Dr. Gönül ASLA Dr. Gönül ASLAN

Tüberküloz Tanısında Yeni
Yaklaşımlar
Dr. Gönül ASLAN
koenf
İD TB
9.4 milyon yeni olgu
4700 ölüm/gün
1.7 milyon ölüm/yıl
TB kontrolü için,
HIZLI, DUYARLI, ÖZGÜL, UCUZ
Yeni tanı yöntemlerine ihtiyaç devam etm
•Aktif TB hastalarını hızlı teşhis ve doğru tedavi etmektir
teşhis ve doğru tedavi için; yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip; h
oji
yöntemleri kullanılmalıdır
“Diagnosis, diagnosis & diagnosis”
William Osler
Histoloji
Kesin Ta
bakteriyol
Mikrobiyoloji
Tüberküloz Tanısı
nfeksiyon
Aktif tüberküloz
Mikroskobik inceleme
Katı & Sıvı By kültür
eknikleri
eküler Yöntemler
olasyon
entifikasyon
renç Belirleme
Moleküler
Epidemiyo
İdentifikasyon
RFLP
Antitüberküloz İlaç Duyarlılık Testleri
Spoligot
Klinik örnekler
Örnekler!! (pulmoner /EP, Steril/nonsteril)
Miktar
Kalite (Tükrük değil balgam alınmalı)
Lokalizasyon ( biyopsi örnekleri mümkün olduğunca enf. bölgesini temsil etmeli)
Transport (Hızlı, kontamine etmeden)
Tedaviye başlamadan önce
Klinik-Laboratuvar İşbirliği/İletişimi
Basit, hızlı, ucuz, özgüllüğü yüksek, duyarlılık %20-80
ARB görülebilmesi için >5000 basil/ml
LED Tekn
eelsen boyama
Auramina O boyama
şık mikroskobuna bir adaptör yerleştirilerekte kullanılabilen LED
duyarlılığı yaklaşık %10 yükseltmektedir
Albert H, Manabe Y. Performance of three LED-based fluorescence microscopy systems for detection of tub
pheli kişilerin balgam yaymaların duyarlılık ve özg
EZN
LED
33/53 (%62.3)
38/53 (%71.7)
Çok düşük pozitif
2
6
Düşük pozitif
8
10
Yüksek pozitif
23
22
Kültür negatif balgam
125/127 (%98.4)
121/127 (%95.3)
Kültür pozitif balgam
örneklerindeki duyarlılık
örneklerindeki özgüllük
Manabe Y, Lukyamuzi G, et all. Performance of three LED-based fluorescence microscopy
tuberculosis in Uganda. PLoS One. 2010 28;5(12):e15206.
Katı ve sıvı ortamda kültür
Homojenizasyon, Konsantrasyon,
altın standart
Dekontaminasyon
B basil
MTC/Atipik
mikobakteri
ayrımı
Yumurta Bazl
üreme
Yavaş: 3
afta
Radyometrik
Flourimetrik
Kolorimetrik
Bölünme zam
Klasik /Moleküler identifikasyon
yöntemleri
DST
S (Microscopic Observation Drug Susceptibility A
ucuklu hücre kültürü plaklarında
brook 7H9 (OADC+PANTA)
ışık mikroskobunda MTC kord oluşumu
kullanan otomatize yöntemlere alternatif (<3$/örn
anti-mikobakteriyel duyarlılık
. gün
(balgam örneğinin direkt inokulasyonu)
9. gün
10. gün
11.gün
12. gün
13.gün
14. gün
16. gün
Thin Layer Agar (TLA)
MTB üremesini Middlebr
7H11 agar besiyerinde er
dönemde mikroskobik ola
belirlemeye dayalı bir yönt
da MTB kültür pozitifliğinin
espit edildiği günler
[50 mg/l piperacillin, 20 mg/l amphother
ve trimethoprim, OADC] 36ºC, %5-8 CO
ru PM et all. Journal of
ology 2009(47) 8
ARB pozitif
ARB negatif
Duyarlılık %
Duyarlılık %
LJ
90.4
70.9
TLA
94.1
89.1
liği MODS 9.9 gün TLA’da 11.1 gün
n MODS’da %7.4,TLA’da %1.4
de mikobakterilerin izotermal mikrokalorimetri ölç
hızlı tanısı
al mikrokalorimetri adı verilen cihaz kullanılarak bakterile
eri sırasında oluşan metabolik ısı µW olarak ölçülmesi pren
bir yöntemdir.
ük inokülasyonda bile (2 cfu/ml) üremenin kantitatif olara
bilmesi
a sıvı besiyerlerinde uygulanabilmesi,
emin kapalı sistemde gerçekleşmesi nedeniyle kontaminasy
lması yöntemin başlıca avantajlarıdır
D "The heat is on": rapid microcalorimetric detection of mycobacteria in culture.
ermal mikrokalorimetri yöntemi aynı zamanda
bakteriyel ilaç duyarlılıklarını belirlemede de
nılabilmektedir.
llikle TB insidansı yüksek olan az gelişmiş ülkel
emin kullanılabilirliğini artırmak için daha düşü
yetli yeni yaklaşımların geliştirilmesi planlanma
ant O, Wirz D "The heat is on": rapid microcalorimetric detection of mycobacteria in cultur
culosis. 2010:90(1):57-9.
Nükleik Asit
Saptanması
Hibridizasyon
Amplifikasyon
Yöntemleri
atı Fazda
Dot Blot
outherrn Blot
Yöntemleri
Sıvı
Fazda
Hedef Amplifikasyon
Northern Blot
PZR, TMA, SDA
Western Blot
Prop Amplifikasyonu
İn situ
LZR
Sinyal Amplifikasyon
r yöntemlerin özgüllükleri yüksek
arlılıkları;
Yayma pozitif örneklerde yüksek, Yayma negatif örnekl
üşük
Solunum yolu örneklerinde yüksek, Diğer örneklerde düşük
üşük duyarlılık
anlış pozitiflik (Ölü basillerle pozitif sonuç)
PTB da ve az sayıda basilin Hom/Dek da kaybı
tandardizasyon
Konvavsiyone
yetersiz/mol yönt.
Moleküler yönt
rutinde kullanımı
Solunum
örneklerinde
duyarlılık (%)
Solunum dışı
örneklerde
duyarlılık (%)
Hedef
Üretici Firma
16S rRNA
Gen-Probe
80-100
60-90
b antijenik protein
Abbott
80-90
65-80
16S rRNA
Roche
75-100
45-60
IS6110 ve
16S rRNA
Becton Dickinson
55-100
30-80
v2
IR16S-23S
Innogenetics
50-95
60-80
rekt
23S rRNA
Hain-lifescience
60-95
60-80
*Yayma negatif örneklerde duyarlılık %50’lere düşmektedir
düzeyinin rolü
Duyarlılık
Özgüllük
PPV
NPV
Düşük şüphe
%75
%97
%59
%99
Orta düzey şüphe
%83
%100
%100
%91
Yüksek şüphe
%87
%100
%100
%55
Catanzaro A. et al JAM
FISH-PNA
hedef alan floresanla işaretli oligonükleotid problar kulla
klinik örneklerden/kültürden Mycobacterium spp. izolasyo
n hızlı kolay bir yöntemdir. Peptit nükleik asit (PNA) probl
arak tür düzeyinde identifikasyon yapılabilmektedir.
TC için PNA Prob
MTC (+) test son
oratuvarımızda MGIT pozitif kültürlerden Oligo ve PNA-
temiyle yaptığımız identifikasyonda
go-FISH in duyarlılığı %96.6, özgüllüğü, PPD ve NPD %100
A-FISH in ise duyarlılığı %91.5, özgüllüğü ve PPD %100
1.4 olarak belirlenmiştir
Aslan G, Aydın E MGIT pozitif kültürlerden Mycobacterıum spp.’nin Oligo ve PNA-FISH
Moleküler İdentifikasyon
Yöntemleri
üksek ayırım gücü (140)
r: Yavaş, emek isteyen
oldukça karmaşık.
PRA (Polymorphism
Restriction Amplifica
*hsp65 geninin 441 bp parçasının PZR ile çoğalt
** İki restriksiyon enzimiyle (BstEII ve HaeI
Hibridizasyon Propları
Hedefe özgü 16S-23S rRNA bölgesi PZR
Amp ürünleri proplar üzerine ters hibridizasyon
Enzimatik reak. ile ürünün bağlandığı proplar belirlenerek
Mikobakteri türü saptanır
Bu testlerle 16 mikobakteri türü saptanabilir
InnoLiPA Myc
İlaç Duyarlılık Testi
08 Raporu: ÇİD-TB & YİD-TB
İzole edilen tüm MTC suşla
İlaç duyarlılık testi (DST) ya
MODS
İlaç Duyalılık Testleri
LJ yöntemi 4-6 hafta
İlaç dağılımı/potensi
CLSI Referans yöntem
Agar proporsiyon 7H10
2-4 hafta
1-3 hafta
TLA
2-3 hafta
İlaç Duyalılık Testleri
Radyometrik
Flourimetrik
Kolorimetrik
Sonuçlanma süresi:
1-2 hafta
EK (ESP II)
MYC
MGIT 960 sistemi
MB/BacT ALERT
Redüktaz testinin tanısal
performansı (n=210)
MODS testinin tanısal perfor
(n=210)
Özgüllük
(%)
PPD %
NPD %
MODS
Duyarlılık
(%)
Özgüllük
(%)
98
98
91
99
RIF
88
93
75
93
96
90
97
INH
90
93
83
97
98
92
99
RIF+INH
(MDR)
97
95
78
uyarlılık
(%)
PPD
ma sonuçlanma süresinin 10 gün, LJ için ise 64 gün olduğu, nitrat redü
DNA Hibridizasyon Stribi
Genotype® MTBDR ve Genotype® MTBDR plus
conjugate
control n control
MTBC ol rpoB type 1 type 2 type 3 type 4 type 5 D516V H526Y H526D S531L ol katG ld type 1 (ACC) 2 (ACA) -
1
2
1 RMPr INHr
2 RMPs INHs
INNO-LiP
TB tanısında Genotype MTBDR tanısal performan
MTBDR
MTBDRplus
karşılaştırıldığı Meta-analiz
22 full text/10 araştırma
7 prevalans
1 retrospektif
1 prevalans + retrospektif
1 belirtilmemiş
Direnç
Duyarlılık Özg
RIF
% 98.1
%9
INH
% 84.3
%9
TB da Direkt İlaç Duyarlılık Testleri; Meta
İngilizce orijinal
RIF/INH dirençli/ÇİD
Direkt ilaç direnci çalışılan
Toplam 64 çalışmadan 18 (indirek DST, Diagnostik, Rewiev
RIF
Duyarlılık %
Özgüllük %
düktaz
INH
Duyarlılık %
Öz
99
100
94
1
96
96
92
9
MTBDR
99
98
71
1
MTBDR Plus
99
99
96
1
NH+RIF dirençli 41 izolatın 39’u %95.1
NH dirençli 37 izolatın 27’si %73’ü doğru olarak tanımlanmıştır
rençli 25 izolatın 16’sı %64
rençli 11 izolatın 9’u %81 doğru olarak tanımlanmıştır
Xpert MTB
GeneXpert
Xpert MTB/RIF
Uygulaması basit, 2 saatte sonuçlanma
e reagent eklenir
sında bekletilir
2 ml örnek pipetle kartuşa
aktarılır
Kartuş cihaza yerleşt
Semi-kantitatif Nested PZR
2 saat sonra örnekte
İzolasyon+Amplifikasyon+RIF
MTC varlığı
direnci tek kartuş içinde
RIF direnci
t MTB/RIF testinde duyarlılığı arttırmak için,
rpoB
Primerler, 81 baz çiftlik kor
içeren rpoB genini amplifye etmekt
Deletion Deletion Deletion
AATTCATGG GACCAG GAACAA
Deletion
CCATTC
Deletion
CAGAAC
Inserti Insertion Del
on
TTCATG AAC
TTC
TGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTG
ACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** *
**
*
*
*
*
*
*
**
81 base pair core region
Boehme CC, Nicol MP Lancet,
**
*
*
*
* 533
kor bölgesindeki “wild”-tip dizileri ve RIF direnci ile ilişkili mut
tedir. RIF direncinde yaygın 23 farklı mutasyonu belirleyebilmek
a, Bakü, Cape Town, Durban, Mumbai olmak üzere 5 merke
AZERBAYCAN
Bakü
1730 hasta
%5
SOUTH
AFRICA
%42
%31
PERU/Lima
Cape
Town
Durban
HIV
%77
%72
HIV
%2
TB (C+)
%39
%13
TB (C+)
%61
MDR TB
%10
%%
HIV
TB (C+)
MDR TB
Duyarlılık %
Solunum yolu
Özgüllük
98.2
rneği
99.2
Solunum yolu
Örnek
72.5
k te toplam
90.2
m Dışı Örnek
53-77.3
MTB-RIF/Fenotipik %97.6 Dirençli
95.5-10
205/200
İlaç Duyarlılık Testleri
Katı Besiyeri
wenstein-Jensen
2-4 hafta
Middlebrook
Sıvı Besiyeri
MGIT
BacT/ALERT MP
üler Yöntemler
VersaTREK
InnoLipa
oTypeMTBDR
Xpert MTB
use”- yöntemler
Saatler-1gün
7-10 gün
Moleküler Yöntemler
vantaj
zlı Sonuç
Dezvantajlar
•Birden
fazla
gen
bölgesinin
dirençten
sorumlu
durumlarda her bir direnç geni için ayrı işlem yapı
gerekmesi
•Dirence yol açmayan sessiz mutasyonların saptanması,
•İlaç
direncine
yol
açan
bilinmeyen
saptanamaması,
•Pahalı olmaları ve cihaz gerektirmeleri
mutas
SerolojikTestler
nf. bölgesinden örnek almayı
gerektirmediğinden EPTB
Avantaj Sağlayabilir
nvaziv girişim gerekmediği için
gam veremeyecek hastalarda
***Ucuz ve basit teknoloji
Duyarlılık yayma pozitif hastalard
Çocuklarda,
EPTB,
HIV enfekte kişilerde
daha d
überkülozda tanısal marker olarak RD1 ve RD2 antijenlerin
kombinasyonunun kullanılması
TB ve EPTB tanısında multi-antijen karışımı (ESAT-6, CFP-10
Ag’ler ve bu Ag’lere karşı oluşan Ab’ların ELISA tekniğiyle ara
Bireysel ve multiantijen kokteyline karşı Ab
Dolaşımda ve balgamda Ag
(serumda v
pesifik interferon gama düzeyinin ölçülme
QuantiFERO
Elispot
n duyarlı hale gelmiş lenfositlerin M. tuberculosis‘e spesifik ESAT
10 proteinlerine cevaben ürettiği IFN- yapımını kantitatif olarak
tırmalarda ortalama duyarlılık
Çalışma sayısı (n)
Duyarlılk %
TB için düşük risk taşıyan birey
ortalama özgüllük
Gruplar
Çalışma sayısı (n)
Ö
omlar
SONUÇ
X-ray
Yayma
Katı By
Kültür
Sıvı Serolojik Mo
Kültür Testler Yön
Moleküler yöntemlerin duyarlılığı ??
Yayma (+)/yayma (-), Pulmoner/EP, Klinik şüphe??
Moleküler DST de, sessiz mutasyonlar yanlı
Test kitinin içermediği mutasyonlar ya
Moleküler yöntemler geleneksel yönt. yerine uygulana
standart kültürdür ve diğer yöntemler tamaml
lasyon Mikroskobik inceleme (Floresan)
Kültür Katı ve Sıvı By
dentifikasyon MTC/NTM ayrımını yapan hızlı
Moleküler Testler
-TB İlaç Direnci belirleme ÇİD TB’un yaygın
u bölgelerde hızlı moleküler duyarlılık testlerinin
mı
Referans laboratuvarl
Periferal laboratuvarl
lk sağlığı laboratuvarları
07
2008
2009
2010
2011
DSÖ tarafından kabul edilen teknoloji ve
2012
2013
2014
2015
20
DSÖ tarafından henüz kabul