Tam Metin(Full Text) - Türkiye Biyolojik Mücadele Derneği

Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi 2016, 7 (1): 13-30
Turkish Journal of Biological Control
ISSN 2146-0035
Orijinal araştırma (Original article)
Bakteriyel biyokontrol etmenler ile bağ küllemesi (Uncinula
necator (Schw.)) hastalığının kontrolü1
Gülşin DEMİR2, Recep KOTAN3
Control of powdery mildew (Uncinula necator (Schw.)) disease with bacterial
biocontrol agents
Abstract: Uncinula necator (Sch.) Burrill is the obligate fungal pathogen responsible for
powdery mildew on grapevine (Vitis vinifera L.). The disease is found in most grapegrowing areas of the world and is one of the most widespread and destructive diseases of
grapevine. Chemical fungicides typically have provided adequate control of most foliar
fungal pathogens. However, fungicide resistance problems, concerns regarding pesticide
residues and the revocation of registration of certain widely used fungicides have led to
increased activity in the development of biocontrol agents against foliar fungal pathogens.
In this study, a total of thirteen bacterial strains from the genera Brevibacillus, Bacillus,
Pseudomonas and Pantoea isolated from the under-ground or above-ground parts of wild
and cultivated plants in previous studies were used. The identity of the bacteria was
confirmed according to the Sherlock Microbial Identification System (Microbial ID,
Newark, DE, USA) and BIOLOG system. Six different combinations of bacterial strains
were propagated in a suitable liquid carrier formulation and tested for suppression of
powdery mildew with the spray method. Our results indicated that all of the liquid
formulations of bacteria significantly reduced the incidence of powdery mildew. The most
effective formulation was Formulation E, which included Brevibacillus brevis RK-342,
Pseudomonas fluorescens RK-255 and Bacillus thuringiensis TV-72F strains. This
formulation could be used as a biopesticide for the control of powdery mildew disease.
Keywords: Vineyard, biopesticide, powdery mildew, grape, PGR, Uncinula necator
Öz: Uncinula necator (Sch.) Burrill, bağda (Vitis vinifera L.) külleme hastalığına sebep
olan obligat bir fungal patojendir. Dünyada üzüm yetiĢtirilen pek çok alanda bulunan
hastalık, üzümün en yaygın ve yıkıcı hastalıklarından birisidir. Kimyasal fungusitler pek
çok fungal yaprak patojenlerinin kontrolünü sağlayabilmektedir. Ancak, fungusitlere karĢı
oluĢan dayanıklılık, pestisit kalıntısı problemi ve bazı pestisitlerin yasaklanmasından dolayı
yaprak patojenlerine karĢı biyokontrol ajanların geliĢtirilmesine olan ilgiyi artırmıĢtır. Bu
1
Bu çalıĢma; birinci yazarın lisans bitirme tezinden yapılmıĢtır.
Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı, Erzurum
3
Atatürk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, Erzurum
Sorumlu yazar (corresponding author) e-mail: [email protected]
AlınıĢ (Received): 26.02.2016
Kabul ediliĢ (Accepted): 31.05.2016
2
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
çalıĢmada; daha önce yapılmıĢ olan farklı araĢtırmalarda yabani ve kültür bitkilerinin
toprakaltı veya toprak üstü aksamlarından izole edilen Brevibacillus, Bacillus,
Pseudomonas ve Pantoea cinsine dâhil toplam onüç bakteri izolatı kullanılmıĢtır.
Bakterilerinin tanıları Microbial Identification Sistemi (MIS) ve BIOLOG sistemi
kullanılarak doğrulanmıĢtır. Bakterilerin altı farklı kombinasyonu uygun bir sıvı taĢıyıcıda
geliĢtirilerek sprey yöntemi kullanılarak külleme hastalığının kontrolü için test edilmiĢtir.
Sonuç olarak, bakteri içeren sıvı formülasyonların tamamının külleme hastalığının
geliĢimini önemli ölçüde önlediği görülmüĢtür. En etkili formülasyon; Brevibacillus brevis
RK-342, Pseudomonas fluorescens RK-255 ve Bacillus thuringiensis TV-72F
izolatlarından oluĢan Formülasyon E olarak belirlenmiĢtir. Bu biyoformülasyon bağ
küllemesi hastalığının kontrolünde biyopestisit olarak kullanılabilir.
Anahtar kelimeler: Bağ, biyopestisit, külleme, üzüm, PGPR, Uncinula necator
Giriş
Bağcılıkta, en önemli sorunların baĢında gerek bitkinin kök bölgesinde gerekse de
toprak üstü aksamında hastalık oluĢturarak verim kayıplarına sebep olan fungal
patojenler gelmektedir. Uncinula necator (Sch.) Burrill. bağ küllemesi hastalığının
etmeni olup gerek dünyada gerek ülkemizde çok ciddi zararlara sebep olmaktadır
(Arı ve ark., 1995). Hastalık omcanın tüm yeĢil organlarında (yaprak, sap, sürgün,
çiçek ve salkım) görülebilmektedir. Ġlk dönemde hastalık genç yapraklarda güç
fark edilir. Genelde yaprakların üst yüzeyinde yağ lekesine benzeyen sarımsı veya
parlak lekeler görülür. Yaprak yaĢlandıkça parlaklığı gider, kalınlaĢır ve
gevrekleĢerek kenardan içe doğru kıvrılır. Ġleri dönemde yapraklar kirli-beyaz
renkte kül serpilmiĢ gibi bir görünüm alır. Misellerin çiçek, sülük ve salkım
saplarında da aynı Ģekilde kirli beyaz ve tozlu bir görünüm oluĢturduğu ve
hastalığa erken yakalanan danelerin küçük kaldığı, olgunlaĢmadan hemen önce
yakalanan danelerin, sapı doğrultusunda çatladığı, meyve eti ve çekirdeklerin dıĢa
fırladığı görülmektedir (Wilcox, 2003).
Türkiye‟de hemen hemen üzüm yetiĢtiriciliği yapılan her bölgede bu hastalığa
rastlanmakta ve çok ciddi zararlar verebildiği gözlenmektedir. Yapılan bir
çalıĢmada; Manisa‟da tüm bağ alanlarında bağ küllemesi hastalığının gerek
bulunuĢ oranı, gerekse de yaygınlık olarak ilk sırada yer aldığı belirlenmiĢtir
(Albayrak ve ark., 2002). Yağmurlar patojenin konidiumlarını yıkayarak veya
miselyumu tahrip ederek hastalık geliĢimini engellediği için; daha çok yazları
kurak geçen bölgelerde hastalık her yıl muntazam bir biçimde görülebilmekte ve
önlem alınmadığı takdirde verim ve kaliteyi oldukça düĢürebilmektedir (Halleen
and Holz, 2001).
Bazı kültürel önlemler ile hastalık Ģiddetini belli oranda azaltmak ve yapılacak
kimyasal mücadelenin daha etkili olmasını sağlamak mümkün olsa bile tek baĢına
kültürel önlemler ile hastalığın kontrol edilmesi mümkün görülmemektedir
(Halleen and Holz, 2001). Manisa, ülkemizde üzüm üretiminde önemli bir yere
sahip olup; bağ alanlarında görülen hastalıklara karĢı yoğun bir ilaçlama
14
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
yapılmaktadır. Küllemenin en eski ve halen birçok ülkede en yaygın olarak
kullanılan ilacı kükürt olup; diğer bir kimyasal grubu ise sistemik fungisitlerdir.
Ancak üzümde fungal patojenlere karĢı uygulanan fungisit uygulamalarının üzüm
yapraklarındaki faydalı epifitik organizma populasyonlarında da çok ciddi
azalmalara sebep olduğu belirtilmektedir (Sholberg et al., 2006).
Bağ küllemesi hastalığının mücadelesinde kültürel önlemler ve dayanıklı çeĢit
kullanımı yetersiz kalmakta; kullanılan kimyasalların insan ve hayvan sağlığı ile
çevre üzerindeki olumsuz etkilerinin her geçen gün daha iyi anlaĢılması ile tarımsal
savaĢ stratejileri içerisinde biyolojik mücadelenin önemini daha da artırmıĢtır.
Özellikle de yoğun tarım uygulamalarında aĢırı kimyasal ilaç ve gübre kullanımı;
tarımsal üretim sistemlerinin sürdürülebilirliğini riske atmıĢ, doğal kaynakların
insan sağlığını tehdit eder boyutlarda kirlenmesine, patojen ve zararlı etmenlerde
ilaçlara karĢı dayanıklılık riskinin oluĢmasına sebep olmuĢtur (Tiryaki ve ark.,
2010; Delen, 2015). Bu nedenle; toprak ve su kaynaklarına daha az zarar veren,
tarımsal kimyasallara daha az bağımlı olan çevre dostu stratejilerin kullanılmasına
ve sürdürülebilir tarım uygulamalarının yaygınlaĢtırılmasına duyulan ihtiyaç her
geçen gün artmaktadır (Szekeres 2006).
Bitki korumada, biyolojik mücadele etmenlerinin kullanımı sürdürülebilir tarım
uygulamalarının vazgeçilmezi haline gelmiĢtir. Serbest yaĢayan, bitki geliĢimini
teĢvik eden, biyolojik mücadele veya biyolojik gübreleme amacıyla kullanılan
bakterilere Bitki GeliĢimini Tesvik Eden (Plant Growth Promoting Rhizobacteria;
PGPR) bakteriler adı verilmektedir. PGPR bakterileri kullanılarak birçok hastalığın
kontrol edilebildiği bilinmektedir (Kotan ve ġahin 2002). Bitki hastalıklarına karĢı
kullanılan mücadele stratejileri değerlendirildiğinde, biyolojik mücadele
yöntemlerinin en az kimyasal mücadele kadar baĢarılı olduğu ve hatta bazı
araĢtırma sonuçlarına göre kimyasal mücadeleyi geride bıraktığı tespit edilmiĢtir
(Kotan, 1998; Kotan ve Sahin, 2002; Oldaç ve ark., 2002; Stromberg et al., 2004;
Mirik ve ark., 2008).
Üzüm yapraklarında mikrobiyal populasyonun oldukça yoğun olduğu, bu
bakteri veya fungusların pek çoğunun da potansiyel biyolojik ajan olarak üzüm
yaprak ve meyvesindeki fungal patojenler ile bir mücadeleye girdikleri
belirtilmektedir (Sholberg et al., 2006). Yapılan bir çalıĢmada; Fusarium
proliferatum G6 izzolatının mikrokonidi süspansiyonu uygulaması ile Plasmopara
viticola (Sacc.)‟nın sporangial oluĢumunun %97 oranında önlenebildiği
belirtilmiĢtir (Falk et al., 1996). Bir baĢka çalıĢmada ise; Bacillus subtilis strain
QST 713 içerikli Serenade ve Ampelomyces quisqualis içerikli AQ10 isimli ticari
preparatların bağ küllemesinin mücedelesinde kullanıldığı bildirilmiĢtir (Bull and
Kokie, 2005).
Ülkemizde bitki hastalıklarının biyolojik mücadelesine yönelik yıllardır çok
sayıda çalıĢma yapılmasına rağmen henüz tescillenmiĢ hiçbir biyopereparat
bulunmamaktadır. Ticari preparatlar tescillenirken laboratuar ve arazi ölçekli
15
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
yapılan çalıĢmaların devamında tespit edilen biyoajan için uygun bir taĢıyıcının
geliĢtirilmesi ve toksikolojik testlerin tamamlanması gerekmektedir. Yapılan bu
çalıĢma ile daha önce yapılmıĢ olan farklı araĢtırmalarda yabani ve kültür
bitkilerinin toprak altı veya toprak üstü aksamlarından izole edilen Brevibacillus,
Bacillus, Pseudomonas ve Pantoea cinslerine dâhil toplam 13 biyoajan bakteri
izolatının farklı kombinasyonlarının uygun bir sıvı taĢıyıcı ile oluĢturulan
formülasyonlarının arazi koĢullarında bağ küllemesi hastalığının mücadelesinde
etkinliklerinin test edilerek hastalığın kontrolünü sağlayabilecek bakteri içerikli bir
biyoformülasyonun geliĢtirilmesi amaçlanmıĢtır.
Materyal ve yöntem
Materyal
Çalışmada kullanılan biyoajan bakteriler
ÇalıĢmada kullanılan toplam 10 bakteri izolatının listesi Çizelge 1‟de verilmiĢtir.
Bu bakteri izolatları daha önce yürütülen çalıĢmalarda yabani ve kültür
bitkilerinden izole edilmiĢtir.
Çizelge 1. ÇalıĢmada kullanılan bakteri izolatları
Table 1. Bacterial strains used in this study
İzolat no
Bakteri türü
İzole edildiği konukçu
Kaynak
TV-20E
TV-67C
RK-43
TV-85F
TV-6F
RK-6
TV-17C
RK-341
TV-72F
RK-342
RK-79
RK-304
RK-255
Bacillus megaterium
Bacillus pumilus
Bacillus pumilus
Bacillus sphaericus
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis
Brevibacillus brevis
Pantoea agglomerans
Pseudomonas chlororaphis
Pseudomonas fluorescens
Ahududu
Ahududu
Kiraz
ġeker pancarı
Yabani buğdaygil
Elma
Ahududu
Elma
Sedum
Armut
Elma
Armut
Armut
Erman ve ark., 2010
Erman ve ark., 2010
Kotan, 2002
Erman ve ark., 2010
Erman ve ark., 2010
Kotan, 2002
Erman ve ark., 2010
Kotan, 2002
Erman ve ark., 2010
Kotan, 2002
Kotan, 2002
Kotan, 2002
Kotan, 2002
Daha önce yürütülen çalıĢmalarda fungal ve bakteriyel bitki patojenlerine karĢı
antagonistik aktiviteleri açısından test edilen ve etkili oldukları belirlenen izolatlar
arasından seçilmiĢtir (Kotan, 1997; Kotan, 2002; Kotan et al., 2004; Kotan and
ġahin, 2006; Kotan et al., 2009; Gökçe, 2013; Gökçe ve Kotan, 2014). Ayrıca bu
izolatların fosfat çözme, azot fiksasyonu (Erman ve ark., 2010), hormon ve amino
asit üretimi bakımından enkinlikleri de test edilmiĢtir (Turan et al., 2014).
Bakteriler, Atatürk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü
Mikroorganizma Kültür Koleksiyonunda muhafaza edilmektedir. Her bakterinin 24
16
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
saatlik saf kültüründen bir öze dolusu alınarak, içerisinde 500 µl %30‟luk glycerol
ve 500 µl LB Broth (1 L dH2O‟ya 10 g tryptone, 10 g NaCl ve 5 g yeast extract
ilave edilerek hazırlanmıĢtır) bulunan eppendorf tüplere aktarılarak etiketlenmiĢ ve
karıĢtırıcıda karıĢtırılarak daha sonraki çalıĢmalarda kullanılmak üzere –80°C‟de
muhafaza edilmiĢtir.
Çalışmada kullanılan üzüm çeşidi ve deneme alanı
ÇalıĢma; Manisa ili Salihli ilçesi Karaoğlanlı köyü Gökdede mevkiinde tamamı 12
yaĢında Sultani Çekirdeksiz kurutmalık üzüm asmalarından oluĢan aile arazisinde
yürütülmüĢtür.
Çalışmada kullanılan sıvı taşıyıcı
Daha önce yürütülen çalıĢmalar sonucunda; Biomarket Tarımsal Bioteknolojik
Ürünler Pazarlama Sanayi ve Ticaret Limitet ġirketi adına, Gıda Tarım ve
Hayvanclık Bakanlığı‟dan 02.01.2013 tarih ve 5943 Tescil Numarası ile BMMegaFlu isimli bir karıĢım mikrobiyal gübre tescili almıĢtır. Bu ürün için sıvı
taĢıyıcı oluĢturulurken bakterilerin raf ömrü ve taĢıyıcının bitkiye toksik etkisinin
olmaması gibi özellikler de dikkate alınarak bazı organik maddeler (deniz yosunu,
peynir altı suyu ve bitkisel özütler), su, koruyucu ve homojenizasyonunu sağlayıcı
çeĢitli maddelerden (carboxymethylcellülose, kalsiyum karbonat, glyserin,
magnezyum sülfat) oluĢan bir sıvı taĢıyıcı geliĢtirilmiĢtir. Bu taĢıyıcının pek çok
bakteri için çok uygun bir sıvı taĢıyıcı olduğu gözlenmiĢtir (Kotan ve Kasapoğlu,
2014).
Çalışmada kullanılan bakteri formülasyonları
Bakteri formülasyonları ve kontrol uygulamalarına ait bilgiler Çizelge 2‟de
verilmiĢtir.
Çizelge 2. Test edilen formülasyonlarda kullanılan bakteri izolatları
Table 2. Bacterial isolates used in the tested formülations
No
1
2
3
4
5
6
7
8
Uygulamalar
Kullanılan biyolojik ajanlar
Formülasyon A
Formülasyon B
Formülasyon C
Formülasyon D
Formülasyon E
Formülasyon F
Kontrol 1
Kontrol 2
RK-342 + TV-6 + RK-6
RK-342 + TV-17C + TV-85F
RK-342 + TV-20E + RK-304
RK-342 + TV-67C + RK-43
RK-342 + RK-255 + TV-72F
RK-342 + RK-79 + RK-341
Yalnızca sıvı taĢıyıcı uygulaması
Ġlaç uygulaması ( Penconazole + Metrafonone + Carbendazim)
Formülasyonlar oluĢturulurken bakteri izolatlarının daha önceki çalıĢmalarda elde
edilen biyokontrol özellikleri ve her bir izolata ait azot fiksasyonu, amino asit,
17
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
organik asit ve/veya hormon üretim değerleri dikkate alınarak yapılan
değerlendirmede 6 farklı kombinasyon oluĢturulmuĢtur.
Yöntem
Bakterilerin BIOLOG sistemi ile tanılanması
Bakteri izolatlarının BIOLOG sistemi yardımı ile metabolik enzim profillerinin
belirlenmesi hem alternatif bir tanı hem de izolatların karakterizasyonunda
kullanılmıĢtır. Aynı zamanda metabolik enzim profillerine bağlı olarak izolatların
kullandıkları karbon kaynakları belirlenmiĢtir. Bu çalıĢmada sadece patojen
oldukları belirlenen izolatlara BIOLOG yapılmıĢ olup test edilen bakteriler Gram
reaksiyonu özelliklerine göre gruplara ayrılmıĢtır. Gram Pozitifler BUG+M
(Biolog Universal Growth Agar +%0,25 Maltoz) besiyerine, Gram Negatifler ise
TSA besiyerine çizgi usulü ile ekilmiĢtir. Kültürler 30°C‟de 16-24 saat süreyle
inkübasyona bırakılarak oluĢan koloniler eküvyon çubukları ile Salina Tampon
Çözeltisine (%0,5‟lik NaCl) aktarılmıĢtır. Vortex cihazında karıĢtırılarak standart
turbidity tüpüne göre konsantrasyonları 108 CFU/ml‟ye ayarlanmıĢtır. Hazırlanan
solüsyonlardan pipet ile 150 mikrolitre alınarak mikroplate üzerindeki her bir
çukurcuğa ilave edilmiĢtir. Mikroplateler 4-6 veya 16-24 saat süreyle 27-30°C‟de
inkübe edilmiĢ ve oluĢan renklenme BIOLOG kinetik okuyucuda okutularak tanı
sonuçları elde edilmiĢtir (ġahin, 1999).
Tütünde aşırı duyarlılık (Hypersensitivity Reaction = HR) testi
ÇalıĢmada kullanılan bakteriyel izolatlar NA besiyerine çizilerek inkübasyona
bırakılmıĢtır. 24 sa‟lik kültürlerden öze ile alınarak sdH2O içerisine aktarılan
bakteriler vorteks cihazında karıĢtırılıp hazırlanan karıĢımın konsantrasyonu sdH2O
108 CFU/ml‟ye ayarlanmıĢtır. Elde edilen solüsyondan steril Ģırınga ile 2 ml‟lik
alınarak tütün (Nicotina tabacum L. var. Samsun) yapraklarının damarları arasına
enjekte edilmiĢtir. Uygulama yapılan bitkiler bitki büyütme kabinlerinde %90
nemde ve 24-48 sa süreyle bekletilerek, inokulasyonun yapıldığı bölgelerde ölü
doku (nekroz) oluĢup oluĢmadığı takip edilmiĢtir. Ölü doku oluĢturan izolatlar HR
pozitif (+), oluĢturmayanlar ise HR negatif (–) olarak değerlendirilmiĢtir. Kontrol
bitkilerinde sdH2O kullanılmıĢtır (Klement et al., 1990).
Taze bakteri kültürlerinin geliştirilmesi ve fermentöre transfer edilmesi
DondurulmuĢ bakteri kültürleri NA besi ortamı içeren petrilere 4 fazlı çizgi ekimle
ekilerek saflığı kontrol edilmiĢtir. Tek bir koloniden alınarak yeniden NA besi
ortamına ekilmiĢ, 27°C‟de inkübasyona bırakılarak 24 saatlik taze kültürleri elde
edilmiĢtir. GeliĢen taze kültürlerden bir öze dolusu bakteri kültürü agar ortamı
yüzeyinden alınarak daha önce fermantörde hazırlanan ve otoklavda 121°C‟de 20
dak steril edilmiĢ Nutrient Broth (NB) içeren sıvı besi ortamına aĢılanmıĢtır. Yatay
çalkalayıcılı inkübatörde bu kültürler 26°C‟de 24 saat geliĢtirilmiĢtir.
18
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
Sıvı taşıyıcının biyoreaktörde buharla sterilizasyonu, soğutulması ve
fermentör kültürlerinin biyoreaktörde sıvı taşıyıcıya transfer edilmesi
Sıvı besi ortamında geliĢtirilen bakteriler her bir formülasyonu içeren izolatlardan
eĢit hacimlerde karıĢtırılarak oluĢturulan bakteri kültürü tamamen organik
maddelerden oluĢan ve buharla sterilizasyonu yapılan taĢıyıcı sıvıya 1:10 oranında
karıĢtırılarak aĢılama yapılmıĢtır. Bakteri aĢılaması yapılan organik sıvı taĢıyıcılar
yatay çalkalayıcılı inkübatörde 26°C‟de 24 saat inkübasyona bırakılmıĢtır.
Hazırlanan bu biyoformülasyonlar 1 litrelik steril plastik kutulara aktarılmıĢ,
numunelerin bir kısmı denemede kullanılmıĢ bir kısmı ise buzdolabında muhafaza
edilerek raf ömürlerinin belirlenmesinde kullanılmıĢtır.
Bakteri formülasyonlarının raf ömürlerinin belirlenmesi
Hazırlanan bakteri formülasyonları karanlık bir yerde oda sıcaklığında muhafaza
edilerek raf ömürlerinin belirlenmesi için aylık toplam bakteri sayımları
yapılmıĢtır. Her sayımın baĢında; önce seri dilisyonlar hazırlamak için içerisine
9‟ar ml deiyonize su konulan cam tüpler, ağızları pamuk tıkaçla kapatılarak
otoklavda steril edilmiĢtir. Saklanan ürünler steril koĢullarda çıkarılarak, ürün iyice
çalkalandıktan sonra kapağı dikkatlice açılarak, 10 ml örnek alınarak steril
erlenlere aktarılmıĢtır. Buradan tekrar iyice çalkalanarak alınan 1 ml örnek bakteri
sayımı için hazırlanan ilk tüpe aktarılmıĢtır. Buradan baĢlanarak her defasında iyice
çalkalanarak alınan 1 ml örnek bir sonraki tüpe aktarılarak formülasyonların seri
dilüsyonları hazırlanmıĢtır. Her dilüsyondan ayrı ayrı 100 ml alınarak 3 petriye
ekim yapılmıĢtır. Kültürler 27°C‟de 48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Burada
sayım yapılacak petrilerde ortalama olarak en az 30-40 en çok 200-250 koloni
olmasına dikkat edilmiĢtir. Bulunan koloni sayısı 3 petrinin ortalaması ile elde
edilmiĢtir. Sayımın yapıldığı dilüsyon katsayısı ile çarpılarak toplam sayı
bulunmuĢtur (kob/ml). Bakteri konsantrasyonunun 1x107 kob/ml olarak belirlendiği
en son süre ürünün raf ömrü olarak değerlendirilmiĢtir.
Deneme deseni ve denemenin kurulması
ÇalıĢma, tesadüf parselleri deneme deseninde faktöriyel düzenlemeye göre
kurulmuĢtur. Denemede 6 bakteri formülasyonu ve 2 kontrolden oluĢan 8
uygulama test edilmiĢtir. 1: Formülasyon A, 2: Formülasyon B, 3: Formülasyon C,
4: Formülasyon D, 5: Formülasyon E, 6: Formülasyon F) 7: Kontrol 1 (Ġlaç
uygulanmıĢ) ve 8: Kontrol 2 (sadece sıvı taĢıyıcı uygulanmıĢ).
Bakterilerin uygulanması ve sonuçların değerlendirilmesi
ÇalıĢma bağ küllemesi hastalığının etmeni olan U. necator fungusunun doğal
inokulasyonlarına karĢı yürütülmüĢtür. Bu hastalık bölgede her yıl çok yaygın
olarak görülmektedir. Sultani üzüm çeĢidinde kurulan denemede kültürel iĢlemler
bütün uygulamalarda aynı zamanda ve eĢit olarak yapılmıĢtır. Hazırlanan bakteri
içerikli biyoformülasyonlar klorsuz kuyu suyu ile 100 kat seyreltilerek hazırlanan
19
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
bakteri süspansiyonu içerisine 1/40 oranında (Kg/L) yapıĢtırıcı olarak Ģeker ilave
edilmiĢ ve iyice karıĢtırılarak 1 gece bekletilmiĢtir. Uygulamalar 3 kez bitkinin
fenolojik dönemleri dikkate alınarak yapılmıĢtır. 1. Ġlaçlama: Çiçekten önce,
sürgünlerin 25–30 cm olduğu dönemde Penconazole etken maddeli preparat 100 lt
su/ 25 ml, 2. Ġlaçlama: Çiçek taç yapraklarının döküldüğü ve korukların saçma
tanesi iriliğinde olduğu dönemde Metrafonone etken maddeli preparat 100 lt su/ 20
ml, 3. Ġlaçlama ise: Ġkinci ilaçlamadan 10 gün sonra Carbendazim etken maddeli
preparat 100 lt su/ 60 gr uygulanmıĢtır. Değerlendirmeler son ilaçlamadan 20 gün
sonra yapılmıĢtır. AraĢtırma da oluĢturulan tesadüf parsel gruplarında bulunan 5
asmanın her birinden ayrı ayrı 20‟Ģer adet, toplamda bir deneme deseninden 100
adet rastgele yaprak seçilerek yapılmıĢtır. Seçilen yapraklar 1-5 skalasına göre hiç
hastalık belirtisi görülmeyen yapraklara 1 değeri, hastalığın maksimum görüldüğü
yapraklara 5 değeri verilmiĢtir. Bağ küllemesi hastalığında yaprak için
değerlendirme skalası Çizelge 3‟de verilmiĢtir (Anonim, 2014). Uygulamaların
yüzde etkinlikleri Abbott formülü yardımıyla hesaplanmıĢtır (Karman 1971).
Yüzde etkinlik = [Kontrol hastalık – Uygulama hastalık ] / Kontrol hastalık X 100
Çizelge 3. Hastalık Ģiddetinin belirlenmesinde kullanılan skala oranları
Table 3. Rating scales used for determination of disease severity
Skala Değeri
1
2
3
4
5
Hastalığın Tanımı
Yaprakta hiç leke yok
Yaprakta 1-2 leke mevcut
Yaprakta 3-5 leke mevcut
Yaprakta 5-10 leke mevcut
Yaprakta 10 ve daha fazla leke mevcut
Sonuçların analiz edilmesi
Sonuçlar SPSS (Statistical Package for Social Sciences, Version 9.0)‟de analiz
edilmiĢ, uygulamaların aritmetik ortalamaları ve standart sapmaları hesaplanmıĢtır.
Uygulamalar arasındaki farklığının önem derecesini belirlemek için Duncan testi
yapılmıĢtır.
Bulgular ve tartışma
Bakterilerin tanısı
ÇalıĢmada kullanılan bakteri izolatlarının MIS ve BIOLOG tanı sonuçları,
benzerlik indeksleri ve HR test sonuçları Çizelge 4‟de verilmiĢtir. MIS ve
BIOLOG tanı sonuçlarına göre; TV-20E izolatı Bacillus megaterium, TV-67C ve
RK-43 izolatları Bacillus pumilus, TV-85F, TV-6F, RK-6, TV-17C, RK-341
izolatları Bacillus subtilis, TV-72F izolatı Bacillus thuringiensis, RK-79 izolatı
Pantoea agglomerans, ve RK-255 izolatı ise Pseudomonas fluorescens olarak
tanılanmıĢtır. MIS sisteminde Brevibacillus brevis olarak tanılanan RK-342 izolatı
20
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
BIOLOG sisteminde Bacillus licheniformis; Pseudomonas chlororaphis olarak
tanılanan RK-304 izolatı ise Pseudomonas marginalis olarak tanılanmıĢtır. MIS
benzerlik indeksleri 0.589-0,886 arasında; BIOLOG benzerlik indeksleri ise 43-76
arasında değiĢmiĢtir. ÇalıĢmada kullanılan bütün bakteri izolatlarının HR test
sonuçları negatif çıkmıĢtır. MIS ve BIOLOG tanı sonuçlarında bütük oranda bir
benzerlik görülmüĢtür.
Çizelge 4. Bakteri izolatlarının MIS ve BIOLOG tanı sonuçları, benzerlik indeksleri ve
tütünde aĢırı duyarlılık test sonuçları
Table 4. MIS and BIOLOG identification results of the bacterial strains, their similarity
index and hypersensitivity test results on tobacco
İzolat no
MIS tanı sonucu
TV-20E
TV-67C
RK-43
TV-85F
TV-6F
RK-6
TV-17C
RK-341
RK-342
TV-72F
RK-79
RK-304
RK-255
Bacillus megaterium
Bacillus pumilus
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Brevibacillus brevis
Bacillus thuringiensis
Pantoea agglomerans
Pseudomonas chlororaphis
Pseudomonas fluorescens
Bİ
0.774
0.645
0.886
0.665
0.851
0.754
0.687
0.865
0.589
0.640
0.760
0.884
0.654
BIOLOG tanı sonucu
Bİ
HR
Bacillus megaterium
Bacillus pumilus
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Bacillus thuringiensis
Pantoea agglomerans
Pseudomonas marginalis
Pseudomonas fluorescens
65
66
57
64
53
76
68
56
43
57
50
54
47
-
Bİ: Benzerlik indeksi, HR: Tütünde aĢırı duyarlılık testi, -: Negatif sonuç
Ürünün raf ömrü
Bakteri formülasyonlarında yapılan aylık bakteri sayım sonuçları ġekil 1‟de
verilmiĢtir. Bütün formülasyonlardaki raf ömrü 7-8 ay arasında değiĢmiĢtir.
Formülasyon B ve D‟de 7. aya kadar koloni oluĢturan bakteri sayıları 1x107
kob/ml‟nin üzerinde olurken, diğer formülasyonların tamamında bu 8. aya kadar
sürmüĢtür. En yüksek etkinliğin sağlandığı formülasyon E ve F uygulamalarında 8.
aydaki bakteri sayısı sırası ile 1,1x107 kob/ml ve 1,7x107 kob/ml olarak sayılmıĢtır.
Dolayısı ile bu formülasyonlarda raf ömrü 8 ay olarak belirlenmiĢtir.
Formülasyonların külleme hastalığının oluşumuna etkisi
Uygulamaların hastalık Ģiddeti üzerine etkisi Çizelge 6‟de verilmiĢtir. Sonuçlar her
sırada önce ayrı ayrı verilmiĢ ve daha sonra üç sıranın ortalaması alınmıĢtır.
21
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
Şekil 1. Bakteri formülasyonlarındaki aylık toplam bakteri sayıları (10 7 kob/ml)
Figure 1. Monthly total bacteria counts in the bacterial formulations (107 cfu/ml)
Çizelge 6. Bakteri ve kontrol uygulamalarının bağda külleme hastalık Ģiddeti üzerine (1-5
skalasına göre) etkisi ve uygulamaların etkinlikleri (%)
Table 6. Effect of the bacterial and control applications, and effectivenes of applications
(%) on disease severity of powdery mildew
Uygulamalar
Formülasyon A
Formülasyon B
Formülasyon C
Formülasyon D
Formülasyon E
Formülasyon F
Kontrol 1 (ilaç)
Kontrol 2 (sıvı taĢıyıcı)
Hastalık şiddeti (1-5 skalası)*
Uygulamaların etkinliği (%)
1,59±0,44 c
1,25±0,23 b
1,67±0,26 c
1,52±0,25 c
1,14±0,07 b
1,22±0,21 b
0,09±0,05 a
3,84±0,32 d
58,59
67,44
58,33
60,41
70,31
68,22
97,65
00,00
Gruplar ortalaması
1,54±1,02
F değeri
246,385
Formülasyon A (RK-342+ TV-6F+ RK-6); Formülasyon B (RK-342+ TV-17C+ TV-85F);
Formülasyon C (RK-342+ TV-20E+ RK-304); Formülasyon D (RK-342+ TV-67C+ RK-43);
Formülasyon E (RK-342+ RK-255+ TV-72F) ve Formülasyon F (RK-342+ RK-79+ RK-341)
*Aynı sütundaki aynı harfle gösterilen uygulamalar arasında istatistiki olarak farklılık
bulunmamaktadır (p=0.05).
Bu sonuçlara göre; her üç sırada da en düĢük hastalık Ģiddeti ilaç uygulamasından
elde edilmiĢ olup; bu farklılık istatistikî olarak da tüm uygulamalarla
karĢılaĢtırıldığında önemli bulunmuĢtur. En yüksek hastalık Ģiddeti ise sadece sıvı
22
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
taĢıyıcının uygulandığı kontrol 2 uygulamasından elde edilmiĢtir. Bakteri
uygulamalarının tamamı sadece sıvı taĢıyıcının uygulandığı kontrol 2
uygulamasına göre hastalık Ģiddetinde önemli düĢüĢlere sebep olmuĢtur. Her üç
sıranın ortalamasına göre; en düĢük hastalık Ģiddeti kontrol 1 (ilaç uygulaması)
uygulamasından (0,09) elde edilmiĢ olup; bunu sırası ile formülasyon F (1,22) ve
formülasyon B (1.25) uygulamaları takip etmiĢtir. ġekil 2‟de formülasyon E
uygulamasının yaprak ve meyvede oluĢan külleme simptomunu belirgin bir Ģekilde
ne kadar önlendiği görülmektedir.
Şekil 2. a: Kontrol 2 uygulaması (sıvı taĢıyıcı), b: Kontrol 1 (fungisit) uygulaması, c:
Formülasyon E uygulamasında meyve ve yaprakdan bir görünüm
Figure 2. a:A general view from fruits and leaves treated with Control 2 application (liquid
carrier), b: Control 1 application (fungucide) c: Formulation E application
Bağcılıkta gerek abiyotik faktörlerden gerek hastalık ve zararlı etmenlerden
kaynaklanan verim kayıpları büyük boyutlara ulaĢabilmektetir. Bu kayıpların
azaltılması için pestisit ve kimyasal gübre uygulamaları yoğun bir Ģekilde
yapılmaktadır. Bu da insan ve çevre sağlığına verdiği zararların yanısıra üzüm
tarımının sürdürülebilirliği açısından ciddi riskler oluĢturmaktadır. Bu yüzden
pestisit ve kimyasal gübre uygulamalarına alternatif teĢkil edecek yöntemlerin
geliĢtirilmesi bakımından mutlak surette uygulanabilir çalıĢmalara gerek
duyulmaktadır. Üzümdeki bakteriyel faunanın belirlenmesine yönelik yapılan bir
çalıĢmada; Enterococcus, Bacillus s, Burkholderia, Serratia ve Staphylococcus
cinslerine ait türlerin yoğun bir Ģekilde bulunabildiği belirtilmiĢtir (Barata et al.,
2012). Wilson (1997); son yıllarda toprak üstü hastalıklarının biyolojik
mücadelesinde bakteriyel biyoajanların kullanımına yönelik çalıĢmaların sayısının
hızla artmakta olduğunu belirtmiĢtir. P. fluorescens A506 izolatından geliĢtirilen
BlightBan A506™ ticari ürünü ateĢ yanıklığına karĢı baĢarılı bir Ģekilde
kullanılabilmiĢtir. Fungisitlerden kaynaklanan sorunlar büyüyünce fungal
23
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
hastalıkların da biyolojik kontrolüne yönelik çalıĢmalar yapılmıĢ ve baĢarılı
sonuçlar da alınmıĢtır. Üzümde fungal patojenlere karĢı uygulanan fungisit
uygulamalarının epifitik organizma populasyonlarında da çok ciddi azalmalara
sebep olduğu belinmektedir. Yapılan bir çalıĢmada fungisit uygulaması yapılmayan
üzümlerdeki mikrobiyal faunanın %76‟sının bakteri, %14‟ünün maya ve %9‟unun
ise fungal organizmalardan ibaret olduğu belirtilmektedir (Sholberg et al., 2006).
Bu bakterilerin pek çoğunun da potansiyel biyoajan olarak üzüm yaprak ve
meyvesindeki fungal patojenler ile bir mücadeleye girdikleri ve yapılacak kimyasal
ilaçlamalar ile bu faydalı mikrobiyal populasyonlarının da yok edilmesi ile
mikrobiyal ekolojinin sürekli patojenler lehine bozulduğu düĢünülmektedir.
Potansiyel biyoajanların geniĢ patojen grubuna karĢı etkili olmaları biyolojik
mücadelede önemli bir avantajdır. Bu çalıĢmada etkili bazı biyoajan bakteri
izolatlarının, bakteriyel ya da fungal farklı patojen gruplarına karĢı etkili oldukları
daha önce yapılan çalıĢmalarda rapor edilmiĢtir (Kotan et al., 2000; Kotan, 2002;
Kotan & ġahin, 2006; Kotan et al., 2009). B. brevis biyoajan bakterisinin Botrytis
cinerea, Sphaerotheca fuliginea ve Pythium ultimum‟u da içine alan geniĢ bir bitki
patojeni fungus türüne karĢı etkili olduğu; biyoajanın etki mekanizmasının ise
gramicidin S isimli bir antifungal metabolit üretmesi ve bitkide yüzey ıslaklık
süresini azaltan biosürfaktan üretmesi olduğu belirtilmektedir (Seddon et al., 2000).
Yapılan
bu
çalıĢmada;
biyoformülasyonlar
oluĢturulurken
bütün
biyoformülasyonlarda bu tür kullanılmıĢtır. Biyoajan içeren formulasyon
uygulamalarının etkinliklerinin birbirine çok yakın çıkmasının sebebinin de bütün
formulasyonlarda bu bakterinin kullanılmıĢ olmasından kaynaklandığı
sanılmaktadır. Diğer bir çalıĢmada ise; Pseudomonas ve Enterobacter cinslerine
dahil bazı potansiyel biyoajan bakteri izolatlarından elde edilen kültür filtratları ile
T. harzianum P1 izolatından elde edilen iki kitinolitik enzimlerinden oluĢan farklı
kombinasyonların B. cinerea, F. solani ve U. necator'a karĢı antifungal aktiviteleri
için test edilmiĢ ve bakterilerin patojen hücre duvarlarına ortamda kitin varlığında
çok kolayca bağlayabildiği dolayısı ile kitinolitik enzim üretimden sorumlu
genlerin bakterilere aktarılması ile çok daha baĢarılı sonuçların alınabileceği
belirtilmektedir (Lorito et al., 1993). Bu çalıĢmada etkili bulunan formülasyonları
oluĢturan bakteri izolatlarının mekanizmalarının tam olarak aydınlatılmasından
sonra bazı biyoteknolojik yöntemler ile etkinliklerinin artırılabileceği de
düĢünülebilir.
Yapılan bu çalıĢma daha önce çok farklı türdeki fungal patojenlere karĢı yürütülen
in vitro çalıĢmalarında petride antifungal aktivitelerinin olduğu belirtilen izolatlar
arasından seçilen bakteriler ile direkt arazi çalıĢması olarak patojene karĢı
etkinlikleri test edilmiĢtir. Fakat U. necator obligat bir patojen olduğu için
laboratuar koĢullarında suni besi ortamlarında geliĢtirilemez. Bu nedenle
çalıĢmamızı direkt olarak in vivo ortamda gerçekleĢtirilmiĢtir. Monteiro et al.,
(2005) yaptıkları bir çalıĢmada bu patojen ile enfekteli üzüm yapraklarında fenolik
bileĢiklerin oranında bir azalma olduğu ve özellikle tanin bileĢiklerinin suni besi
24
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
ortam içeriklerine ilavesi ile bu patojenin kültüre alınabilmesine imkan
sağlayacağını vurgulamıĢtır. Ancak U. necator ile enfekteli yapraklardaki fenolik
bileĢiklerden tanin oranının azalmıĢ olması aynı zamanda patojen yoğunluğunun ve
dolayısı ile hastalık Ģiddetinin de dolaylı bir göstergesi olabileceği
düĢünülmektedir. Bu çalıĢmada hastalık Ģiddeti değerlendirmesi yapılmıĢ fakat
yapraklardaki fenolik bileĢiklerin oranına bakılmamıĢtır. Ancak ileride yapılacak
daha kapsamlı çalıĢmalarda hastalık Ģiddeti değerlendirmesine ek olarak üzüm
yapraklarındaki fenolik bileĢiklerin oranına da bakılması biyoajanların
mekanizması hakkında da önemli ip uçları vereceği düĢünülmektedir.
Ülkemizde de biyolojik mücadele çalıĢmaları uzun yıllardır yapılmaktadır. Ancak
bazı çalıĢmalarda biyoformülasyonlar geliĢtirilmiĢ ancak ticari olarak kullanımları
henüz gerçekleĢtirilememiĢtir (Bora ve ark., 2004; Kınay ve Yıldız, 2008). Yapılan
çalıĢmalarda kullanılan biyoajanlar laboratuar koĢullarında üretilerek denemelere
alınmıĢtır. Mikrobiyal biyopestisitlerin ticari kullanıma sunulabilmesinde yapılan
en önemli çalıĢmalardan birisi de etkili biyoajan için uygun bir taĢıyıcının
geliĢtirilmesidir. Prof. Dr. Recep Kotan danıĢmanlığında yürütülen çalıĢmalarda
Biomarket Tarımsal Bioteknolojik Ürünler Pazarlama Sanayi ve Ticaret Limitet
ġirketi tarafından Gıda Tarım ve Hayvanclık Bakanlığı‟dan BM-MegaFlu, BMCotonPlus ve BM-RootPan isimli üç karıĢım mikrobiyal gübre tescili almıĢtır. Bu
ürünler için sıvı taĢıyıcı oluĢturulurken uzun süre yürütülen laboratuar çalıĢmaları
sonucunda bazı organik maddeler, su ve koruyucu maddeler kullanılmıĢtır. Yapılan
bu çalıĢmada da taĢıyıcı olarak yukarıda bahsedilen ürünler için geliĢtirilen sıvı
taĢıyıcı kullanılmıĢtır. Direk uygulamaya akatarılabilir bir çalıĢma olması açısından
bu çalıĢma önem arz etmektedir. Ġleride yapılacak toksisite çalıĢmaları ve farklı
lokasyon ve doz uygulamaları ile ticarileĢtirilebilecek bir ürün geliĢtirilmiĢ olması
açısından da oldukça önemli olduğu düĢünülmektedir.
Son yıllarda bitki hastalıklarının kontrolünde kullanılan biyolojik preparatlardan
birisi de bitkisel ekstre ve uçucu yağlardan oluĢan biyopestisitlerdir. Yapıla bir
çalıĢmada; Reynoutria sachalinensis ekstresinden geliĢtirilen Milsana ® VP ve
Pseudozyma flocculosa bitkisi ekstresinden geliĢtirilen Sporodex ®
formülasyonları kullanılarak bağ küllemesinin kontrolünde potansiyel biyopestisit
olabildikleri belirtilmiĢtir. Hatta bu biyopestisitlerin kükürt bileĢikleri ile
dönüĢümlü kullanımının etkinliği daha da artırdığı belirtilmiĢtir (KonstantinidouDoltsinis et al., 2007). Ġleride yapılacak çalıĢmalarda sıvı taĢıyıcı içerisine
eklenecek bazı bitkisel ekstraktları ile bu çalıĢmada etkili bulunan
formülasyonların etkinliklerinin daha da artırılabileceği düĢünülmektedir.
Külleme hastalığının kontrolünde organik madde bakımından zengin olan bazı
uygulamaların yapraktaki faydalı bakteriyel faunanın populasyonunu olumlu yönde
etkileyerek patojen populasyonunu baskı altına alarak hastalık geliĢiminde çok
ciddi düĢüĢlerin olduğu bilinmektedir. Yapılan bir çalıĢmada; olgunlaĢtırılmıĢ çay
kompostunun üzümde yaprak ve meyve uygulamalarının B. cinerea ve U.
25
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
necator‟un kontrolünde baĢarılı olduğu belirtilmiĢtir (Evans et al., 2013). Bu
çalıĢmada da bakteri uygulamalarında kullanılan sıvı taĢıyıcı içerisindeki
besinlerden dolayı bitki yüzeyindeki epifitik mikroorganizma popülasyonunda
baĢlangıçtaki popülasyona göre önemli artıĢların olduğu ve bu
mikroorganizmaların fungusların kontrolünde rol oynadıkları düĢünülmektedir.
Benzer bir Ģekilde süt uygulamasının da bitkilerdeki patojenik olmayan
mikroorganizma
çeĢitliliğini
artırarak
mildiyö
hastalık
etmenlerinin
kolonizasyonlarında belirgin bir azalmanın olduğu ve bundan dolayı hastalığın
belli ölçüde kontrol altına alınabildiği belirtilmiĢtir (Medeiros et al., 2012). Her iki
çalıĢmada bitki fungal hastalıklarının kontrolünde epifitik patojen olmayan
organizma popülasyonun ne kadar önemli olduğunu göstermektedir. Bu çalıĢmada
kullanılan sıvı taĢıyıcı içerisindeki peynir altı suyunda bakterilerin etkinliğini
tetiklemiĢ olabileceği sanılmaktadır. Biyolojik değeri oldukça fazla olan peynir altı
suyu proteinlerinin insanlarda doğal ve modifiye edilmiĢ olarak antiviral etkilerinin
olduğu birçok çalıĢma ile ortaya konulmuĢ olmakla beraber (Pan et al. 2006),
külleme hastalıklarının ve bitki viruslarının kontrolünde de süte dayalı ürünlerin
etkili olduğu da tespit edilmiĢtir. Crips et al., (2006) bağlarda önemli zarara yol
açan bağ küllemesi hastalığına karĢı peyniraltı suyu kullanıldığını ve hastalığın
kontrolünde antimikrobiyal karakterli laktoferrin protein‟in etkili olduğunu
bulmuĢlardır. U. necator‟un üzümün dormant haldeki tomurcuk pullarında misel
olarak kıĢı geçirebildiği belirtilmektedir (Khiavi et al.2012). U. necator
fungusunun çimlenmesi 12 ile 30°C arasında 30 sa‟de tamamlanmaktadır (Delp,
1954). Çimlenme sürecini çok hızlı bir Ģekilde tamamlayan patojenin uygun çevre
koĢullarında epidemik boyutta hastalığa sebep olması da kaçınılmazdır. Bu yüzden,
patojenin çimlenerek bitki dokusu içine girmeden uygulanacak biyoajanların bitki
dokusuna kolonize olarak populasyonunu artırması ile biyoajanların patojene karĢı
sürekli bir koruyucu bariyer görevi üstleneceği düĢünülmektedir. Ayrıca bakteriyel
biyopretların sonbahar uygulaması ile kıĢlayan misel popülasyonunda da önemli
düĢüĢlere sebep olarak hastalığı kontrol altına alabileceği ve ilkbahardaki primer
inokulum kaynaklarında önemli azalmalara sebep olacağı düĢünülmektedir.
B. brevis, P. fuorescens ve P. agglomerans bakteri izolatlarının havadaki serbest
azotu fikse ederek bitki geliĢimine de önemli katkılar sağladığı belirtilmektedir
(Potrikus & Breznak 1977; Bashan, 1998; Mirabal et al., 2000). Yapılan in-vitro
çalıĢmalarında biyopestisit formulasyonlarında kullanılan bakterilerin azot
fiksasyonu yapabildikleri veya fosfatı çözebildikleri belirlenmiĢtir. Bu çalıĢma
sonucunda; külleme hastalığına karĢı etkili olduğu belirtilen formulasyonların
tamamının içeriğinde B. brevis, P. fuorescens ya da P. agglomerans bakteri
izolatlarının bulunması önemli bir avantaj oluĢturmaktadır. Çünkü, bağ küllemesi
için geliĢtirilecek biyopestisitin aynı zamanda bitki geliĢimine de önemli katkılar
sağlayacağı düĢünülmektedir. Yapılan bir diğer çalıĢmada; P. putida, P.
fluorescens ve P. agglomerans izolatlarının antifiriz proteini üretmelerinden dolayı
26
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
hücre süspansiyonlarının suyun donma derecesini düĢürdükleri belirlenmiĢtir (Lee
et al., 1995).
Sonuç olarak yapılan bu çalıĢmada, bakteri içeren sıvı formülasyonlardan özellikle
formülasyon B (Brevibacillus brevis RK-342 + Bacillus subtilis TV-17C + Bacillus
sphaericus TV-85F), formülasyon E (Brevibacillus brevis RK-342 + Pseudomonas
fluorescens RK-255 + Bacillus thuringiensis TV-72F) ve formülasyon F
(Brevibacillus brevis RK-342 + Pantoea agglomerans RK-79 + Bacillus subtilis
RK-341) uygulamalarının külleme hastalığının geliĢimini önemli ölçüde önlediği
ve bu biyoformülasyonların bağ küllemesi hastalığının kontrolünde biyopestisit
olarak kullanılabileceği görülmüĢtür. Farklı doz, farklı uygulama zamanı ve farklı
uygulama sayısının belirlenmesine yönelik ileride yapılacak daha detay
çalıĢmalardan sonra, biolojik ürünlerin tescillendirilmesi ile ilgili yönetmelikte
istenilen toksisite testlerin de tamamlanması ile geliĢtirilecek biyopestisitin
bağlarda külleme hastalığının kontrolünde baĢarılı bir Ģekilde kullanılabileceği
düĢünülmektedir.
Kaynaklar
Albayrak S., S. Turak, A. Y. Gökçe & Ö. Bozbek 2002. Erzincan ili bağlarında fungal
hastalık etmenlerinin belirlenmesi üzerinde ön çalıĢmalar. Bitki Koruma Bülteni, 42 (14): 81-90.
Anonim 2014. Zirai Mücadele Standart Ġlaç Deneme Metodları. Cilt 2, Ankara, 224-226.
Arı M., A. Kapkın & S. Öz 1995. Ege bölgesi bağ fidanlıklarında görülen fungal hastalıklar
üzerinde araĢtırmalar. Bitki Koruma Bülteni, 35: 3-4.
Barata A., M. Malfeito-Ferreira & V. Loureiro 2012. The microbial ecology of wine grape
berries. Internatıonal journal of food microbiology., 153: 243-259.
Bashan Y. 1998. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture.
Biotechnology Advances, 16 (4): 729-770.
Bora, T., H. Özaktan, E. Göre & E. Aslan 2004. Biological control of Fusarium oxysporum
f. sp. melonis by wettable powder formulations of the two strains of Pseudomonas
putida. Journal of Phytopathology, 152: 471-475.
Bull C. T. & S. T. Koike 2005. Evaluating the efficiacy of commercial products for
management of bacterial leaf spot lettuce on lettuce. Plant Health Progress, November,
1-7.
Crips P., T. J. Wicks, G. Troup & E. S. Scott 2006. Mode of action of milk and whey in the
control of grapevine powdery mildew. Australasia Plant Pathology, 35(5): 487-493.
Delen, N., 2015. Fungisitler. Nobel Yayın Dağıtım. S. 552.
Delp C. J. 1954. Effect of temperature and humidity on the grape powdery mildew fungus.
Phytopathology, 44: 615-626.
Erman M., R. Kotan, R. Çakmakçı, F. Çığ, K. Karagöz & M. Sezen 2010. Van Gölü
Havzası‟ndan izole edilen azot fikseri ve fosfat çözücü bakterilerin buğday ve Ģeker
pancarında büyüme ve verim özellikleri üzerine etkileri. Türkiye IV. Organik Tarım
Sempozyumu, 28 Haziran-1 Temmuz 2010, Erzurum. 325-329.
27
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
Evans K. J., A. K. Palmer & D. A. Metcalf 2013. Effect of aerated compost tea on
grapevine powdery mildew, botrytis bunch rot and microbial abundance on leaves.
European Journal of Plant Pathology, 135: 661-673.
Gökçe A. Y. 2013. Buğday kök çürüklüğüne neden olan Bipolaris sorokiniana (Sacc.)
fungusunun PGPR ve antogonist bakteriler kullanılarak kontrollü koĢullarda biyolojik
mücadele imkânlarının araĢtırılması. Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü,
Yüksek Lisans Tezi, sayfa 67.
Gökçe A.Y & R. Kotan 2014. Buğday kök çürüklüğüne neden olan Bipolaris sorokiniana
(Sacc.) fungusunun PGPR ve antogonist bakteriler kullanılarak kontrollü koĢullarda
biyolojik mücadele imkânlarının araĢtırılması. Türkiye V. Bitki Koruma Kongresi, 3-5
ġubat 2014, Antalya, Türkiye, sayfa 358.
Halleen F & G. Holz 2001. An overview of the biology, epidemiology and control of
Uncinula necator (Powdery Mildew) on grapevine, with reference to South Africa.
South African Journal of Enology and Viticulture, 22: 2.
Karman, M., 1971. Bitki Koruma AraĢtırmalarında Genel Bilgiler Denemelerin KuruluĢu
ve Değerlendirme Esasları. 279s., Bornova-Ġzmir.
Kınay, P. & M. Yıldız 2008. The Shelflife and effectiveness of granular formulations of
Metschnikowia pulcherrima and Pichia guilliermondii yeast isolates that control
postharvest decay of citrus fruit. Biological Control, 45 (3): 433–440.
Khiavi H. K., H. Shikhlinskiy, A. B. Ahari & M. Akrami 2012. Study on the biology and
epidemiology of Unicinula necator the causal agent of grape powdery mildew disease.
Life Science Journal-Acta Zhengzhou University Overseas Edition, 9: 1787-1792.
Klement Z., K. Rudolph & D. C. Sands 1990. Methods in Phytobacteriology. Akademiai
Kiado, Budapest, p547.
Konstantinidou-Doltsinis S., E. Markellou, A. M. Kasselaki, E. Siranidou, A. Kalamarakis,
K. Tzembelikou, A. Schmitt, C. Koumakis & N. Malathrakis 2007. Control of powdery
mildew of grape in Greece using Sporodex® L and Milsana®. Journal of Plant
Diseases and Protection, 114: 256-262.
Kotan, R. & A. Kasapoğlu 2014. Bakteri içerikli mikrobiyal gübre ve biyopestisitler.
Harman Time, 12: 66-72.
Kotan R & F. Sahin 2006. Biological control of Pseudomonas syringae pv. syringae and
nutritional similarity in carbon source utilization of pathogen and its potential biocontrol
agents. Journal of Turkish Phytopathology, 35 (1-3): 1-13.
Kotan R. 2002. Doğu Anadolu Bölgesi‟nde yetiĢtirilen yumuĢak çekirdekli meyve
ağaçlarından izole edilen patojen ve saprofitik bakteriyel organizmaların klasik ve
moleküler metotlar ile tanısı ve biyolojik mücadele imkânlarının araĢtırılması. Atatürk
Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı. Doktora Tezi,
Erzurum, 217.
Kotan R. & Sahin F. 2006. Biological control of Pseudomonas syringae pv. syringae and
nutritional similarity in carbon source utilization of pathogen and its potential biocontrol
agents. Journal of Turkish Phytopathology, 35 (1-3): 1-13.
Kotan R. & ġahin F. 2002. Bitki hastalıkları ile biyolojik mücadelede bakteriyel
organizmaların kullanılması. Atatürk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 33(1): 111119.
Kotan R. 1997. Biber ve domatesteki bakteriyel leke hastalığı (Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria (Doidge) Dye.)‟nın biyolojik ve kimyasal kontrolü. Atatürk Atatürk
28
Türkiye Biyolojik Mücadele Dergisi
Turkish Jounal of Biological Control
Demir &Kotan 2016, 7 (1): 13-30
Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı,Yüksek Lisans Tezi,
sayfa 49.
Kotan R. 2002. Doğu Anadolu Bölgesi‟nde yetiĢtirilen yumuĢak çekirdekli meyve
ağaçlarından izole edilen patojen ve saprofitik bakteriyel organizmaların klasik ve
moleküler metotlar ile tanısı ve biyolojik mücadele imkânlarının araĢtırılması. Atatürk
Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bitki Koruma Anabilim Dalı. Doktora Tezi, sayfa
217.
Kotan R., F. Sahin, E. Demirci, A. Ozbek, C. Eken & S. A. Miller 2000. Evaluation of
antagonistic bacteria for control of Fusarium dry rot of potato. Phytopathology, 89: 41.
Kotan R., F. Sahin, F. & A. Ala 2004. Nutritional similarity in carbon source utilization of
Erwinia amylovora and its potential biocontrol agents. Journal of Turkish
Phytopathology, 33 (1-3): 25-38.
Kotan R., N. DikbaĢ & H. Bostan 2009. Biological control of post harvest disease caused
by Aspergillus flavus on stored lemon fruits. African Journal of Biotechnology, 8 (2):
209-214.
Lee M. R., R. E. Jr. Lee, J. M. Strong-Gunderson, S. R. & Mings S. R 1995. Isolation of
ice-nucleating active bacteria from the freeze-tolerant frog, Rana sylvatica.
Cryobiology, 358-365.
Lorito M., A. Dipietro, C. K. Hayes, S. L. Woo & G. E. Harman 1993. Antifungal,
synergistic interaction between chitinolytic enzymes from Trichoderma harzianum and
Enterobacter cloacae. Phytopathology, 83: 721-728.
Medeiros F. H. V., W. Bettiol, R. M. Souza, E. Alves, Z. V. Pinto & R. Iost 2012.
Microorganisms, application timing and fractions as players of the milk-mediated
powdery mildew management. Crop Protectıon, 40: 8-15.
Mirabal L., A. de Los, E. Ortega, R. Rodés, L. Fernández & E. Pérez 2000. Another
nitrogen-fixing microorganism in sugarcane stalks: Bacillus brevis? Cultivos
Tropicales, 21 (4): 9-12.
Mirik M., Y. Aysan & Ö. Çınar 2008. Biological control of bacterial spot disease of pepper
with Bacillus Strains. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 32: 369-379.
Monteiro S., R. Freitas, A. Teixeira & R. Ferreira 2005. A new approach to extend the life
span of Uncinula necator growing in vitro. Acta Horticulturae, 689: 133-136.
Oldaç S., G. Ülke &M. Mirik 2002. Domates bakteriyel leke hastalığına (Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria). Türkiye 5. Biyolojik Mücadele Kongresi, Erzurum.
Potrikus C. J & J. A. Breznak 1977. Nitrogen-fixing Enterobacter agglomerans isolated
from guts of wood-eating termites. Applied Environmental Microbiology, 33(2): 392399.
Seddon B., R. C. McHugh & A. Schmitt 2000. Brevibacillus brevis - a novel candidate
biocontrol agent with broad-spectrum antifungal activity. Pests and Diseases, 2: 563570.
Sholberg P., C. Harlton, J. Boule & P. Haag 2006. Fungicide and clay treatments for
control of powdery mildew influence wine grape microflora. Hortscıence, 41: 176-182.
Stromberg K. D., L. L. Kinkel & K. J. Leonard 2004. Quantifiying the effect of bacterial
antagonists on the relationship between phyllosphere population sizes of Xanthomonas
translucens pv. translucens and subsequent bacterial leaf streak severity on wheat
seedlings. Biological Control, 29: 58-65.
29
Bağ küllemesinin biyolojik kontrolü
ġahin F. 1999. Mikroorganizmaların yağ asitleri profillerine göre tanısı (Microbial
Identification System). Uygulamalı Moleküler Biyoloji Teknikleri Kursu. Atatürk
Üniversitesi Biyoteknoloji Uygulama ve AraĢtırma Merkezi, Erzurum-Türkiye 66.
Turan M., M. Ekinci, E. Yildirim, A. GüneĢ, K. Karagöz, R. Kotan & A. Dursun
2014. Plant growth-promoting rhizobacteria improved growth, nutrient, and hormone
content of cabbage (Brassica oleracea) seedlings. Türkish Journal of Agriculture and
Forestry, 38: 327-333.
Wilcox W. F. 2003. Grapevine powdery mildew Uncinula necator (Schw.) Burr. Cornell
Cooperative Extension., Disease Identification Sheet No.102GFSG-D2.
Wilson M 1997. Biocontrol of aerial plant diseases in agriculture and horticulture: current
approaches and future prospects. Journal Of Industrıal Mıcrobıology & Bıotechnology,
19: 188-191.
30