coli, Applied Microbiology and
Lingle, S.E., Dunlap, J.R., 1987, Sucrose metabolism in netted
muskmelon fruit during development, Plant Physiology, 84: 386389.
Liu, C.-C., Huang, L.-C., Chang, C.-T., Sung, H.-Y., 2006,
Purification and characterization of soluble invertases from
suspension-cultured bamboo (Bambusa edulis) cells, Food
Chemistry, 96: 621-631.
Lopez, M.E., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1988, Partial
purification and properties of invertase from Carica papaya fruits,
Phytochemistry, 27: 3077-3081.
156
Marcos, J.C., Fonseca, L.P., Ramalho, M.T., Cabral, J.M.S., 1999,
Partial purification of penicilin acylase from Escherichia coli in
poly(ethylene glycol)-sodium citrate aqueous two-phase systems,
Journal of Chromatography B, 734: 15-22.
Masayoshi, M., Teruo, N., 1995, Enzymatic synthesis of novel fructosyl
and oligofructosyl trehaloses by Aspergillus sydowi ȕfructofuranosidase, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry,
59: 208-212.
Masuda, H., Sugawara, S., 1980, Purification and some properties of
cell wall-bound invertases from sugar beet seedlings and aged
slices of mature roots, Plant Physiology, 66: 93-96.
McCarter, J.D., Withers, S.G., 1994, Mechanisms of enzymatic
glycoside hydrolysis, Current Opinion in Structural Biology, 4:
885-892.
Meachum, Z.D., Colvin, H.R., Braymer, H.D., 1971, Chemical and
physical studies of Neurospora crassa invertase: molecular weight,
amino acid and carbohydrate composition, and quaternary
structure, Biochemistry, 10: 326-332.
Michaelis, L., Menten, M.L., 1913, Die kinetik der invertin-wirkung,
Biochemische Zeitschrift, 49: 333–396.
157
Miller, W.B., Ranwala, A.P., 1994, Characterization and localization of
three soluble invertase forms from Lilium longiflorum flower buds,
Physiologia Plantarum, 92 (2): 247-253.
Minuth, T., Thömmes, J., Kula, M.-R., 1995, Extraction of cholesterol
oxidase from Nocardia rhodochrous using a nonionic surfactant-
based
aqueous
two-phase
Journal of Biotechnology, 38: 151-164.
system,
Mohamadi, H.S., Omidinia, E., Dinarvand, R., 2007, Evaluation of
recombinant phenylalanine dehydrogenase behavior in aqueous
two-phase partitioning, Process Biochemistry, 42: 1296-1301.
Morell, M., Copeland, L., 1984, Enzymes of sucrose breakdown in
soybean nodules, Plant Physiology, 74: 1030-1034.
Moreno, S., Sanchez, Y., Rodriguez, L., 1990, Purification and
characterization of the invertase from Schizosaccharomyces pombe,
Biochemical Journal, 267: 697-702.
Moriguchi, T., Sanada, T., Yamaki, S., 1991, Properties of acid
invertase purified from peach fruits, Phytochemistry, 30: 95-97.
Nadkarni, M.A., Pandey, V.N., Pradhan, D.S., 1993, An invertase with
unusual properties secreted by sucrose-grown cells of
Corynebacterium murisepticum, Indian Journal of Biochemistry &
Biophysics, 30: 156-159.
158
Nakagawa, H., Kawasaki, Y., Ogura, N., Takehana, H., 1971,
Purification and some properties of two types of betafructofuranosidase from tomato fruit, Agricultural Biology and
Chemistry, 36: 18-26.
Nakamura, M., Hagimori, M., Matsumoto, T., 1988, Purification and
characterization of acid invertase from cultured tobacco cells,
Agricultural and Biological Chemistry, 52 (12): 3157-3158.
Negrete, A., Ling,T. C., Lyddiatt, A., 2007, Aqueous two-phase
recovery of bio-nanoparticles: a miniaturization study for the
recovery of bacteriophage T4, Journal of Chromatography B., 854:
13-19.
Neumann, N.P., Lampen, J.O., 1967, Purification and properties of
yeast invertase, Biochemistry, 6: 468-475.
Nguyen, Q.D., Rezessy-Szabó, J.M., Bhat, M.K., Hoschke, Á., 2005,
Purification and some properties of ȕ-fructofuranosidase from
Aspergillus niger IMI303386, Process Biochemistry, 40: 24612466.
Nishizawa, M., Maruyama, Y., Nakamura, M., 1980, Purification and
characterization of invertase isoenzymes from Fusarium
oxysporum, Agricultural Biology and Chemistry, 44: 489-498.
159
Obenland, D.M., Simmen, U., Boller, T., Wiemken, A., 1993,
Purification and characterization of three soluble invertases from
barley (Hordeum vulgare L.) leaves, Plant Physiology, 101: 1331-
1339.
Önal, S., Telefoncu, A., 1998, Some properties of Į-galactosidase
extracted from tomato and pineapple, Journal of Faculty of Science
Ege University, 121 (1): 113-124.
Pan, Q., Zou, K., Peng, C., Wang, X., Zhang, D., 2005, Purification,
biochemical and immunological characterization of acid invertases
from apple fruit, Journal of Integrative Plant Biology Formerly
Acta Botanica Sinica, 47: 50-59.
Prado, F.E., Vattuone, M.A., Fleischmacher, O.L., Sampietro, A.R.,
1985, Purification and characterization of Ricinus communis
invertase, Journal of Biological Chemistry, 260: 4952-4957.
Pressey, R., Avants, J.K., 1980, Invertases in oat seedlings, Plant
Quiroga, E.N., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1995, Purification
and characterization of the invertase from Pycnoporus sanguineus,
Biochimica et Biophysica Acta, 1251: 75-80.
160
Rahman, M.H., Akand, A.S.M.A.H., Yaesmin, T., Udin, M.S.,
Rahman, M., 2001, Purification and properties of invertase from
mango fruit, Pakistan Journal of Biological Sciences, 4 (10): 12711274.
Reddy, V.A., Maley, F., 1990, Identification of an active-site residue in
yeast invertase by affinity labeling and site-directed mutagenesis,
The Journal of Biological Chemistry, 265: 10817-10820.
Reddy, A., Maley, F., 1996, Studies on identifying the catalytic role of
Glu-204 in the active site of yeast invertase, The Journal of
Biological Chemistry, 271: 13953-13958.
Rojo, H.P., Quiroga, E.N., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1998,
Nicotiana glauca invertase: characterization and effects of
endogenous alkaloids, Phytochemistry, 49: 965-969.
Roobol-Bóza, M., Dolby, V., Doverskog, M., Barrefelt, Å., Lindqvist,
F., Oppermann, U.C., Alstine, K.K.V., Tjerneld, F., 2004,
Membrane protein isolation by in situ solubilization, partitioning
and affinity adsorption in aqueous two-phase systems: purification
of the human type 1 11ȕ-hydroxysteroid dehydrogenase, Journal of
Chromatography A, 1043: 217-223.
Rodriguez, M., Gomez, A., Gonzalez, F., Barzana, E., LopezMunguia, A., 1996, Selectivity of methyl-fructoside synthesis with
ȕ-fructofuranosidase, Applied biochemistry and biotechnology, 59:
167-176.
161
Roitsch, T., González, M.-C., 2004, Function and regulation of plant
invertases: sweet sensations, Trends in Plant Science, 9 (12): 606613.
Rojo, H.P., Quiroga, E.N., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1998,
Nicotiana glauca invertase: characterization and effects of
endogenous alkaloids, Phytochemistry, 49 (4): 965-969.
Rosa, P.A.J., Azevedo, A.M., Aires-Barros, M.R., 2007, Application of
central composite design to the optimisation of aqueous two-phase
extraction of human antibodies, Journal of Chromatography A,
1141: 50-60.
Rubio, M.C., Maldonado, M.C., 1995, Purification and characterization
of invertase from Aspergillus niger, Current Microbiology, 31: 80-
83.
Rubio, M.C., Runco, R., Navarro, A.R., 2002, Invertase from a strain
of Rhodotorula glutinis, Phytochemistry, 61: 605–609.
Salabat, A., Abnosi, M.H., Bahar, A.R., 2007, Amino acids partitioning
in aqueous two-phase system of polypropylene glycol and
magnesium sulfate, Journal of Chromatography B, 858: 234-238.
SaldamlÕ, ø., 2005, GÕda KimyasÕ.
162
Sanjay, G., Sugunan, S., 2006, Enhanced pH and thermal stabilities of
invertase immobilizied on montmorillonite K-10, Food Chemistry,
94: 573-579.
Sato,
M., Kaji, A., 1976, An acid- and heat-stable betafructofuranosidase from Corticium rolfsii, Agricultural Biology and
Chemistry, 40 : 2107-2108.
Schaffer, A.A., 1986, Invertases in young and mature leaves of Citrus
sinensis, Phytochemistry, 25: 2275-2277.
Singh, M.B., Knox, R.B., 1984, Invertases of Lilium polen, Plant
Sinnot, M.L., 1990, Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer,
Chemical Review, 90: 1171-1202.
Snyder, S.M., Cole, K.D., Szaig, D.C., 1992, Phase compositions,
viscosities and densities
for aqueous two phase systems composed of polyethylene glycol and
various salts at 25° C, Journal of Chemical & Engineering Data,
37: 268–274.
Srinivas, N.D., Rashmi, K.R., Raghavarao, K.S.M.S., 1999, Extraction
and purification of a plant peroxidase by aqueous two-phase
extraction coupled with gel filtration, Process Biochemistry, 35:
43-48.
163
Sturm, A., 1999, Invertases. Primary structures, functions and roles in
plant development and sucrose partitioning, Plant Physiology, 121:
1–7.
Su, C.-K., Chiang B.H., 2006, Partitioning and purification of lysozyme
from chicken egg white using aqueous two-phase system, Process
Biochemistry, 41(2): 257-263.
Sutherland, I.A., Audo, G., Bourton, E., Couillard, F., Fisher, D.,
Garrard, I., Hewitson, P., Intes, O., 2008, Rapid linear scale-up
of a protein separation by centrifugal partition chromatography,
Journal of Chromatography A, 1190: 57-62.
Tanaka, N., Ohuchi, N., Mukai, Y., Osaka, Y., Ohtani, Y., Tabuchi,
M., Bhuiyan, M.S.A., Fukui, H., Harashima, S., Takegawa, K.,
1998, Isolation and characterizatio of an invertase and its repressor
genes from Schizosaccharomycess pombe, Biochemical and
Biophysical Research Communications, 245: 246-253.
Tang, X., Ruffner, H.P., Scholes, J.D., Rolfe, S.A., 1996, Purification
and characterisation of soluble invertases from leaves of
Arabidopsis thaliana, Planta, 198: 17-23.
Telefoncu, A., 1986, Enzimolojinin prensibleri, Temel ve UygulamalÕ
Enzimoloji (Yaz Okulu). Editör: A. Telefoncu, 18s.
164
Telefoncu, A., 1996, Protein saflaútÕrma stratejisi ve amacÕ, Protein
SaflaútÕrÕlmasÕ ve Karakterizasyonu (Yaz Okulu), Editör A.
Telefoncu, 18s.
Tomotani, E.J., Vitolo, M., 2006, Catalytic performance of invertase
immobilized by adsorption on anionic Exchange resin, Process
Biochemistry, 41 (6): 1325-1331.
Trindade, I.P., Diogo, M.M., Prazeres, D.M.F., Marcos, J.C., 2005,
Purification of plasmid DNA vectors by aqueous two-phase
extraction and hydrophobic interaction chromatography, Journal of
Chromatography A, 1082 (2): 176-184.
Uslan, A.A., 1997, Enzimlerin etki mekanizmalarÕ ve aktif merkez tayini,
Enzimoloji (Yaz Okulu), Editör: A. Telefoncu, 30s.
Vaidya, B.K., Suthar, H.K., Kasture, S., Nene, S., 2006, Purification of
potato polyphenol oxidase (PPO) by partitioning in aqueous twophase system, Biochemical Engineering Journal, 28(2): 161-16.
Vailaya, A., Horváth, C., 1996, Retention Thermodynamics in
Hydrophobic Interaction Chromatography, Industrial &
Engineering Chemistry Research, 35: 2964-2981.
Vorster, D.J., Botha, F.C., 1998, Partial purification and
characterisation of sugarcane neutral invertase, Phytochemistry, 49:
651-655.
165
Salabat, A., 2006, Prediction of liquid-liquid phase diagrams of aqueous
salt + PEG systems using a thermodynamic model, Computer
Coupling of Phase Diagrams and Thermochemistry, 30: 296-300.
Schmidt, A.S., Ventom, A.M., Asenjo, J.A., 1994, Partitioning and
purification of Į-amylase in aqueous two-phase systems, Enzyme
and Microbial Technology, 16: 131-142.
Su, C.-K., Chiang, B.H., 2006, Partitioning and purification of lysozyme
from chicken egg white using aqueous two-phase system, Process
Biochemistry, 41: 257-263.
Simon G. Walker, Andrew Lyddiatt, 1998, Aqueous two-phase
systems as an alternative process route for the fractionation of
small inclusion bodies, Journal of Chromatography B: Biomedical
Sciences and Applications, 711: 185–194.
Wang, L.T., Wang, A.Y., Hsieh, C.W., Chen, C.Y., Sung, H.Y., 2005,
Vacuolar invertases in sweet potato: molecular cloning,
characterization and analysis of gene expression, Journal of
Agriculture and Food Chemistry, 53: 3672-3678.
Warchol, M., Perin, S., Gril, J.-P., Schneider, F., 2002,
Characterization of a purified ȕ-fructofuranosidase from
Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Letters in Applied
Microbiology, 35: 462-467.
166
Weersaooriya, M.K.B., Yatawara, H.P., 2002, Purification and
properties of invertase from the flowers of Woodfordia fruticosa,
Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 39: 347-350.
Weil, M., Rausch, T., 1990, Cell wall invertase in tobacco crown gall
cells: enzyme properties and regulation by auxin, Plant Physiology,
94: 1575-1581.
West, C., Wade, M., McMillan III, C., Albersheim, P., 1980,
Purification and properties of invertases extractable from
Phytophthora megasperma var. sojae mycelia, Archives of
Biochemistry and Biophysics, 201: 25–35.
Win, T.T., Isono, N., Kusnadi, Y., Watanabe, K., Obae, K., Ito, H.,
Matsui, H., 2004, Enzymatic synthesis of two novel non reducing
oligosaccharides using transfructosylation activity with ȕfructofuranosidase from Arthrobacter globiformis, Biotechnology
Letters, 26: 499-503.
Workman, W.E., Day, D.F., 1983, Purification and properties of the
beta-fructofuranosidase from Kluyveromyces fragilis, FEBS
Letters, 160: 16-20.
Xu, Y., He, G.-Q., Li, J.-J., 2005, Effective extraction of elastase from
Bacillus sp. Fermentation broth using aqueous two-phase system,
Journal of Zhejiang University Science, 11: 1087–1094.
167
Yanahira, S., Yabe, Y., Nakakoshi, M., Miura, S., Matsubara, N.,
Ishikawa,
H.,
1998,
Structures
of
Novel
Acidic
Galactooligosaccharides Synthesized by Bacillus circulans ȕGalactosidase, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 62 (9):
1791.
Yamada, K., Kojima, T., Bantog, N., Shimoda, T., Mori, H.,
Shiratake, K., Yamaki S., 2007, Cloning of two isoforms of
soluble acid invertase of Japanese pear and their expression during
fruit development, Journal of Plant Phtsiology, 164 (6): 746-755.
Yue, H., Yuan, Q., Wang, W., 2007, Purification of phenylalanine
ammonia-lyase in PEG1000/Na2SO4 aqueous two-phase system by
a two-step extraction, Biochemical Engineering Journal, 37: 231237.
Yun, H.S., Yoon, I.S., Kang, B.G., 2002, Rapid repression of vacuolar
invertase in mungbean hypocotyl segments and regulation by
sucrose, auxin and light, Plant Growth Regulation, 38: 181-189.
Zaslavsky, B.Y., Miheeva L.M., Aleschko, P.Y., Mahmudov, A.U.,
Bagirov, T.O., Garaev, E.S., 1988, Distribution of inorganic salts
between the coexisting phases of aqueous polymer two-phase
systems: interrelationship between the ionic and polymer
compousition of the phases, Journal of Chromatography, 439: 267-
281.
168
Zeng, C., Biemann, K., 1999, Determination of N-linked glycosylation
of yeast external invertase by matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-night mass spectrometry, Journal of
Mass Spectrometry, 34: 311-329.
Zhai, S.L., Luo, G.S., Liu, J.G., 2001, Selective recovery of amino
acids by aqueous two-phase electrophoresis, Chemical Engineering
Journal, 83: 55-59.
Zhang, H., Chi, Z., 2004, Inositol and phosphatidylinositol-mediated
invertase secretion in Schizosaccharomyces pombe, Enzyme and
Microbial Technology, 34: 213–218.
Zihnio÷lu, F., 1996, Elektroforetik yöntemler, Protein SaflaútÕrÕlmasÕ ve
Karakterizasyonu (Yaz Okulu), Editör A. Telefoncu, 150s.
169
ÖZGEÇMøù
x
AdÕ, SoyadÕ
: ølke YÜCEKAN
Do÷um Tarihi
: 26.04.1984
Do÷um Yeri
: K.ÇøFTLøK/LEFKOùA
Medeni Hali
: Bekar
Uyru÷u
: K.K.T.C.
Ev Adresi
: No:9 ÇakÕl Sokak SerdarlÕ / Gazima÷osa,
KKTC
E-mail
: [email protected]
YabancÕ Dili
: øngilizce
Eitim Durumu : ølkö÷retim e÷itimini ùehit Tuncer ølkokulunda,
orta e÷itimini ùehit Hüseyin Ruso Ortaokulunda ve lise e÷itimini ise
Türk Maarif Kolejinde tamamladÕ. 2005 yÕlÕnda Ege Üniversitesi Fen
Fakültesi Biyokimya Bölümünden Biyokimyager olarak mezun oldu.
2005 yÕlÕndan bu yana Ege Üniversitesi Biyokimya Bölümünde
Yüksek Lisans e÷itimi almaktadÕr.

øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøK

Transkript

Benzer belgeler

Yarış Programı