biyokimya uygulama el kitabı - Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi

Transkript

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ YAYINLARI
BİYOKİMYA
UYGULAMA EL KİTABI
Ç U K U R O V A
Ü N İ V E R S İ T E S İ
T I P
F A K Ü L T E S İ
Y A Y I N L A R I
Biyokimya Uygulama El Kitabı
Prof. Dr. Abdullah TULİ
Prof. Dr. Kıymet AKSOY
Prof. Dr. Levent KAYRIN
Prof. Dr. Nurten DİKMEN
Prof. Dr. Mehmet Akif ÇÜRÜK
Doç. Dr. Tamer C. İNAL
Doç. Dr.Özlem Görüroğlu Öztürk
Öğr. Gör. Dr. Ebru Dündar Yenilmez
Biyokimya Anabilim Dalı
2015 Adana
İÇİNDEKİLER
Genel Laboratuvar Bilgileri ..................................................................................................... 1
Spektrofotometre ...................................................................................................................... 7
Asit-Baz, pH ve Titrasyon ....................................................................................................... 12
Karbohidratlar ........................................................................................................................... 29
Lipitler-Yağlar ............................................................................................................................ 39
Proteinler .................................................................................................................................... 48
Kağıt Kromatografisi ................................................................................................................ 58
Enzim.......................................................................................................................................... 64
Açlık Kan Şekeri Tayini............................................................................................................ 72
PCR Uygulamaları ..................................................................................................................... 78
Elektroforez ............................................................................................................................... 86
Rutin İdrar Analizi .................................................................................................................... 95
Oral Glukoz Tolerans Testi ..................................................................................................... 112
Üre Analizi ................................................................................................................................. 117
Ürik Asit Tayini ......................................................................................................................... 122
EKLER....................................................................................................................................... 124
i
ÖNSÖZ
Birçok bilim dalının eğitiminde temel taşlardan birini oluşturan Biyokimya her gün ilerleyen ve
gelişmelere kapısını açık tutan uygulamalı bilim dalıdır. Biyokimya eğitimi ancak uygulama ile koşut
yürütüldüğünde bir anlam kazanmakta, kuramsal bilgilerin pekiştirilmesinde önemli bir zemin
oluşturmaktadır. Bu kitabı yazmaktaki amacımız, Tıp Fakültesi öğrencileri için bu koşutluğu biraz olsun
sağlamak, ayrıca daha sonraki baskılarda olası gelişmeler ışığında düzenlemeler yaparak bir kaynak
oluşturmanın yanında, bir açıdan da biyokimyasal yöntemlerin gelişim sürecine sinema şeridi akışıyla bir bakış
yaratmaktır.
Kitabın hazırlanışında emeği geçen öğretim üyelerine (Prof. Dr. Abdullah TULİ, Prof. Dr.
Sakine Kıymet AKSOY, Prof. Dr. Levent KAYRIN, Prof. Dr. Nurten DİKMEN, Prof. Dr.
Mehmet Akif ÇÜRÜK, Doç. Dr. Tamer Cevat İNAL, Doç. Dr. Özlem Görüroğlu ÖZTÜRK,
Öğr. Gör. Dr. Ebru Dündar YENİLMEZ) ve Araştırma Görevlilerine (Arş. Gör. Duygu
Düzgünce BOĞA, Bio. Ümit YAŞAR, Bio. Gülüzar ÖZBOLAT, Arş. Gör. Umut KÖKBAŞ,
Arş. Gör. Mustafa Muhlis ALPARSLAN, Arş. Gör. Başak SANNA, Arş. Gör. Dr. Nevin
YILMAZ, Mol. Bio. Kezban KARTLAŞMIŞ, Kim. Mehmet BULUT) teşekkür ederiz.
Ç.Ü. Tıp Fakültesi
Biyokimya Anabilim Dalı
ii
GE N EL L A BO R AT U VA R B İ LGİ LE Rİ
1
Genel Laboratuvar Bilgileri
LABORATUVAR ÇALIŞMALARININ KAPSAMI VE AMACI
Bilim; evreni ve doğayı anlama yolunda, deneysel yöntemlerle ve gözlemlerle elde ettiği bilgi
birikimlerine dayanarak yasalar çıkarmaya çalışan disiplinlerin tümü olarak tanımlanabilir. Bu
disiplinlerden biri olan Biyokimya yaşamı kimyasal temellerde tanımlamayı ve anlamayı kendisine
amaç edinmiştir. Günümüzde Biyokimya; Ekoloji, Klinik Biyoloji, Tıp, Farmakoloji ve Ziraat gibi
bir çok disiplinin temelini oluşturmaktadır.
Bilim ve teknolojideki hızlı ilerlemeler her şeyden önce kontrollü deneylere ve bu
deneylerden ortaya çıkan sonuçlara dayanmaktadır. Pozitif bilimleri temel alan disiplinlerde
öğrenim gören öğrenciler bilimsel gözlem yapmayı ve bilimsel düşünmeyi öğrenmelidirler.
Gözlemin nasıl yapılması gerektiği en iyi laboratuvarlarda öğrenilmektedir. Yapılan gözlemlerin ve
alınan verilerin doğruluğu, değerlendirilmesi ve yorumlanması da en az deneyin hassas bir şekilde
yapılması kadar önemlidir.
Klinik Biyokimya biyolojik sıvı ve dokuların analizi ile hastalıkların tanısında, tedavisinde ve
tedavinin takibinde önemli bilgiler sunan bir bilim dalıdır. Günümüzde, vücut sıvıları kullanılarak
yüze yakın parametre bu amaç için Klinik Biyokimya laboratuvarlarında analiz edilmektedir.
Bu uygulama el kitabında tıp fakültesi öğrencilerine klinik biyokimyanın analiz
yöntemlerinin prensiplerini aktarabilmek amacıyla temel deneyler seçilmiştir. Deneylerde materyal
olarak vücut sıvıları kullanılacak ve bu sıvılarda kimyasal ve enzimatik analizler; kolorimetrik,
elektroforetik ve kromatografik yöntemlerle analiz edilecektir. Bu teknikler klinik biyokimyada
halen geniş uygulama alanları bulmakta ve çoğu analizin prensibini içermektedir.
CAM MALZEMELER
Laboratuvarlarda kullanılan malzemeler genelde camdan yapılmaktadır. Cam malzemelere
ek olarak; plastik, metal, ahşap ve porselen malzemeler de laboratuvarlarda sıkça kullanım alanı
bulurlar (Şekil 5). Cam malzemelerin bir bölümü çözeltilerin ölçümü amacıyla kullanılırken diğer
bölümü çözeltilerin aktarılması, taşınması ve saklanması amacıyla kullanılır. Bu nedenle cam
malzemeleri derecelendirilmiş (Şekil 3) ve derecelendirilmemiş (Şekil 4) olarak iki ana gruba
ayırabiliriz.
Derecelendirilmiş Cam Malzemeler
Sıkça kullanılan dereceli cam malzemeler; mezür, büret, pipet ve balon joje olarak
sıralanabilir. Dereceli cam malzemeler genellikle sıvıların hacimlerinin ölçülmesinde kullanılır.
Ölçüm yapılırken işaretin göz hizasında tutulması gereklidir. Sıvıların hassas ölçümlerinde,
sıvıların yüzey gerilimi ile dar cam borularda oluşan menüsküsün doğru okunması önemlidir.
Sıvıların büyük bir çoğunluğu dar cam borularda iç bükey menüsküs oluşturur. Cıva gibi
moleküller arası birleşme kuvveti büyük olan sıvılarda ise dış bükey menüsküs oluşur. İç bükey bir
menüsküs durumunda hacim, menüsküs işaret çizgisine teğet geçecek şekilde, en düşük
noktasında okunur (Şekil 1).
2
Menüsküs
Şekil 1. Menüsküsün okunuşu
Mezür (dereceli silindir): Üzerlerindeki bir seri çizgilerin ölçülebilen hacimleri gösterdiği
mililitre olarak işaretlenmiş, hassasiyet gerektirmeyen sıvı ölçümlerinde kullanılırlar.
Büret: Herhangi bir hacmi maksimum kapasitelerinde boşaltmaya yarayan alt kısmında bir
musluk bulunan ölçüm malzemeleridir. Sıvıların titrasyonunda da kullanılır.
Pipet: Genellikle kaplar arasında belirli sıvı hacimlerinin ölçülerek aktarılmasında kullanılır.
Pipet orta ve başparmak arasında tutulur (Şekil 2). Çözelti istenilen hacim çizgisini biraz geçinceye
kadar hafif bir emme ile çekilir. Üst ucu işaret parmağı ile hemen kapatılır. İşaret parmağını
baskısı çözelti hacim çizgisine gelinceye kadar yavaş yavaş azaltılır. Pipetler boşaltılırken üst
ucundan ve dik konumda tutulur. İşaretleme pipetin ucunda biten pipetlerde son damla üflenerek
boşaltılır. İşaretleme pipetin ucundan yukarıda bitiyor ise işaretin altında kalan miktar boşaltılmaz.
Şekil 2. Pipetin tutuluşu
Balon joje: Tampon ve standart çözeltiler gibi derişimlerinin hassas olarak ayarlanması
gereken çözeltilerin hazırlanmasında kullanılır. Hacimleri 1-4000 mL arasında değişen modelleri
mevcuttur. Hazırlanacak çözelti için gerekli katı veya sıvı madde tartılıp balon jojeye aktarıldıktan
sonra bir miktar çözücüde tamamen çözüldükten sonra son hacme çözücü ile tamamlanır.
3
Derecelendirilmemiş Cam Malzemeler
Beher, erlen, balon, şişe gibi ölçeklendirilmemiş bazı cam malzemeler her ne kadar belirli
hacimleri gösterirlerse de duyarlı hacim ölçümlerinde kullanılmazlar. Bu kaplar ölçmeden çok esas
olarak sıvıyı bulundurmak için kullanılırlar.
Beher: Taban ve ağız kısmı aynı çapta olup genellikle bir sıvının başka bir kaba
aktarılmasında, çözelti hazırlanmasında, karıştırılmasında ve ısıtılmasında kullanılır.
Erlen: Dar bir boyun ve geniş bir tabanı olan konik yapıda cam kaplardır. Özellikle
buharlaşması istenmeyen çözeltilerin hazırlanmasında ısıtılmasında ve titrasyonlarında kullanılır.
Ağızları dar olduğu için çalkalanmaları kolaydır.
Balon: Hacim ölçümü yapılmaz çözeltilerin hazırlanmasında ve ısıtılmasında kullanılırlar.
Ölçeklendirilmemişlerdir.
Cam şişe: Hazırlanan çözeltilerin saklanmasında kullanılır. Çözeltinin güneş ışınlarından
korunması amacıyla çoğunlukla koyu renklidirler. Üzerinde çözelti ile ilgili etiket olmalıdır, etikette
çözeltinin adı, hazırlanış tarihi ve hazırlayanın adı yazılmalıdır.
Bu ölçü malzemelerinin dışında çeşitli amaçlarla kullanılan deney tüpü, cam çubuk (baget),
cam boru, huni, saat camı, havan, petri kutusu, desikatör vb. gibi malzemeler de laboratuvarda
sıkça kullanılmaktadır.
Mezür (dereceli silindir)
Pipet
Dereceli balon (balon joje)
Şekil 3. Derecelendirilmiş cam malzemeler
Folin-Wu tüpü
Büret
4
Balon çeşitleri
Beher çeşitleri
Çeşitli santrifüj tüpleri
Deney tüpü
Saklama şişesi
Şekil 4. Derecelendirilmemiş cam malzemeler
Erlen çeşitleri
5
Temizlik fırçası
Çeşitli huniler
Ayaklı spor
Üç ayak
Kil üçgen
Süzgeçli huni
Porselen kroze
Amyant tel
Bunsen beki
Ayırma hunileri
Büret kıskacı
Şekil 5. Çeşitli laboratuvar malzemeleri
Piset
6
ÇÖZELTİLER VE DERİŞİM KAVRAMLARI
İki veya daha fazla bileşenin homojen karışımlarına çözelti denir. Bu bileşenler, çözücü
içinde iyon ve/veya moleküllerine kadar ayrılırlar.
Bir çözeltiyi oluşturan maddelerden her birine o çözeltinin bileşenleri denir. Bu
bileşenlerden bağıl miktarı fazla olana çözücü, miktarca az olana ise çözünen denir. Örneğin tuzlu
suda, suya çözücü, tuza çözünen denir.
Bileşenleri birbiri içine dağılmış fakat ayrı fazlarda bulunan çözeltilere heterojen çözeltiler
denir. Bir sıvı içinde bir katının dağılmasıyla oluşan heterojen karışımlara süspansiyon (örn.
Penisilin çözeltisi) denir. Sıvı içinde dağılan madde sıvı ise böyle çözeltilere emülsiyon (örn. Su ile
karıştırılmış sıvı yağlar) denir. Bir çözelti içinde dağılan maddenin tanecikleri tek tek atom ya da
moleküllerine dağılmış ise, böyle karışımlara homojen karışım yani çözelti denir. Böyle
çözeltilerin her bir noktası aynıdır. Örneğin glukoz distile su içerisinde tamamen çözündüğünde
şeker molekülleri tek tek sıvı faza geçerler ve homojen bir karışım oluşur.
Bir çözeltideki çözünenlerden birinin madde miktarına, o bileşenin içinde bulunduğu
çözeltideki derişimi (konsantrasyonu) denir. Çözünenin çözelti içindeki miktarı ne kadar çok
ise, derişimi de o kadar büyüktür. Yani daha derişiktir. Derişimi daha küçük ise çözelti daha
seyreltik olur ve az miktarda çözünen içerir.
Bir çözeltinin derişimi; çeşitli derişim birimleri ile tanımlanabilir. Biyokimyasal
hesaplamalarda sıklıkla kullanılan derişim birimleri aşağıda tanımlanmaktadır.
1- Yüzde (%) çözeltiler: Bir çözeltinin derişimi genellikle yüzde olarak tanımlanır.
Yüzdenin anlamı 100 mL veya 100 g çözeltideki çözünmüş olan madde miktarıdır. Yüzde
çözeltilerde birim verilmemiş ise katılar için tartılacak madde gram, sıvılar ise mililitre cinsinden
alınır. Yüzde derişimlerin tanımlanmasında kullanılan üç en temel yöntem aşağıda sıralanmıştır.
Çözünenin ağırlığı
X100
Çözücünün ağırlığı
a)
Yüzde ağırlık(%w/w) =
b)
Yüzde hacim (%v/v)=
Çözünenin hacmi
Çözücünün hacmi
X100
c) Yüzde ağırlık-hacim(%w/v)=
Çözünenin ağırlığı
Çözücünün hacmi
X100
w/v yüzde derişim birimi derişimlerinin çok hassas olarak hazırlanmalarını gerektirmeyen
laboratuvar çözeltilerinin hazırlanmasında sıklıkla kullanılır.
2- Molar çözeltiler: Bir çözeltinin Molaritesi (M), o çözeltinin bir litresinde çözünmüş
maddenin mol miktarı ile tanımlanır. Litresinde mol ile ifade edilen miktarlarda madde
bulunduran çözeltilere de molar çözelti denir. Molar çözeltiler genellikle köşeli parantez ile
gösterilirler, örneğin, H+ iyonunun molaritesi=[H+]. Bir çözeltinin molaritesini hesaplamak için
çözünen maddenin ağırlık cinsinden miktarını ve moleküler ağırlığını bilmemiz gerekir.
3- Molal çözeltiler: Bir çözeltinin molalitesi (m), o çözeltinin çözücüsünün 1000
gramında çözünmüş çözünenin mol cinsinden miktarına karşılık gelir. Özellikle farklı sıcaklıklarda
yapılacak çalışmalar için molalite biriminin kullanımı doğruluğu artırıcı bir etkendir.
4- Normal çözeltiler: Litresinde ekivalan ile ifade edilen miktarlarda madde çözünmüş
bulunan çözeltilere normal çözeltiler denir. Bir çözeltinin bir litresinde çözünen maddenin
ekivalan gram sayısı o çözeltinin normalitesine eşittir. “N” harfi ile gösterilir.
SPEKTROFOTOMETRE
7
Laboratuvar
Spektrofotometre
1
GENEL BİLGİ
Çözelti halindeki bir maddenin ışık yutma kabiliyetinin ölçülmesi biyokimyada oldukça fazla
kullanılan bir yöntemdir. Buna neden olarak da, biyokimyacıların ilgilendiği birçok bileşiğin mor
ötesi, görünür ve yakın kızıl ötesi alanda ışığı yutması gösterilebilir. Bu ölçümü yapan
kolorimetrenin biyokimyada kullanılmasıyla, klinik biyokimyada da büyük ilerlemeler
kaydedilmiştir. Biyolojik materyallerde çok düşük derişimlerde bulunan ve bu sebepten tartım
veya titrasyon ile miktarlarının tayini mümkün olmayan unsurların ölçülmesi kolorimetrik
yöntemlerle mümkün olmuştur. Ayrıca birçok unsurun tayini saatler alırken kolorimetreyle bu
analizlerin süresi kısaltılmıştır.
Bilindiği gibi güneş ışınlarını prizmadan geçirerek bir ekranın üzerine alırsak ışık tayf elde
ederiz. Işık bandı da denilen bu şeridin içinde sırasıyla kırmızı, sarı, yeşil, mavi, lacivert ve mor
renkler dizilmiş olarak bulunur. Bu tayf, ışık bandı 400-700 nm dalga boyu uzunluğundaki ışık
dalgalarından oluşur. 400 nm’den kısa dalga boyu uzunlukları mor ötesi ışınlardır. 700 nm’den
büyük dalga boyu uzunlukları ise enfraruj ışınlardır. 400 nm dalga boyu uzunluğundaki ışık
prizmadan geçerken en çok kırılır ve renkli görülür. En az kırılan ise kırmızı ışıktır ve ışık dalga
boyunun uzunluğu 700 nm’dir.
Prizmadan ayrışan ışık demetinin önüne kırmızı renkte cam koyup geçen ışınları bir ekran
üzerine alırsak ekran üzerindeki ışığın kırmızı renkte olduğunu görürüz. Buna sebep kırmızı
filtrenin (kırmızı cam) kırmızıdan başka bütün renkleri tutup yalnız kırmızıyı geçirmesidir.
Prizmadan ayrışan ışık demetinin önüne yeşil bir filtre koyacak olursak ekrandaki rengin yeşil
olduğunu görürüz. Öyle ise bir cismin renkli görülmesinin sebebi, cisimlerin, içinden geçen
ışınların özellikle bir kısmını yutması, diğerlerini geçirmesidir.
Kolorimetrik yöntemlerde esas bir maddenin veya kimyasal tepkimelerin neticesinde renk
oluşturan bir maddenin ışık yutma kabiliyetine dayanarak derişimin tayin edilmesidir. Daha basit
olarak derişimi bilenen bir madde ile derişimi bilinmeyen aynı maddenin eşit koşullar altında
oluşturdukları renklerin şiddetlerinin kıyaslanmasıdır.
Bir maddenin kolorimetrik yöntemlerle tayin edilebilmesi için:
1) Maddenin renkli olması veya kimyasal tepkimeler sonucunda renk oluşturması,
2) Oluşan rengin yalnız ve yalnız o maddeye ait olması,
3) Rengin sabit kalması,
4) Beer-Lambert Kanununa uyması gerekir.
Beer-Lambert Kanununa göre: renkli bir çözelti içinden geçen belirli dalga boyundaki ışığın
şiddeti, o eriyiğin derişimine ve ışığın çözelti içinde kat ettiği mesafeye bağlı olarak azalmaktadır.
Bu kanunu matematiksel olarak,
I= Ioe-klC (1) formülü ile ifade edebiliriz. Bu formülde;
SPEKTROFOTOMETRE
8
Io= Çözeltiye düşen ışığın şiddetini,
I = Çözeltiden çıkan ışığın şiddetini (IoI),
C= Renkli maddenin derişimini,
l = Işık yolunun uzunluğunu,
є = Çözelti içindeki soğuran materyalin soğurma katsayısı veya molar soğurganlık.
ifade etmektedir. Diğer taraftan herhangi bir eriyiğin ışık geçirme kabiliyetine transmitans (T), ışık
yutma (soğurma) kabiliyetine ise absorbans (A) denir. Buna göre:
T= I/Io (2);
A= -log T (3) dir (şekil 1).
Şekil 1. Beer-Lambert Kanunu
Diğer taraftan (1), (2) ve (3) numaralı formülleri birleştirip doğal logaritmadan 10 tabanlı
logaritmaya geçersek; A=  Cl formülünü elde ederiz.
Beer-Lambert Kanunu
T= I/Io = 10 -A= 10 -Cl,
I= Ioe-Cl
log1010 I0 /I = Cl
A= Cl
SPEKTROFOTOMETRE
9
Bu formülde;
A= Absorbans veya optik yoğunluğu (OD, [Optical Density])
(emilmiş, soğurulmuş ışık miktarı)
= Ekstinksiyon katsayısını
C= Derişimi
l = Işık yolunun uzunluğunu ifade etmektedir.
Absorbans kavramı içinde ekstinksiyon katsayısı () anahtar bir rol oynamaktadır ve
çalışılan maddenin bilinen sabit bir derişiminin, sabit bir ışık yolundaki değeridir ve bu nedenle
birimi değişken olabilmektedir. Mesela bir A maddesinin  değeri için,
1M
260
= 500
veya
260 : 500 M-1 cm-1 verilmiş ise bunun anlamı;
1 cm
260 nm dalga boyunda, 1 cm ışık yoluna sahip bir ortamda 1 M’lık bir A çözeltisinin absorbans
değeri 500 demektir. Dolayısı ile bu kavram;
1 mM
 1 cm
%1
veya
275 nm
 1 cm
olarak değişik şekillerde ve rakamlarla
275
ifade edilebilir. Diğer taraftan transmitansı yüzde olarak ifade ettiğimizi varsayarsak,
%T = I / Io x 100 ise, transmitans ile absorbans arasındaki ilişki de
A = 2 -log %T’dir.
Sonuç olarak bir maddenin absorbansı (A) o maddenin derişimiyle doğru orantılıdır. Diğer
taraftan bir maddenin derişimi % transmitansa orantılı olmayıp % transmitansın logaritması ile
doğru orantılıdır (şekil 2).
Şekil 2. %T ve A arasındaki ilişki.
Renk şiddetini yukarıda izah edilen esaslara göre ölçen cihazlara FOTOMETRE denir.
Fotometrelerde belirli bir dalga boyunda (ki bu özel renkli cam filtrelerle veya prizmalarla elde
edilir) renkli bir çözeltiden geçen ışık bir detektör üzerine (photocell) düşürülür ve oluşan elektrik
akımı hassas bir galvonometre ile ölçülür. Bu değer isteğe göre ya A değeridir ya da %
transmitanstır. Gelişmiş cihazlarda l daima 1 cm’ye eşit olduğundan dolayı Beer-Lambert kanunu
A= C veya AC olarak basitleştirilmiş olur (şekil 3).
SPEKTROFOTOMETRE
10
Şekil 3. Bir fotometrenin şematik gösterimi
Tüm kolorimetrik analizlerin en önemli kısmını standart eğrilerin çizimi oluşturur. Bu
eğriler genelde derişime karşı absorbans değerleri olarak değerlendirilir. Bu eğrilerin çizimi
sırasında derişimi bilinen bir maddenin değişik miktarları (protein tayini için B.S.A) seyreltici (su
veya tampon) ile karıştırılıp aynı hacime getirip ve renklendirildikten sonra her birinin absorbans
değeri okunarak grafik kağıdında derişime karşı absorbans grafiği çizilir. Daha sonra derişimi
bilinmeyen aynı madde aynı şartlar altında renklendirilir ve bulunan absorbans değerine karşılık
gelen derişimin standart eğrisi kullanılarak hesaplanır. Burada önemli nokta çalışmanın daima
standart eğrinin doğrusal bölümünde yapılmasıdır. Eğer ölçümler doğrusal bölgeyi aşıyorsa
seyreltme kullanılır ve bulunan sonuç seyreltme katsayısı ile çarpılır.
UYGULAMA
Çözeltiler
0,1 M Sitrat tamponu (pH 2,4)
1,5 x 10-3 M Bromfenol mavisi
%95 Etanol
Teknik
Yedi adet deney tüpü alınır ve numaralandırdıktan sonra her bir tüpe aşağıdaki tabloda
gösterilen ayıraçlar konularak karıştırılır.
Çözeltiler (mL)
0,1 M Sitrat tamponu (pH 2,4)
1,5x10-3 M Bromfenol mavisi
%95’lik Etanol
Bilinmeyen
Bromfenol mavisinin
son derişimi (x10-5M)
1
9,0
0,1
0,9
1,5
2
9,0
0,2
0,8
3,0
3
9,0
0,4
0,6
6,0
Tüp No
4
9,0
0,6
0,4
9,0
5
9,0
0,8
0,2
12
6
9,0
1,0
15
7
9,0
1,0
Her bir tüpte oluşan rengin şiddeti 430 nm dalga boyunda (neden 430 nm?) okunur.
Okuma yapılmadan önce fotometrenin absorbans değeri örnek yerine su kullanılarak sıfıra
ayarlanır (%100 transmitans değeri). Daha sonra bromfenol mavisinin değişik derişimlerine
karşılık (tablodan hesaplanacak) bulunan absorbans değerleri grafik kağıdında işaretlenerek
standart eğri çizilir. Bilinmeyen numunenin derişimi ise, kendisine ait absorbans değeri standart
eğriden değerlendirilerek bulunur.
SPEKTROFOTOMETRE
11
Derişimlerin hesaplanışı:
0,1
 1,5x103  1,5x105
1. tüp için;
10
0,2
 1,5x103  3,0x105
2. tüp için
10
Not: Diğer bir hesaplama yöntemi ise sadece bir standart kullanılarak eğri çizilmeden
yapılan hesaplama yöntemidir. Derişimi bilinen standart için AS değeri bulunur (AS = CS l) aynı
işlem derişimi bilinmeyen örnek için yapılır. (AB = CB l) bu iki eşitlik birbirine bölünerek (AB =
CS x AB / AS) formülünden derişim hesabı yapılır.
A SİT - B AZ , p H ve TİT R AS Y ON
12
Laboratuvar
Asit-Baz, pH ve Titrasyon
2
GENEL BİLGİ
Kimyasal tepkimelerin çoğunluğu asit ve baz tepkimelerinden oluştuğundan asit ve baz
kavramı kimyanın en önemli konularından biridir. Ayrıca yaşamın her döneminde karşılaşılan
bileşikler sınıfından olan asit ve bazların (örneğin; sirkenin asetik asitin sulandırılmış çözeltisi,
aspirinin de asetil salisilik asit olması gibi) başlıca özellikleri şunlardır:
- Asit ve bazlar tepkimeye girerek tuzları verirler.
- Asit ve bazlar katalizör etkisi gösterirler.
- Asit ve bazlar ortamda indikatörle farklı renk verirler.
- Asit ve bazlar kendilerinden daha zayıf olan asit ve bazları molekül haline dönüştürürler.
Kimya tarihinin çeşitli dönemlerinde çeşitli asit baz tanımları yapılmış ve kullanılmıştır. İlk
zamanlarda tadı ekşi olan maddelere asit (Latince acidus; ekşi) denmiştir. Asitlerin etkisini ortadan
kaldıran, nötrleştiren maddelere ise alkaliler (Arapça alkali; bitki külü) ismi verilmiştir. Önceleri
her asitin belli bir element oksijen (Yunanca oxus ekşi; genaz doğuran) içermesi gerektiğine
inanılırdı. 1810’da "Davy"nin, HCl'nin yalnız hidrojenle klordan oluştuğunu göstermesi sonucu
bütün asitlerin temel bileşiminin hidrojen olduğu fikri kabul edilmiştir.
1880-1890 arasında Svante Arrhenius tarafından geliştirilen “İyonların Ayrışması Teorisi”
sonucu asit ve bazların tanımlanması yapılmıştır. İyon Teorisi aynı zamanda asitlerin niçin farklı
kuvvette olduğuna açıklık getiriyordu. Bu kavramın bir takım açmazları olması üzerine 1923’de
Lowry-Brönsted ve yine 1923’de Lewis yeni bir asit baz kavramı geliştirmiştir.
Arrhenius’a Göre Asit ve Baz Kavramı
Arrhenius’a göre mavi turnusolü kırmızı yapan, bazı metallerle hidrojen açığa çıkaran, tadı
ekşimsi, sıvı ortamına H+ veren maddelere asit; kırmızı turnusolü mavi yapan, asitleri nötrleştiren,
sıvı ortamına OH veren maddelere de baz denir. Bu kurama göre asit çözeltilerin kimyasal
aktiflikleri ve iletkenlikleri, biri H+ olan iyonlarına ayrışmasının sonucudur.
HCl
H+ + Cl
CH3COOH
CH3COO + H+
Farklı asitlerin kuvvetlerinin farklı olması bunların ayrışma derecelerinin de farklı
olmasındandır. Çözeltiye hidroksil iyonu verdikleri kabul edilen bazların davranışı için de buna
benzer bir açıklama yapılmaktadır. Diğer bir tanımlama ile asit özelliklerinden proton, baz
özelliklerinden ise hidroksil iyonu sorumludur.
NaOH (k )
Na+ (sıvı) + OH (sıvı)
Mg(OH)2 (k)
13
Mg++(sıvı) + 2 OH (sıvı)
Bu kuram açıklamakta güçlük çektiği iki temel soru ile karşı karşıyadır. Birincisi protonun
niteliği; ikincisi ise hidroksil iyonuna sahip olmadıkları halde baz özelliği gösterilebilen maddeler
ile ilgilidir.
1) Suyun iyonik bileşikler için bu kadar mükemmel bir çözücü olmasının nedenlerinden biri,
iyonların su moleküllerini kuvvetle çekmeleri ve kararlı hale geçmeleridir. Su molekülündeki yük
dağılımının asimetrik olması yüzünden bu çekim kuvveti özellikle büyüktür. Sulu çözeltilerde her
iyon su ile doymuş durumda bulunmaktadır. Diğer bir değişle su moleküllerini kuvvetle kendine
bağlamış, bunlar tarafından sarılmıştır. Proton, çözücü moleküllerin elektronik sistemine diğer
iyonlardan çok daha kolay ve fazla yaklaşabilmeli ve kendine bağlayabilmelidir. Başka bir deyişle,
iyonların su ile doyduğu durumlarda proton çözücüye daha sıkıca bağlanmaktadır. Buna göre de
asitlerin ayrışarak bağımsız protonlar vermesi beklenemez.
Bu bilgiler ışığında H+ iyonunu sulu çözeltilerde H3O+ olarak kabul edersek, ayrışma olayını
yalnız aşağıdaki şekilde düşünemeyiz.
HCl
H+ + Cl
Asit ayrışmasını asitten çözücüye bir proton aktarılması olarak düşünmek gerçeğe daha
yakındır.
HCl + H2O
H3O+ (aq) +Cl (aq)
Bu ise bizi asitin bir protona ayrışan değil, başka bir moleküle proton aktarabilen ya da
verebilen madde düşüncesine yöneltir.
2) Arrheniusa kuramına göre oluşturulan asit ve baz tanımında ortaya çıkan ikinci güçlük,
bütün baz özelliklerinin OH iyonlarından gelmesidir. Oysa OH iyonlarına sahip olmadıkları
halde asitleri nötrleştiren bazı maddeler vardır. Örneğin, sıvı amonyak içinde aşağıdaki tepkime
olmaktadır.
HCl+NH3
NH 4 +Cl
Bilinen bir asitle tepkimeye girerek onu nötrleştirdiği için amonyağa bir baz gözüyle
bakılabilir. Sodyum karbonatın (Na2CO3) ayrışarak doğrudan doğruya OH iyonları vermesi
imkansızdır. Öyleyse asitler ve bazlar için Arrhenius’un kuramında tanımlanandan daha geniş bir
alanı kapsayan görüşe gereksinim vardır.
Lowry-Brönsted’e Göre Asit ve Baz Kavramı
Bu teoriye göre proton verebilen tüm maddeler asit, proton alabilenler ise bazdır. Bir asit
proton verdiği zaman kendisinin KONJUGE ÇİFTİ veya KONJUGE BAZI, bir baz da proton
aldığı zaman kendisinin KONJUGE ÇİFTİ veya KONJUGE ASİTİ meydana gelir. Bu basit
olarak şöyle gösterilebilir:
Asit
Baz + Proton
14
Proton çapı öteki iyonların çapından çok daha küçük (1013 cm), yük yoğunluğu
(yük/yarıçap) çok daha büyüktür. Etrafta bundan başka elektron tabakası olmaması ve protonun
ortamda yalnız kalmaması nedeniyle muhakkak bir maddeye bağlanmalıdır. Bu madde de bazdır.
Yukarıdaki denge tek başına kurulamayacağından ikinci bir denge daha kurulur. Bu iki denge
aşağıdaki şekilde yazılır:
Asit1
Baz1 + Proton
Proton + Baz2
Asit2
Yukarıdaki dengelerin taraf tarafa toplanması ile de aşağıdaki eşitlik elde edilir.
Asit1 + Baz2
Asit2 + Baz1
Buna göre bir asitle bir baz tepkimeye girerek yeni bir asit ve baz oluşur. Ancak; yeniden
oluşan asit ve baz kuvvet bakımından tepkimeye giren asit ve bazdan çok farklıdır (Tablo 1).
Tablo 1. Çeşitli asit-baz tepkimeleri.
Asit1
Baz2
HCl
+
H2O
Asit2
H3O+
Baz1
+
C1
H2O
+
NH3
NH 4
+
OH
H2O
+
H2O
H3O+
+
OH
HCO 3-
+
OH
H2O
+
CO 3-
H3O+
+
HCO 3-
H2CO3
+
H2O
NH 4
+
HS
H2S
+
NH3
Bu tanıma göre kuvvetli bir asit başka bir moleküle bir proton aktarmak için büyük bir
eğilim, kuvvetli bir baz ise proton almak için büyük bir eğilim gösterir. Buna göre aşağıdaki
tepkimede asitin kuvvetini, tepkimeye katılan maddelerin tepkime ürünlerine dönme yatkınlığının
derecesine göre ölçeriz.
HSO -4 + H2O
H3O+ + SO -4
Asit1 + Baz2
Asit2 + Baz1
Tepkimenin ürünler yönünde ilerlemesi yalnız Asit1’in kolayca proton kaybetmesine değil
aynı zamanda Baz2’nin bu protonu alma yatkınlığına da bağlıdır. Bu nedenle çeşitli asitlerin
kuvvetini karşılaştırmak için bunların aynı baza proton verme eğilimlerini ölçmemiz gerekir.
Çeşitli asitlerin suya proton verme yatkınlıklarına göre bunları asit kuvveti yönünden sıralamak
olasıdır. Bir asitin kuvvetinin nicel ölçüsü, bu asitin ayrışma sabitidir.
H3O+ + A
HA + H2O
K
15
tepkimesi için,
[H 3O  ][ A - ]
[HA]
denge sabitidir.
Bunlardan başka çözücü içindeki herhangi bir asitin kuvveti:
- Asitin konjuge bazının kuvvetine,
- Eritenin baz ile kuvvetine (Örneğin, HOAc zayıf bir asit olmasına karşın sıvı amonyak
içinde süratle H+ iyonu vererek kuvvetli asit olmakta; NH3 ise süratle H+ kabul ettiğinden kuvvetli
baz olmaktadır.),
3) Eritenin dielektrik sabitesine (Yüksek dielektrik sabitesi olan bileşikler, karşıt yüklü
parçacıklar arasındaki çekimi azaltır. Örneğin, su içinde ayrışma alkole oranla çok daha fazladır.)
bağlıdır.
G. N. Lewis’in Asit ve Baz Tanımı
Bir asit elektron alan veya elektron çiftini katabilen, bir baz ise elektron veren veya
ortaklanmamış elektron çifti taşıyan bir maddedir. Bu tanıma “asit ve bazların elektron tanımları”
denir. Böyle bir tanım susuz ortamda ve yüksek sıcaklıkta oluşan tepkimeleri açıklamakta çok
yararlı ve daha genel bir tanımdır. Fakat analitik kimya tepkimeleri genellikle sulu ortamda
gerçekleştiklerinden asit ve bazlar için Lowry ve Brönsted’in proton tanımı kullanılır.
Suyun İyonizasyonu
İki su molekülü yeterli enerji ile çarpışırsa, su molekülleri H+ ve OH‘e ayrışabilir. Diğer bir
ifade ile su kendi kendine iyonize olabilir.
H3O+ + OH
H-O-H + H-O-H
+
H2O
H
+
OH
veya basitçe;
şeklinde yazılabilir.
Suyun kendi kendine iyonizasyonu iki yol ile düşünülmektedir:
- H+ ve OH iyonları veren basit ayrışma ile
- Brönsted’in konjuge asit-konjuge baz çiftine dayanarak.
Her iki durumda amfoter olan suyun H+ ve OH iyonlarını verdiği hem proton alıcı hem de
proton verici olduğu açıktır.
Suyun iyonizasyonu aşağıda gösterildiği gibi AYRIŞMA SABİTİ (Kd), İYONİZASYON
SABİTİ (Ki) ve SUYUN ÖZGÜL SABİTİ ile tanımlanabilmektedir.
Basit Ayrışma
HOH
Konjuge AsitKonjuge Baz
H+ + OH
[H  ][OH - ]
Kd 
HOH
HOH + HOH
Ki 
[H 3 O  ][OH - ]
[HOH] 2
H3O+ + OH
16
Suyun iki konjuge asit-konjuge baz çifti oluşturduğuna dikkat etmelidir (HOH/OH ve
H3O+/HOH). H+’nin (veya H3O+) her molü için 1 mol OH oluşturur. Saf suda [H+] = 10-7 M,
[OH] = 10-7 M olduğuna göre HOH'nin molaritesi aşağıdaki gibi hesaplanabilir.
M
Molekül Sayısı (H 2 O)
Litre
Molekül Sayısı 
Ağırlık (gr)
Moleküler Ağırlık
Suyun bir litresi 1000 g ağırlığında olup molekül ağırlığı 18’dir. Buradan;
M
1000 / 18(gr)
 55.6
1 (L)
Suyun molaritesi gerçekte 55,6 M (orijinal derişimi), ya da 10-7 M'dır (iyonize miktarı). Bu
miktar 55,6 M çok yakın olmakla birlikte 10-7 M ihmal edilebilir. Kd ve Ki ifadelerine yukarıdaki
diğerleri uygulayabilir.
Kd 
[10 -7 ][10 -7 ] [10 14 ]

[55,6]
55,6
Kd = 1,8x10-16
Ki 
[10 -7 ][10 -7 ]
[10 14 ]

[55,6] 2
3,09  10 3
Ki = 3,24x10-18
Suyun molaritesi birçok biyokimyasal problemde dikkate alınan sulandırılmış çözeltilerde
sabittir. Bu nedenle iki sabiteyi (Kd ve [H2O] veya [H2O]2 ve Ki) birleştirerek suyun iyonizasyonu
ya da ayrışması için yeni bir sabit tanımlayabiliriz (Kw)
Kw = Kd x [H2O]
Kw = (1,8x10-16) x (55,6)
Kw = 1X10-14 = [H+] [OH-]
Kw = Ki x [H2O]2
Kw = (3,24x10-18) x (55,6)2
Kw = 1x10-14 = [H3O+] [OH-]
pH ve pOH
pH bir çözeltinin hidrojen iyon etkinliğini kısa yoldan göstermektedir. Diğer bir ifadeyle
çözeltinin hidrojen iyon etkinliği ölçütüdür. Bu tanımlamayla pH, hidrojen iyon etkinliğinin
negatif logaritmasıdır. Benzer olarak pOH, hidroksil iyon derişiminin negatif logaritmasıdır.
1
1
pH  -log qH   log
pOH  -log qOH  log

qH
OH = -log H+ [H+]
1
 -log

γH [H  ]
= -log OH [OH]
1
  log

γOH [OH  ]
Asit ve bazların seyreltik çözeltilerde ve saf suda H+ ve OH- aktiviteleri, derişimlerine eş
olduğu düşünülebilir.
pH  -log [H  ]  log
1
[H  ]
pOH  -log [OH - ]  log
1
[OH - ]
17
Tüm sulu çözeltilerde suyun iyonizasyon dengesi sağlanmalıdır. Bu da [H+][OH-] = Kw
= 10-14'dür. Böylece [H+] bilindiğinde [OH-] de kolayca hesaplanabilmektedir. Ek olarak pH ve
pOH arasındaki ilişki aşağıdaki biçimde de yazılabilir.
[H+] [OH] = Kw
eşitliğinin logaritması alınır ise,
= logKw

-log[H+] –log[OH] = -logKw

+
log[H ] +
log[OH]
+
-log[H ] = pH,
-log[OH]
= pOH, -logKw = pKw
pH + pOH = pKw

-14

Kw = 10
-14
pKw = -log 10 = 14
pH + pOH = 14
ise,

Böylece [H+], [OH], pH veya pOH değerlerinden herhangi biri bilindiğinde diğer üçü
kolaylıkla hesaplanabilmektedir. 0,1 M’dan daha büyük H+ ve OH derişimlerinde aktivite
katsayıları göz önüne alınmalıdır. Bu ifadelerden de anlaşılacağı gibi pH’nin 10’un kuvveti
olduğudur. Bir pH birim farkının H+ derişiminde 10 kat farklılık getireceği de akılda tutulmalıdır.
pH 7’de çözeltiler nötrdür. pH 7’nin altındaki çözeltiler asitik, üstündekiler ise alkalidir.
Zayıf Asit Çözeltilerinin pH’sı
Zayıf bir monoprotik asitin (HA) ayrışmasından eşit derişimlerde H+ ve A oluşur. Eğer Ka
ve HA’nın başlangıç derişimi biliniyorsa [H+] kolayca hesaplanabilir.
[H  ][A - ] [H  ] 2
Ka 

[HA]
[HA]
[H  ]  Ka [HA]
Yukarıdaki eşitlik iyonizasyon derecesinin [HA]’nın değişmeden kalacak kadar çok küçük
olduğunu kabul eder. pH’yi veren bir tanım elde etmek için yukarıdaki eşitlik logaritmik forma
çevrilir.
log [H  ]  1 2 log Ka [HA]  1 2 (log Ka  log [HA]) 
- log Ka - log [HA]
2
pKa  p[HA]
pH 
2
- log [H] 
veya
Burada p[HA], HA derişiminin (-) logaritmasıdır. Zayıf bazlar, için de benzer ilişkiler
türetilebilir.
18
Henderson-Hasselbalch Eşitliği
Zayıf bir asitin (HA), Ka’sı ve zayıf asit çözeltisinin pH’si veya zayıf bir bazın Kb’si ve
zayıf baz çözeltisinin pOH’ı ile ilgili yararlı bir eşitlik türetilebilir. Bu eşitlik Henderson
Hasselbalch eşitliği olup bir zayıf asit ile onun tuzu, bir zayıf baz ile onun tuzunun
bulunduğu çözeltilerin pH’si ölçülür.
Ka 
[H  ][A - ]
[HA]
[H  ]  Ka
 eşitlikte değişkenlerin yerini değiştirir isek,
[HA]
[A - ]
log [H  ]  log Ka
 her iki tarafın logaritması alındığında,
log [HA ]
log [A - ]
- log [H  ]  -log Ka - log
pH  pKa - log
 her iki taraf -1 ile çarpıldığında,
[HA]
[A - ]
[HA]
[A - ]
veya
eşitliği ortaya çıkar.
Aynı eşitlik pOH için de türetilebilir. Herhangi bir zayıf baz MOH olarak
simgelendiğinde eşitlik aşağıdaki gibidir.
pOH  pKb - log
[MOH]
[OH - ]
Konjuge asit ve konjuge baz çözeltileri eşit olduğunda pH = pKa ve pOH = pKb
olduğuna dikkat edilmelidir. Aynı ilişki [A-] = [HA], [H+] = Ka ve [MOH] =[OH], [OH-] =
Kb olduğunda orijinal Ka ve Kb tanımlarından da görülebilir.
Yukarıdaki eşitliklere göre HA ve A içeren bir çözeltinin pH’si derişiminden
bağımsızdır. pH sadece konjuge bazın, konjuge asite oranı ile elde edilir. Bu tam doğru
değildir. Konjuge baz/konjuge asit oranını belirleyici faktör olarak varsayılacaktır. Bu
varsayım [A] ve [HA], Ka ile karşılaştırıldığında yüksek olduğu fakat; aktivite katsayıları için
düzeltimi sağlayacak kadar yüksek olmadığı sürece geçerlidir. Normal laboratuvar
koşullarında bu durumla karşılaşılması için derişimlerin 0,1 M veya aşağısı, Ka değerlerinin
10-3 veya aşağısı olmalıdır.
Normalite ve Titrasyon
Normalite 1 litre çözeltideki bir asit ya da bazın ekivalans sayısı olarak tanımlanır ve
aşağıdaki eşitlikte hesaplanır.
NORMALİTE (N) 
ÇÖZÜNENİN EKİVALANSI
ÇÖZELTİNİN LİTRESİ
Sadece bir H+ veya OH- veren bileşikler için (HCl, NaOH veya KOH gibi) normalite
ve molarite aynıdır. Yalnız bir asit veya bazın 1 molü 2 veya daha fazla H + veya OHverebildiğinden normalite molariteden farklı olur. En çok karşılaşılan vakalar H2SO4 ve
19
H3PO4’dür. Bu olgularda çözeltinin normalitesi daima molaritesinden büyüktür. Örneğin,
0,5 M H2SO4 çözeltisi (1,0 litresi 49 g) 1,0 N’dir (litresi 1,0 ekivalansdır).
Titre Edilebilen Asitite ve Gerçek Asitite
10 mL 0,1 N HCl ile 0,1 N NaOH titre edildiğinde ekivalans noktasına, tam 10 mL NaOH
harcandığı zaman gelinir. Aynı şekilde 10 mL 0,1 N Asetik Asit (HOAc) ile 0,1 N NaOH’ın
nötrleşmesi 10 mL 0,1 N NaOH ile gerçekleşir. Demek ki her iki tür asit de aynı molaritede
olmak kaydı ile titre edilebilen asit miktarı aynıdır. Çünkü her ikisinde de fenolfitaleyin ile sonuca
eşit miktar aynı normalitede baz kullanılarak gelinmiştir. Fakat bilindiği gibi HCl daha kuvvetli bir
asittir. HOAc ise daha zayıf asittir. Birinci asit, bir damla elimize değdiğinde yakar iken diğerinde
elde etki görülmez. HCl elektrik akımına daha geçirgendir; HOAc ise daha az iletkendir. HCl daha
düşük derecede donar; HOAc’e ise daha yüksek derecede donar. HCl sulu ortamda tamamen
iyonize olur; HOAc kısmen iyonize olur.
HCl
HOAc
H+ + ClH+ + OAc-
%100
%1-3
Bu oranlardan da anlaşıldığı gibi titre edilen asitite ile H+ iyon derişimi arasında fevkalade
bir fark vardır. Titrasyon süresinde HCl üzerine NaOH eklenince serbest olan H+ iyonu OH
iyonu ile birleşerek su oluşur. Na+ ve Cl iyonları tamamen iyonizedir. H2O ise çok az iyonlaşan
bir maddedir. Dolayısıyla titrasyonda ekivalans noktasında HCl çözeltisindeki tüm H+ iyonları
titre edilmiş olur. HOAc ise biraz önce belirtildiği gibi zayıf asit olup %1-3 arasında ayrışır. Bu
kadar az oranda ayrışmasına rağmen NaOH eklenmesiyle NaOAc ile H2O oluşacaktır. NaOAc da
iyoniktir ve H2O çok az ayrışır. Eklenen OH kuvvetli baz olduğundan çok az ayrışmış H+ iyonu
ile birleşir. Bu işlem, HOAc’nin tamamının ayrışıp H+ iyonlarının OH iyonları ile birleşmesine
kadar devam eder. Böylece HOAc’nin NaOH ile titrasyonunda HCl’nin NaOH ile titrasyonundan
titre edilebilir asitite yönünde fark olmaz.
Titrasyon
Derişimi bilinmeyen bir çözeltinin derişimini derişimi bilinen çözelti ile bulunmasıdır. Diğer
bir tanımla derişimi bilinen bir çözelti ile bilinmeyen madde miktarını ekivalans noktasına kadar
titre etmektir. Derişimi bilinen bu çözelti standart bir çözeltidir. Standart edilmiş bir tüpten
karışım nötral olana değin eklenir.
Bir asit-baz titrasyonu, tepkimeyi gösterecek hiç bir bulgu vermez. Bu yüzden nötral
noktaya ulaşıldığında bize durmamızı söyleyecek bir şey eklememiz gereklidir. Bu amaçla
karışımın ekivalans noktasında renk değişikliği veren indikatör denen maddeler eklenir. Bir
indikatör, asitik çözeltide bir renk, alkali çözeltide başka bir renk olan organik bileşiktir. Bir
titrasyonda nötrleştirme tepkimesini son noktaya kadar yaparız. Bu noktada eklenen asitin (veya
bazın) ekivalanslarının sayısı, bilinmeyen çözeltideki bazın veya asitin ekivalanslarının sayısına
eşittir. Böylelikle hesap yapmamızı sağlayacak uygun bir eşitlik kurabiliriz.
Asitin ekivalans sayısı = Bazın ekivalans sayısı
Nasit x Vasit = Nbaz x Vbaz
Titrasyon Çeşitleri
1- Asit-Baz Titrasyonları
a) Kuvvetli Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu
20
b) Zayıf Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu
c) Kuvvetli Asit-Zayıf Baz Titrasyonu
d) Zayıf Asit-Zayıf Baz Titrasyonu
2- Yükseltgenme-İndirgenme Esasına Dayanan Titrasyonlar
3- Çökelme Esasına Dayanan Titrasyonlar
Asit-Baz Titrasyonları
a)Kuvvetli Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu
Kuvvetli Asit-Kuvvetli Baz titrasyonunda ne katyon ne de anyon hidrolize olur. Çözeltinin
pH’si 7’dir. Bu titrasyon için 0,100 N HCl çözeltisinden 50,0 mL’lik örnek 0,100 N NaOH
çözeltisi ile titre edildiğinde, hem HCl hem de NaOH kuvvetli elektrolitler olduğundan
düşünülebilecek tek denge su dengesidir. Titrasyon erlenindeki asitin orijinal 50,0 mL örneğindeki
H+ derişimi 0,1 M'dır (veya 10-1 M). Böylelikle pH 1’dir. Büretten 10,0 mL 0,100 M NaOH
eklenmesinden sonra 0,100 N HCl’nin 40,0 mL'lik ekivalanı nötralize olmadan kalır. Böylece
titrasyon erlenindeki H+ moleküllerin sayısı:
mol H   40,0 ml x
(0,1 mol H  )
 4,0x10 -3 mol H 
1000 ml
Eklenmesinden sonra toplam çözeltinin hacmi 60,0 mL’dir (6,00x10-2 L). Böylece
[H  ] 
4,0x10 -3 mol H 
 6,67x10 -2 M
-2
6,0x10 L
Büretten 50,0 mL 0,100 M NaOH eklendiğinde denge noktasına ulaşır. Tüm asit hidrolize
olmuş ve pH 7'dir.
NaOH çözeltisi, denge noktasının ilerisinde eklendiğinde titrasyon balonundaki çözelti artan
şekilde alkali olur. Örneğin, 60,0 mL 0,100 M NaOH eklendiğinde çözeltinin 10,0 mL 0,100 M
NaOH'nin ekivalansı:
mol OH -  10,0 ml
0,1 mol OH  1,0x10 -3 mol OH - ' dir.
1000 ml
Bu noktada çözeltinin toplam hacmi 110,0 ml’dir (11,0x10-2 L). Böylece;
[OH - ] 
1,0x10 -3 mol OH 11,0x10 -2 L
pOH = 2,04
pH = 11,96
Tablo 3’deki değerler bunun gibi hesaplamalardan elde edilmiştir. Tablo 3’ün verileri şekil
1’de gösterilmiştir. Denge noktası civarında eğrinin keskin olarak yükseldiğinde dikkat edilmelidir.
21
Üç indikatörün renk değişim sınırları şekil 1'de gösterilmiştir. Her indikatör, sınırının
altındaki pH’lerde asit rengini, üstündeki pH’lerde alkali rengini gösterir. Titrasyonda çözeltinin
pH’si eğri boyunca soldan sağa değişir. Titrasyonun son noktası indikatörün alkali rengine
dönmesi ile saptanır.
Üç indikatörden herhangi biri titrasyonda kullanılması tatmin edici olabilir. Her üçünün de
renk değişim sınırları pH eğrisinin düz kısmına (bir damla NaOH çözeltisinin pH’de keskin bir
artışa sebep olduğu yerde) düşer.
Tablo 3. 0,100 M NaOH ile 50,0 mL
0,100 M HCl’nin titrasyonundan elde
edilen pH değerleri.
Eklenen 0,100 M NaOH
Hacmi (mL)
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
49,0
49,9
50,0
50,1
51,0
60,0
70,0
80,0
90,0
1,00
1,18
1,37
1,60
1,96
3,00
4,00
7,00
10,00
11,00
11,96
12,22
12,36
12,46
100,0
12,52
PH
Şekil 1. 0,100 M NaOH ile 50,0 mL
0,100 M HCl'nin titrasyon eğrisi.
b) Zayıf Asit-Kuvvetli Baz Titrasyonu
50 mL 0,1 M asetik asit (CH3COOH, zayıf bir asit) 0,1 M NaOH ile titre edildiğinde orijinal
50 mL asit örneğindeki H+ iyonu derişimi asetik asitin denge sabiti kullanılarak hesaplanabilir.
Tablo 4'te [H+] = 1,34x10-3 M olduğu görülür. Böylece çözelti pH’si 2,87'dir.
10 mL 0,1 M NaOH’nin, 50 mL 0,1 M CH3COOH çözeltisine eklenmesi sonucu oluşan
çözelti, CH3COO- iyonlarının bir karışımını içerdiğinden nötralize olmamış CH3COO- ile birlikte
nötralizasyonla oluştuğundan bir tampondur.
Tablo 4. 25C'de asetik asit çözeltilerinin iyonizasyon yüzdesi ve iyon derişimi.
ÇÖZELTİNİN DERİŞİMİ
1,00
0,100
0,0100
0,00100
[H+] veya [CH3COO-] (M)
0,00426
0,00134
0,000418
0,000126
İYONİZASYON YÜZDESİ
0,426
1,34
4,18
12,6
22
Bir tamponun pH’si;
[HA]
pH  pKa - log
[A - ]
ilişkisi kullanılarak hesaplanabilir. Asetik Asit için pKa 4,74’dür (1,8x10-5’in eksi logaritması).
[HC2H3O2]/ C 2 H 3 O -2 oranı kolayca hesaplanabilir. 10,0 mL NaOH eklendikten sonra orijinal
çözelti asitinin 40/50’si nötralize olmadan kalır. 10/50’si de sodyum asetat tuzuna çevrilir. Bu
yüzden oran 4’e 1’dir. Böylece;
pH  pKa - log
[CH 3 COOH]
[CH 3 COO - ]
 4.74 - log (4/1)  4.14
Tablo 5. 0.100 M NaOH ile 50,0 mL
0,100 M CH3COOH’nin
titrasyonundan elde edilen pH
değerleri.
PH
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
49,0
49,9
50,0
50,1
51,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
Eklenen 0,100 M
NaOH Hacmi (mL)
2,87
4,14
4,56
4,92
5,34
6,44
7,45
8,72
10,00
11,00
11,96
12,22
12,36
12,46
12,52
Şekil 2. 0,100 M NaOH ile 50,0 mL
0,100 M CH3COOH’nin titrasyon eğrisi.
Denge noktasında asitin tümü nötralize olmuş; ve oluşan çözelti (100 mL) sodyum asetat da
etkin olarak 0,05 M derişimindedir. Bu çözelti pH’sinin hesaplanmasında C2H3O2- iyonunun
hidrolizi dikkate alınmalıdır.
Bu titrasyonun denge noktası pH 7’de oluşmamaktadır. Denge noktasından sonra NaOH
eklenmesi çözeltinin artan derecede alkali olmasına neden olur. Eklenen OH iyonları hidroliz
23
dengesini sola kaydırır. Bununla birlikte oluşan ters yöndeki hidrolizin pH’ye etkisi ihmal edilir.
Bundan dolayı bu noktadan sonraki hesaplar HCl-NaOH titrasyonu için olanların aynıdır.
Bir CH3COOH -NaOH titrasyonunun verileri tablo 5’de özetlenmiş olup, şekil 2’de de
titrasyon eğrisi gösterilmiştir. Bu titrasyonun denge noktası bir önceki titrasyondan daha yüksek
pH’de oluşur ve denge noktası asit taraftan daha yüksek pH değerlerinde meydana gelir.
Sonuç olarak eğrinin denge noktası civarındaki hızlı yükselen bölümünün uzunluğu
azalmıştır. Şekil 2’den de anlaşıldığı gibi metil turuncusunun bu titrasyon için uygun indikatör
olmadığını görülmektedir. Aynı ifade bromtimol mavisi için de kullanılabilir. Çünkü renk
değişikliği 47,34 mL NaOH eklendikten sonra başlamakta ve 49,97 mL eklenene dek sürmektedir.
Bu olgu bir titrasyon için çok keskin bitişe neden olduğundan, bu titrasyonda fenolfitaleyin uygun
bir indikatör olacaktır.
c)Kuvvetli Asit-Zayıf Baz Titrasyonu
Kuvvetli baz zayıf asit titrasyonunda belirlenen yaklaşımın genel çizgilerini takip ederek
diğer titrasyon eğrileri çizilebilir. Bu tür titrasyonda metil turuncusunu indikatör olarak
kullanılabilir.
d)Zayıf Asit-Zayıf Baz Titrasyonu
Bu titrasyonda işlev gösterecek hiçbir uygun indikatör bulunamamıştır. Böyle titrasyonlar
(zayıf asitler arasındaki) genellikle yürümez.
Titrasyonlar potansiyometrik olarak yapılabilir. Örneğin, bir pH metrenin elektrotlarını
analiz edilen çözeltinin içine sokarak bir titrasyon gerçekleştirilebilir. Başarılı ayıraç
eklemelerinden sonra çözelti pH’si saptanır. Titrasyonun denge noktası, pH’de ani bir değişiklik
ile belirlenir; fakat eklenmeler ve okumalar bu noktanın ötesindedir. Denge noktası, verilerin
grafiğini çizerek ve titrasyon eğrisinin hızla yükselen bölümünün orta noktasına karşılık gelen
hacmi hesaplayarak bulunabilir.
Zayıf bir elektrolitin potansiyometrik titrasyonu elektrolitin ayrışma sabitini belirlemede
önemli bir yöntem sağlar.
pH  pK - log
[HA]
[A - ]
Elektrolitin pK’sı, yarı nötralizasyonda çözeltinin pH’sine eşit olduğundan ([HA]=[A-]
olduğu durumda), pK ve K’nin kendisi titrasyon eğrisinin herhangi bir yerinden saptanabilir.
İndikatörler
Çok değişik amaçlı indikatör kullanımı vardır. Bunlar;
- pH indikatörleri,
- Redoks indikatörleri,
- Kompleks indikatörleri,
- Adsorbsiyon indikatörleri,
- Derişim indikatörleri,
- Çökelek indikatörleri,
- Floresans indikatörleri.
24
İndikatörler arasında konumuz nedeniyle bizi ilgilendireni pH indikatörleri olduğundan
burada sadece bu konudan söz edilecektir. pH indikatörleri, pH değişikliğinde çözeltide renk
değiştiren, kompleks yapıda organik bileşiklerdir. pH indikatörleri çok çeşitli olup organik zayıf
asit ve bazlardır. Asit indikatörler İndH, bazik indikatörler de İndOH şeklinde gösterilir. Buna
göre ortamda aşağıda gösterildiği şekilde bulunurlar.
İndH
İnd + H+
İndOH
İnd+ + OH
İndH ve İnd farklı renklerde olduklarından ortamın rengini [İndH]/[İnd] belirler. Gözün
ayırt edebileceği oran yaklaşık 1/10-1 olduğundan, göz renklerin her orandaki karışımını ayırt
edemez. Bundan dolayı bir indikatörün etkin olduğu pH aralığı aşağıdaki şekilde bulunabilir.
pH  pKi - log
[İndH]

[İnd - ]
1
10 -1
pH  pKi - 1 ’dir.
pH  pKi - log

Bu eşitlik sonucu bir indikatör pKi 1 aralığında kullanılır. Bu da bir pH indikatörünün
ancak 2 pH aralığında kullanılabileceği anlamına gelir. İndikatörlerin pKi’si farklı olduğundan 0-14
aralığındaki pH’yi ölçmek için çeşitli indikatörler kullanılır. Çeşitli indikatörler tablo 6’da
gösterilmiştir.
Tablo 6. Bazı pH indikatörlerinin kullanım derişimleri, renk değişimi ve pH aralığı.
İndikatör
Çözücü
Renk
Derişim
%
İndikatörün
Yapısı
Asit şekli
Baz şekli
pH
aralığı
Alizarin sarısı
Su
0,1
Asit
Sarı
Menekşe
10,1-12,0
Timolfitalein
%90 alkol
0,1
Asit
Renksiz
Mavi
9,3-10,5
Fenolfitalein
%60 alkol
0,1 ve 1,0
Asit
Renksiz
Kırmızı
8,2-9,6
Kresol moru
%20 alkol
0,05
Asit
Sarı
Mor
7,4-9,0
Nötral kırmızı
%60 alkol
0,1
Bazik
Kırmızı
Sarı-Kahverengi
6,8-8,0
Fenol kırmızısı
%20 alkol*
0,1
Asit
Sarı
Kırmızı
6,4-8,0
Bromtimol mavisi
%20 alkol**
0,05
Asit
Sarı
Mavi
6,0-7,6
Litmus (azolitmin)
Su
1,0
Asit
Kırmızı
Mavi
5,0-8,0
Metil kırmızısı
%60 alkol
0,1 ve 0,2
Bazik
Kırmızı
Sarı
4,2-6,2
Metil turuncusu
Su
0,1
Bazik
Kırmızı
Sarı
3,1-4,4
Bromfenol mavisi
Su
0,1
Asit
Sarı
Mavi
3,0-4,6
Tropeolin 00
Su
0,01, 0,1, 1,0
Bazik
Kırmızı
Sarı
1,4-3,2
Kristal menekşesi
Su

Yeşil
Menekşe
0,0-2,0
* Veya her bir 100 mg indikatör için 5,7 mL 0,05 N NaOH içeren sulu çözelti.
** Veya her bir 100 mg indikatör için 3,2 mL 0,05 N NaOH içeren sulu çözelti.
25
Bu maddelerin çözeltileri kullanılacağı gibi sünger kağıdına emdirilip kurutulmuş biçimleri
de kullanılır. Timol mavisi gibi indikatörlerin iki Ki’si olduğundan bu gibi indikatörler hem asitik,
hem de bazik alanda kullanılır.
İndikatörler ile pH’nin belirlenmesinde bir takım hatalar yapılmaktadır. Aşağıda sıralanan bu
hatalar çözeltinin iyonik şiddetinin arttıracağından indikatörün fazla iyonlaşarak farklı renk
göstermesine neden olacaktır. Bunlar:
- Ortamda yabancı tuzların bulunması,
- Ortamda çözücü olarak sudan başka çözücülerin de bulunması,
- Ortamda koloidal taneciklerin bulunması,
- Ortamda yükseltgen ve indirgenlerin bulunması,
- Ortamın bulanık olmasıdır.
UYGULAMA
Yöntem ve Gereçler
Gereçler
- Büret (50 mL)
- 100 mL’lik erlen (2 adet)
- Değişik kapasitelerde pipetler
- Damlalık
- pH ölçüm çubukları veya pH metre
edilir.
Ayıraçlar
- 0,100 N HCl: %39’luk HCl asitten 7,8 mL alınıp 1 litreye saf suyla tamamlanarak elde
- 0,100 N NaOH: Sodyum hidroksitte karbonat bulunduğundan ve sodyum hidroksitin su
emme özelliğinden dolayı analitik terazide tartarak standart eriyik elde etmek imkansızdır. Bundan
dolayı sodyum hidroksitin doymuş eriyiğinden istenilen 0,100 N NaOH standardı hazırlanır.
Bunun değeri hazırlanmış ön standart 0,100 N Potasyum Asit Fitalat ile titre edilerek tayin edilir.
- 0,100 N CH3COOH: %96’lık asetik asitten 6,0 mL alınıp 1 litreye saf suyla tamamlanarak
elde edilir. Tam 0,100 N yapmak için ayarlı bir çözeltiyle hassas olarak titre edilir.
- Fenolfitalein: 0,5 g fenolfitalein 100 mL %60’lık alkol içinde eritilerek hazırlanır.
- Metil kırmızısı: 0,1 g metil kırmızısı 100 mL %60’lık alkol içinde eritilerek hazırlanır.
Yöntem
Kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonu
- Büretteki çözelti damlatmasını önlemek için büret musluğundaki tıpa çıkarıldıktan sonra
iyice silinip yağlanarak yerine tekrardan takılır.
- 0,100 N NaOH bir miktar bürete konur. Birkaç damla çözelti büretin musluğundan
akıtıldıktan sonra musluk kapatılıp yatay bir konumda elde çevrilerek durulanır. Bu olay üç kez
tekrarlanır.
- Büret NaOH ile doldurulur. Sıvı seviyesi tam sıfırın üzerine getirilir. Cıva hariç birçok sıvı
ince bir borunun içinde iç bükey yüzey konumundadır. Bu nedenle sıvı yüzeyinin, büretin sıfır
çizgisinden geçen düzleme teğet olması gerekir. Ayrıca dikkat edilecek nokta, büreti ayarlar iken
büretin sıfır çizgisi ile gözün aynı hizada olmasıdır.
26
- 0,100 N HCl’den 100 mL’lik erlen içine 25,0 mL konur ve içine 2-3 damla fenolfitalein
damlatılır.
- Titrasyon sırasında kuvvetli asit ve bazın değişik miktardaki karışımlarında pH ölçümü ve
indikatör değişimi gözlenir. Bu amaçla çözeltiler tablo 7'de gösterilen miktarlarda eklenerek elde
edilen karışımın pH’si pH metre (ya da pH ölçüm çubukları) ile ölçülüp kuramsal hesaplamalarda
elde edilen değerlerle karşılaştırılır. Her iki ölçüm sonucun (pH metre ölçümü ile kuramsal
hesaplamalar sonucu elde edilen) verileri kullanılarak titrasyon eğri grafiği çizilir.
Tablo 7. Her aşamada büretten erlene aktarılacak 0,100 N NaOH hacmi.
Aşamalar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Erlendeki 25 mL 0,100 N HCl’ye eklenecek
0,100 N NaOH hacmi (mL)
Erlene eklenen toplam 0,100 N NaOH
hacmi (mL)

2,5
5,0
5,0
5,0
2,5
2,5
2,5
2,5

2,5
7,5
12,5
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
- Gerçekte titrasyona (büretten NaOH eklenmesine) çözeltinin pembe rengi 30 saniye sabit
kalana dek devam edilir. Kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonunda ekivalans noktasının pH aralığı
geniş olduğundan burada kullanılan indikatör, pH aralığı 8,2-9,6 olan fenolfitaleindir.
- Titrasyon sonucu derişimini ayarlamak istediğimiz çözeltinin derişimi aşağıdaki eşitlik
kullanılarak hesaplanır.
V 1 x N1 = V 2 x N2
V1: Erlene konulan HCl’nin hacmi (25,0 mL)
N1: HCl’nin bulunması gereken derişimi (yaklaşık 0,100 N olacağını biliyoruz)
V2: Harcanan (büretten akıtılan) NaOH’nin hacmi
N2: NaOH’nin derişimi (0,100 N).
Zayıf asit-kuvvetli baz titrasyonu
- Kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonunda anlatılanlar aynen tekrarlanır. Ancak; 100,0 mL’lik
erlen içine 25,0 mL normalitesi yaklaşık 0,100 N olan asetik asit konur. Ayrıca; bu deney için
belirlenen çözeltiler aşağıdaki tabloda gösterilen miktarlarda konularak deney ve hesaplamalar aynı
kuvvetli asit-kuvvetli baz titrasyonundaki gibi yapılır.
- Anlatılan her şey indikatör olarak fenolfitalein yerine metil kırmızısı kullanılarak
tekrarlanır.
- Her iki deneyde de asetik asitin istenilen derişimde olup olmadığı V1 x N1 = V2 x N2
eşitliği kullanılarak bulunur.
27
V1= 25,0 mL asetik asitin hacmi
N1= Asetik asitin bulunması gereken derişimi
V2= Büretten harcanan NaOH’ın hacmi (ml)
N2=NaOH’ın derişimi (0,100 N)
Tablo 8. Her aşamada büretten erlene aktarılacak 0,100 N NaOH hacmi.
Aşamalar
Erlendeki 25 mL 0,100 N CH3COOH’ye
eklenecek 0,100 N NaOH hacmi (mL)
Erlene eklenen toplam 0,100 N
NaOH hacmi (mL)

2,5
5,0
5,0
5,0
2,5
2,5
2,5
2,5

2,5
7,5
12,5
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Örnek Problemler
Çözeltilerin normalitesi istediğimiz normaliteden yani 0,100’den düşük veya yüksek çıkar ise
bunu tam 0,100 N yapmak için aşağıdaki örneklerde verilen işlemler yapılır.
Örnek 1) HCl’nin normalitesi istenilenden küçük ise (örneğin 0,08 N) ayarlama şu şekilde
yapılır. Şişenin içerisinden 100,0 mL kullanmış olalım geriye 900,0 mL 0,08 N HCl kalmıştır.
Normalitesi bilinen stok HCl’den (10,0 M) ne kadar ekleyeceğimiz aşağıdaki eşitlikten hesaplanır.
(V1 x N1) + (V2 x N2) = N3 x V3
N1= HCl’nin hesaplana normalitesi (0,08 N)
V1= Ayarlanmak istenen HCl’nin hacmi (900,0 mL)
N2= Stok HCl’nin derişimi (10,0 M)
V2= Eklenecek stok HCl’nin bilinmeyen miktarı
N3= İstenilen normalite
V3= İstenilen hacim
V2= 2,8 mL’dir. Buna göre 10,0 M HCl’den alınan 2,8 mL sıvı, elimizdeki 900,0 mL HCl
içine eklenip 1 litreye saf su ile tamamlandığında 0,100 N HCl elde edilmiş olur.
Örnek 2) HCl’nin normalitesi istenilenden (0,100 N) yüksek çıkmış ise (örneğin 0,130 N)
aşağıdaki formül uygulanarak derişim istenilene ayarlanır.
N1 x V1 = N2 x V2
0,130 x 900 = 0,100 x V2
V2 = 1170 mL
28
1170-900 = 270 mL saf su 0,130 N HCl’ye eklendiğinde tam 0,100 N HCl elde edilmiş olur.
Ancak tam değerin tekrar kontrol edilmesi için bir titrasyon daha gereklidir.
KAYNAKLAR
1. Segel, Irwin H. Biochemical Calculations. Canada, John Wiley Sons, Inc.1976.
2. Fesseden, Ralph J. Basic Chemistry For The Health Siences. Massachusetts, Allyn and
Bacon, Inc. 1979.
3. Mahan, Bruce H. University Chemistry. Masschusetts, Addison-Wesley Publishing
Company, 1965.
4. Mortimer, Charles E. Chemistry: A Conceptual Approach. New York, D. Van Nostrand
Company, 1979.
5. Skoog, Douglas A. and West, Donalt M. Fundamentals Of Analytical Chemistry. New
York, Holt, Rinehart and Winston, Inc 1969.
6. Hamilton, Leicester F., Simpson, Stephen G., Ellis, Dawiv W. Tokya, Kojakusha Co.,
Ltd., 1969.
KARBOHİDRATLAR
29
Laboratuvar
3
Karbohidratlar
GENEL BİLGİ
Karbohidratlar, potansiyel olarak aktif aldehit keton grubu içeren polihidroksi alkoller veya
hidroliz edildiklerinde bu bileşikleri veren maddelerdir. Yapılarında başlıca C, H, O bulunur. Üç ana
gruba ayrılırlar.
- Monosakkaritler
- Disakkaritler
- Polisakkaritler
1- Monosakkaritler: Karbohidratların temel yapı taşlarıdır. İki grupta incelenirler.
a) Aldozlar: Aldehit grubu içeren monosakkaritlerdir.
b) Ketozlar: Keton grubu içeren monosakkaritlerdir.
Her iki grup da 3-9 arasında C iskeletten oluşurlar. Dihidroksi aseton dışında asimetrik C
atomu içerirler.
3 karbonlu bileşikler triozlar olarak adlandırılır. Gliseraldehit bir aldoz, dihidroksi aseton ise
bir ketozdur.
4 karbonlu bileşikler, tetroz olarak adlandırılır. Eritroz bir aldoz, eritruloz ise ketozdur.
5 karbonlu bileşikler pentozlar olarak adlandırılır. DNA ve RNA'daki ozlar pentoz olup
aldoz yapıdadır. Riboz RNA'nın, deoksiriboz ise DNA'nın şekeridir. Ketozlara örnek olarak ksilüloz
örnek verilebilir.
6 karbonlu bileşikler, heksozlar olarak bilinmektedir. Glukoz, galaktoz, mannoz, bir
aldoheksoz; fruktoz ise bir ketoheksozdur.
Glukoz
Galaktoz
Mannoz
Fruktoz
Canlı organizmalarda ana enerji kaynağı glukozdur. Açlık kan şekeri (AKŞ) normal sınırları
(10-12 saatlik açlıktan sonra) Folin-Wu yöntemi göre 70-120 mg/dl, glukoz oksidaz yöntemiyle 65110 mg/dl düzeyindedir. Glukoz oksidaz yönteminde gerçek glukoz ölçüldüğünden kan şekeri daha
30
KARBOHİDRATLAR
düşük değerde bulunmaktadır. Bugün artık AKŞ'den ziyade serum glukoz düzeyine bakılmaktadır.
Diğer şekerler glukozun izlediği metabolik yolların ara basamaklarına girerek metabolize
olmaktadır.
Galaktoz süt şekeri içinde bulunurken; fruktoz meyva şekeri olarak bilinir; çay şekerinin yani
sükrozun yapısında bulunur.
2- Disakkaritler : 2 monosakkaritin ardarda su çıkışı ile O-glikozidik bağ yaparak birleşmesi
ile oluşan karbohidratlardır.
Örnekler:
a) Sakkaroz (=Sükroz: -D-Glukoz + ß-D-Fruktoz): Glukoz ve fruktoz birimlerinden
meydana gelir. Çay şekeri olarak adlandırdığımız disakkarittir. Besinlerle alınan karbohidratlar
arasında miktar olarak ikinci yüksek şekerdir. İndirgen özellik göstermez. Bu nedenle, indirgenmeyükseltgenme tepkimesine dayanan şeker tayin yöntemleriyle tepkime vermez. Ancak hidroliz edilip
serbest glukoz ve fruktoza ayrıldığında, bu şekerlerin tepkimeye girmesi ile pozitif yanıt alınır.
Sakkaroz
b) Maltoz (-D-Glukoz + -D-Glukoz): -D-Glukoz birimlerinin 2 tanesinin birleşmesiyle
meydana gelmiştir. Glukoz moleküllerinden birisinin aldehit grubunun serbest olması nedeniyle
indirgenme-yükseltgenme temeline dayanan tayin yöntemleri ile tepkime verir.
Maltoz
c) Laktoz (-D-Glukoz +ß-D-Galaktoz): Glukoz ve galaktoz monosakkaritlerinden
meydana gelmiştir. Süt şekeri olarak bilinir ve indirgen özelliktedir.
d) Sellobioz (ß-D-Glukoz
temel birimlerini oluşturur. ßmeydana gelmiştir.
+ß-D-Glukoz): Selülozun
Glukoz
birimlerinden
Laktoz
Sellobioz
KARBOHİDRATLAR
31
Besinlerle alınan disakkaritlerin emilebilmesi için barsakta hidroliz olarak monosakkaritlere
ayrışmaları gereklidir. Ancak sellobioz ß-D-glukoz birimlerin birleşmesi ile oluştuğundan insanda bu
yapıyı hidroliz edebilecek bir enzim mevcut değildir.
3- Polisakkaritler
Uzun zincirli monosakkarit polimerleridirler. Çatısal özelliklerine göre 2 alt gruba ayrılırlar.
A- Homopolisakkaritler, tek tip monosakkaritin O-glikozidik bağ ile ardarda birleşmesi ile
oluşmuşlardır. Önemli homopolisakkaritlerin özellikleri:
1- Nişasta: Bitkisel karbohidrat depo maddesidir. Nişastayı oluşturan -Glukoz birimleri
birbirlerine O-glikozidik bağları ile 1-4 ve 1-6 karbon atomları arasında su çıkışı ile bağlanır. İndirgen
değildir. Vücutta emilebilmesi için glukoz birimlerine hidrolizi gerekir. Bu ise tükrük bezleri ve
pankreastan salgılanan amilaz enzimi ile sağlanır. Nişasta, iyot ile mor renkli kompleks oluşturur
ve kalitatif tayin amacı ile kullanılır.
Nişasta
2- Glikojen: Hayvansal karbohidrat depo maddesidir. Nişastaya benzer biçimde -D- Glukoz
birimlerinden oluşmuştur. O-glikozidik bağlanmalar 1-4 ve 1-6 karbonlar arasındadır. Nişastadan
farklı olarak bu 1-6 dallanmaları çok daha sıktır. Amilaz enzimi yardımı ile glukoz birimlerine
parçalanır. İyot ile kırmızı-siyah renkli kompleks oluşturur.
3- İnulin: Fruktoz polimeridir. 5000 moleküler ağırlığındadır. Enginar ve hindiba bitkilerinin
köklerinde bulunur. Hayvansal organizmalarda hidroliz edilmeden idrar ile atılır. Bu nedenle böbrek
fonksiyon testi olarak kullanılmaktadır.
4- Selüloz: 1-4 karbon atomlarının O-glikozidik bağ ile birleşmesi ile oluşan ß-D-Glukoz
polimeridir. Mide-barsak sisteminde selülozu hidroliz edecek enzim sistemi bulunmağından, insan
tarafından enerji kaynağı olarak yararlanılamaz; ama önemli bir "kütle" kaynağıdır. Dünyada en çok
sentezlenen biyomoleküldür.
B- Heteropolisakkaritler: Şeker türevi maddelerin de karışmasıyla birden fazla tipte birimin
polimerizasyonuyla oluşturduğu bileşiklerdir. Kan grubu antijenleri, kıkırdak dokusu bileşikleri,
32
KARBOHİDRATLAR
bakteri hücre duvarı bu tür biyomoleküllerden oluşur.
Karbohidratların Vücuttaki Metabolizması
Ağızdan alınan karbohidrat nişasta veya glikojen ise önce tükürükte bulunan enzimler
(pityalin=tükrük -amilazı) ile hidroliz edilerek nişasta molekülünden maltoz birimleri ayrılmaya
başlar.
Midede karbohidratları hidroliz edecek enzim yoktur. Karbohidratların sindirimi için gerekli
en önemli salgı pankreastan gelir, ekzokrin (dış) salgıyla -amilaz enzimini ince bağırsağa boşaltır.
Ancak amilaz şekerlerin emilimleri için yeterli değildir, tüm şekerlerin monosakkaride dönüşmesi
lazımdır. Bu amaçla ince bağırsakta maltozu parçalamak için maltaz; sakkarozu parçalamak için
sükraz; laktoz parçalamak için laktaz enzimi bulunmaktadır. Monosakkarit halinde emilen şekerler
Vena Porta (portal ven) aracılığıyla karaciğere gelir. Glukoza çevrilir veya metabolik yollarda
kullanılır. Beyin ve sinir hücreleri, eritrositler enerji kaynağı olarak glukozdan yararlanabilirler.
Glukoz;
1. Enerji gereksinimi için Embden-Meyerhof yoluyla GLİKOLİZ’e uğrar. Glukoz
sitoplazmada bu yol ile PİRÜVAT'a çevrilir.
2. Ortamda oksijen varsa pirüvat, CO2'ye dönüşür. Mitokondride gerçekleşen bu yola KREBS
DÖNGÜSÜ (Trikarboksilik Asit Döngüsü) denir. Bu 2 basamak sayesinde vücut enerji
gereksinimleri için ATP (Adenosin trifosfat) sağlar.
3. Eğer enerjiye gereksinim yoksa fazla oluşmuş ise glukoz glikojene çevrilir. Bu olaya
GLİKOJENEZ denir.
4. Şayet glukoz azalmış, ama glikojen varsa organizma bu glikojeni glukoza geri çevirir. Buna
GLİKOJENOLİZ denir. Bu olay karaciğer ve kaslarda gerçekleşir.
5. Eğer ortamda yeterli glikojen kalmamış ise organizma, başka maddelerden glukoz yapmaya
çalışır. Proteinleri oluşturan aminoasitler, pirüvat, laktoz, gliserol karaciğerde glukoza döndürülmeye
çalışılır. Buna GLUKONEOGENEZ denir.
6. Glukozun direk girdiği önemli bir yolda PENTOZ-FOSFAT ŞANTI’dır. Bu yolun amacı:
a) Vücutta yağ sentezi, steroid sentezi için gerekli NADPH'lerin (indirgenmiş Nikotinamid
dinükleotidfosfat) üretilmesidir.
b) Riboz ve deoksiriboz gibi değişik şekerlerin sentezidir.
UYGULAMA
Karbohidratların Genel Tepkimeleri
Deneylerde Kullanılacak Şekerler
%5 Glukoz
%5 Fruktoz
%5 Laktoz
%5 Sakkaroz
%5 Arabinoz
%5 Nişasta
KARBOHİDRATLAR
33
1- Genel Karbohidrat Tanımlanması( Molisch Tepkimesi)
Prensip
Karbohidratların genel tanıma tepkimesi olup tüm karbohidrat yapısındaki bileşikler bu
tepkimeyi verirler. Karbohidratların asitli ortamda oksitlenip furfarallere çevrilir. Bu bileşikler
değişik aromatik alkollerle farklı renk tepkimeleri oluşur. Tüm furfural türevlerin -naftol ile
pembe-mor renk vermesine dayanır.
Ayıraçlar
- Molisch Ayıracı: 10 g -naftol bir miktar alkolde çözüldükten sonra 100 mL ’ye alkol ile
tamamlanır.
- %98 H2SO4
Teknik
Bir deney tüpüne 2-3 ml şeker çözeltisinden konup üzerine 5-6 damla Molisch ayıracından
ilave edilerek karıştırılır. Musluk altında soğutulan tüp içeriğinin üzerine dikkatle tabaka teşkil
edecek şekilde %98 ’lik H2SO4 ’ten (yaklaşık 1mL) konulur, karbohidrat varlığında çözelti ile
H2SO4’tin temas yüzeyinde pembe-mor halka oluşur.
Karbohidratları tanımlamak için kullanılır.
2- İndirgen Karbohidratların Tanımlanması(Benedict Tepkimesi)
Prensip
Serbest aldehit ve keton grubu içeren karbohidratların yükseltgenme özelliğinden yararlanır.
Alkali ve sıcak ortamda aldehit grupları karboksil grubuna yükseltgenirken ortamda bulunan
CuSO4 indirgenerek Cu2O’ya dönüşür ve tuğla kırmızısı çökelek oluşur.
Ayıraçlar
-Benedict Ayıracı:
A: 17,.3 g CuSO4 bir miktar suda çözülerek 100 mL’ ye arık su ile tamamlanır.
B: 173 g sodyum-sitrat ve 100 g Na2CO3 susuz 800 mL arık su içinde ısıtılarak eritilir.
Soğuduktan sonra A çözeltisi B çözeltisine çalkalanarak ilave edilir. Daha sonra bir litreye arık su
ile tamamlanır.
Teknik
Bir deney tüpüne Benedict ayıracından 5 mL konulup üzerine 8-10 damla şeker
çözeltisinden ilave edilir. Bu karışım alevde kaynatılınca mavi renkli çözelti şeker miktarına bağlı
olarak tuğla kırmızısına bulanıklık ve çökeleğe dönüşür.
Serbest aldehit ve keton grubu içeren bütün karbohidratlar bu tepkimeyi verirken,
disakkaritlerden sakkaroz ve polisakkaritler tepkime vermezler.
3- Pentozların Tanımlanması (Bial Testi)
Prensip
Pentozlar asitli ortamda ısıtıldığında furfural oluşurken, heksozlar asitli ortamda
ısıtıldıklarında hidroksimetilfurfuraller meydana gelir. Bial ayıracı içerisindeki orsinol ile sadece
pentozların furfuralleri tepkime verirler. Böylece pentozlar heksozlardan ayırt edilebilir.
Furfural
34
KARBOHİDRATLAR
Ayıraçlar
Bial Ayıracı: 1,5 g orsinol 500 mL derişik HCl içerisinde çözülerek içerisine 25-30 damla
%10’luk demir III klorür (FeCl3 ) ilave edilir.
Teknik
Bir deney tüpüne 5 mL bial ayıracından konur, üzerine iki damla şeker çözeltisi ilave
edilerek dikkatle kaynatılır ve soğutularak oluşan renk kontrol edilir.
Pentozlar bial ayıracı ile kaynatıldığında renk oluşmadığı halde soğumaya başlayınca yeşil
renk veya çökelti oluşur.
- Ketoheksozların Tanımlanması(Seliwanoff Testi)
Prensip
Heksozlar asit ortamda ısıtıldıklarında hidroksimetilfurfural türevleri oluşur. Ketoheksozlar
bu tepkime daha hassastır. Aldoheksozlar ise daha geç dönüşmektedir. Seliwanoff ayıracındaki
rezorsinol ile ketoheksozların furfural türevleri pembe renk verdikleri için aldoheksozlardan
kolaylıkla ayrıştırılırlar.
Hidroksimetilfurfural
Ayıraçlar
Seliwanoff Ayıracı: 0,05 g resorsinol 100 ml %12’lik HCl içerisinde çözülür.
Teknik
Bir deney tüpüne 5 mL seliwanoff ayıracı konulur, üzerine 4-5 damla şeker çözeltisi ilave
edilerek kaynatılır, kırmızı renk oluşur. Şeker çözeltisinin derişimi fazla ise kırmızı çökelek oluşur,
bu çökelti soğuduktan sonra alkolde çözülürse daha parlak bir renk oluşur.
Fruktoza özel olan bu test, sakkarozun hidrolizi ile oluşan fruktozu tanımlamada ve
hidrolizin tam yapılıp yapılmadığını kontrol etmede kullanılır.
Galaktoz Varlığının Gösterilmesi
5- Musik Asit Testi
Prensip
Monosakkaritler asitlerle furfural türevlerine dönüştükleri halde heksozlar HNO3 ile uzun
süre kaynatılınca şeker asitlerine dönüşürler. Heksozların primer alkol ve aldehid grupları
oksitlenerek karboksil grubuna dönüşür. Bu şekilde oluşan şeker asitlerinden sadece galaktoz ve
laktoz suda erimeyen musik asite dönüşür.
KARBOHİDRATLAR
35
Ayıraçlar
%65 HNO3
Teknik
Şeker çözeltisinden 50 mL alınarak bir behere konulur. Çeker ocakta üzerine 12 mL derişik
HNO3 ilave edilerek kaynar su banyosunda 10 mL kalıncaya kadar ısıtılır. Soğuyunca 10 mL su
ilave edilip bir gece bekletildiğinde iğne şeklinde musik asit kristalleri oluşur.
6- Hidroliz
Prensip
Disakkaritler ve polisakkaritler %10’luk HCI ile ısıtıldıklarında kendilerini meydana getiren
monasakkaritlere ayrılırlar. Asit derişimi %10’dan düşükse hidroliz gerçekleşmez. Eğer derişik asit
kullanılacak olursa furfural türevleri oluşacaktır.
Hidroliz neticesinde oluşan monosakkaridler kendilerine özgü tepkimelerle tanımlanarak
hidrolizin tam yapılıp yapılmadığı ve karbohidratın yapısı tanımlan kontrol edilir.
Ayıraçlar
%10’luk HCI
%10’luk NaOH
Teknik
Bir deney tüpüne 5 mL %5’lik şeker çözeltisi konulup üzerine 1 mL HCI ilave edilerek
kaynar su banyosunda 3 dk kaynatılır. Tüp soğuyunca 1 mL %10’luk NaOH ile nötralize edilir.
Hidrolizi izleyebilmek için daha sonra nötralize edilmiş çözeltiden belirli kısım ayrılarak her şeker
kendisine özgü tepkime ile test edilir.
7- Osazon Testi
Prensip
Serbest aldehit ve keton grubu içeren şekerler fenil hidrazin ile tepkimeye girip bir molekül
H2O kaybederek önce fenil hidrazona dönüşürler. Fenilhidrojen yapılar tekrar fenil hidrazin ile
tepkimeye girerek osazonları verir ve sarı renkli kristaller oluştururlar.
Osazon kristallerinin görüntüsü şekerin cinsine göre farklı olur. Karbohidratların ilk iki
karbonu fenil hidrazine bağlandığı için glukoz, fruktoz ve mannozun geriye kalan dört karbonu
aynı konfigürasyona sahip olduklarından aynı osazon kristallerini verir. Yapısında serbest aldehit
ve keton grubu bulunmayan sakkaroz ve polisakkaridler ise osazon oluşturamazlar.
Glukoz, fruktoz ve mannozun osazon kristalleri ekin demeti şeklinde, galaktozun ( laktoz )
Osazon oluşumu
KARBOHİDRATLAR
36
atkestanesi şeklinde ve pentozun ise iğne tepkime biçimindedir.
Ayıraçlar
-Fenil hidrazin klorhidrat
-Sodyum asetat
Teknik
Bir çakı ucu kadar fenil hidrazin klor hidrat deney tüpüne konulur. Üzerine bir çakı ucu
kadar sodyum asetat eklenir. Bunun üzerine 10 mL şeker çözeltisi konarak en az 5 dk. kaynatılır.
Hareket ettirmeden çeşme altında soğutulur. Tüpün alt kısmında sarı renkli kristaller oluşur,
kristaller süzülerek lam-lamel arasında mikroskopta incelenir.
8. İyot Testi
Prensip
Polisakkaritlerin iyot çözeltisi ile verdiği renk tepkimesi esasına dayanır. Bu renk şiddeti
polisakkaritin zincir uzunluğu ile orantılıdır.
Nişasta
Mavi
Amilodekstrin
Mor
Eritrodekstrin
Kırmızı
Maltoz
Sarı
Glukoz
Sarı
Ayıraçlar
İyot: Bir cam havanda 0,5 g potasyum iyodür 10 mL saf suda eritilip üzerine 0,25 g iyot
ilave edilerek eritilir,100 mL’ye saf suyla tamamlanır.
Teknik
Bir deney tüpüne 2 mL şeker çözeltisinden konup üzerine 3 damla iyot çözeltisinden ilave
edilip oluşan renk izlenir.
Testler
Molisch
Benedict
Bial
Seliwanof
Hidroliz öncesi
Hidroliz sonrası
Osazon
Musik asit
İyot
SORULAR:
%1 Nişasta
%5 Glukoz
%5 Fruktoz
%5 Laktoz
%5 Sakkaroz %5 Arabinoz
KARBOHİDRATLAR
37
1- Karbohidratları tanımlayınız. Bir ortamda karbohidrat varlığı hangi test ile gösterilebilir?
2- Serbest aldehit veya keton grubu içeren karbohidratlar hangi test ile tanımlanır? Testin
prensibi nedir?
3- Molich testiyle pozitif, Benedict testi ile negetif sonuç veren bir biyolojik materyalde
karbohidrat varlığı hangi test ile gösterilebilir?
4- Ortamda laktoz ve sakkaroz bulunmaktadır. Bu iki şekeri hangi testlerle birbirinden
ayırtedebiliriz?
5- Hangi monosakkaritin Aldarik asit formu suda çözünmeyen berrak kristaller oluşturur?
6- Osazon testi nedir? Hangi şekerler benzer osazon verirler, neden?
7- Nişasta ve glikojen karbohidrat sınıflandırılmasında hangi gruba girerler? Her iki bileşik
arasında kaynaksal ve kimyasal yapı yönünden ne gibi farklılık vardır?
8- Glukoz, fruktoz, galaktoz ve mannoz’un açık ve halka formüllerini yazınız.
9- Maltoz, laktoz, sakkaroz, izomaltoz, Sellobioz’un yapısı hangi monosakkaritlerden
meydana gelmiştir? İnsanda bu disakkaritlerden hangisi/hangileri hidroliz edilemediğinden
emilemez?
10- Hamileliğin son devresinde veya süt veren annede idrarda indirgen şeker bulunması
patolojik midir (hastalık durumu)? Bu şeker ne olabilir?
Lİ PİTL E R - YA ĞL A R
39
Laboratuvar
Lipitler-Yağlar
4
GENEL BİLGİ
Lipitler; protein, karbohidrat ve nükleotidlerden sonra dördüncü ana grubu oluşturan
biyomoleküllerdir. Diğer grup biyomoleküllerden farklı olarak lipitler yapısal olarak geniş bir
çeşitlilik gösterirler. Lipitler; genellikle, biyolojik sistemlerde bulunan suda çözünemeyen organik
bileşikler olarak tanımlanırlar. Eter, kloroform ve benzen gibi polar olmayan çözücülerde
çözünebilirler. Lipitlerin görevleri şöyle sıralanabilir:
1- Hücre zarının yapı taşıdırlar.
2- Metabolizma için gerekli hücresel yakıt maddesi olarak depo edilmişlerdir.
Karbohidratların bir gramı 4,2 kcal enerji verirken, yağlarda bu 9,3 kcal’ye çıkmaktadır.
3- Bakterilerin hücre duvarı, bazı bitkilerin de yapraklarındaki koruyucu tabaka lipit
yapıdadır.
4- Vitamin olarak rol oynarlar. Bazı vitaminlerin de emilimleri için gereklidirler.
5- Prostaglandinler, steroidal hormonlar gibi bazı biyomoleküllerin ön maddesini
oluştururlar.
Lipitlerin büyük bir kısmı besinlerle dışarıdan alınmaktadır. Bir bölümü de organizma
tarafından sentezlenmektedir. Lipitler hayvansal organizmalarda başlıca şu gruplarda incelenirler:
A- Yağ Asitleri
Bunlar uzun bir hidrokarbon zincirin ucunda karboksilik asit fonksiyonel grupları olan
organik asitlerdir.
- Doymuş yağ asitleri,
- Doymamış yağ asitleri, olarak sınıflandırılırlar.
Doymuş yağ asitleri; hidrokarbon zincirin doymuş yapıda olduğu yağ asitleridir. Doymamış
yağ asitleri ise hidrokarbon zincirde bir veya daha fazla çift bağ içerirler. Doğada gözlenen yağ
asitlerinin karbon sayıları genellikle çift sayılardır; 4 ile 24 arasında karbon atomundan
oluşmuşlardır.
B- Gliserol esterleri
Gliseritler
Gliserol ile yağ asitlerinin esterleşmesi ile meydana gelirler. Gliserol molekülünün üç
hidroksil grubu da esterleşebileceği gibi, bir veya ikisi de bağlanabilir. Buna göre tanımlanırlar
40
(monogliserit, digliserit, trigliserit). Gliserole bağlanan yağ asitlerinin hepsi aynı tür olabileceği gibi
farklı yağ asitleri de olabilir.
Fosfolipitler
Beyaz mumsu maddelerdir. Yapılarında ortak olarak gliserol, yağ asiti, fosforik asit
kombinasyonu bulunur. Bu tür bileşik Fosfatidik asit olarak adlandırılır. Fosfolipitler, bu yapıya,
değişik alkolik türevlerin eklenmesiyle meydana gelirler. Hücre zarında önemli bileşiklerdir. Ayrıca
hücreye dışarıdan gelen uyarıların hücre içine iletilmesinde görevinde rol oynamaktadırlar.
Başlıca fosfolipitler şunlardır:
- Fosfatidil serin,
- Fosfatidil inozitol,
- Fosfatidilkolin (Lesitin),
- Fosfatidil lizin.
- Fosfolipitler, fosfolipaz denilen enzimler tarafından hidroliz edilirler.
C- Mumlar
Yağ asitleriyle uzun zincirli alkollerin birleşmesiyle oluşan ester yapılardır.
D- Steroidler
Siklopentanoperhidrofenantren çekirdeği içeren maddelerdir. Hayvansal ve bitkisel
organizmalarda çok önemli bileşiklerdir. Hayvansal organizmalarda temel steroidal bileşik
kolesteroldür. Diğer steroidlerin sentezinde ön maddedir.
Steroidal Hormonlar; değişik sayıda karbon atomu taşımaktadırlar. En büyük grup 21
karbon atomlu bileşiklerdir. Bunlar, Korpus luteumdan ve plasentadan salgılanan progesteron ile
böbrek üstü bezinden salgılanan kortikosteroidlerdir. 19 Karbonlu türevler ise androjenler
olarak adlandırılan erkek seks hormonlarıdır. 18 karbonlu bileşikler ise, östrojenler yani dişi seks
hormonlarıdır. Bunların dışında safra asitleri steroidal yapı taşır. D vitamini de steroid türevi bir
biyomoleküldür.
E- Sfingolipitler
Sfingozin adlı özel bir alkolün amino grubuna 18 veya daha fazla sayıda karbon içeren yağ
asitinin bağlanması seramit oluşturur. Bu öncül maddeden üç tür sfingolipit meydana gelir.
Bunlar; sfingomiyelin, galaktozil seramit, glukozil seramit'’ir. Bu lipitler santral sinir
sisteminde, hücre membranın yapısında birincil öneme sahiptirler.
F- Terpenler
5 karbonlu izopren ünitelerinden oluşmuşlardır. Kolesterol sentezinde ara madde olarak
sentezlenirler. A, E, K vitaminleri bu grup biyomoleküllerdir.
Yağların Sindirim ve Emilimi
Midede lipitlerin sindirimi için mide lipazı denilen bir enzim mevcutsa da bu yetişkinlerde
etkin değildir. Süt çocuklarında süt lipitlerinin, yağ asitleri ve gliserole hidrolizini sağlayabilir.
İnce bağırsaklarda ise safra kesesinden salınan safra asitleri pankreastan salgılanan pankreas
lipazı, lipitlerden yağ asitlerinin hidrolizini sağlarlar.
41
Barsak tarafından emilen kolesterol ile burada trigliseritlere çevrilen yağ asitleri şilomikron
halinde Vena porta ve lenf sistemine aktarılırlar. Bu nedenle yemeklerden sonra plazma veya
serum bulanık bir görünüm alır.
Plazma Lipitleri
İnsan plazması 500-700 mg/dl kadar lipit içermektedir. Bu fosfolipitler, steroidler,
kolesterol ve gliseritlerden oluşur. Ancak lipitler suda çözünmediklerinden plazmada bir yerden
diğer tarafa lipoproteinler halinde taşınmaktadırlar. Lipoproteinler, elektroforezdeki ayırımlarına
göre 4 grupta incelenirler:
1- Şilomikronlar: Barsaktan emilen lipitlerin taşındığı fraksiyondur. Açlık
örneklerinde lipoprotein elektroforezinde bu bantın görülmemesi gerekir. Bulunması
patolojiktir.
2- Beta Lipoproteinler: Özellikle kolesterolce zengindirler. Serumda
kolesterolün artışı elektroforezde kendisini beta bantında yükselme ile gösterir.
3- Pre beta Lipoproteinler: Karaciğerde sentezlenen trigliseridleri içeren
lipoprotein fraksiyonudur. Lipoprotein elektroforezinde oranları normal kişilerde %15’in
altında olmalıdır.
4- Alfa Lipoproteinler: En yüksek protein ve fosfolipit oranı bu fraksiyondadır. Kolesterol
de ihtiva eder. Bu fraksiyondaki kolesterolü yansıtan HDL-Kolesterol düzeyi çok önemlidir,
zira bunun miktarında azalma, kişide ateroskleroz riskinin yüksek olduğunu gösterir.
Şekil 1. LDL molekülü
42
Lipoproteinler ultrasantrifüjde ayrıldıkları fraksiyonlara göre de gruplandırılırlar.
1- Şilomikronlar,
2- LDL-Düşük dansiteli lipoproteinler, elektroforezdeki betalipoproteinlere karşılıktır.
3- VLDL-Çok düşük dansiteli lipoproteinler, elektroforezde, prebeta lipoproteinlere
karşılıktırlar, Plazmada trigliseritleri uzaklaşarak LDL’ye dönüşürler.
4- HDL-Yüksek dansiteli lipoproteinler, elektroforetik ayrımda alfa-lipoproteinlere
karşılıktır.
İnsan plazma lipoproteinlerinin esas sınıfları ve bunlara ait özellikler tablo I’de
gösterilmiştir.
Tablo I: İnsan Plazma Lipoproteinleri
Lipoprotein
Yoğunluk
(g/mL)
Protein
Şilomikronlar
VLDL
LDL
HDL
1,006
0,95-1,006
1,006-1,063
1,063-1,210
2
10
23
55
Bileşenler (% ağırlık)
Fosfolipit
Serbest
Kolesteril
kolesterol
esterleri
9
1
3
18
7
12
20
8
37
24
2
15
Triaçil
gliseroller
85
50
10
4
Serum Total Kolesterol Tayini
Kolesterol steroid yapısında bir biyomoleküldür (Şekil 2a). 3. karbonda bulunan hidroksil
grubu kolesterol esterlerindeki yağ asitinin bağlanma yöresini oluşturur (Şekil 2b).
Şekil 2. a) Siklopentanoperhidrofenantren çekirdeği
b) Kolesterol molekülü
43
Plazma kolesterolünün %70’i esterleşmiş şekilde %30 ise serbest haldedir. Kolesterol
esterleri kolesterolün dokulardaki depo şeklidir.
Kolesterol bir amfipatik lipit olması dolayısı ile bütün hücre zarlarının, plazma
lipoproteinlerinin bir bileşenidir. Vücutta kortikosteroidler, seks hormonları, safra asitleri ve D
vitamini gibi diğer steroidlerin öncül maddesidir.
Kolesterol vücutta başlıca karaciğerde de novo sentezi ile bağırsak, adrenal korteks ve
üreme organları (yumurtalık, testis, plasenta) gibi hemen hemen tüm dokularda sentezlenir.
Yumurta sarısı, et, karaciğer gibi besinlerle de alınabilir. Diyetle alınan; karaciğerde de novo
sentezlenen ve ekstra hepatik dokularda yapılan kolesterol, karaciğerde toplanır. Karaciğer,
kolesterol dengesinin sağlanması açısından önemli role sahiptir. Alınım ve atılımı arasındaki
dengenin bozulmasıyla birlikte birçok patalojik olay gerçekleşir. Yüksek kolesterol düzeyine sahip
olan kişiler ateroskleroz riski taşırlar.
Kolesterol Sentezi, Taşınması ve Yıkımı
Kolesterol sentezi, Asetil-KoA’dan başlamak üzere çok basamaklı işlevlerle sitozol ve
endoplazmik retikulumda bulunan enzimlerle gerçekleşir.
Kolesterol, dokular arası taşınımı için özellikle LDL( -lipoprotein) lipoproteinlerinin
yapısına girer. Ekstrahepatik dokularda sentezlenen kolesterol ise HDL ile ayrılır ve karaciğere
getirilir. Ortamda VLDL miktarının yüksek olduğu durumlarda plazma kolesterolünün daha
büyük bir kısmı VLDL içinde kalır.
Kolesterol vücutta enerji kaynağı olarak kullanılmadığından insanlarda H2O ve CO2’de
metabolize edilemez, yıkım için karaciğere gelir. Safra sıvısı içinde kolesterol veya safra asitleri
halinde bağırsağa verilir. Safra asitlerine dönüştükten sonra yaklaşık olarak yarısı feçes ile atılır.
Diğer kısmı ise tekrar safra içine salgılanır.
Kolesterol Tayin Yöntemleri
Kolesterol direkt veya indirekt olmak üzere kimyasal ya da enzimatik yöntemler ile tayin
edilir.
Kimyasal Yöntemler
Bu yöntemlerde kolesterolün kimyasal ajanlarla verdiği tepkime sonucu oluşan renkli
maddeler niceliksel olarak tayin edilir.
-Liebermann-Burchard yöntemi,
-Salkowsky yöntemi,
-Zlatkis-Zak ve Boyle Yöntemi.
Enzimatik Yöntemler
Enzimatik yöntemler özgünlüklerinin daha fazla olmasından ötürü 1970’ lerden bu yana
kimyasal yöntemlerin yerini almıştır. Bunlar kolesterolün oksidaz enzimi ile tepkimesi sonrası
oluşan H2O2’nin daha sonra renkli komplekslere dönüştürülmesine dayanır.
Depolama
Kolesterol analizi yapılacak serum veya plazma örnekleri uzun süreli kullanımda –70 C
veya daha aşağısındaki sıcaklıklarda saklanabilir. Bir veya iki ay gibi kısa süreli kullanımlarda ise –
20 C’ta muhafaza edilebilir.
44
Zlatkis-Zak Yöntemi ile Kolesterol Tayini
Deneyin prensibi
Çift bağ içeren steroidlerin sülfürik asit ve asetik asitli ortamda FeCl3 ile tepkimesi sonucu
oluşan bis-kolestadienil-disülfonik asitin verdiği yeşil-eflatun rengin 560nm dalga boyunda
okunması esasına dayanır. Renk çok dayanıklı olup yöntem Liebermann-Burchard tepkimesinden
5-10 kez daha hassastır.
Ayıraçlar
1- % 0,05 FeCl3: 50mg FeCl3 tartılır ve glasiyel asetik asit ile 100mL’ye tamamlanır.
2- Konsantre H2SO4
3- Stok kolesterol standartı: 400mg kolesterol tartılır, 60-70 mL glasiyel asetik asitte
çözülür ve 100 mL’ye tamamlanır (400 mg/dL).
4- Günlük standart: 2mL stok standarttan alınır, üzerine 2mL glasiyel asetik asit eklenir
(200mg/dL).
Standart Eğri Çizimi;
Stok standarttan 100, 200, 300 ve 400mg/dL olacak şekilde standart dizisi hazırlanır. Bunun
için 4 tane deney tüpü alınır aşağıdaki şekilde standartlar hazırlanır.
Stok çözelti (mL)
1
2
3
4
Glasiyel asetik asit(mL)
3
2
1
-
Son derişim (%mg)
%100
%200
%300
%400
Standart eğri çizmek için önce 5 tane deney tüpünde bir ön karışım hazırlanır.
Ön karışım:
Çözeltiler (mL)
Standart
Saf Su
%0,05 FeCl3
Derişim (mg/dL)
Kör
0,1
10
-
Tüp No
2
0,1
10
200
1
0,1
10
100
3
0,1
10
300
4
0,1
10
400
Tüpler karıştırılarak 10 dk oda ısısında bekletilir. Daha sonra 5 deney tüpü alınır. Aşağıdaki
şekilde pipetleme yapılır.
Çözeltiler (mL)
Ön karışım
Konsantre H2SO4
Derişim (mg/dL)
Kör
2,5
1,5
-
1
2,5
1,5
100
Tüp No
2
2,5
1,5
200
3
2,5
1,5
300
4
2,5
1,5
400
45
Tüpler karıştırılarak 10 dk oda ısısında bekletilir. Spektrofotometrede 560 nm dalga
boyunda köre karşı absorbans okunarak eğri çizilir.
OD (560nm)
Kolesterol Standard Eğrisi
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
y = 0,0009x
R2 = 0,9975
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
375
400
425
450
Konsantrasyon (m g/dL)
Örnek Çalışması
Üç tane santrifüj tüpü alınarak aşağıdaki pipetleme yapılır.
Çözeltiler (mL)
Kör
Standart
Örnek
Standart (200mg/dL)
Serum
Saf su
%0,05’lik FeCl3
0,1
10
0,1
10
0,1
10
Tüpler karıştırılır 10dk santrifüj edilir. Üç tane deney tüpü alınır.
Çözeltiler (mL)
Kör
Standart
Örnek
Süpernatan
Konsantre H2SO4
2,5
1,5
2,5
1,5
2,5
1,5
Tüpler karıştırılarak 10 dk bekletilir. Spektrofotometrede 560 nm dalga boyunda absorbans
okunarak derişim, eğriden veya standart ile karşılaştırılarak değerlendirilir.
Standart derişimden değerlendirme
OD1
Örnek konsantras yonu (mg/dL) 
 standart konsantras yonu (200 mg/dL)
OD 2
OD1: Konsantrasyonu bilinmeyen örneğin optik dansitesi
OD2: Standartın optik dansitesi
Not: H2SO4 ve glasiyel asetik asit tahriş edici maddeler olduğundan çok dikkatli
çalışılmalıdır.
46
Referans değerler
Referans değerler yaşa ve cinsiyete göre değişir. (mg/dlL)
0-20 yaş
115-200,
20-24 yaş
E
K
124-218,
122-216,
35-40 yaş
E
K
146-270,
140-242,
55-60 yaş
E
K
156-276,
172-300.
Klinik olarak istenen değerler:
İdeal
Orta dereceli risk
:  200mg/dL
: 200-239 mg/dL
Yüksek risk
:  240 mg/dL
Kolesterol Tayininde Kimyasal İnterferanslar
Kolesterol Değerini artıranlar
Askorbik asit
Kolesterol Değerini düşürenler
Sodyumazit ve timerosal gibi serum koruyucuları
 Hidroksisteroller
Bilirubin
Lipemik ikterik veya hemolizli numuneler
Plazma Kolesterol Düzeyini Etkileyen (in vivo) Nedenler
Kolesterol Düzeyini Artıranlar
Amiodaron
Androjenler
Kateşolaminler
Kenodiol
Siklosporin
Diüretikler
Glikojenik kortikosteroidler
Yüksek kolesterollü diyetler
Kolesterol Düzeyini Azaltanlar
Amino salisilik asit
Asparaginaz
Östrojenler
Fibrik asit türevleri (klofibrat vs.)
HMG-CoA redüktaz inhibitörleri
Düşük kolesterol ve yüksek doymamış yağlı diyetler
47
YORUM
Serum kolesterol düzeyinin yükseldiği (= hiper kolesterolemi) durumlar:
-İdiyopatik hiperkolesterolemi,
-Karaciğer hastalıkları (Ör. Tıkanma sarılıkları, hafif portal siroz, hepatik glikojen depo
hastalığı),
-Ateroskleroz,
-Hipotiroidi,
-Böbrek hastalıkları (Ör. Nefrotik sendrom),
-Hiperlipoproteinemiler,
-Gebelik,
-Lösemi.
Serum kolesterol düzeyinin azaldığı (=hipokolesterolemi) durumlar
-Hipertiroidizm,
-Ağır karaciğer hücre harabiyeti,
-Kronik anemiler,
-Hemofililer,
-İnfeksiyonlar,
-Malnütrisyon(Ör. , üremi, açlık, terminal neoplazm).
1- Kolesterol plazma değerleri yaş ve cinsiyete göre değişir.
2- Kadınlarda (K) değerler, erkeklere (E) göre daha düşüktür.
3- Menapoz döneminden sonra K/E değerleri birbirine yaklaşır.
4- Ateroskleroz ve kalp hastalığı açısından kolesterol yüksekliği risk faktörlerinden yalnızca
birisidir.
5- Kolesterol düzeyleri diğer lipit parametreleri( LDL-Kol, HDL-Kol, Trigliserit, Apo B,
Apo E) ile birlikte değerlendirilir. Örneğin Total Kol/HDL oranının 5 olması bir diğer risk
faktörüdür.
6- Toplumlara göre referans değerler değişir. Örneğin 10 yaş üzerinde Afrikalı
Amerikalılarda ortalama 10 mg/dL daha yüksek değerler saptanmıştır.
SORULAR:
1- Lipitleri tanımlayınız, görevlerini anlatınız.
2- Trigliserit, fosfolipit ve sfingolipitlerin benzerlik ve farklılıkları nelerdir?
3- Lipoprotein ne demektir? Kaç tipte incelenir?
4- Kolesterol nasıl bir bileşiktir? Önemini anlatınız.
5- Kolesterol tayin yöntemleri hakkında bilgi veriniz.
6- Ateroskleroz nedir?
P RO TE İN L ER
48
Laboratuvar
Proteinler
5
GENEL BİLGİ
Amino asitlerin peptit bağı ile bağlanmaları sonucu meydana gelen proteinler, tüm canlıların
yapısında ve yaşamları boyunca fonksiyonlarını yürütmede ön planda yer alır. C, H, O, N ve çoğu
kez S içeren bileşikler olup bazılarının yapısında fosfor, demir, bakır, çinko gibi elementler
bulunur (hemoglobin’de demir, serüloplazminde bakır gibi). Proteinlerin yapı taşları doğal olarak
bildiğimiz 20 amino asitten meydana gelmiştir. Bir amino asidin -karboksil grubu ile diğer bir
amino asidin -amino grubu arasından bir mol su açığa çıkmasıyla peptit bağı (amit bağları)
oluşur (Şekil 1).
Şekil 1. İki amino asit arasında oluşan peptit bağı.
Peptit bağları kendiliğinden veya ısıtılarak ya da üre gibi yüksek derişimlerde proteinleri
denatüre eden ajanlarla yıkılmazlar. Bu bağları nonenzimatik olarak parçalamak için yüksek
sıcaklıkta uzun süre, kuvvetli asit ya da alkaliye maruz bırakmak gerekir.
Proteinler canlı organizmanın çok önemli fonksiyonlarını oluştururlar. Bunlar:
- Biyokimyasal tepkimeleri katalizleme (enzimler),
- Hücre ileti sistemi (hormon),
- Taşıma (Hb),
- Organizmanın mekanik hareketleri (kas gibi),
- Savunma (Ig).
Proteinlerin yapısını dört basamakta incelemek mümkündür. Bunlar; primer, sekonder,
tersiyer, kuaterner yapılar olarak bilinmektedir.
Primer Yapı (birincil): Bir proteindeki amino asitlerin sayısı, türü ve diziliş sırası primer
yapıyı tayin eder. Birincil yapının en karakteristik özelliği peptit bağıdır. Bazı genetik hastalıklarda
P RO TE İN L ER
49
anormal proteinler (amino asit dizilişindeki farklılıktan dolayı) meydana gelmekte olup, bu
değişimin üç boyutlu yapıyı etkilemesi sonucu proteinlerin fonksiyonu değişmekte veya stabilitesi
bozulmaktadır. Bu nedenle primer yapıyı anlamak çok önemlidir. Normal ve mutasyona uğramış
proteinlerin primer yapıları bilindiği takdirde bu bilgi kullanılarak hastalığın moleküler patolojisi
araştırılabilir ve kesin tanı konulabilir.
Sekonder Yapı (ikincil): Polipeptit ana yapısı gelişigüzel bir üç boyutlu yapı oluşturmayıp
genellikle lineer (düz) dizide birbirine yakın olan amino asitlerin kurallı (karboksil ve amino
grupları arasındaki hidrojen bağlarının) düzenlenmesiyle yapılanır. Bu düzenlemelere
polipeptitlerin sekonder yapısı denir. -sarmal, -kırmalı tabaka ve üçlü sarmal bu yapılara örnek
teşkil eder.
Tersiyer Yapı (üçüncül): Proteinin polipeptit ünitelerinin üç boyutla yapısı tersiyer yapıyı
gösterir. Protein molekülünün yuvarlak veya elipsoid bir şekil alabilmesi için ikinci yapıyı meydana
getiren konformasyonların üst üste katlanması veya yumak şeklinde sıralanması gerekmektedir. Bu
ise yan zincirlerin yapıya girmesi ile mümkün olur.
Polipeptit zinciri sarmal şeklinde kıvrıldığında sarmalı bu durumda tutmak gerekir. Hidrojen
köprüleri ise bütün molekülü kıvrık halde tutacak kadar kuvvetli değildir. Yapıyı istenilen formda
tutabilmek için bazı yeni bağlara gereksinim vardır.
Bu yapıda görev alan bağlar şunlardır:
- Hidrojen bağları,
- Hidrofobik etkileşimler,
- İyonik etkileşimler,
- Disülfit bağları,
- Van der Waals kuvvetleri.
Kuaterner Yapı (dördüncül): Her üç yapıyı içeren polipeptit birimleri birleşerek kuaterner
yapıyı oluşturur. Birçok protein tek bir polipeptit zincirinden meydana gelir, bunlar monomerik
proteinlerdir (miyoglobin). Birçoğu da yapısal olarak benzer veya tamamen ilgisiz bir veya daha
fazla polipeptit zincirinden oluşur. Bu polipeptit zincirlerinin düzenlenmesine kuaterner yapı
denir. Bu yapıya en güzel örnek hemoglobin’dir.
Protein Metabolizması
Plazma proteinlerinin yaklaşık tamamı karaciğerde sentezlenirken, sadece immünglobulinler
immün sistemin plazma hücrelerinde üretilirler. Proteinlerin yine büyük bir kısmı yapıtaşları olan
amino asitlerine karaciğerde katabolize edilirler. Amino asitler de katabolizmalarında deamine
edilerek amonyağa ve keto asitlerine dönüştürülür. Organizma için toksik olan amonyak da
karaciğerde üre döngüsü ile üreye metabolize edilir ve daha sonra idrarla atılır. Keto asitler sitrik
asit döngüsünde okside edilerek glukoza veya yağ asitlerine dönüştürülür.
Azot Dengesi
Her ne kadar protein döngüsü (turnover) her bir protein için farklılık gösterse de
proteinlerin metabolizmaları ile katabolizmaları arasında genel bir denge vardır, bu da azot
dengesi olarak bilinir. Eğer, protein katabolizması ya da kaybı sentezini geçer ise negatif; sentez,
katabolizmayı geçer ise pozitif azot dengesi olarak tanımlanır.
P RO TE İN L ER
50
UYGULAMALAR
A- Proteinlerin Renk Tepkimesi
Proteinler belirli ayıraçlarla farklı karakteristik renk tepkimesi verirler. En karakteristik
tepkime biüret tepkimesi'dir. Az miktarlarda bulunan proteinleri ölçmek için Lowry yönteminde
kullanılan Folin–Ciocalteu ayıracından yararlanılır.
Prensip: Biüret tepkimesinde proteinler kuvvetli alkali bir ortamda bakır sülfat ile
pembemsi mor renkte bir kompleks oluştururlar (Şekil 2). Bu tepkimenin gerçekleşmesi için en az
iki peptit bağı bulunmalıdır.
Biüret
Çözeltisi
Biüre
Mor renkli kompleks
Şekil 2. Biüret ile oluşan renkli kompleksin yapısı.
Ayıraçlar
Biüret Çözeltisi: 1,5 g bakır sülfat ve 6 g sodyum potasyum tartarat bir miktar arık suda
eritilir. Şiddetle çalkalanarak üzerine 300 mL %10’luk sodyum hidroksit ve 1 g potasyum iyodür
eklenir. Karışım 1 litreye arık su ile tamamlanır. Kırmızı veya siyah bir çökelti oluşursa ayıraç
kullanılmaz.
Yumurta Akı Çözeltisi (%1): 10 mL yumurta akı %1’lik sodyum klorür solüsyonu ile 1
litreye tamamlanır.
Üre Çözeltisi (%1): 1 g üre bir miktar arık suda çözülerek 100 mL’ye tamamlanır.
Üre Kristalleri: Orijinal ambalajından alınır.
Alanin (%1): 1 g alanin 50-60 mL saf suda çözülerek 100 mL'ye tamamlanır.
Glutamik asit (%1): 1 g glutamik asit 50-60 mL saf suda çözülerek 100 mL'ye tamamlanır.
Deneyin Yapılışı
Aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi örneklere biüret ayıracı ilave edildikten sonra karıştırılır,
oluşan renk kaydedilir. Ayrıca bir deney tüpüne bir miktar üre kristali konur. Daha sonra bek
alevinde amonyak kokusu çıkıncaya kadar ısıtılır. Üre kristalleri ısının etkisiyle sıvı hale
dönüşürken amonyak çıkışı olur ve biüret meydana gelir. Soğutulan tüpün üzerine 4 mL biüret
çözeltisi ilave edilir, karıştırıldıktan sonra oluşan renk kaydedilir.
Tüp No
1
Örnekler
1 mL %1’lik üre çözeltisi
Renk reaktifi
4 mL Biüret çözeltisi
Renk
P RO TE İN L ER
51
2
1 mL süt
3
1 mL serum
4
1 mL %1’lik yumurta akı çözeltisi
5
1 mL alanin
6
1 mL glutamik asit
7
1 mL su
8
Biüret kristalleri
Yorum
Biüret deneyinde su kontrol amaçlı kullanılmıştır. Biüret tepkimesi peptit bağına özgün bir
tepkime olduğundan süt, serum, %1’lik yumurta akı gibi protein içeren yapılarda pembemsi mor
renk oluşurken; alanin, glutamik asit ve %1’lik üre çözeltisinde bu renk gözlenmemiştir. Üre
kristalleri ısıtıldığında iki üre molekülü arasında bir peptit bağı oluşarak biüret isimli madde (Şekil
3) teşekkül etmiş ve pembe mor renk oluşmuştur.
Isı
Üre
Üre
Biüre
Amonyak
Şekil 3. İki mol ürenin ısıtılmasıyla oluşan biüre molekülü.
B- Denatürasyon
Proteinlerin denatürasyonu, 3 boyutlu yapının bozulması ile meydana gelir. Denatüre olmuş
proteinin birincil yapısını oluşturan peptit bağları korunurken, ikincil, üçüncül ve dördüncül
yapısını belirleyen bağlar kırılır.
Prensip: Hidrojen bağları, polar-apolar etkileşimler, sülfidril köprüleri gibi bağlarını
kaybetmesi ile özgün yapılarını yitirmeleri proteinlerin denatürasyonu olarak bilinir ve çok sayıda
farklı kimyasal ve fiziksel ajanlar tarafından gerçekleştirilebilir. Bunlardan bazılar aşağıdaki tabloda
gösterilmiştir.
- Yüksek sıcaklık,
- Ağır metal iyonları,
- Organik çözücüler,
- Basınç,
- Mekanik karıştırma,
- UV, radyasyon,
- Kuvvetli asit veya bazlar,
- Yüksek tuz konsantrasyonları,
- Deterjanlar,
- Üre, guanidin,
P RO TE İN L ER
52
Yukarıda bahsedilen fiziksel ve kimyasal ajanlar proteinleri özelliklerine ve etki sürelerine
göre çeşitli derecelerde denatüre ederler. Denatürasyonun derecesini ölçmek için kullanılan
deneysel kriterler:
-Çözünürlüğün azalması,
-Peptid zincirindeki yan grupların reaktivitelerinin azalması,
-Biyolojik aktivitenin kaybı,
-Viskozite ve sedimantasyon kat sayılarının farklılaşmasına yol açan şekil ve
boyut değişimleri,
-Absorbsiyon ve floresan spektrumundaki değişimler olarak özetlenebilir.
Ayıraçlar
Trikloro asetik asit, TCA (%20): 20 g trikloroasetik asit bir miktar arık suda çözülerek
100 mL’ye tamamlanır.
Sodyum hidroksit, NaOH (%40) : 40 g sodyum hidroksit bir miktar arık suda çözülerek
100 mL’ye tamamlanır.
Sıcaklık: 6-7mL yumurta akı solüsyonu bir deney tüpüne konarak kaynatılır, değişiklikler
gözlenir, sonra üzerine biüret ayıracı konularak oluşan renk kaydedilir.
Baz: Bir deney tüpüne 3-4 mL süt konulur. Üzerine 1-2 mL %40' lık sodyum hidroksit (tüp
eğilerek yavaş yavaş) ilave edilir. Oluşan değişiklikler gözlenir, sonra biüret ayıracı eklenerek renk
kaydedilir.
Asit: Bir deney tüpüne 3-4 mL süt konulup üzerine 1-2 mL %20 TCA(tüp eğilerek yavaş
yavaş) ilave edilir, değişiklik izlenir, sonra ortamı alkali yapmak için % 40' lık NaOH'den 1 mL
eklenerek karıştırılır, biüret ayıracı eklenerek oluşan renk kaydedilir.
Sıcaklık
Isıtıldıktan
sonraki
gözlenen
değişiklikler
Biüret
tepkimesi
sonrası renk
değişikliği
Baz
Bazik işlem
sonrası
gözlenen
değişiklikler
Biüret
tepkimesi
sonrası renk
değişikliği
Asit*
Asidik işlem
sonrası
gözlenen
değişiklikler
Biüret
tepkimesi
sonrası renk
değişikliği
Yumurta akı
Süt
Serum
*Ortam alkali yapıldıktan sonra biüret eklenir.
C- Diyaliz
Proteinlerin en karakteristik özelliklerinden biri büyük çaplı olmalarıdır. Bu özelliklerinden
yararlanılarak küçük moleküllerden ayrıştırılmaları için basit yöntemler geliştirilmiştir. Bu
yöntemlerden biri de diyalizdir.
P RO TE İN L ER
53
Prensip: Proteinlerin yarı geçirgen bir zar kullanılarak düşük moleküler ağırlığına sahip olan
iyonlardan ve moleküllerden ayrıştırılmasına diyaliz denir.
Diyalizdeki yarı geçirgen zar protein molekülünü tutar; küçük ebatlı çözünen moleküllerin
ve elektrolitlerin (Na+, K+, Cl- gibi) zardan dışarı çıkmasına, bunların yerine suyun içeriye
girmesine izin verir (Şekil 4). Bu şekilde uzaklaştırılması istenen glukoz ya da amonyum sülfat gibi
küçük moleküllerin derişimi yok denecek bir miktara düşürülebilir. İşlem sırasında zarın içine
giren su daha sonra uzaklaştırılarak iyonlardan ve küçük moleküllerden arındırılmış protein elde
edilir.
Şekil 4. Diyaliz olayının şematik olarak gösterimi
Ayıraçlar
Baryum Klorür, BaCl2 (%1) : 1 g baryum klorür suda çözülerek 100 mL’ye tamamlanır.
Gümüş Nitrat, AgNO3 (%1) : 1 g gümüş nitrat suda çözülerek 100 mL’ye tamamlanır.
Bir tüpe 0,5 mL serum, 2 mL arık su ve 7,5 mL sodyum sülfat konur ve karıştırılır. Bu
karışım, bir ucu daha önce iple bağlanmış olan yarı geçirgen zarın (bağırsağın) içine konur ve
bağırsağın açık olan ucu yeniden bir iple bağlanır. İçinde arık su bulunan bir behere konur ve 15
dakika zaman zaman yavaşça karıştırılarak bekletilir. Sonra bu beherdeki sudan üç ayrı örnek farklı
tüplere alınarak birine %1’lik BaCl2, diğerine %1’lik AgNO3 çözeltisinden 3-5 damla damlatılır.
Beyaz çökelti görülürse, beherdeki su dökülür, yeniden saf su ile doldurulur ve bağırsak içine
konur. Üçüncü tüpe 4 mL biüret ayıracı eklenerek renk değişimi gözlenir. Aynı işlemler 15 dakika
sonra tekrarlanır. Beherdeki suyun kontrollerine beyaz çökelek vermeyinceye kadar devam edilir.
Beherdeki suyu değiştirdikçe bağırsak içindeki iyonlar biter, bu arada su da bağırsak içine girer ve
diyaliz tamamlanır.
Yorum
P RO TE İN L ER
54
%1’lik BaCl2 damlatılan tüpte, zardan dışarı çıkan SO4-2 anyonları varsa baryum sülfat
oluşur, beyaz çökelek meydana gelir. Baryum sülfatın çözünürlüğü az olduğu için tüpün dibinde
çökelir.
%1’lik AgNO3 damlatılan tüpte zardan dışarı çıkan Cl- anyonları varsa gümüş klorür oluşur,
beyaz çökelek meydana gelir.
Sülfat iyonları sodyum sülfat, klorür iyonları ise deneyimizde serum kaynaklıdır.
D- İzoelektrik Nokta
Teorik açıdan bir proteinin bütün çözülebilir gruplarının (örneğin: karboksil, amino,
imidazol, guanidiniyum vb. gibi) yüklerinin toplamının yani proteinin net yükünün sıfıra eşit
olduğu pH izoelektrik noktadır.
İzoelektrik nokta, bir elektrik alanında proteinlerin ne anoda ne de katoda göç ettikleri pH
değeri olarak tanımlanır. İzoelektrik noktanın diğer bir tanımı da, proteinlerin en az çözündükleri
nokta olarak yapılabilir. Aşağıda yapılacak olan deney bu prensip üzerine kurulmuştur.
Ayıraçlar
Sodyum asetat (0,1M): 13,6 g sodyum asetat bir miktar arık suda eritilerek 1 L’ye
tamamlanır.
Asetik Asit (0,1M): 6 mL glasiyel asetik asit 1L’ye arık su ile tamamlanır.
Asetik Asit (0,01M): 100 mL 0,1M asetik asit 1L’ye arık su ile tamamlanır.
Serum (%5): Çeşitli serumlardan bir serum gölcüğü hazırlanır. Balon jojeye serum
gölcüğünden 5 mL konup 100 mL’ye arık su ile tamamlanır.
Etanol (Etil alkol 95o)
Deneyin Yapılışı : Deney tüpleri tabloda görüldüğü gibi hazırlanır:
Çözeltiler (mL)
01 M Sodyum asetat
0,1 M Asetik asit (0,1 M)
0,01 M Asetik asit
1. Tüp
2. Tüp
3. Tüp
4. Tüp
5. Tüp
6. Tüp
7. Tüp
8. Tüp
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
4,0
2,0
1,0
-
-
-
-
-
-
-
-
5,0
2,5
1,25
0,6
0,3
Su
2,0
4,0
5,0
1,0
3,5
4,75
5,4
5,7
PH
4,1
4,4
4,7
5,1
5,4
5,7
6,0
6,3
Tüpler yukarıdaki gibi hazırlandıktan sonra baş aşağı çevrilerek iyice karıştırılır ve deneysel
pH kaydedilir. Daha sonra her bir tüpe birer mL sulandırılmış serum (% 5) ilave edilerek tüm
tüpler yeniden iyice karıştırılır ve bulanıklık kaydedilir. Kaydetme işleminden sonra her tüpe 5 mL
etanol ilave edilerek çalkalanır. Tüplerin bulanıklıklarındaki değişim gözlenerek kaydedilmek üzere
bir köşeye bırakılır. Proteinlerin en fazla çökeldikleri tüp saptanır ve o tüpün pH’sı izoelektrik
nokta olarak kaydedilir.
Yorum
P RO TE İN L ER
55
Proteinlerin en az çözündükleri, en fazla çöktükleri nokta izoelektrik nokta olduğu için bu
niteliği taşıyan tüpün pH’sı izoelektrik nokta olarak kabul edilir. Karışım halinde bulunan
proteinlerin her birinin izoelektrik noktası farklı olduğundan elektrik alanda izoelektrik fokuslama
ile proteinleri birbirinden ayırma ve karakterize etme imkanı bulunmaktadır.
İnsan Serum ve Plazma Proteinleri
Kan plazmada asılı halde bulunan şekilli elemanlar olan eritrositler ve lökositler ile
trombositlerden oluşur. Kan pıhtılaştıktan sonra kalan sıvıya serum denir. Serum, plazmada
normalde bulunan fakat pıhtılaşma sonucu tüketilen pıhtılaşma faktörlerini içermezken (fibrinojen
dahil) bazı pıhtılaşma faktörlerinin yıkım ürünlerini ihtiva eder.
İnsan serumu, çok çeşitli fonksiyonları olan 100’den fazla protein içermektedir. Bu
proteinler arasında taşıyıcı olarak görev yapanlar, antikorlar, enzim inhibitörleri ve pıhtılaşma
faktörleri bulunur. Plazma, yaklaşık 0,3 g/dL kadar fibrinojen içerir. Bu protein serumda
bulunmaz. Total serum protein derişimleri ve her bir fraksiyonun miktarı, çeşitli hastalıklar
sırasında değişime uğrar. Bu nedenle serum total proteini ve diğer protein fraksiyonlarının klinik
tanıda önemi fazladır.
E- Serum Proteinlerinin Tuzla Ayrıştırılması (Salting-Out)
Proteinlerin denatüre olmadan beraberce bulunduğu bileşiklerden (genelde biyolojik sıvı ve
doku) ayrıştırılması işlemine tuzla ayrıştırma denir. Genel olarak bu işlem doymuş tuz eriyikleri ile
yapıldığından bu ad verilmiştir.
Bu metot enzimlerin saflaştırılmasında ve klinik biyokimyada kan proteinlerinin
ölçülmesinde kullanılır. Serum proteinlerinin alkali ortamda bakır sülfat ile menekşe renk vermesi
esasına dayanan biüret tepkimesi sonucu kan serumundaki total protein içeriği niceliksel olarak
analiz edilir. Serum globülinleri ise %23’lük sodyum sülfat ile çökeltilince eriyikte kalan albumin
biüret tepkimesine tabi tutulacaktır. Serumdaki total protein ile albumin miktarlarının farkı da
globülin miktarını verecektir.
Prensip: Serumdaki proteinlerden albumin doymuş amonyum sülfat kullanılarak tamamen
çöktürülebilir. Kalan proteinler globülinler olarak tanımlanır. Ayrıca serum %23’lük sodyum sülfat
solüsyonu ile çöktürülürse ortamda çözünür olarak yalnızca albumin fraksiyonu kalır.
Ayıraçlar
1- Sodyum Sülfat (%23): 230 g sodyum sülfat (anhidrit) 600 mL kadar sıcak su ile çözülür,
ılık arık su ile 1L’ye tamamlanır ve 37 0C’de saklanır.
2- Dietil eter,
3- Biüret solüsyonu,
4- Serum
5- Serum (1/20 seyreltilmiş): 0,5 mL serum üzerine 9,5 mL. arık su ilave edilerek
karıştırılır.
Serum total protein ve albumin miktarının biüret yöntemi ile tayini
Bir santrifüj tüpüne 0,5 mL serum konur. Üzerine 7,5 mL %23’lük sodyum sülfat ilave
edilerek iyice çalkalanır. 3 mL dietil eter eklenen tüpün ağzı kapak ile kapatılıp, tekrar şiddetle
çalkalanır, 10 dakika santrifüj edilir. Eter tabakasının altında kalan berrak kısımda albumin
bulunur. Bu berrak kısım ile eter tabakasının arasında yüzer şekilde çöktürülmüş beyaz globulin
halkası göze çarpar. Böylece sodyum sülfat kullanılarak serumdaki globulinler ayrıştırılmış olur.
P RO TE İN L ER
56
Bir pipetin ucu eter tabakasından dikkatlice geçirilir, beyaz globulin tabakasını mümkün
olduğunca parçalamadan ve alttaki berrak sıvıyı bulandırmadan yeterince sıvı pipete çekilir. Bu
fraksiyon albumin miktar tayini için aşağıda verilen basamaklarda kullanılır.
Üç adet deney tüpü alınır ve aşağıdaki şekilde hazırlanır.
Çözelti (Ml)
Arık su
Albumin fraksiyonu
Serum (1/20)
Biüret
Kör
1
4
Albumin
1
4
Total Protein
1
4
Tüpler karıştırılarak 15 dakika bekletilir. 540 nm’de köre karşı spektrofotometrede okunur.
Absorbanslar standart eğriden değerlendirilerek albumin ve total protein derişimleri elde edilir.
Serum albumin değerini bulmak için elde edilen değer 0,8 (seyreltme faktörü nedeniyle) ile
çarpılır.
Serum total protein (g/L)=Albumin (g/L)+Globulin (g/L) formülünde yerine konarak
serum globulin derişimi elde edilir.
Serum proteinlerinin normal değerleri:
Total Protein
Albumin (A)
Globulin (G)
A/G
= 6-8 g/dL
= 3,5-5,6 g/dL
= 1,2-3,2 g/dL
= 1,6
Yorum
Serum albumini; albumin sentezinde azalma olduğu zaman (malnütrisyon, malabsorbsiyon,
karaciğer sirozu, cerrahi müdahaleler, enfeksiyonlar, kanser, analbuminemi, bisalbuminemi) veya
aşırı albumin kaybı olduğunda (nefrotik sendrom, yanıklar, vb.) azalır. Serum globulininin arttığı
durumlar arasında: dehidrasyon, malnütrisyon enflamasyon, karsinomalar, myeloma, sarkoidozis
ya da kollajen hastalıklar, karaciğer sirozu gibi nedenler sayılabilir.
Serum proteinleri elektroforezle ayrıştırılıp daha geniş bilgi elde edilebilir. Bu durumda
globulinler dört farklı fraksiyona ayrılır ve serum proteinleri sırayla; albumin, 1, 2, , 
globulinler şeklinde 5 bant halinde görülür. Globulin fraksiyonu, heterojen bir gruptur. Daha
ayrıntılı bir teknik ile ayrıştırıldığında ise bunların da alt gruplardan oluştuğu görülür. Bu
subgrubların da her birinde çok farklı proteinler bulunmaktadır.
Sorular
1- Proteinler yapılarına göre kaç basamakta incelenir? Kısaca anlatınız.
2- Peptit bağı nasıl oluşur çizerek gösteriniz?
3- Biüret deneyinin prensibi nedir?
4- Üre kristalleri biüret ile tepkime verirken ; % 1’lik üre çözeltisi neden biüret ile tepkime
vermez?
5- Denatürasyon nedir? Proteinlerin hangi yapıları bozulmaz açıklayınız.
P RO TE İN L ER
6- Denatürasyona neden olan ajanlar nelerdir?
7- İzoelektrik noktanın deneysel ve teorik tanımını yapınız?
8- İzoelektrik nokta deneyini hangi prensibe göre yaptınız?
9- Diyalizin amacı nedir?
10- Diyalizin tamamlanıp tamamlanmadığı hangi çözeltilerle kontrol edilir? Neden?
11- Diyalizin amacı nedir?
12- Serum total protein miktarı hangi fraksiyonların toplamına eşittir?
13- Serum ve plazma arasındaki farklar nelerdir? Tanımlayınız.
14- Serum albumin, serum globulinlerini çöktürmek için hangi solüsyonlar kullanılır?
57
58
K AĞ IT K ROM AT OG R AFİ S İ
Laboratuvar
Kağıt Kromatografisi
6
GENEL BİLGİ
Kromatografi; bir karışımdaki, kimyasal yapıları çok az farklılık gösteren maddeleri,
birbirinden ayrıştırmak veya saflaştırmak amacıyla kullanılan yöntemlerden birisidir. Yöntemi ilk
kez geliştiren Rus botanikçi Mikhail Tsweet, bitki pigmentini kalsiyum karbonat (tebeşir)
kolonundan geçirerek çeşitli renk bantları elde etmiş ve 1906'da yayınladığı makalesinde bu
ayrışmanın kimyasalların adsorbsiyonuna bağlı olduğunu belirtmiştir. Beyaz tebeşir kolonda renkli
bantların görülmesi üzerine chroma=renk ve graphe=yazı anlamında kromatografi terimini
kullanmıştır. 1941 yılında Martin ve Synge partisyon (partition) kromatografiyi geliştirerek suyla
kaplı silika jel kolonunda monoamino monokarboksilik asitleri ayrıştırmayı başarmışlardır. Silika
jelin istenilen performansı göstermemesi üzerine, bunun yerine kağıt kullanmışlar ve kağıt
kromatografisini oluşturmuşlardır.
Kromatografik sistemde, durgun ve hareketli faz olmak üzere iki faz bulunur. Durgun faz
(katı veya sıvı) sabit, hareketli faz (sıvı veya gaz) ise akışkan haldedir. Ayrıştırılmak istenen
moleküller durgun ve hareketli fazlar arasında dağılıp bir dengeye ulaşırlar. Hareketli faz içinde
daha iyi çözünen ve durgun faza daha az ilgi gösteren bir molekül; hareketli fazda daha az
çözünen ve durgun faza daha fazla ilgi gösteren bir başka moleküle oranla daha hızlı hareket
edecek ve bu iki molekül birbirlerinden farklı alanlara göç ederek ayrışmış olacaktır. Eğer bu
moleküller renkli maddeler ise doğrudan görüldükleri halde, renksiz maddeler ikinci bir boyama
işlemini takiben görülebilirler.
Değişik çalışma prensipleri içeren kromatografik yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemleri
mekanizmalarına göre sınıflamak mümkünse de, aynı kromatografik sistem içinde birden fazla
mekanizmadan yararlanmak da mümkündür. Başlıca kromatografi yöntemleri aşağıda
özetlenmiştir.
Adsorbsiyon: Durgun fazı oluşturan destek madde ile molekül arasındaki elektrostatik
etkileşim, hidrojen bağları veya destek madde içinde molekülün dağılması gibi özellikler
adsorpsiyon kromatografisinin temelini oluşturur. Moleküllerin hareket hızları, hareketli faz içinde
çözülme oranlarına ve durgun faza olan ilgi derecelerine bağlı olarak değişkenlik gösterir ve
kimyasal olarak farklı özellik içeren moleküller birbirlerinden farklı alanlara göç ederler. Durgun
ve hareketli fazı oluşturan maddeler ayrıştırılmak istenen moleküllerin özelliklerine göre seçilir.
Örneğin sıvı kromatografide genellikle üç tip adsorban madde kullanılır: non-polar, asit-polar ve
bazik-polar.
Partisyon (partition): Moleküllerin durgun ve hareketli fazlarda çözünme oranlarına bağlı
olarak ayrıştırılmaları esasına dayanır. Normal faz partisyon kromatografide durgun fazda polar
bir madde, hareketli fazda ise non-polar bir madde kullanılır. Genellikle adsorpsiyon ve partisyon
mekanizmaları iç içe geçmiştir ve ayrıştırma işlemlerinde her iki mekanizma da rol oynamaktadır.
59
İyon Değiştirici Kromatografi: Bu tip kromatografide moleküllerin iyonik yüklerinin
yönü ve kuvveti ayrışmanın temelini oluşturur. İnorganik iyonlar, amino asitler, nükleik asitler ve
proteinler bu tip ayrıştırma için ideal moleküllerdir. Katyonları ayrıştırmak için negatif yüklü
gruplardan oluşan katyon-değiştirici reçineler (sülfonat veya karboksilat iyonları gibi); anyonları
ayrıştırmak için ise pozitif yüklü gruplardan oluşan anyon-değiştirici reçineler (trietilaminoetil) kullanılır.
Karışım halindeki numune kolona uygulandıktan sonra hareketli fazın pH'sı veya iyonik gücü
değiştirilerek istenen özellikteki moleküllerin akışkanlığı sağlanır (şekil 1). Numune içindeki diğer
madde ise kolonda kalır. pH veya iyonik gücü biraz daha değiştirilerek ikinci fraksiyonun da
kolondan alınması mümkündür.
Şekil 1. Kolon kromatografisi ile bir numunenin (A+B) ayrıştırılması.
Affinite Kromatografi: Ayrıştırılmak istenen molekülün biyokimyasal özelliğine göre,
durgun fazda onu bağlayabilecek özel yapıların kullanılması prensibine dayanır. En sık olarak
enzim-substrat, hormon-reseptör veya antijen-antikor etkileşimleri kullanılır.
Moleküler Eleme: Her ne kadar şekil ve hidrasyon durumları etken olsa da, temel olarak
molekülleri büyüklüklerine göre ayrışmasını sağlayan bir kromatografi türüdür.
Kağıt Kromatografisi
Kağıt kromatografisi adsorpsiyon ve partisyon prensiplerinin bir arada kullanılması ile
oluşturulmuş bir yöntemdir. Durgun ve hareketli fazların her ikisi de sıvıdır. Durgun fazı kağıtta
bulunan selüloz lifleri arasına emilmiş olan atmosferdeki su buharı; hareketli fazı ise suda
çözünmeyen (non-aquous) bir sıvı oluşturur. Kapiller boru etkisi ile durgun faz üzerinde hareket
eden sıvı, kağıt üzerinde herhangi bir moleküle rastlayınca çözerek, onu da beraberinde
sürüklemekte ve iki faz arasında dağıtmaktadır. Moleküller, hareketli faz içerisinde ne kadar çok
çözünür ve durgun faz ile ne kadar az etkileşime girer ise, o kadar hızlı hareket edecektir.
Kromatografide hareketli fazı oluşturan sıvı yukarı doğru ilerliyorsa buna asendan (çıkıcı), aşağı
doğru ilerliyorsa buna da desendan (inici) adı verilir. Asendan kromatografide kapiller boru
etkisinden, desendan da ise yer çekimi etkisinden yararlanılır (şekil 2).
Asendan kromatografi prensibine göre numuneler kağıda uygulandıktan sonra (şekil 3) kağıt
rulo haline getirilerek (iplikle tutturularak) hareketli fazın bulunduğu kaba yerleştirilir. Belli bir
süre sonunda kağıt çıkarılarak çözücünün kat ettiği mesafe (y) ölçülür. Boyama işleminden sonra
numunenin kat ettiği mesafe (x) ölçülür. Elde edilen x ve y ölçümleri aşağıda verilen eşitlikte
yerlerine konarak Rf (Relative to front ) değeri hesaplanır.
Rf 
x
y
60
a.
b.
Şekil 2. Asendan (a) ve desendan (b) kağıt kromatografisi düzenekleri
UYGULAMA
Gereçler
Kromatografi tankı: 1000 mL'lik beher
Durgun faz: Whatman No.1 filtre kağıdı
Ambalaj kağıdı: Çalışma esnasında Whatman kağıdını korumak amacıyla
Pipet: Numuneleri uygulamak için
Amino asit kromatografisi
Ayıraçlar
%2'lik Ninhidrin: Aminoasitleri boyamak için kullanılır. 2 gram ninhidrin bir miktar
aseton içinde çözülerek 1 litreye aseton ile tamamlanır. Kahverengi bir şişede ağzı sıkıca
kapatılarak saklanır.
n-butanol:asetik asit:su (12:3:5): 120 mL n-butanol, 30 mL glasiyel asetik asit ve 50 mL
arık su karıştırılarak hazırlanır. Amino asitlerin çözücüsü olarak kullanılır.
%75’lik etil alkol: 375 mL %95’lik etil alkol 100 ml arık su ile karıştırılarak hazırlanır.
Amino asitlerin standartlarının hazırlanmasında kullanılır.
%0,3’lük amino asit standartları: 150’şer mg L-alanin, L-glutamik asit, L-prolin, Ltreonin ve L-sistein minimum miktarda %75’lik etil alkol içinde çözülür; gerekirse bir kaç damla
derişik HCl ilave edilir. Daha sonra 50 mL’ye %75 etil alkol ile tamamlanır.
61
Yöntem
Whatman No.1 filtre kağıdı alınarak temiz ambalaj kağıdı üzerine konur. Ambalaj kağıdının
kullanım amacı sadece Whatman kağıdının laboratuvar masası ile temasını engellemek ve el
temasını en aza indirmektir. Yapılan deneyle hiçbir ilgisi yoktur. Kağıdın alt kısmından 2 cm.
ölçülerek kurşun kalem ile bir çizgi çizilir. Çözücü ile temas ettiğinde dağılma olabileceğinden
kesinlikle tükenmez veya dolma kalem kullanılmaz. Daha sonra bu çizgi üzerinde aralarında en az
2 cm kalacak şekilde beş nokta tespit edilerek bu noktaların etrafına 0,5 cm çapında daireler çizilir
(şekil 3). Alanin için A, prolin için P, treonin için T, glutamik asit için G ve sistein için S yazılır.
Şekil 3. Amino asit kromatografisi
DİKKAT: Tüm işlemler sırasında Whatman kağıdına mümkün olduğu kadar
dokunulmaması gerekmektedir. Hafif nemli bir parmak dahi, kağıt ninhidrin ile muamele
edildiğinde parlak menekşe-mor bir renk verir. El terinde bulunan çok düşük derişimlerdeki
aminoasitler dahi ninhidrin ile tepkime verirler.
Numune uygulaması (aplikasyon) pastör pipeti veya mikropipet ile yapılır. Bir damla çözelti,
kağıtta daha önceden kendisi için işaretlenmiş alana taşırmadan damlatılır, uygulanan miktarın
iyice kuruduğundan emin olduktan sonra ikinci uygulama yapılır. Örnek aplikasyonu sırasında
kağıdın alttan havalanabilmesi için alt ucuna kalem veya pipet konarak hafifçe havada tutulur. Bu
uygulama işlemini 5 kez tekrar edilir. İşlemin tekrarlanma amacı uygulanan örneğin yoğunluğunu
veya miktarını arttırmaktır. Birinci uygulama kurumadan ikincisine geçilmez. Uygulama sırasında
0,5 cm’lik çap aşılmamalıdır. Bu çap aşıldığı taktirde yaygın leke elde edilir. Numunelerin
uygulama işlemi bittikten sonra yine iyice kurumaları beklenir. Kuruduktan sonra kağıdın
enlemesine olarak karşılıklı uçları bir araya getirilerek silindir bir boru şekli verilir ve bu uçlar iğne
62
iplik ile tutturulur. Daha önceden hazırlanmış, içinde 1,5 cm yükseklikte n-butanol-asetik asit-su
(aminoasit çözücüsü) bulunan behere yerleştirilir.
Çözücü kağıdın 4/5’ine ulaşıncaya kadar beklenir (~2-3 saat), kağıt beherden çıkarılarak
açılır. Çözücünün kağıt üzerinde ulaştığı en son nokta kurşun kalemle çizilir. Bu noktadan, ilk
uygulama noktasına olan uzaklık her bir madde için ölçülerek deftere kaydedilir. Kağıt tam
kurutulmadan önce üzerine ninhidrin uygulaması yapılarak boyama işlemi gerçekleştirilir. Kağıt
kuruduktan sonra pembe-mor lekelerin oluştuğu gözlenir. Ninhidrin ile amino asitlerin renk
tepkimesi şekil 4’de gösterilmiştir. Lekelerin çevresi kurşun kalemle çizilir ve bu dairelerin tam
orta noktası işaretlenir. Orta noktadan ilk uygulama noktasına olan uzaklık her bir madde için
ölçülerek deftere kaydedilir. Çözücü ve numunenin kat ettiği mesafeler kullanılarak her bir madde
için Rf değerleri hesaplanır.
Şekil 4. Ninhidrin tepkimesi
Keto asit kromatografisi
Ayıraçlar
2,4 dinitrofenil hidrazin: 1 N HCl içinde 19,8 mg madde çözülerek yine 1 N HCl ile 100
mL’ye tamamlanır. Keto asitleri boyamak için kullanılır.
n-butanol:amonyak:su: 3 mL amonyum hidroksit (NH4OH) 100 mL’ye arık su ile
tamamlanarak hazırlanır. Daha sonra hazırlanan bu çözelti bir erlen içinde 100 mL n-butanol ile
şiddetli bir şekilde karıştırılır. Doymuş hale getirilir ve daha sonra üstteki faz alınarak saklanır.
Keto asitler için çözücü olarak kullanılır.
Derişik HCl ve etil asetat: Keto asitlerin standartlarının hazırlanmasında kullanılır.
%0,3’lük keto asit standartları: 150 şer mg sitrik asit, oksalik asit, 2,4-dinitrofenil
hidrazin, Na-pirüvik asit ve α-ketoglutarik asit, sitrik asit haricinde, minimum miktarda %75’lik
etil alkol içinde çözülür; gerekirse bir kaç damla derişik HCl ilave edilir. Daha sonra 50 mL’ye
%75 etil alkol ile tamamlanır. Sitrik asit ise etil asetat içinde çözülerek 50 mL’ye tamamlanır.
Keto asit numunelerinin her biri kendisi için işaretlenen alana uyguladıktan sonra kurutulur
(şekil 5). Aynı noktalara boyama amacıyla 2,4-dinitrofenil hidrazin (2,4 DNFH) uygulaması yapılır.
Her keto asit ve 2,4-DNFH uygulamasından sonra kuruması beklenir. Numune uygulama ve
takibinde boyama 5 kez tekrarlanır. Böylece keto asitlerin her biri hidrazon meydana getirmiş
olacaktır. Bu şekilde keto asitlerin boyanması işlemi uygulama evresinde yapılmış olur.
Kromatografi kağıdı rulo haline getirilerek iğne iplik ile tutturulur. İçerisinde 1,5 cm yüksekliğinde
63
keto asit çözeltisi bulunan behere yerleştirilir. Ortalama 2-3 saat sonra kağıt beherden alınarak
çözücünün çıktığı mesafe işaretlenip tamamen kuruması sağlanır. Numunenin ulaştığı noktalar
ölçülerek Rf değeri hesaplanır.
Şekil 5. Keto asit kromatografisi
Değerlendirme ve Yorum
Deneyimizi yaparken hangi alana hangi amino asiti hangi derişiminde uyguladığımızı
önceden biliyoruz. İçinde hangi amino asitin bulunduğunu bilmediğimiz numuneyi ise anlamanın
iki yolu vardır. Birincisi, bizim de deneyimizde yaptığımız gibi Rf değerini hesaplarız. Her bir
amino asit için bu değerler önceden hesaplanmış olduğu için tabloya bakarak bulduğumuz değerin
hangi amino asite ait olduğunu anlayabiliriz. Pratikte daha çok uygulanan ikinci bir yol ise,
standart kullanmaktır. Uygulayacağımız, içinde bilinmeyen madde bulunan numunenin yanı sıra
bir de kendi hazırladığımız içinde belli derişimlerde madde bulunan standartları aplike ederiz.
Aynı hizada aynı mesafeyi kat eden madde bizim aradığımız maddedir. Standardı değişik
derişimlerde hazırlayarak semikantitatif olarak miktar hesaplaması dahi yapılabilir.
Tıpta Kullanım Alanları
Numune olarak serum, plazma, idrar veya diğer vücut sıvıları kullanılabilir. Özellikle yeni
doğan aminoasit metabolizma hastalıklarının tanısında kullanılabilir. Günümüzde çok daha etkin
kromatografik yöntemler geliştirilmiş olsa da basit, ucuz ve özel cihaz gerektirmeyen bir yöntem
olması kağıt kromatografisinin güncel kalmasını sağlamaktadır.
E NZİM
64
Laboratuvar
7
Enzim
GENEL BİLGİ
Enzimler biyolojik katalizörlerdir. Biyolojik kökenli bu maddeler kimyasal tepkimeleri
hızlandırırlar. Bütün hücrelerde bulunan ve varlıkları genetik olarak belirlenen enzimler koordine
birçok tepkimenin (metabolik tepkimeler) gerçekleşmesini sağlarlar. Metabolizmayı kontrol eden
çoğu mekanizma enzimlerin varlığında fonksiyon gösterir. Enzimlerin aktivitelerinin regülasyonu
metabolizmanın değişken şartlara uyum sağlamasına olanak tanır. Yaklaşık bütün enzimler protein
yapısındadır. Ancak, katalitik aktivite gösteren bazı nükleik asitler de [özellikle fosfodiesteraz
bağlarının yıkımı ve sentezi sırasında] enzim gibi davranabilirler. Katalitik aktiviteye sahip nükleik
asitlere ribozim denir ve bunlarla protein katalizörlerden daha az karşılaşılır.
Bir enzimatik tepkimede tepkimeye giren maddeler “Substrat” (S) olarak isimlendirilir.
Tepkime sonucu ortaya çıkan ürünler ise “Product” (P) olarak isimlendirilir.
E+S  ES  E + P
Birçok enzim tek başına aktivitesini gösterirken birçoğu ise aktivite için protein yapısı
göstermeyen ufak nonprotein moleküllere ihtiyaç duyar. Kofaktör denilen bu moleküller basit
inorganik metal iyonlarıdır (Mg, Zn, Fe, Cu), ancak bazen bu moleküller kompleks organik
moleküller olabilir ki bu moleküllere Koenzim denir. Koenzimler kimyasal grup, özgün atom
veya elektronun transportunu yaparlar ve genellikle vitamin türevidirler (NAD, FAD, koenzimA).
Bazı enzimler her iki gruba birden bağımlılık gösterebilirler. Genelde kofaktörler enzimler
üzerindeki özgün bölgelere sıkıca bağlanırlar ve ısıya karşı ise dayanıklıdırlar.
Protein+kofaktör
Holoenzim (Kompleks enzim)
Protein +
Apoenzim
Kofaktör
Holoenzim kofaktörü ile birlikte enzimi ifade eder. Apoenzim ise holoenzimin protein
kısmını ifade eder ve uygun kofaktör yoksa apoenzim biyolojik aktivite göstermez. Prostetik
grup ise enzimden ayrılamayan sıkıca bağlı bir koenzimdir. Kofaktör olarak metal iyonuna
gereksinim gösteren enzimlere ise metalloenzimler denir. Bu enzimler metal iyonu olmadan
aktivite göstermezler.
Enzimlerin İsimlendirilmesi
1- Önerilen ismidir. Kısa, basit ve günlük kullanım içindir. Tepkime substratına “az’’ eki
eklenerek (Örneğin üreaz, sükraz gibi) ya da yapılan işin tanımına “az’’ eki eklenerek ifade edilir
(Örneğin laktat dehidrogenaz (LDH) gibi). Pepsin, tripsin örneğinde olduğu gibi bazı enzimler ise
ilgili oldukları tepkime hakkında hiç bilgi vermezler. Bunlar ticari isimlerdir.
2- Sistematik isimlendirme: Enzimler başlıca tepkime özgüllüğüne göre altı sınıfa ayrılırlar.
E NZİM
65
- Oksidoredüktazlar: oksidasyon redüksiyon tepkimelerini katalizler.
LDH
Laktat  NAD   Pirüvat  NADH
- Transferazlar: Karbon, azot veya fosfat içeren grupların transferini katalizler.
Serin  THF
Serinhidroksim etiltransferaz

Glisin  THF  CH 2
- Hidrolazlar: Bağlara su sokarak yıkımı katalizlerler.
Üreaz
Üre  H 2 O  CO2  2NH 3
- Liyazlar: C-C, C-S ve bazı C-N bağlarının yıkımını katalizler.
Pirüvatdekarboksilaz
Pirüvat

Asetaldehit  CO2
- İzomerazlar: Optik veya geometrik izomerazların rasemizasyonunu katalizler.
MetilmalonilCoA 
MetilmalonilCoAMutaz

SüksinilCoA
- Ligazlar: Yüksek enerjili fosfatların hidrolizi ile birlikte yürüyen karbon ve oksijen, sülfür,
azot arasında bağ oluşumunu katalizler.
Pirüvat  CO2
Pirüvatkarboksilaz

Okzaloaset at
Bu sınıflandırmanın da alt grupları vardır.
Aktif bölge: Enzim moleküllerinde aktif bölge denilen özel bir cep ya da yuva bulunur.
Aktif bölge substrata komplemanter olan üç boyutlu bir yüzey yaratan amino asit yan zincirlerini
içerir ve substratı bağlayarak bir enzim-substrat kompleksi meydana getirir. Bu da sonradan enzim
ve ürüne parçalanan enzim-ürün kompleksine döner.
Katalitik etkinlik: Enzimle katalizlenen tepkimeler katalizlenmeyen tepkimelere göre 103
ile10 kere daha hızlı olarak çalışırlar. Tipik olarak her enzim molekülü saniyede 100 ile 1000
substrat molekülünü ürüne çevirme yeteneğine sahiptir.
8
Turnover sayısı: Enzim başına düşen, ürüne çevrilmiş substrat molekülü sayısıdır.
Spesifite: Enzimler bir veya birkaç belirli substrat ile etkileşir ve sadece tek tip kimyasal
tepkimeyi katalizler.
Serbest Aktivasyon enerjisi: Bütün kimyasal tepkimelerde substrat ve ürünü ayıran bir
enerji bariyeri vardır. Serbest aktivasyon enerjisi denilen bu bariyer reaktanlar (S) ile ürün (P)
oluşumu sırasında meydana gelen yüksek enerjili ara ürün arasındaki enerji farkıdır. Serbest
aktivasyon enerjisi denilen bu enerji piki substratın ürüne dönüşümü sırasında yüksek enerjili bir
ara ürünün meydana geldiği geçiş durumunu gösterir. Yüksek aktivasyon enerjisi varsa tepkime
hızı yavaş olur. Moleküllerin tepkimeye girmeleri için geçiş durumunun enerji bariyerini aşmaya
66
E NZİM
yetecek kadar enerjiye sahip olmaları gerekir. Genel olarak serbest aktivasyon enerjisi ne kadar
düşük ise o kadar molekül geçiş durumunu aşmaya yeterli enerjiye sahiptir ve böylece tepkime hızı
o kadar fazladır.
Zimojen: İlk sentezlendiklerinde aktif olmayıp
aktif hale geçen enzimlerdir (ör: sindirim enzimleri).
İzoenzim: Aynı tepkimeyi katalizleyen fakat
yüzünden fiziksel özellikleri farklı olan enzimlerdir.
izoenzimleri bulunur.
Abzim: Katalitik antikorlardır. Belirli kimyasal
sanayisinde kullanılırlar.
fonksiyon görecekleri yere ulaştıklarında
aminoasit dizilerindeki genetik farklılık
Bir enzimin, değişik dokularda değişik
tepkimeleri katalizler. Sentetik olup ilaç
Enzim Aktivitesinin Kontrolü
Organizmanın, sayısız metabolik işlevini kontrol edebilmesi için enzimlerin tepkime
hızlarını düzenlemesi şarttır.
Allosterik Bağlanma Bölgeleri: Allosterik enzimler aktif bölgeleri dışında bir yere
nonkovalent olarak bağlanan efektör adlı moleküller tarafından düzenlenir. Bir allosterik efektör
enzimin substratına olan ilgisini değiştirebilir veya enzimin maksimal katalitik aktivitesini
değiştirebilir yada ikisini birden yapar. Enzim aktivitesini inhibe eden effektöre negatif effektör,
enzim aktivitesini arttıran effektöre pozitif effektör denir. Allosterik enzimler genellikle birden
fazla alt birime sahiptir ve sıklıkla metabolik yolun başlarındaki bir anahtar basamağı katalizler.
- Homotropik efektörler: Substrat kendisi bir efektör görevi yapıyorsa, bu etkiye
homotropik etki denir.
- Heterotropik efektör: Efektör substrattan farklı olabilir, bu durumda etkisinin
heterotropik olduğu söylenir. Örnek: Feedback inhibisyon.
Enzimlerin Kovalent Modifikasyonla Düzenlenmesi: Birçok enzim kovalent
modifikasyonla, sıklıkla enzimin serin, treonin veya tirozin kalıntılarına fosfat gruplarının
eklenmesi veya ayrılması ile düzenlenir. Protein fosforilasyonu hücresel işlevin kontrolünde belli
başlı bir yoldur. Fosforillenme ATP’yi fosfat vericisi olarak kullanan protein kinazlarca yapılır.
Protein fosfatazlar ise fosforillenmiş proteinlerden fosfat grubunu kopartır. Örneğin glikojen
fosforilaz enziminin aktivitesi fosforillenince artarken glikojen sentaz enziminin azalır.
Enzim Sentezinin İndüklenmesi ve Baskılanması: Hücreler genellikle varolan enzim
miktarını enzim sentez hızlarını değiştirerek de düzenleyebilir. Protein sentezindeki artış ya da
azalma var olan enzim moleküllerinin etkisinden çok aktif bölge sayısında değişikliğe neden olur.
E NZİM
67
Enzimatik Tepkime Hızını Etkileyin Faktörler
Bir tepkimenin hızı (V) birim zamanda ürüne çevrilen substrat molekülü sayısıdır ve
genelde standart şartlar altında dakikada oluşan mikromol ürün olarak ifade edilir. Maksimum hız
ise enzim aktivasyonunun maksimuma ulaştığı andaki hızdır. Vmax/2’ye karşılık gelen substrat
derişimine ise Km denir. Km fizyolojik koşullarda her enzime spesifiktir. Km artarsa enzimin
substrata olan ilgisi azalır, Km azalırsa ilgi artar.
Substrat derişimi: Enzim katalizli bir tepkimenin hızı maksimum bir hıza ulaşana kadar
substrat derişimi ile artar, tepkime hızının dengeye ulaşması enzimin bütün uygun bölgelerinin
substratla doyduğuna işaret eder (enzim sabit ise). Michaelis-Menten kinetiğine uyanlar hiperbolik,
allosterik enzimler ise sigmoidal eğri gösterirler.
Sıcaklık: Tepkime hızı bir tepe noktasına (Vmax) ulaşıncaya kadar ısının artması ile artar. Bu
artış enerji bariyerini geçip tepkime ürünlerini oluşturmaya yetecek enerjiye sahip olan molekül
sayısının artmasına bağlıdır. Isının daha da arttırılması sonucunda enzimin ısı ile denatürasyonuna
bağlı olarak tepkime hızında bir azalma meydana gelir. Enzimler optimum 37C de çalışır.
56C’nin üstünde denatürasyon başlar. 0C’de bekletme enzimi denatüre etmez sadece
tepkimenin hızını düşürür. Her 10C ısı artışı denatürasyon başlayıncaya kadar enzim aktivitesini
katlar. Taq polimeraz enzimi ısıya dayanıklı bir enzim olup in vitro şartlarda DNA’yı çoğaltırken
kullanılır. Isıtılıp soğutma ile yapısı bozulmaz Vücutta böyle bir enzim yoktur.
pH: Katalitik işlem için genellikle enzim ve substratın spesifik gruplarının tepkimeye
girebilmeleri için iyonize ve iyonize olmamış durumda bulunmaları gerekir. pH bunu etkiler.
68
E NZİM
pH’daki aşırılıklar bir protein olan enzimin denatüre olmasına yol açar. Enzimlerin maksimum
çalıştığı pH aralığı enzime göre değişir ve enzimin vücutta çalıştığı yerdeki hidrojen iyon
derişimini yansıtır. Genelde enzimler pH 6-8 arasında optimum olarak çalışırlar.
Enzim Derişimi: Yeterli substrat varsa enzim miktarı arttıkça hız da artar fakat substrat
miktarı sabit ise belli bir yere kadar artış görülür.
Aktivatörlerin Varlığı: Bazı enzimlerin çalışması için aktivatörlere gerek vardır. Bunlar
iyonik gücü etkileyerek tepkime hızını artırır fakat aktivatör olmasa da tepkime yürür (Cl iyonu
amilaz enzimi için aktivatördür).
Ortamdaki Su Varlığı: Canlı ortamdaki enzimatik tepkimeler su varlığında yürürler.
Tıpta Sık Kullanılan Enzimler
Plazma enzimleri iki gruptur:
- Plazmaya belirli organlar tarafından aktif olarak salgılanan küçük bir grup enzim
(Karaciğerden salınan pıhtılaşma faktörleri)
- Normal hücre turnoveri sırasında hücrelerden salgılanan enzimler. Normalde bu enzimler
intrasellüler olup plazmada fonksiyonları yoktur. Sağlıklı insanda plazma düzeyleri sabittir. Çünkü
eşit miktarda sentezlenip uzaklaştırılırlar. Plazmadaki bu enzimlerin düzeyindeki artış hücre
hasarına bağlı olarak ya da enzim sentezinin artmasına bağlı olarak veya atılımın artıp azalmasına
bağlı olarak değişir.
AST (aspartat aminotransferaz): Serum glutamat oksaloasetat transaminaz (SGOT)
enzimi de denilen bu enzim sitozol ve mitokondride bulunup transaminasyon tepkimelerini
katalizler. Yüksek miktarda kalp, karaciğer, iskelet kası, böbrek ve eritrositte bulunur. Miyokart
enfaktüsünde bu enzimin düzeyi göğüs ağrısından 6-8 saat sonra artmaya başlar. 24-48 saatte pik
yapar 4-6 gün sonra normale döner. Bu enzim kas hastalıklarında, enfeksiyöz hepatitte ve şiddetli
hemolitik anemi gibi çeşitli hastalıklarda artar.
ALT (alanin aminotransferaz): Serum glutamat pirüvat transaminaz (SGPT) enzimi de
denilen bu enzim sitozolik bir enzimdir. En yüksek oranda karaciğerde bulunur. Viral hepatit,
toksik karaciğer nekrozu gibi çeşitli hastalıklarda plazma düzeyi artar.
LDH (laktat dehidrogenaz): Çinko metalloenzimi olup tetramerik yapıda, M ve H
denilen iki alt birimi vardır. Bu subünitlere göre beş izoenzimi vardır. Myokart enfarktüsünde
göğüs ağrısından 12 saat sonra enzimin plazmadaki düzeyi artmaya başlar. 48 saatte pik yapıp 7-12
gün sonra normale döner. Megaloblastik anemiler, Karaciğer hastalıkları, Malin hastalıklar gibi
çeşitli hastalıklarda artış görülür.
E NZİM
69
ALP (alkalen fosfataz): Fosfat esterlerinin alkali şartlarda hidrolizini katalizler. İntestinal
epitel hücreleri, böbrek tübül hücreleri, kemik, K.C ve plasentada bulunur. Çocukluk, puberte ve
gebelikte fizyolojik bir artış görülürken kemik ve K.C hastalıklarında patolojik olarak artar.
CK (kreatin kinaz): M ve B denilen iki subüniti olup sitozolik bir enzimdir. Üç izoenzimi
vardır. CK-1 beyin, düz kas, GİS ve GÜS de bulunur. CK-2 myokartta, CK-3 ise çizgili ve kalp
kasında bulunur. Myokard enfaktüsünde göğüs ağrısından 4-6 saat sonra artmaya başlar, 24-48
saatte pik yapar, 3. Günden sonra normale döner. Kas hastalıkları, şok, hipotroidi, fiziksel işlevler,
alkolizim ve kafa travmalarında da artar.
UYGULAMA
Amilaz (Pityalin) Enzimi
Bu laboratuvarda, nişastanın amilaz enzimi (tükürükte bulunan amilaz enzimi eskiden
pityalin enzimi olarak adlandırılırdı) tarafından parçalanması olayı incelenecektir. Nişasta bilindiği
gibi bir polisakkarittir. (C6H10O6)n glikozidik zinciri şeklinde teşekkül eder. Hidroliz sonunda
sadece glukoz veren böyle bir bileşiğe glukozan denir. Doğal nişasta suda çözünmez ve iyot
çözeltisi ile mavi renk verir. Nişasta başlıca iki kısımdan meydana gelmiştir.
1- Amiloz: Dallanma göstermeyen düz bir zincir olup glukoz üniteleri birbirlerine α-1,4
glikozidik bağ ile bağlanmıştır. Nişastanın yaklaşık %15-20’sini meydana getirir.
2- Amilopektin: Dallı zincirlerden oluşmuş olup bünyesinde α-1,4 ve α-1,6 bağları
bulundurur. Bu kısım tüm molekülün %80-85’ini oluşturur.
Bu hidrolitik tepkimeyi katalize eden enzime amilaz denir. İki tür amilaz vardır: α-amilaz ve
β-amilaz. α-amilaz zincirin non redüktan ucundan başlayarak teker teker maltoz ünitelerini
zincirden ayırır. Ancak her ikisi de α-1,6 bağlarına etki edemez, dolayısıyla ortamda maltoz
ünitelerinin yanı sıra büyükçe dallı bir yapı; limit dekstran meydana gelir. β-amilaz insanda
bulunmaz. Sonuç olarak tükürükteki amilaz, nişastanın maltoz ve dekstrinlere hidrolize eder.
Bu deneyde, amilaz enziminin etkisinde bırakılan nişastanın tepkimeye girmeyen
kısımlarının iyot ile verdiği renk değişikliği incelenecektir. Ayrıca bu deneylerle amilaz enziminin
nişasta sindirimi için en uygun pH ve sıcaklığı tespit edilecektir.
Deneyler sırasıyla:
1- Sıcaklık
2- pH
3- Substrat derişimi
4- Enzim derişimi
5- Cl iyonu,
gibi faktörlerin enzim aktivitesi üzerine etkileri incelenerek yürütülecektir.
Ayıraçlar
Tükürük: Ağızda bir miktar parafin çiğnenerek toplanabileceği gibi dilin üzerine bir damla
kloroform veya asetik asit konarak da tükürük çıkışı yapılabilir.
Nişasta Çözeltisi (%2)
Yirmi gram nişasta 75 mL soğuk redistile su içerisinde iyice karıştırılarak süspanse edilir. Bir
erlende 850 mL arık su ısıtılır ve kabarcıklar çıkmaya başlayınca ocaktan alınır. Bunun üzerine
nişastalı su azar azar ilave edilir ve şiddetle çalkalanır. Tamamıyla homojen bir süspansiyon elde
edilinceye kadar iyice karıştırılır. Redistile su ile litreye tamamlanır.
Serum Fizyolojik
Bir miktar arık su içerisinde 9 g sodyum klorür eritilerek 1000 mL’ye tamamlanır.
Sodyum Klorür Çözeltisi (%0,1): 100 mg sodyum klorür (NaCl) bir miktar arık suda
çözülerek 100 mL’ye tamamlanır.
İyot Çözeltisi: 0,5 g potasyum iyodür 10mL arık suda eritilip üzerine 0,25 g iyot ilave
edilerek eriyinceye kadar çalkalanır. 100 mL’ye arık su ile tamamlanır.
HCl (%0,2) : 0,2 mL derişik HCl 100 mL’ye arık su ile tamamlanır.
70
E NZİM
Fosfat Tampon Çözeltisi (pH 6,8): 762 mg potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) ve
2,45 g disodyum hidrojen fosfat (Na2PO4) bir miktar arık su içinde eritilerek 100 mL’ye
tamamlanır, pH’sı 6,8’e ayarlanır.
DENEY I
Sıcaklığın Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi
Dört adet deney tüpü alınır. Her birine 1 mL %2’lik nişasta çözeltisi ve 1 mL fosfat
tamponu (pH 6,8) konarak iyice karıştırılır.
Birinci tüp 0ºC buz-tuz karışımına,
İkinci tüp 20ºC çeşme suyu banyosuna,
Üçüncü tüp 37ºC’de (vücut ısısı) su banyosuna
Dördüncü tüp 95ºC’de kaynar su banyosuna konur, 10 dakikada tüp içindeki ısının ortama
uyabilmesi için beklenir. Sonra her bir tüpe 1 mL 1/20 seyreltilmiş tükürük ilave edilerek
karıştırılır.
Bir dakika sonra her bir tüpteki karışımdan birer damla alınarak; evvelce fayans üzerine
damlatılmış birer damla iyot çözeltisi üzerine damlatılır ve her bir tüpün iyot ile verdiği renk
kaydedilir. Aynı işlem beşinci, onuncu, on beşinci ve yirminci dakikalarda tekrar edilir. Renkler
kaydedilir.
DENEY II
pH’nın Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi
On adet deney tüpü alınır ve her birine aşağıdaki tabloda görülen ayıraçlar konur.
Ayıraçlar (mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
%2 Nişasta
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
%0,2 NaOH
0,2
0,5
1,0
%0,2 HCl
5,0
2,5
1,0
0,5
0,2
Arık Su
4,0
6,5
8,0
8,5
8,8
9,0
8,8
8,5
8,0
10
2,5
2,5
6,5
Tükürük ilavesinden önce tüpler iyice karıştırılır. pH kağıdı ile her tüpün pH’sı ölçülerek
kaydedilir. Tükürük ilave edilerek tekrar iyice karıştırılır.
Tüp no
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tükürük (mL)
(1/20 seyreltilmiş)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Bir dakika sonra her bir tüpten birer damla alınarak daha önceden fayans üzerine
damlatılmış iyot damlalarının üzerine damlatılır ve renkleri kaydedilir. Bu işlem her bir tüp için
beşinci, onuncu, on beşinci ve yirminci dakikalarda tekrarlanarak, her bir tüpün iyotla verdiği renk
kaydedilir. Hangi pH’nın enzim aktivitesi için en uygun pH olduğu kaydedilir.
DENEY III
Klorür (Cl-) Anyonunun Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi
Dört adet deney tüpü alınarak aşağıda tabloda gösterilen ayıraçlar ilave edilir.
Ayıraçlar (mL)
1. Tüp
2. Tüp
3. Tüp
%2 Nişasta
2
2
2
%0.1 NaCl
1
2
Arık Su
5
4
3
Tükürük (1/20 Seyreltilmiş)
1
1
1
4. Tüp
2
5
1
E NZİM
71
Tüpler iyice karıştırılır, bir dakika sonra daha önceden fayans üzerine damlatılmış iyot
damlalarının üzerine her bir tüpten bir damla damlatılır ve renkler her bir tüp için kaydedilir. Aynı
işlem beşinci, onuncu, on beşinci ve yirminci dakikalarda tekrarlanarak sodyum klorür bir başka
deyişle Cl- iyonunun amilaz enzimi üzerine ne tip bir etki yaptığı, oluşan renklerin ışığı altında
incelenerek kaydedilir.
DENEY IV
Enzim Derişiminin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi
Altı adet deney tüpüne aşağıda gösterilen ayıraçlar ilave edilir.
Ayıraçlar (mL)
1. Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp
5. Tüp
Serum fizyolojik
1
1
1
1
1
Tükürük (1/10 seyreltilmiş)
Aşağıda tarif edilen şekilde aktarma yapılacaktır.
Seyreltme oranı
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
Fosfat tamponu pH 6,8
1
1
1
1
1
%2 nişasta
1
1
1
1
1
6. Tüp
1
1/640
1
1
Tüplerin her birine tabloda görüldüğü gibi 1 mL serum fizyolojik konur. 1 nolu tüpe 1 mL
1/10 sulandırılmış tükürük ilave edilir. Sonra ikinci tüpe 1. tüpten 1 mL, 3. tüpe de 2. tüpten 1
mL konur. 6. tüpten ise 1 mL alınarak dışarıya atılır. Böylece sırasıyla 1/20, 1/40, 1/80, 1/160,
1/320, 1/640 sulandırma yapılmış olur. Daha sonra diğer ayıraçlar konur. Tüpler iyice karıştırılır.
İki dakika sonra diğer kısımlardaki gibi iyot ile her bir tüpten renk değişimi izlenir. Bu işlem
beşinci, onuncu on beşinci, yirminci dakikalarda tekrarlanır. Gözlemler kaydedilir.
DENEY V
Subtrat Derişiminin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi
Yedi adet deney tüpü alınarak aşağıdaki tabloda görülen ayıraçlar ilave edilir.
Ayıraçlar (mL)
1. Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp 5. Tüp 6. Tüp 7. Tüp
%2 Nişasta
0,2
0,5
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Arık Su
4,8
4,5
4,0
3,0
2,0
1,0
Fosfat Tamponu pH 6,8
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Tükürük (1/20 seyreltilmiş)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Tüpler iyice karıştırılır, iki dakika sonra iyot ile renk değişimi incelenir. Bu işlem beşinci
onuncu, on beşinci ve yirminci dakikalarda tekrarlanarak renk değişimi incelenir.
SORULAR
1- Amilaz enzim aktivitesinin en iyi gözlendiği optimum sıcaklık ve pH nedir?
2- Klorür (Cl-) anyonunun enzim aktivitesi üzerine ne gibi bir etkisi vardır?
3- Enzim derişimim, enzim aktivitesi ile nasıl orantılıdır?
4- Substrat derişimi ile enzim aktivitesi arasında ne gibi bir ilişki vardır?
5- Amilaz enziminin aktivatörü nedir?
6- Deney I’de 0ºC’deki tüp alınıp 37ºC’ye konduğunda bir müddet sonra ne olur?
7- Deney I’de 95ºC’deki tüp alınıp 37ºC’ye konursa ne olur?
72
A ÇLI K K A N Ş E K E Rİ T A Y İ Nİ
Laboratuvar
Açlık Kan Şekeri Tayini
8
GENEL BİLGİ
Karbohidratlar; işlevsel olarak etkin aldehit ya da keton grubu içeren, hidroliz edildiklerinde
bu tür bileşikleri veren polihidroksialkollerdir.
Karbohidratlar; monosakkaritler, disakkaritler ve polisakkaritler olarak 3 gruba ayrılırlar.
Glukoz bir monosakkarit olup vücut için en önemli enerji kaynağıdır. Diyetle vücuda
alınan karbohidratların sindirilmesi ve emilmesi ile sağlandığı gibi vücudun kendi depolarından
(karaciğer ve iskelet kasında depolanan glikojenden) ya da glukoneojenez sayesinde karbohidrat
olmayan laktat, gliserol ve glikojenik aminoasitlerden de elde edilir.
Kan şekeri olan glukozun kan düzeyine glisemi adı verilir. Eğer kan şeker düzeyi normal
sınırlarda ise normoglisemi, normalden düşük ise hipoglisemi, normalden yüksek ise hiperglisemi
denir.
Kan şeker düzeyi insülin, glukagon, epinefrin, glukokortikoitler gibi birçok düzenleyici
hormon tarafından normal sınırlar içinde tutulmaya çalışılır. Kan şeker düzeyinin normal sınırları
ölçüm yapılan yönteme göre değişmektedir.
Kan şekeri düzeyinin ölçümü klinikte oldukça sık kullanılan bir parametredir.
Örnek Toplanması ve Saklanması
Açlık kan şekeri; 12 saatlik açlıktan sonra ölçülen kan şekeridir.
Açlık kan şekeri ölçüm yöntemlerinde tam kan, serum ve plazma kullanılabilmektedir.
Normal hematokriti olan bireylerde, açlık tam kan glukoz derişim, plazma glukozundan yaklaşık
%12-15 daha düşüktür (tam kanda bulunan hücrelerin yer kaplaması sonucu). Eritrosit membranı
glukozu serbest olarak geçirdiğinden; eritrosit içi glukoz derişimi ile plazmadaki glukoz derişimi
birbirine hemen hemen eşittir. Son yıllarda, hastaların evlerinde kendi kan şeker düzeylerini
ölçebilmelerini sağlayan cihazlar üretilmiştir. Ölçüm için tam kan kullanılan bu cihazlarda
sonuçlar değerlendirilirken yukarıdaki bilgi göz önüne alınmalıdır. Yine bu konu ile bağlantılı
olarak bilinmesi gereken ikinci bir özellik ise kapiller kan-venöz kan glukoz derişimleri arasındaki
farktır. Açlık durumunda kapiller kan glukoz derişimi venöz kandan sadece 2-5 mg/dL kadar
yüksektir. Ancak, glukoz yüklendikten sonra (veya tokluk durumlarında) kapiller kan glukoz
derişimi, venöz kandan 20-70 mg/dL (ortalama 30 mg/dL) kadar yüksek çıkabilmektedir.
Evlerde, hasta başı kullanılan cihazlarda kapiller kan kullanılmaktadır. Normalde Glisemi
tayininde ven kanı kullanılır.
Kan şekeri ölçümü için alınan kan oda sıcaklığında, hücreler santrifüj ile ayrılmadan
bekletildiğinde, bekletilen her saat için kan şeker düzeyi %7 oranında azalmaktadır. Eğer hastada
ayrıca lökosit ve eritrositlerin sayıca artmasına neden olan bir hastalık varsa (lösemi veya lenfoma
gibi) veya bakteriyel kontaminasyon durumunda in vitro glikoliz hızı daha da artacaktır. Serum
steril şartlarda sentrifügasyon ile hemolizsiz olarak ayrıldığında serum şeker düzeyi 25C’de 8 saat
73
süreyle, 4 C’de ise 72 saat kararlıdır. Hücrelerden tamamen arındırılmış (santrifüj edilmiş) steril
plazmada glikolitik aktivite gözlenmez.
Kan örneği sodyum floritli (NaF) veya sodyum iyodoasetatlı bir tüpe alınırsa, glikoliz
inhibe olur ve örneğin glukoz ölçümü için bekletilme süresi oda sıcaklığında 3 güne kadar uzar.
Florid iyonları, glikolitik yolda bir enzim olan ve çalışması için Mg++ iyonlarına gereksinim duyan
enolazı inhibe eder. Bu inhibisyon F- iyonlarının Mg++ ile kompleks yapması sonucu oluşur.
Florid aynı zamanda zayıf bir antikoagülandır, çünkü Ca++ iyonlarını da bağlar. F- iyonları yüksek
derişimlerinde üreaz ve bazı diğer enzimlerin aktivitelerini de inhibe eder. Bu nedenle NaF’li tüpe
alınan kan örneklerinde üre ve serum enzim aktiviteleri çalışılmamalıdır; aksi taktirde yanlış
sonuçlar elde edilir. Normal koşullarda kanlar bir saatten kısa bir sürede santrifüj edildiğinden
NaF’li tüplerin kullanılmasına gereksinim yoktur. Ancak bekletilmesi gereken örneklerde veya az
önce bahsedilen yüksek lökosit bulunan örneklerde kan şekeri çalışılacaksa mutlaka NaF’li tüp
kullanılmalıdır.
Beyin-omurilik sıvısı olan BOS’ta glukoz hemen bakılmalıdır. Çünkü bakteriyel
kontaminasyon meydana gelebilir. Bekleme kaçınılmaz ise örnek santrifüj edilmeli ve +4 C veya
-20C’de saklanmalıdır.
Yirmi dört saatlik idrarda 5 mL glasiyel asetik asit ilavesi ile glukoz korunabilir. Bakteriyel
aktivasyonun engellenmesi için idrar pH’sı genellikle 4-5 arasında olmalıdır. 24 saatlik idrarın
toplanması sırasında idrarın +4C’de saklanması gerekir. Çünkü idrar örnekleri oda ısısında 24
saat sonunda glukozlarının %40’nı kaybedebilirler.
Diabetes Mellitus (DM)
Karbohidrat metabolizmasındaki bozukluğa bağlı olarak glukoz kullanımının azalması ve
hiperglisemi (kan glukoz düzeyinin artması) ile karakterize metabolik bir hastalıktır. Bu hastalığın
tanısı, sadece hipergliseminin gösterilmesi ile konulur. Açlık kan glukoz derişiminin, birden fazla
ölçüm sonucunda (tek bir ölçüm ile karar verilmez) 126 mg/dL üzerinde; tokluk kan şekerinin ise
200 mg/dL’nin üzerinde çıkması DM tanısı koydurur. Bazı durumlarda, örneğin açlık kan şekeri
110-126 mg/dL arasında bulunduğunda karar verme zorlaşır. Böyle durumlarda oral glukoz
tolerans testi uygulanması gerekir.
Glukoz Ölçüm Yöntemleri
Günümüzde, glukoz ölçümleri hemen hemen tamamen enzimatik yöntemlerle
yapılmaktadır. Daha önceleri ölçüm yöntemleri olarak fotometrik veya oksidasyon-redüksiyon
teknikleri kullanılmaktaydı. Enzimatik yöntemler arasında;
- Hekzokinaz
- Glukoz oksidaz
- Glukoz dehidrogenaz
Bu yöntemlerin çeşitli avantajları vardır. Bunlar;
- Glukoza spesifik yöntemler olup sadece kandaki glukozu ölçerler,
- Çok az örnekle çalışma imkanı sağlarlar,
- Otomasyona uygundurlar.
Oksidasyon-redüksiyon yöntemleri arasında ise;
- Folin-Wu
- Somogy-Nelson
sayılabilir.
74
Enzimatik Yöntemler
Hekzokinaz yönteminde; glukoz hekzokinaz enzimi ve Mg++ varlığında ATP ile
fosforillenerek glukoz-6-fosfat oluşur. Bu da, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzimi ile 6fosfoglukonat’a dönüşür.
Hekzokinaz
Glukoz-6-fosfat + ADP + Pi
Glukoz + ATP
Mg++
G6PD
6-Fosfoglukonat
Glukoz-6-fosfat
NADP→NADPH+H+
Bu reaksiyon için NADP+’ye ihtiyaç vardır. Reaksiyon sonucunda oluşan NADPH miktarı,
ortamda bulunan glukoz miktarı ile doğru orantılıdır. NADPH 340 nm’de ölçülür. Kullanılan
serum ya da plazma baryum hidroksit ve çinko sülfat ile deproteinize edilmelidir. Bu yöntem
daha spesifik bir yöntemdir. Doğruluğu ve kesinliği yüksek olan referans bir yöntemdir; fakat
klinik laboratuvarlarda rutin kullanımı çok zaman alır, titizlik ister ve çok pahalıdır. Bu nedenle
çok sık kullanılmamaktadır.
olur.
Glukoz oksidaz yönteminde; glukoz, glukonik asit ve hidrojen perokside (H2O2) okside
Glukoz+2H2O+O2
Glukoz oksidaz
o-Dianisin + H2O2
Peroksidaz
renksiz
Glukonik asit+H2O2
Okside o-dianisidin + H2O
renkli
Daha sonra peroksidaz enzimi ve kromojenik bir O2 akseptörü varlığında (örneğin odianisidine) renkli bir madde oluşur ve bu renk şiddeti spektrofotometre ile 510 nm’de ölçülür.
Günümüzde rutinde en sık kullanılan yöntemdir. BOS’ta glukoz ölçümü için idealdir.
Glukoz dehidrogenaz yönteminde; glukoz, glukonolakton’a okside olur.
Glukoz
Glukoz dehidrogenaz
Glukonolakton
NADP→NADPH+H+
Oluşan NADPH miktarı 340 nm’de ölçülür ve bu miktar ortamda bulunan glukoz miktarı
ile doğru orantılıdır.
75
Enzimatik yöntemlerle elde edilen referans aralıklar:
Plazma/Serum
Açlık kan şekeri (mg/dL)
Erişkinlerde
74-106
Çocuklarda
60-100
Yeni doğanlarda
30-60
Prematür yeni doğanlarda
20-60
Tam kan erişkin
65-95
Değerlerde kadın-erkek cinsiyeti arasında fark yoktur. Oksidasyon-redüksiyon
yöntemlerinde interferense (ortamda ölçülmek istenen maddenin dışında deney sonucunu azaltıcı
ya da arttırıcı yönde etkileyen maddeler) daha sık rastlandığından referans değerin üst sınırı biraz
daha yüksektir (70-120 mg/dL). Ortamda bulunan diğer indirgeyici özelliğe sahip maddeler
arasında kreatinin ve ürik asit sayılabilir.
Oksidasyon-Redüksiyon Yöntemleri
Bu yöntemlerde temel prensip; karbohidratlardaki açık aldehit gruplarının indirgen
olmasıdır.
Alkali
+2
Cu
Cu+
Isı
Cu+ + OH
2CuOH
CuOH (Sarı)
Cu2O+ H2O (Kırmızı)
Nonspesifik yöntemler olan bu yöntemlerde öncelikle örnekler deproteinize edilmelidir.
Folin-Wu yönteminde proteinler tungustik asit ile çöktürülür. Bu yöntem spesifik değildir;
çünkü ortamda bulunan glukoz dışı indirgen maddeler deneyin sonucunu etkiler ve sonuçta %2030 oranında bir fazlalığa neden olur (Glutatyon, kreatinin, askorbik asit vb).
Somogy-Nelson yönteminde deproteinizasyon için çinko sülfat ile NaOH ya da baryum
hidroksit kullanılır. Folin-Wu yöntemine göre daha hassastır.
Folin-Wu Yöntemi İle Kan Şekeri Tayini
Proteinden yoksun kan süzüntüsü (Folin-Wu süzüntüsü) hazırlanır. Bu süzüntü Alkalen
Bakır Sülfat ile kaynatılır. Mevcut glukoz oranında bakır sülfat indirgenerek kırmızı renkli bakır
oksit fosfomolibdik asitle birleşerek mavi renkte bir kompleks oluşturur. Bu rengin şiddeti kanın
içerdiği glukoz derişimi ile orantılıdır. Bu renk şiddeti standart glukoz eriyiği ile karşılaştırılarak
örnek glukoz derişimi hesaplanır.
Ayıraçlar
1- Sodyum Tungstat (%10’luk): 10 g sodyum tungstat tartılır. Balon jojeye konur. Yeterli
miktarda saf su ile çözüldükten sonra 100 mL’ ye saf su ile tamamlanır.
2- Alkalen Bakır Sülfat: Bir litrelik balon jojeye 40 g. susuz sodyum karbonat ve 7,5 g
tartarik asit konur ve 400 mL saf suda çözülür. Ayrıca 4,5 g saf bakır sülfat 100 mL’lik balon joje
de yeteri kadar saf suda çözülüp 100 mL’ye saf su ile tamamlanır. Bu bakır sülfat çözeltisi birinci
76
çözeltiye yavaş yavaş ve karıştırarak aktarılır, saf su ile bir litreye tamamlanır. Çökelek oluşturursa
filtre kağıdından süzülür.
3- 2/3 N H2SO4: Bir litrelik balon jojeye 200 mL saf su konur. Üzerine 18,5 mL derişik
(%99’luk) sülfürik asit eklenir. Soğuyunca saf su ile bir litreye tamamlanır. On kez alt üst edilerek
karıştırılır. 0,5 N NaOH ile titre edilir ve tam 2/3 N’e ayarlanır.
4- Fosfomolibdik Asit: Bir litrelik balonda 35 g molibdik asit, 5 g sodyum tungstat, 200 mL
karbonattan yoksun %10’luk NaOH (2,5 N) çözeltisinde eritilir. 175 mL saf su ilave edilir. 20-40
dakika süre ile oluşan amonyağı uçurmak için geri soğutucu altında kaynatılır. Soğutulur ve 500
mL’lik balon jojeye aktarılır. Üzerine 125 mL derişik fosforik asit yavaş yavaş eklenir. Soğuduktan
sonra 500 mL’ye saf su ile tamamlanır.
5- Stok Glukoz Standart: 2,5 g benzoik asit tartılır ve bir litre saf suda ısıtılarak eritilir. Elde
edilen çözelti %0,25’likdir. 37C’ de kurutulmuş ve desikatörde bir gece bekletilmiş saf glukozdan
tam 1,000 g tartılır ve içinde 50 mL %0,25’lik benzoik asit bulunan 100 mL’lik balon jojede
eritilir. Tamamen eriyince benzoik asit çözeltisi ile 100 mL’ye tamamlanır. Çözeltinin her
mililitresinde 10 mg glukoz vardır. Buzdolabında bir yıl kadar saklanabilir.
6- Günlük Glukoz Standart: 1 mL stok standart 100 mL’ye saf su ile tamamlanarak
hazırlanır (0,1 mg/mL). Buzdolabında bir gün dayanıklıdır.
Yöntem
Deney iki aşamada yapılır;
- Proteinden yoksun süzüntü hazırlanması
- Süzüntüde kan şekeri tayini
Materyal olarak 12 saat açlıktan sonra hastadan alınan tam kan, serum ya da plazma
kullanılabilir. 50 mL’lik bir erlene 7 mL saf su konulur. Bunun üzerine 1 mL serum ya da plazma
eklenip karıştırılır ve 1 mL sodyum tungstat eklenir. Bütün bu karışım üzerine 1 mL 2/3 N
sülfürik asit damla damla eklenir ve her eklemede çalkalayarak karıştırılır. 10 dakika bekletilir. Bu
arada temiz ve kuru bir tüpe küçük bir huni yerleştirilir. Huni içine uygun şekilde kesilmiş bir
filtre kağıdı yerleştirilir. Erlende hazırlanan karışım süre sonunda huniye dökülür. Tungustik asit
ile çökelen proteinler filtre kağıdında kalarak proteinden yoksun süzüntü yavaş yavaş süzülür.
Süzüntü berrak değilse tekrar süzülür. Bazı proteinlerin glukozla benzeri reaksiyon veriyor olması
nedeni ile proteinden yoksun süzüntü hazırlanması gereklidir. Ortamdaki bu interferens
verebilecek proteinlerin uzaklaştırılması ile glukozun gerçek değerinde ölçülmesi sağlanır.
Üç adet Folin-Wu tüpü kör, standart ve numune olarak işaretlenir ve aşağıdaki ayraçlar
eklenir.
Çözeltiler (mL)
Kör
Standart
Numune
Saf Su
2
Standart
2
Folin-Wu Süzüntüsü
2
Alkalen Bakır Sülfat
2
2
2
Bu üç tüp karıştırıldıktan sonra şiddetli şekilde kaynayan su banyosunda 8 dakika kaynatılır.
Kaynamadan alınan tüpler hemen soğuk su banyosunda soğutulur. Renk şeker oranına bağlı
olarak yeşil-kırmızı olacaktır.
Bu aşamada tüm tüplere 2’şer mL fosfomolibdik asit konulur. Tüpler yan tutularak gaz
çıkması için çalkalanır. Tüpler 25 mL çizgisine kadar saf su ile doldurulur, en az 10 kez alt üst
ederek karıştırılır.
77
Standart ve numune köre karşı spektrofotometre de 540 nm dalga boyunda okunarak elde
edilen absorbans değerleri ile aşağıdaki şekilde örneğin kan şekeri düzeyi saptanır.
Örnek   ÖrnekOD  S tan dard(%mg )
StdOD
Bu yöntemle ölçülen kan şekerinin normal sınırları 70-120 mg/dL'dir.
P CR U Y GU L AM AL A RI
78
Laboratuvar
PCR Uygulamaları
9
GENEL BİLGİ
İn vitro replikasyon (Polimeraz Zincir Tepkimesi)
Hücre içi in vivo koşullarda DNA çoğalması replikasyon yoluyla gerçekleşir. Replikasyon
sırasında çift sarmal DNA iplikçikleri birbirinden ayrılır ve bu iplikçiklerin tamamlayıcıları
sentezlenerek bir DNA molekülünden iki DNA molekülü elde edilir. Bunun sonucunda hücre
bölünmesiyle yeni oluşan hücrelere tüm genler aynen geçer. In vitro replikasyon ise DNA içinde
yer alan, dizisi bilinen iki bölge arasındaki özgün DNA bölgesinin in vitro koşullarda
çoğaltılmasıdır (amplifikasyon). Bu işlem için uygulanan tepkimelerin tümüne polimeraz zincir
tepkimesi (PCR) adı verilir. In vitro replikasyon yapabilmek içi çoğaltılacak gen bölgesine ait baz
dizisinin bilinmesi gereklidir.
1980'li yılların ortalarında “Cetus” firması araştırıcıları tarafından geliştirilmiş olan in vitro
replikasyon (PCR) yöntemi yıllardır temel moleküler araştırmalarda ve birçok hastalığın tanısında
(orak hücre anemisi, kistik fibröz, frajil X sendromu vb.) yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu
yöntemle insan genomik DNA'sı gibi kompleks bir molekülden bir kaç saat gibi kısa sürelerde
istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin replikasyonu hızlandırmış bir şekilde
gerçekleştirilmektedir.
Uygulama Alanları
PCR’ın çok feşitli uygulama alanları vardır ve giderek yeni uygulama alanları ortaya
çıkmaktadır. PCR kullanılarak yapılan moleküler analizler özellikle klinikte hastalıkların moleküler
tanısında, patojen mikroorganizmalarm ( insan papilloma virüsü, insan immün yetmezlik virüsü,
hepatit C virüsü vb.) varlığının gösterilmesinde, kanser araştırmalarında (kronik myelojenik
lösemide BCR/abl ve p53 tümör süpresor geni vb.), moleküler bozuklukların doğum öncesi
tanısında, adli tıpta örneklerin genetik tanımlanmasında ve temel moleküler araştırmalarda
(klonlama, gen haritalaması, vb.) kullanılmaktadır.
PCR Mekanizması
PCR, tek zincir kalıp DNA molekülünde çoğaltılması planlanan bölgenin her iki ucunda
bulunan hedef dizilere iki primerin (20-30 bazlık oligonükleotit) bağlanması ve uzatılarak
komplementer DNA zincirinin sentezlenmesi esasına dayanır. Bunun için kalıp DNA molekülü
yüksek sıcaklık derecelerinde (94-97 ºC) denatüre edilir. Amplimer olarak da adlandınlan
primerler, DNA çift sarmalı açıldıktan sonra tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine
komplementer olan bölgelere bağlanırlar. Primerlerin özgün olarak bu hedef dizilere bağlanması
düşük sıcaklık derecelerinde (55-65 ºC ) gerçekleşir. Daha sonra, ortam uygun sıcaklığa (72ºC)
çıkarılarak yüksek sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz enziminin dört deoksiribonükleotit fosfatı
(dNTP; [A,C,G ve T]) her iki primerin 3' OH ucuna eklemesi ile komplementer DNA iplikçiğini
sentezlemesi sağlanır. Yukarıda bahsi geçen üç aşama PCR’ın bir döngüsünü oluşturur. Bu
79
tepkime kalıp DNA’nın her iki iplikçiğinde gerçekleştiğinden, çoğaltılmak istenen DNA
bölgesinin miktarı iki katına çıkarılmış olur. Böylece, her bir kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan
yeni bir DNA molekülü sentezlenmiş olur (Şekil 1).
Denatürasyon, primer bağlanması ve primer uzaması aşamalarının oluşturduğu her bir
döngünün ardışık olarak tekrarlanması ile DNA fragmanlarının miktarı geometrik olarak artar.
Artışın nedeni bir döngü sonucu sentezlenen ürünün ardışık döngülerde diğerleri için kalıp görevi
yapmasıdır. Böylece, her PCR döngüsünde ürün iki kat artar. PCR ile sentezlenen ürünlerin boyu
iki primerin boyları ve hedef DNA bölgesinin boyu toplamları kadardır.
Şekil 1. PCR döngüsünün şematik gösterimi
* Bir PCR döngüsü:
1. Denatürasyon
2. Primer bağlanması (annealing)
3. Uzama (extension)
Olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur (şekil 1).
PCR’ın Temel Bileşenleri ve Standardizasyonu
Polimeraz zincir tepkimelerinde temel bileşenlerin derişimleri ve kimyasal özellikleri son
derece önemlidir. Kimyasallar, kesinlikle moleküler analiz için üretilen ürünler arasından
seçilmelidir.
PCR temel bilesenleri:
- Kalıp DNA molekülü
- DNA polimeraz enzimi
80
- dNTP karışımı
- Tampon
- MgCl2
- Primerler
Kalıp DNA: PCR'da kalıp DNA olarak; rekombinant DNA parçaları, plazmid ile faj,
bakteri ve yüksek organizmaların genomik DNA’ları kullanılabilir. Kalıp DNA molekülleri amaca
göre cDNA, genomik DNA, genomik kitaplıklar halinde araştırma laboratuvarlarından,
kliniklerden veya ticari olarak firmalardan elde edilir.
DNA polimeraz enzimleri: DNA polimeraz enzimleri kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA
ipliği sentezlemek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit dNTP'den uzun
polinükleotit zincirin sentezini kataliz ederler. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp diziye
bağlanan kısa DNA parçasına (primer) gereksinim duyarlar. Sentez 5'3' yönünde gerçekleşir.
Primerin serbest 3' OH ucuna ortamdaki dNTP'lerin nükleofilik etki yapmalarıyla fosfodiester
bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır. DNA polimerazın optimum
sıcaklığı 72 C’dir. Bu sıcaklıkta saniyede 35-100 nükleotitin polimerizasyonunu yapar.
Enzimin tepkime karışımındaki derişimi de önemlidir. 100 L'lik bir tepkimesinde polimeraz
enzim derişimi 1-5 Ünite arasında olmalıdır. Bu miktarlar hedef ve kalıba göre değişim gösterir.
Primerler: Oligonükleotit primerler; primer sentezi yapan laboratuvarlardan veya ticari
firmalardan elde edilirler. PCR uygulamalarında, çoğaltılmak istenen hedef DNA bölgesine özgün
primerlere gereksinim vardır. Genel olarak, kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak
üzere primerler 20-30 nükleotit uzunluğunda seçilir.
dNTP karışımı: Deoksinükleotit trifosfatlar (dATP, dGTP, dTTP ve dCTP) saf olarak tek
tek veya dörtlü şekilde ticari olarak elde edilir. Stok dNTP çözeltileri pH 7,0'a nötralize
edilmelidir. Stoklar 10 mM'a sulandırılıp küçük porsiyonlar halinde -20°C'da saklanır. Bir PCR
tepkimesi için optimal dNTP derişimine; MgCl2 derişimine, primer derişimine, çoğaltılacak
ürünün boyuna ve PCR döngü sayısına bağlı olarak değişir.
Mg derişimi: PCR analizlerinde Mg derişimi en uygun şekilde ayarlanması çok önemlidir.
Mg derişimi (1) primer yapışmasını, (2) PCR ürünü ve kahp zincir ayrışma sıcaklıklarını, (3) ürün
özgüllüğünü (4) primer-dimer kalıntılarıın oluşumunu ve (5) enzim etkinliğini ve doğruluğunu
etkilemektedir. Düşük Mg derişimlerinin ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg derişimlerinin
ise özgün olmayan ürünlerin birikimine neden olacağı unutulmamalıdır.
Tampon: PCR için önerilen tampon taq polimeraz enzimlerine özgü olan 10-50 mM
derişimde 20°C'de pH 8,3-8,8 arasında olan Tris-HCl tamponudur. Ancak hedef dizi ve amaca
uygun olarak farklı tamponlar kullanılabilir.
Tampon içeriğinde bulunan KCl’ün 50 mM'a kadar olan derişimlerinde primer yapışmasını
artırdığı belirlenmiştir. Ancak 50 mM üzerindeki KCl derişimlerleri taq polimeraz enzimini inhibe
eder.
PCR'ın İşleyişi ve Standardizasyonu
Termostabil DNA polimerazın keşfi ve PCR döngüsü aşamalarının sıcaklıklarını ve
sürelerini hassas olarak ayarlayabilen bilgisayar kontrollü PCR cihazlarının (ısı döngüleyici)
81
kullanıma sunulması PCR’ın verimliliği ve kullanım alanlarında önemli gelişmelere neden
olmuştur.
Verimli bir PCR için aşağıdaki aşamaların dikkatle uygulanması gerekmektedir.
1. Denatüirasyon
2. Primer bağlanması
3. Primer uzaması
4. Döngü Sayısı
5. PCR cihazının sıcaklık iniş çıkış sürelerinin ayarlanması çok önemlidir.
PCR analizleri mikrotüplerde (50 L, 100 L; ependorf tüpü) gerçekleştirilir. Polimeraz
zincir tepkimesinde tepkimenin koşulları örneğin özelliklerine, amplifiye edilecek bölgenin
uzunluğuna ve primer dizisine bağlı olarak değişiklik gösterir. Ortalama olarak 20 döngü ile kalıp
DNA 1.000.000 kez çoğaltılır.
Denatürasyon: Genomik DNA gibi kompleks kalıpların denatürasyonunun tam olmasını
sağlamak amacıyla başlangıçta yüksek sıcaklıklar (92-95°C) kullanılır.
Denatürasyonun tam olarak gerçekleşmesi önemlidir. Tamamlanmamış denatürasyon DNA
zincirlerinde kopmalara neden olarak ürün verimini azaltır. Ayrıca Taq DNA polimerazın yarı
ömrü de dikkate alınmalıdır. Taq DNA polimeraz enzimi 92°C'de 2 saatten fazla, 95°C'de 40
dakika ve 97°C'da ise 5 dakika yarı ömre sahiptir. Çok yüksek sıcaklık ve uzun süreli denatürasyon
gereksiz enzim kaybına neden olur.
Primer yapışması (annealing): Primer yapısması için gerekli zamanın uzunluğu ve
sıcaklık amplifikasyon primerlerinin baz içeriğine, uzunluğuna ve derişimine bağlıdır. 55-72°C
arası yapışma sıcaklıkları en iyi sonuçları verir. Yapışma işlemi normal primer derişimlerinde bir
kaç saniye sürer.
Primer uzaması (extension): Uzama zamanı hedef dizinin derişimine, uzunluğuna ve
sıcaklığa bağlıdır. Primer uzaması aşamasında genellikle Taq/Amlitaq DNA polimerazların
polimerizasyon aktivitesi için en uygun sıcaklık 72°C'dir.
PCR ürünü olan tüm moleküllerde tepkimenin tamamlanmasını garanti altına almak için
son döngünün uzama süresi 10-15 dakika gibi uzun sürelerde tutulur.
Döngü sayısı: En uygun döngü sayısı hedef DNA başlangıç derişimine bağlı olarak
değişkenlik gösterir. Çok fazla döngü uygulanması sonucu istenmeyen ürünlerin sentezi artar,
istenen ürün miktarı ise değişmez. İdeal döngü sayısı 25-35 arasıdır. Ancak döngü sayısının
gerekenin altında olmasının PCR ürününün verimini azaltacağı akılda tutulmalıdır.
UYGULAMA
Amplification refractory mutation system (ARMS) yöntemi prensibi: Allel spesifik
amplifikasyon adı da verilen bu yöntemde beş PCR primeri hazırlanır. İlk ikisi kontrol primerleri
diğer üçü ise mutasyon bölgesine özgü primerlerdir. Normal ve mutant olmak üzere iki ayrı
amplifikasyon tepkimesi gerçekleştirilir ve elektroforezde oluşan bantlar gözlenir. Mutant ve
normal amplifikasyonların oluşumuna bakılarak kişinin genetik bozukluğu taşıyıp taşımadığı
belirlenir.
1
2
3
4
5
82
6
Örnek
yükleme
kuyucukları
Mutant
PCR ürün
bantları
Agaroz jel
1
2
3
4
5
6
Normal
Şekil 2. ARMS yöntemi ile Hb S mutasyonunun şematik gösterimi
Şemada; üst bölüm Hb S mutant amplifikasyonu, alt bölüm Hb S normal amplifikasyonu
göstermektedir.
Not: Şekilde 1, 2 ve 6 no’lu örnekler taşıyıcı (heterozigot, M/N), 3 ve 4 no’lu örnekler hasta
(homozigot, M/M), 5 no’lu örnek normal (homozigot, N/N)
Ayıraçlar
10X Cetus tamponu
1,25 mL
2 MKCL (stok)
0,50 mL
1 M Tris pH 8,3 (stok)
75 L
5 mg
3,2 mL
1 M MgCl2
Jelatin
Steril distile H2O
Jelatini eritmek için 37°C'de çözülür ve -20°C'de saklanır.
dNTP'ler (100mM)
Her bir dNTP'den (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 60 L alınıp üzerine 4740 L steril distile
su eklenir.
Primerler
Tüm primerler 10 pm/L olacak şekilde steril distile su ile seyreltilir.
HbS primerleri
Mutant (AT)
Normal
Common
Sabit primer 5'
Sabit primer 3'
5'-CCC ACA GGG CAG TAA CGG CAG ACT TCT GCA 3'
5' CCC ACA GGG CAG TAA CGG CAG ACT TCT GCT 3'
5' ACC TCA CCC TGT GGA GCC AC 3'
5' CAA TGT ATC ATG CCT CTT TGC ACC 3'
3' GAG TCA AGG CTG AGA GAT GCA GGA5'
Daha sonra PCR karışımı hazırlanır
20 örnek için PCR karışımı (4 mL)
500 L
10X Cetus tampon
2700 L
steril distile H2O
800 L
1,25 mM dNTP'ler
Amplification refractory mutation system( ARMS) yöntemi ile PCR
Bir örnek icin
20 L
PCR karışımı
l L
Primer HbS mutant
1 L
Common primer
l L
5' Sabit primer
l L
3' Sabit primer
0,l L
Taq polimeraz enzimi
1 L
DNA (yaklaşık 0,5 g )
Vortekslenir santrifuj edilir ve PCR cihazına yerleştirilir.
PCR Programı:
94 °C'de
1 dakika
65 °C'de
1 dakika
72°C'de
1,5 dakika
72°C'da
25 döngü
3 dakika
Agaroz/Nusieve agaroz Elektroforezi
Ayıraçlar
50X AGB Tamponu
2 M Tris
1 M Sodyum asetat (NaAc 3H2O)
10 mM Sodyum EDTA
pH 8,3'e yaklaşık 60 mL Glasiyel asetik asit ile ayarlanır.
83
84
Bromfenol mavisi
%15 Fikol
%10 Gliserol
%0,05 Brom fenol mavisi
1X AGB tamponu ile 100 mL’ye tamamlanır.
15 g fikol tartılır üzerine 50-100 mg bromfenol mavisi ve 10 mL gliserol eklenir ve 90 mL
1X AGB tamponu eklenir. Manyetik karıştırıcı ile ısıtılarak çözülür ve 100 mL'ye tamamlanır.
Etidiyum bromit
10 mg/mL olacak şekilde suda çözülür.
Elektroforez uygulaması
20 L amplifiye edilen DNA 5 L bromfenol mavisi karıştırılır ve %2'lik agaroz jelde 1X
AGB tampon içinde 1 saat 160 Voltta yürütülür. Elektoforez sonrası jel etidiyum bromid içinde
boyanır ve ultraviyole ışık altında gözlenerek fotoğrafı çekilir.
PCR Uygulamalarında Alınması Gereken Önlemler
PCR uygulamalarının etkinliği, onun özgüllüğü, verimliliği ve doğruluğu ile ölçülür.
İdeal PCR; yüksek özgüllük, verim ve doğruluğa sahip olmalıdır. Özgül bir PCR analizinde
tasarlanmış hedef dizisi olan tek bir amplifikasyon ürünü oluşur. Daha verimli bir amplifikasyon
için birkaç fazla döngü yapmak gereklidir. PCR analizleri, başlıca tampon, içeriği, döngü sayısı ve
sıcaklığı ve DNA polimeraz enzimininden etkilenir.
Maksimum özgüllük sağlamak için gerekli koşullar ne yazık ki PCR veriminin düşmesine
neden olmaktadır. Benzer şekilde doğruluk için gerekli koşullarda yine verimin azalmasına neden
olur. Çalışmamızda hangi özellik önemli ise PCR koşullarını ona göre ayarlamamız gereklidir.
Örneğin homojen bir hücre topluluğunun direk dizi analizi için, verim ve özgüllük doğruluktan
daha önemlidir. Buna karşın bir bireye ait DNA örneğinde mutasyon araştırıldığında PCR' in
doğruluğu yaşamsal önem taşır.
PCR uygulamalarında alınması gereken önlemlerin başında kontaminasyon gelir. PCR
analizi ile tek bir molekülün bile amplifikasyonu yapılabilmektedir. Bu nedenle kalıp DNA'ların
eser miktarı bile bir diğer çalışmada bulaşmaya neden olabilir. Kontaminasyonu önlemek amacıyla
aşağıda belirtilen kurallara kesinlikle uyulmalıdır.
1. PCR analizleri ultraviyole (UV) ışık ile donatılmış bir “laminar flow”da
gerçekleştirilmelidir. “Laminar flow” kullanılmadığı zamanlarda UV ışık kullanılmalıdır. PCR
analizlerinde kullanılan mikrosantrifüj, tek kullanımlık eldivenler, pipet takımları ve diğer araç ve
gereçler “laminar flow”da tutulmalıdır.
2. Pipetlerin temizliğine çok dikkat edilmelidir. Otomatik pipetlerin hazneleri
kontaminasyonun en önemli kaynaklarıdır. Kesinlikle tek kullanımlık pipet uçları kullanılmalıdır.
3. Kullanım öncesi tüm ayıraçlar, pipet uçları ve santrifüj tüpleri otoklavlanmalıdır.
4. PCR uygulama alanlarında temiz, steril çift eldiven giyilerek çalışılmalı ve sık sık
eldivenler değiştirilip yenilenmelidir.
5. Kimyasal maddeler, primerler küçük porsiyonlara bölünerek uygun sıcaklıklarda
saklanmalıdır. Özellikle tamponlar, primerler, dNTP'ler gibi maddeler küçük ependorf tüpleri
içinde derin dondurucuda saklanmalıdır. Böylece her seferinde çözülüp yeniden dondurma
işlemiyle kimyasalların bozulması önlenmiş olur.
6. Moleküler analiz laboratuvarlarında çalışan kişilerin kişiye özgü ayıraç setlerinin olması
85
gereklidir. Böylece başkasının neden olacağı kontaminasyondan çalışmacı kendi deneyini ve
ayıraçlarını korumuş olur. Ayrıca ortaya çıkan aksaklık sonucu laboratuvarda çalışılan tüm
moleküler analizler değil sadece kişinin kendi çalışması etkilenir.
7. PCR'da kullanılan ayıraçları içeren tüpler kullanım öncesi “laminar flow”da yerleşmiş
mikrosantrifüjde kısa süreli (10 saniye) santrifüj edilmelidir. Bu işlem sıvıyı tüpün tabanına toplar
ve böylece eldivenlere ve pipetlere bulaşma olasılığı azaltılmış olur.
8. Tepkimeyi gerçekleştirirken kalıp DNA'nın tepkime tüpüne tüm bileşenlerden sonra
eklenmesi uygundur. Ayrıca ekleme sırasında hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edilmelidir.
Kalıp DNA eklendikten sonra tüp kapatılmalı, yavaşça karıştırılmalı ve sıvı-organik faz ayırımını
sağlamak amacıyla kısa süre (10 saniye) santrifüj edilmelidir.
9. Her PCR analizinde çoğaltılan hedef diziye uygun pozitif ve negatif kontrol örneği
çalışmaya eklenmeli ve kalıp DNA dışındaki tüm PCR bileşenlerini aynı oranda içermelidir.
KAYNAKLAR
1. Erlich H. A. (1990). “PCR Technology. Molecular Biology and Biotechnology” Edited
by Robert A. Meyers), VCH Publishers USA, 641-648.
2. Newton C. R. ve Graham A. (1994). “PCR”, Bios Scientific Publishers Limited, Oxford,
UK.
3. Gyllensten U. B. (1989). Bio Tecchniques. 7 (7), 700-708.
4. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989). “Molecular cloning: A laboratory
Manuel”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
5. White B. A. (1993). “PCR Protocols: Current Methods and Applications for DNA
Amplification”, IRL Press at Oxford University Press, UK.
86
EL E KT ROF O R EZ
Laboratuvar
Elektroforez
10
GENEL BİLGİ
Elektroforez, genel olarak, bir çözelti içerisindeki elektrik yüklü partiküllerin uygulanan
elektriksel alanda göç ettirilerek ayrıştırılması prensibine dayanır. İlk elektroforetik metot 1937
senesinde Tiselius tarafından proteinleri fraksiyonlarına ayırmak için dizayn edilmiştir.
Günümüzde halen; amino asitler, peptitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyolojik olarak
önemli birçok molekülün fraksiyonlarına ayrılmasında kullanılan en yaygın yöntem
elektroforezdir.
Yüklü moleküller, çözelti içerisinde ortamın pH'sına bağlı olarak değişmek üzere (+) veya
(-) elektrik yüklü birer partikül olarak davranırlar. Elektriksel alanda (+) yüklü partiküller katota
(negatif yüklü elektrot), (-) yüklü olanlar ise anoda (+ yüklü elektrot) doğru göç ederler.
Her elektroforez sistemi üç temel bileşenden oluşur. Bunlar; 1) destek ortamı, 2)
elektroforez tamponu ve 3)güç kaynağıdır.
Destek ortamı: Ayrıştırılmak istenen örneğin uygulandığı ve üzerinde veya içerisinde göç
ettiği ortamdır. Kullanılan örneğe ve analizin amacına göre farklı fiziksel özelliklere sahip destek
ortamları kullanılır. Bunlar arasında en yaygın kullanım alanına sahip olanlar kağıt; nisaşta, agar,
poliakrilamit jelleri ve selüloz asetat membranıdır. Destek ortamları (özellikle jel olanlar),
malzemesine ve derişimlerine bağlı olarak çapları değişebilen mikro kanallar (por) içeren birer elek
işlevi gösterirler.
Elektroforez tamponu: Elektroforezde kullanılan tamponların iki görevi vardır; uygulanan
akımı taşımak ve elektroforez ortamının pH'sını sabitleyerek ayrıştırılmak istenen partiküllerin
elektrik yükünü belirlemektir. Tamponun pH'sı kadar iyonik gücü de önemlidir. Tamponun iyon
derişimi arttıkça iyonik gücü de artar ve yüklü partikülleri çevreleyen iyonik bulutun çapı artar,
mobiliteleri azalır. Yüksek iyonik güce sahip tamponlar keskin bant ayırımı sağlar; fakat artan
dirence paralel fazla miktarda açığa çıkan ısı yüksek sıcaklığa dayanıksız (ör: protein) moleküllerin
denatürasyon problemini ortaya çıkarır.
Bazı elektroforez sistemlerinde tampon ile destek ortam arasındaki bağlantı filtre kağıdı ile
sağlanırken (Şekil 1) diğer sistemlerde destek ortam tamamen tampon içerisine daldırılır.
Güç kaynağı: Elektroforez sistemlerine sabit akım veya sabit voltaj sağlamak amacıyla
ticari olarak elde edilebilen güç kaynakları kullanılır. Elektroforezde, destek ortam içerisinden
geçirilen akım, destek ortamın elektriksel direnci nedeni ile ısı üretimine neden olur. Artan
sıcaklık, tamponun buharlaşmasına, iyon derişimlerinin artmasına, destek ortamının kurumasına,
ayrıştırılmak istenen protein gibi moleküllerin denatürasyonuna ve destek ortam direncini
azaltarak akımın artmasına neden olur. Artan sıcaklık ile doğan bu tür problemler, sistemden
soğuk su (+4C) geçirilerek giderilmeye çalışılır.
EL E KT ROF O R EZ
87
Fraksiyonların boyanması: Çoğu biyolojik bileşik renkli değildir. Bu nedenle, elektroforez
ile ayrıştırma işlemi sonunda fraksiyonların destek ortamı üzerinde yerlerinin belirlenmesi için
görünür hale getirilmeleri gerekir. Fraksiyonların belirlenmesinde çeşitli kimyasal maddelerle
boyama, enzimatik tepkimeler, immünokimyasal tepkimeler kullanılır. Elektroforezde yaygın
olarak kullanılan bazı boyar maddeler ve uygun dalga boyları aşağıdaki tabloda verilmiştir.
Kimyasal boya maddeleri arasında her tür protein için kullanılan “Ponceau S”, “Amido Black”
(Naphthol Blue Black), “Bromophenol Blue” ve “Coomassie Brillant Blue” serisi sayılabilir.
Gümüş ile boyama (Silver nitrate) idrar ve BOS gibi düşük miktarda protein içeren örnekler için
uygulanan çok duyarlı bir yöntemdir. Ayrıştırılan protein enzim aktivitesine sahip ise özgün
substratı kullanılarak enzimatik tepkimeler uygulanır. İmmün tanıma prensibine dayanan antijen
antikor tepkimeleri ile de proteinler duyarlı olarak görüntülenirler. Bunlara ek olarak ayrıştırılan
fraksiyon radyoaktiviteye sahip ise otoradyografi kullanılarak görüntüleme sağlanır.
Tablo I. Elektroforez boyaları
Bileşik
Reaktif
Serum proteinleri
Amido Black (Naphthol Blue Black)
Coomassie Brillant Blue G-250
Coomassie Brillant Blue R-250
Ponceau S
İzoenzimler
Nitrotetrazolium Blue (formazan)
Lipoproteinler
Fat Red 7B (Sudan Red 7B)
Oil Red O
Sudan Black B
DNA
Etidiyum bromür (flüoresan)
BOS proteinleri
Gümüş nitrat
Dalga boyu (nm)
640
595
560
520
570
540
520
600
254-590
-
Güç kaynağı
negatif
elektrot
destek ortam
kapak
pozitif
elektrot
Fitil
(filtre kağıdı)
Tampon çözeltiler
Şekil 1. Yatay Elektroforez sistemi
Soğutma sistemi
88
EL E KT ROF O R EZ
Elektroforez Tipleri
Nişasta jel elektroforezi: Nisaşta jel elektroforezi genellikle makromoleküllerin yüklerine
ve moleküler büyüklüklerine dayanılarak ayrıştırılmasında kullanılan metottur. Agaroz jelde
olduğu gibi hem dikey hem de yatay olarak kullanılabilmektedir. Nişasta jelinin uygun hazırlanışı
diğerlerine göre daha zor olması nedeniyle günümüzde klinik laboratuvarlarda kullanımı yaygın
değildir.
Agaroz jel elektroforezi: Agaroz jel elektroforezi destekleyici ortam olarak bileşenleri
agaroz ve agaropektin olan agarın kullanıldığı kullanışlı bir yöntemdir. Serum proteinlerinin,
hemoglobin varyantlarının, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz izozimlerinin ve lipoprotein
fraksiyonlarının analizinde başarıyla kullanılmaktadır. Agaroz serbest iyonize gruplar içermez iken,
agaropektin HSO4- ve COOH- grupları içerir. Agar yerine agaroz tercih edilir. Tercih nedenleri,
agarozda endozmozisin agara göre daha az olması, proteinlere afinitesinin daha az olması,
kurutulduğu zaman doğal olarak şeffaf kalması ve dansitometrik inceleme için daha uygun
olmasıdır.
Selüloz asetat elektroforezi: Selüloz asetat, selülozun hidroksil gruplarının asetik anhidrit
ile işlenerek elde edilmiş bir termoplastik reçinesidir. Ticari olarak elde edilebilen selüloz asetat
membranları kullanım öncesinde kuru, opak ve kırılgan olup %80 hava boşluğu içerirler. Tampon
ile ıslatıldığında hava boşlukları tampon ile dolar. Örnek ıslatılmış membrana bir aplikatör yardımı
ile uygulanır. Selüloz asetat elektroforezinin avantajı ayrıştırma hızının yüksek oluşu ve
şeffaflaştırılan membranların uzun süre saklanabilmesidir.
Poliakrilamit jel elektroforezi: Bu metotta kullanılan jel bir akrilamit polimeridir. Uzun
zincirli moleküller arasında çapraz bağlanmalar gerçekleşir. Elektroforetik ayırımı sağlayan başlıca
etken bileşiklerin büyüklüğü olup, elektrik yüklerinin önemi daha azdır. %7,5'lik tipik bir
Poliakrilamit jeli yaklaşık 5 nm (50Å) por çapına sahip olup, moleküler elek işlevi gösterir. Büyük
bileşikler göç sırasında küçük olanlara göre daha fazla moleküler elek içerisinde tutulurlar ve daha
yavaş göç ederler.
UYGULAMA
Serum Protein Elektroforezi
Prensip
Serum proteinleri elektriksel ortamda, kendilerini oluşturan amino asitlerin yan zincirlerinin
(-) veya (+) elektrik yük farklılıklarından dolayı anot ya da katoda göç ederler. Bu şekilde protein
fraksiyonları birbirlerinden ayrılır.
Ayıraçlar
1- Barbital tampon ( pH 8,6; iyonik kuvvet 0,045)
7,36g barbital
41,20 g sodyum barbital
Yaklaşık bir litre sıcak saf suda çözülür, soğutulur ve 4 litreye saf suyla tamamlanır. 1 N
NaOH ya da 1 N HCI kullanılarak pH'sı ayarlanır. Üzerine koruyucu olarak %5'lik izopropil
alkoldeki timol çözeltisinden 20 mL konur.
EL E KT ROF O R EZ
89
2- Ponceau-S boyası: Kapsül içeriği (Gelman, bir kapsül 500 mg boya içerir) %5'lik
trikloroasetik asit içinde çözülür ve aynı solüsyonla 100 mL'ye tamamlanır.
3- Yıkama çözeltileri:
%6.5 asetik asit
%15 asetik asit
Metanol (Merck)
4- Liphogel (Gelman): İdrar ya da BOS'da protein elektroforezi çalışırken suyu çekmek
amacıyla kullanılır.
5- Selüloz asetat şeritler (Gelman Sephraphore III)
Teknik
Elektroforez tankına 200 mL kadar tampon konur, tank 45 açıyla eğilerek her iki küvetteki
tampon miktarı eşitlenir.
2,5x15 cm boyutlarındaki selüloz asetat şeritler el değirilmeden kesilerek ikiye bölünür. Tüm
işlemler sırasında şeritlerin üst yüzeyinin sürekli üstte kalmasına dikkat edilmelidir. Kullanmadan
önce şeritlere uygulama noktası, tarih, hasta adı özel elektroforez kalemi ile kaydedilir. Daha sonra
şeritler tampona atılır ve ıslanmaları sağlanır. İki süzgeç kağıdı arasında kurutulup Whatman I
üzerine alınır.
1 L'lik aplikatör ile serumlar aplike edilir. Şeritler tanka katotik olarak yerleştirilir (köprü
aralığı 4,5 cm) ve santimetre başına 0,6 mA akım 45 dakika süre ile uygulanır. Şartlar
elektroforetik uygulamaya göre değiştirilebilir.
Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra şeritler 10 dakika boyada bırakılır. Sonra artık
boyalardan arındırmak amacıyla yıkama işlemi yapılır. Bu amaçla, üç ayrı %6,5'luk asetik asit
çözeltisinde sırayla bekletilir.
Saydamlaştırma için ilk metanol küvetinde 2 dakika, ikincisinde 1 dakika, ve %15'lik asetik
asit içerisinde 2 dakika bekletilir. Temiz cam plaklara şeritler hava kabarcığı kalmayacak şekilde
yerleştirilip fazla sıvı kalıntısı düzgün kenarlı bir lam yardımıyla alınır.
Cam plaklar 10 dakika süreyle 80 C'lik etüvde bekletilerek şeffaflaşması sağlanır. Plak
soğuduktan sonra dansitometrede 525 nm'de okunur. Elde edilen grafikten protein fraksiyonları
% olarak değerlendirilir.
Dikkat edilecek noktalar
Protein elektroforezi serumda değil de plazmada yapılırsa beta ile gamma fraksiyonu
arasında fibrinojen bantı gözlenir.
Kullanılan serum hemolizli olursa yine beta ile gamma fraksiyonu arasında Hb bantı izlenir.
İdrar ve BOS'da protein elektroforezi çalışılacaksa elektroforez işlemine başlamadan önce
Liphogel ile sıvı kısım konsantre edilir.
Dansitometrede okuma yapılacaksa saydamlaştırma işlemine gerek yoktur.
Yorum
Serum proteinlerinin, selüloz asetat elektroforezinde ayrılan bantları oluşturan proteinlerin;
molekül ağırlığı, erişkin plazma düzeyleri ve işlevleri Tablo I'de ve çeşitli hastalıklarda serum
protein elektroforezindeki değişimler Tablo II'de gösterilmiştir.
Aşağıda bazı hastalıkların ve normal serum elektroforez değerlerinin 525nm’ de
dansitometredeki çizimleri ve elektroforez protein bantları bulunmaktadır.
EL E KT ROF O R EZ
90
A- Normal serum
Normal serum protein elektroforez bağıl değerleri:
Albümin
Alfa-1
Alfa-2
Beta
Gamma
%
60
4
8
12
16
g/dL
3,8
0,3
0,7
1,0
1,3
g/dL aralığı
3,4-5,4
0,2-0,4
0,5-0,9
0,6-1,1
0,8-1,5
B- Monoklonal gamopati
C- Akut faz görüntüsü
D- Kronik enflamasyon görüntüsü
E- 1 Antitiripsin yetersizliği
F- Nefrotik sendrom
H- Siroz
EL E KT ROF O R EZ
91
Hemoglobin
Hemoglobin dört globin zincirinden oluşan bir konjuge proteindir. Her bir globinde demir
protoporfirin kompleksinden oluşan hem çekirdeği bulunur. Molekül ağırlığı 65,5 kDa olup
tetramerik yapıdadır. Globin zincirleri iki çift özdeş olmayan polipeptitten oluşmuştur. Yetişkin
hemoglobin A 22 (HbA =22), fötal hemoglobin 22 (Hb F=22) ve hemoglobin A2 ise
22 (HbA2 =22) zincirlerinden meydana gelmiştir.
Şekil 2. Hemoglobin A molekülü
Hemoglobin  zinciri 141 amino asit; ,, zincirlerinden her biri 146 amino asit kalıntısı
içermektedir.
Genetik hastalıkların varolduğu yüzyıllardır bilinmektedir. Hemoglobinle ilgili bir genetik
hastalık olan orak hücre anemisi 1910 yılında Herrick tarafından, talasemi ise 1925 yılında Cooley
tarafından tanımlanmıştır. Ancak bu hastalıkların nedeninin tam olarak aydınlatılması ve tedavi
edici genetik uygulamaların tartışılabilmesi için moleküler genetiğin gelişmesini beklemek
gerekmiştir.
Orak hücre anemisinde hemoglobinin  globin geninin 6. kodonunda adenin yerine timin
geçmiştir. Böylece  globin zincirinde glutamik asit yerine valin değişimi olur ve bu molekülde
yapısal bir değişime neden olur.
Talasemi (Akdeniz anemisi) ise dünyada en yaygın hastalık olarak kabul edilir. Talasemiler,
eritrositler içindeki hemoglobin molekülünün globin alt birimlerinden birinin sentezinin
yapılamaması ya da yetersiz sentezlenmesi ile karekterize kalıtsal bir kan hastalığıdır. Talasemiler
normal insan hemoglobini Hb A’nın (22) tutulumuna göre  ve  talasemiler olarak iki büyük
gruba ayrılır.
Çukurova bölgesinde yapılan araştırmalar  talasemi sıklığının %3,7 ve orak hücre
anemisinin %8,1 gibi yüksek oranda olduğunu göstermiştir.
PRATİK UYGULAMA
Hemoglobin Elektroforezi
Prensip: Alkali pH’da hemoglobin molekülü negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda
doğru göç eder. Yüzey yük değişikliği olan yapısal varyantlar ise farklı göç ederler. Alkali ortamda
selüloz asetat kağıdı üzerine uygulanan kan örneklerine, elektriksel güç uygulanarak basit ve seri
bir şekilde hemoglobin tiplendirilmesi yapılır.
EL E KT ROF O R EZ
92
Ayıraçlar
1- Katot tamponu, pH 8,6
Na-Barbital
5,15 g
Barbital
0,92 g
Bir litre redistile suda çözülür.
2- Anot tamponu, pH 9,1
Tris-aminometan
25,2 g
EDTA
2,5 g
Borik Asit
1,9 g
Bir litre redistile suda çözülür.
3- Boya
500 mg Ponceau-S 100 mL %5’lik trikloroasetik asitte çözülür.
4- Yıkama çözeltisi
Asetik asit
%5’lik
5- Elektroforez koşulları
Süre
Voltaj
Amper
Uygulama
45 dk
190-200 volt
0,75 mA/cm
Katotik
6- Taşıyıcı ortam
Selüloz asetat
Teknik
1. Hemolizat Hazırlanması: EDTA’lı tüplere alınan kan örnekleri santrifüj edilerek
plazmasından ayrılır.
2. Eritrositler serum fizyolojik ile üç defa yıkanır.
3. Hemoliz edici olarak 800 L saf su, 60 L eritrosit üzerine eklenerek karıştırılır.
4. Eşit hacimde anot ve katot tamponu (100 mL + 100 mL) içerisinde selüloz asetat kağıdı
ıslatılır.
5. Filtre kağıdının arasında hafifçe kurutularak üzerine hemolizat tatbik edilir.
6. Örnek uygulaması katotik yapılır.
7. Elektroforez bitiminde kağıtlar 5 dk Ponceau S içerisinde boyanır.
8. Boya artıkları %5’lik asetik asit ile temizlenir.
9. Fraksiyonların miktarlarını bulunmak için dansitometrede çizdirilir.
EL E KT ROF O R EZ
93
Yorum
Normal yetişkin bir kişide selüloz asetat taşıyıcı üzerinde (pH 8,6: 9,1) yapılan
elektroforezde %98 oranında Hb A gözlenir. Hb F %1’in altında olduğu için görülmez.
Aplikasyon noktasına yakın bölgede eritrosit membran artıkları ve karbonik anhidraz eser halde
izlenebilir. Bu kısımda göç eden Hb A2 de iz haldedir. Kordon kanı ve yenidoğan örneklerinde ise
Hb A hemen yanında katotik tarafta Hb F gözlenir.
Orak hücre anemisinde ise taşıyıcılarda Hb A yanı sıra Hb A2 ile Hb F arasında göç eden
Hb S bandı ortaya çıkar. Hastalarda ise Hb A gözlenmez. Bantların büyük kısmı Hb S’dir. Değişik
oranda Hb F izlenebilir.
-talasemi taşıyıcılarda Hb A2 miktarında artış vardır. Hastalarda ise Hb A görülmeyebilir,
Hb F miktarı artmıştır.  talasemi olgularında kordon kanı incelenmesinde Hb A’dan daha hızlı
göç eden (daha anotik ) Hb Bart’s izlenir. Bu Hemoglobin 4 globin zincirinden oluşmuştur.
94
EL E KT ROF O R EZ
Kolayca denatüre olur. Yetişkin hastalarda ise 4 globin zincirden oluşan Hb H izlenebilir. Bu
hemoglobinde Hb A’dan daha hızlı olup kolayca denatüre olabilmektedir.
Hb Oarab, Hb C, Hb E pH 8,6: 9,1’de uygulanan elektroforezde Hb A2 ile aynı yerde göç
ederler. Hb S, Hb D, Hb G aynı yerde bant verirler. Hb S ile diğerlerinin ayrımı "sickling" testi ile
yapılır.
Hemoglobinopati ve talasemilerin kesin değerlendirilmeleri ise DNA analizleri ile sağlanır.
SORULAR
1) Elektroforez nedir? Kısaca tanımlayınız.
2) Elektroforezi etkileyen etkenler nelerdir?
3) Orak hücre anemisi taşıyıcsı olan bir kişinin hemoglobin elektroforezi görüntüsü nasıl
olur?
4) Sağlıklı bir yenidoğanın hemoglobin elektroforezi görüntüsü nasıl olur?
5) Normal serum protein elektroforezinde gözlenen proteinler nelerdir? Bunların bağıl
değerlerini ve miktarlarını belirtiniz.
6) Multipl miyeloma, siroz, analbüminemi durumlarında serum protein elektroforezinde
gözlenen değişiklikler nelerdir?
RUT İN İ DR A R A N ALİ Zİ
95
Laboratuvar
Rutin İdrar Analizi
11
GENEL BİLGİ
Rutin idrar analizi, renal veya sistemik bir hastalık olup olmadığını, bu hastalığın türünü,
nasıl bir gidiş gösterdiğini tahmin etmek için başvurulan basit ve ucuz, ancak çok önemli bir
testtir. Tam idrar incelemesi, fiziksel muayenede veya hastane yatışlarında standart olarak kabul
edilmektedir.
Genellikle rutin idrar analiz işlemleri iki temel bileşenden oluşur.
Makroskobik İdrar Analizi: İdrar fiziko-kimyasal olarak incelenir.
a) Fiziksel İnceleme:
Miktar
Renk
Görünüş
Koku
Dansite
Osmolarite
b) Kimyasal İnceleme:
pH
Şeker
Protein
Safra pigmentleri:
Bilirubin
Ürobilinojen
Ürobilin
Keton cisimleri:
Aseton
Asetoasetik Asit
-Hidroksibütürik asit
c) Mikroskobik İnceleme:
96
İdrar örneğinin toplanmasında aşırı dikkat ve laboratuvara kısa sürede teslimi idrar analiz
sonuçlarını önemli derecede etkilemektedir. Steril, kapaklı örnek taşıyıcısına hastanın adı, örneğin
alındığı tarih ve zaman mutlaka yazılmalıdır. Rutin idrar analizi gerek böbrek işlevlerini saptama,
gerekse diürinal ritm göz önüne alınarak, zamanlanmış idrar örnekleri olarak çalışılabilinir.
Örneğin, ürobilinojenin diürnal atılımın en yüksek değeri saat 1400-1600 arasındadır. 12 saatlik, ilk
sabah idrarı, rast gele idrar örnekleri de kullanılabilir.
İdrarın Fiziksel İncelenmesi
Miktar
Normal yetişkinin günlük idrar miktarı 750-2000 mL arasında değişmektedir. İdrar
miktarının 500 mL’ye kadar azalması veya 2000 mL’ye kadar artması normaldir. Sıcak havalarda,
az sıvı alanlarda, diyare ve dehidratasyonu olanlarda idrar az çıkar. Kahve, çay, su, alkollü içki
kullananlar, kavun-karpuz yiyenlerde, soğuk algınlığı olanlarda, Diabetes mellitus ve Diabetes
insipidusu olanlarda bol idrar çıkar.
Poliüri
 2000 mL/gün,
Oligüri  500 mL/gün,
Anüri
 200 mL/gün veya idrar çıkışı yoktur.
Renk
Normal taze idrarın rengi yenilen gıda maddelerine, idrarın sulu veya yoğun olmasına ve
alınan ilaçlara bağlıdır. Sulu idrar açık sarı renkte, konsantre idrar ise koyu sarı renktedir.
Kırmızı:
Kan (taze idrarda hemoglobin)
Kırmızı pancar yiyenlerde
Porfirinüri
Rifampisin tedavisi
Alkali idrarda fenolftalein
Yeşil-Mavi:
Pseudomonas enfeksiyonları
Metilen mavisi tedavisi
Tetrasiklin tedavisi
Portakal:
Konsantre idrar
Safra boyaları
Mavi-Siyah:
Methemoglobinüri
Melanin pigmenti
Alkaptonüri
İntramüsküler demir tedavisi (beklemiş idrarda)
Soluk:
Diürezis (diüretik kullanımında)
Diabetes mellitus
Diabetes insipidus
Koyu kahverengi:
Bilirubinüri
Hematüri (beklemiş idrarda)
Metildopa tedavisi
Levodopa tedavisi
Süt:
Yağ
97
Görünüş
İdrarın görünüşü berrak, hafif bulanık veya çöküntülü olur. Taze normal idrar berraktır.
İdrarın bulanık olmasının nedenleri arasında fosfatlar, üratlar, iltihap ve bakteriler sayılabilir.
Beyaz ve pembemsi çöküntü asidik idrarda üratlara, beyaz bol miktarda çökelek alkali
idrarda fosfatlara delalet eder.
Koku
Normal taze idrar kendine özgü bir kokuya sahiptir. Kötü koku, idrar örneğinin güvenli
analiz için çok eski olduğunu gösterir. İki saatten daha uzun süre korumasız ve soğukta
tutulmadan toplanan örnekteki kötü koku, kabul edilemeyen bir örneğin göstergesidir.
Koku
Amonyak kokusu
Fare idrarı kokusu
Akça ağaç kokusu
Meyvemsi koku
Tat
Patolojik Durumlar
Üriner sistem enfeksiyonu
Fenilketonüri
Maple syrup hastalığı
Asetonun varlığında
Diabetes mellitus
Patolojik Olmayan Durumlar
Eski idrar
Açlık, diyet, ağır egzersiz, kusma ve ishal
Dansite
Böbreğin yoğunlaştırma yeteneğini ölçmek için kullanılır. Normal idrar dansitesi 1,0151,025 g/mL’dir. İdrarda bulunan çözünmüş partiküllerin miktarı, ağırlığı ve kıvamı ile doğru
orantılıdır. Dansitenin normal sınırları günlük sıvı alımına, hava sıcaklığına, gastrointestinal sıvı
kaybına, terlemeye bağlı olarak 1,003-1,035 g/mL arasında değişebilir.
İdrar dansitesi üronometre (dansitometre) ile ölçülür. İdrar, çapı ve boyu
üronometreninkinden daha büyük bir mezüre konur. Üronometrenin dip kısmında kurşun
kürecikler mevcuttur. Üronometrenin tepesinden baş ve işaret parmakları ile tutularak bir dönme
hızı verilir. Üronometre idrarın içinde serbestçe yüzebilmelidir. Dengeyi bulduğu an idrar
seviyesinin üronometreyi kestiği çizgideki rakam okunur. Üronometre üzerindeki rakamlar 1,0001,060 arasında olup yukarıdan aşağı doğru işaretlenmiştir. Bundan dolayı rakamlar yukarıdan aşağı
doğru okunur ve not edilir. Dansite üronometre ile ölçülebildiği gibi, çok küçük miktarlardaki
idrarlar için refraktometre kullanılabilir.
Belirgin glukozüri veya proteinüri olgularında düzeltme çarpanları daha iyi değerler elde
etmek için dansite ayarlamada kullanılabilir. Her 10 g/L’lik glukoz için 0,004, her 10 g/L protein
için 0,003 değeri çıkartılır.
Osmolarite
Normal böbrek 50-1200 mOsm/kg arasında idrar oluşturma yeteneğindedir. Osmolarite,
böbreğin konsantre etme kabiliyetini dansiteden daha iyi ölçen bir değişkendir. Çünkü dansite,
idrardaki partiküllerin hem sayısına hem ağırlığına bağlı iken, osmolarite ise partiküllerin sayısına
bağlıdır. Osmometre ile ölçülür.
Kimyasal İnceleme
98
İdrarın kimyasal analizi, idrarın anormal içeriklerin tespiti için mükemmel bir göstergedir.
pH
pH ölçümlerinde genel yöntem elektrotlar yardımıyla pH metre kullanılarak yapılmasına
karşın, idrar pH’sı genellikle turnusol kağıdı ile ölçülür. Çünkü pH’daki küçük değişiklikler küçük
klinik anlamlardan kaynaklanır. İdrar pH’sının tayini için mavi ve kırmızı turnusol kağıdı kullanılır.
Bir parça idrara batırılan kırmızı turnusol kağıdı mavi olursa ALKALİ, mavi turnusol kağıdı
kırmızı olursa ASİDİK, hiçbir renk değişikliği olmazsa NÖTR, her ikisi de renk değiştirirse
AMFOTERİK idrar denir.
Günümüzde pH’sı 5 ile 9 arasında olan pH stripleri de kullanılmaktadır.
Üreyi parçalayan ve amonyak açığa çıkaran mikroorganizmalar varlığında, solunumsal ve
metabolik alkalozda, renal tübüler asidozda idrar alkali olur. Diabetes mellitusta, açlıkta yüksek
proteinle beslenenlerde idrar asidiktir.
Şeker
Vücut hücrelerinin birincil enerji kaynağı glukozdur. İdrarda glukozdan başka diğer şekerler
de bulunabilir. Örneğin, laktoz (süt şekeri), früktoz (meyve şekeri) ve pentozlardan arabinoz,
ksiloz ve ramnoz gibi idrarda şekerin mevcudiyeti idrarın yoğunluğunu artırır. Diabetes mellitusta,
çok miktarda karbohidrat alımında glukozüri gözlenebilir.
Yalancı (+) Güçlü yükseltgen ayıraçlar
Yalancı ()  Askorbik asit
Aspirin
Çok miktarda keton
İdrarda şeker tayininde önceleri yükseltgenme indirgenme ilkesinden yararlanılır iken;
günümüzde enzimatik temele dayalı glukoz tayini için stripler kullanılmaktadır.
Benedict Yöntemi ile İndirgen Şeker Tayini
Prensip
İdrarda şeker tayini için seçilmiş basit ve hassas yöntemlerin başında Benedict analiz
yöntemi gelir. Benedict yöntemi ile şeker nitelik ve nicelik olarak iki şekilde saptanır.
İdrarda şeker tayini, şekerlerin (monosakkarit ve disakkaritlerin) alkali ortamda bazı
metalleri indirgeme esasına dayanır. Bundan dolayı yapılarında serbest aldehit veya keton grubu
içeren şekerler bakır vb iyonları indirgerler. Bu özellikten istifade edilerek sıcak ve alkali ortamda
şekerler teşhis edilirler.
CuSO3, NaOH çözeltisi ile tepkimeye girer ve beyaz renkte bakır hidroksit çöker.
CuCO4 +2 NaOH  Cu(OH)2 + Na2SO4
Bunun üzerine indirgeyici bir şeker çözeltisi ilave edilir ve ısıtılırsa sarı renkli Cu(OH) çöker
ve bu da Cu2O’ya çevrilir.
2 Cu (OH)2 + Şeker  2 Cu(OH) + H2O+1/2 O2
2 Cu (OH)  Cu2O+H2O
Bulanıklık veya sarı-kırmızı çökelek oluşması, tepkimenin oluştuğunu gösterir.
Ayıraçlar
99
Niteliksel Benedict:
1- 100 mL arık suda 17,3 g bakır sülfat eritilir.
2- Bir litrelik balona 800 mL arık su, 173 g sodyum sitrat (anhidr), 100 g sodyum karbonat
(susuz) konur. Isıtılarak eritilir. Bakır sülfat eriyiği ikinci eriyiğe her ilavede çalkalanarak eklenir.
Sonra bir litreye arık su ile tamamlanır.
Teknik:
Bir tüpe 5 mL Benedict ayıracından konur. Üzerine 8-10 damla idrar damlatılır. Alevde iyice
kaynatılır. İdrarda şeker varsa koloidal bir çökelti olur. Bu çökeltinin rengi idrardaki şeker
miktarına göre sarı, turuncu ve kırmızı olur. İdrarda çok şeker varsa, tüp ısıtılır ısıtılmaz çökeleğin
rengi tuğla kırmızısı olur. Bu sonuç 4 (+) diye yazılır. Çökeleğin rengi koyu turuncu ise 3 (+),
biraz açık ise 2 (+), sarı ise (+) şeklinde değerlendirilir. İdrarda şeker yoksa sıvının rengi değişmez
veya yeşil olup çökelek teşkil etmez ve berrak kalır.
Niceliksel İdrar Şeker Analizi
Ayıraçlar
1- Niceliksel Benedict
A- 18 g saf kristal bakır sülfat 60 mL arık suda eritilir. 100 mL’ye arık su ile tamamlanır.
B- Bir balona 800 mL arık su konur. İçine 100 g sodyum karbonat (susuz), 200 g sodyum
veya potasyum sitrat, 125 g potasyum sülfosiyanat konur ve ısıtılarak eritilir.
C- 5 g Potasyum ferrosiyanür tartılır, biraz arık suda eritilir. 100 mL’ye arık su ile
tamamlanır.
(C) ayıracından 5 mL (B) ayıracına ilave edilir. Elde edilen bu eriyiğe çalkalayarak (A) ayıracı
eklenir ve son bakır sülfat damlaları biraz su ile karbonatlı eriyiğe aktarılır. Bu işlemin sonunda
elde edilen karbonatlı bakır sülfat eriyiği bir litrelik balon jojeye aktarılır. Biraz su ile balon birkaç
kez 5-10 mL’lik arık su ile çalkalanır ve çalkantılar balon jojeye eklenir. Ayıracın tamamı bir litre
olmalıdır.
2- Standart Glukoz Eriyiği
Analitik terazide 1 g saf kurutulmuş glukoz tartılır ve 100 mL’lik balon jojede 100 mL
içinde eritilir. 5 mL Benedict ayıracını 1 mL %1 oranında glukoz eriyiği indirgemelidir.
Teknik
Isıya dayanıklı bir tüpe pipetle 5 mL niceliksel Benedict ayıracından konur. Bir bıçak ucu
sodyum karbonat (susuz) eklenir. Tüp sol elde bir tahta kıskaçla tutularak alevde ısıtılır.
Kaynamaya başlayınca sağ eldeki dereceli 1 mL’lik pipetle idrar damla damla tüpün içine
damlatılır. Tüpler damlanın ilavesinde iyice kaynatılır. Bakır sülfatın mavi rengi kayboluncaya
kadar bu işleme devam edilir. Beyaz renk oluşunca eldeki pipet okunarak harcama not edilir.
Hesap: 1 mL %1 oranında glukoz eriyiği 5 mL Benedict ayıracını indirgediğine göre:
1
(10)  litrede gram glukoz
x
(x= mL harcanan idrar)
100
Protein
Normal bir şahsın idrarında, standart laboratuvar yöntemleri ile yapılan incelemede, protein
bulunmaz. Ancak duyarlı yöntemler kullanıldığında (RIA ve özel stick’lerle) günde 150 mg’ı
geçmeyen proteinüri söz konusudur. Sağlıklı yetişkinde bu sınır günde 300 mg’a kadar çıkabilir.
İdrar proteininin büyük kısmını glomerüler membrandan geçmiş albümin oluşturur ise de
çeşitli hastalıklarda globülinler gibi daha küçük molekül ağırlıklı proteinlerde bulunur.
Ayıraçlar
Tanret ayıracı: 13,5 g merkürik klorür 250 mL arık suda bir litrelik erlen içinde eritilir. 33,2 g
potasyum iyodürde 250 mL arık suda ikinci bir litrelik erlende eritilir. Her ikisi de iyice eriyince
yavaş yavaş ve her ilavede şiddetli çalkalayarak ikinci eriyik birinciye eklenir. Hacim arık su ile 600
mL’ye tamamlanır. Üzerine yine her ilavede çalkalamak üzere 200 mL Glasiyel Asetik asit (buzlu)
eklenir. Hatasız hazırlanan Tanret ayıracının rengi sarıdır.
Teknik
Bir deney tüpünün üçte ikisine idrar konur. Tüpün alt kısmı baş, orta ve işaret parmağı
arasında hafif eğik tutulur ve alevde idrarın üst yarısı tüp döndürülerek ısıtılır. İçine üç damla
tanret ayıracı konur. Tanretin ilavesiyle idrarın üst yarısında bulanıklık oluşur ve bu bulanıklık
ayıracın ilavesiyle artarsa idrarda albümin var demektir.
Isıtılırken bulanıklık oluşur ayıracın ilavesiyle kaybolur, fakat aynı zaman da idrar köpürürse
idrarda kalsiyum karbonat veya amonyum karbonat var demektir.
Eğer idrar başlangıçta bulanık ise, ısıtılırken bu bulanıklık kaybolur ve asit ilavesiyle bir
değişiklik olmazsa idrarda üratlar var demektir.
Hiç bulanıklık olmazsa idrarda albümin yoktur.
İdrarda Albümin Miktarının Ölçülmesi
İdrarda albümin miktarını ölçmek için kullanılan türlü yöntemlerden biri de Sülfosalisilik
asit yöntemidir.
Prensip
Albümin miktarının ölçülmesi, idrarda mevcut proteinin Sülfosalisilik asit ile oluşturduğu
bulanıklığın, fotometrede bilinen albümin miktarının oluşturduğu bulanıklık ile karşılaştırılması
esasına dayanır.
Ayıraçlar
%3 Sülfosalisilik Asit: 3 g Sülfosalisilik asit 100 mL balon jojede bir miktar arık suda
çözülür ve 100 mL’ye tamamlanır.
Teknik
İdrarda tanret yöntemi ile albümin çıkmışsa, iki tüp alınır. Her birine 2,5 mL idrar konur.
Birinciye 7,5 mL arık su, ikinciye ise 7,5 mL%3 Sülfosalisilik asit eklenir. Tüpler karıştırılır. 10
dakika bekletilir ve 620 nm’de fotometrede köre karşı okunur. Okunan rakamın karşılığı derişim
eğrisinden bulunur.
101
İdrarda Safra Pigmentleri
A- Bilirubin
Hemoglobinin retiküloendotelial sistem tarafından yıkılması ile oluşan bilirubin normalde
idrarda bulunmaz. Koyu sarı-kahverengi renkli köpüklü idrar, konjuge bilirubinin olasılığını
düşündürür.
Ayıraç
Rosin Ayıracı: 0,7 g iyot, 0,5 g Potasyum iyodür 5 mL arık suda eritilir. 100 mL’ye etil
alkol ile tamamlanır.
Teknik
Bir tüpe 3-4 mL kadar idrar konur. Tüp 45 eğik tutulup kenarından üzerine tabaka teşkil
edecek şekilde 1 mL kadar rosin ayıracı konur. İdrarla rosin ayıracının arasındaki bölgede, zümrüt
yeşili bir halka oluşursa idrarda bilirubin var denilir ve böyle bir idrar patolojik kabul edilir.
B- Ürobilinojen
Renksiz bir bileşik olan ürobilinojen, bilirubinin bakteriyel indirgemesi ile bağırsakta oluşur.
Normal idrar az miktarda ürobilinojen içerir (Böbrekler tarafında idrar ile günde 1-4 mg kadar
atılmaktadır, buna karşılık dışkı ile atılım günde 40-280 mg arasında değişmektedir).
Ürobilinojenin ışığa duyarlı bir bileşik olması nedeniyle miktar ölçümünde taze örnek
kullanılmalıdır. Diürinal ritmden kaynaklanan idrar ürobilinojen miktarındaki dalgalanma
nedeniyle ölçüm için saat 1400-1600 arası toplanan örnek tercih edilmelidir.
Ayıraç
Ehrlich Ayıracı: 20 mL konsantre hidroklorik asit 80 mL arık suya eklenir. 2 g paradimetil-amino benzaldehit sulandırılmış asitte eritilir.
Teknik
Bir tüpe 10 mL idrar konur, üzerine 1 mL Ehrlich ayıracı eklenir ve üç dakika bekletilir.
Kiraz kırmızısı renk verirse idrarda ürobilinojen vardır. İdrar direkt analizinde pembe-kırmızı
renge dönüşüyorsa, örnek 1/40 oranında seyreltilip, deney tekrarlanır. Yine pembe renk
görülmesi patolojik düzeyi yansıtır.
C- Ürobilin: Bilirubinin bağırsakta bakteriyel indirgenmesiyle oluşan ürobilinojen ve
sterkobilinojen, dışkının hava ile temasıyla oksitlenerek, dışkı ve idrarın normal rengini veren
turuncu-kırmızı renkli ürobilin ve sterkobilini oluşturmaktadır.
Ayıraç
Schlessinger Ayıracı: 50 g Çinko asetat tartılır ve 1 litre alkol içine konur. Bu su banyosu
üzerinde 50oC ısıtılır. Çinko asetat tam eriyince bir şişeye konur ve soğumaya bırakılır. Soğuyunca
şişenin dibinde kristaller oluşacaktır. Üstteki sıvı kullanmaya hazırdır.
Teknik
Bir tüpe 10 mL idrar, 10 mL Schlessinger ayıracı konur. Tüp alt üst edilerek karıştırılır. 10
dakika bekletilir. Filtre kağıdından geçirilir. Süzüntü siyah zemin üzerine konur. Yeşil bir
flüoresans görülürse idrarda ürobilin var demektir.
102
Keton Cisimleri
Lipit kaynaklı moleküller olan keton cisimleri, enerji sağlanmasında kullanılmaktadır. Suda
çözünen bu moleküller karaciğerde yağ asiti yükseltgenmesi sırasında oluşmaktadır.
Keton cisimleri (Aseton, Asetoasetik asit ve -hidroksibütürik asit) düşük karbohidrat
rejiminde, açlıkta, uzamış kusmada, dehidratasyon durumlarında, ateşli hastalıklarda ve kontrolsüz
Diabetes mellitusta idrarda saptanır. İdrarda aseton çok çeşitli yöntemlerle aranabilir. Bunlardan
en fazla kullanılanı aşağıda tarif edilmiştir.
Ayıraç
Aseto test: 1 g Sodyum Nitroprussiyat havanda iyice dövülerek ezilir. 20 g Amonyum
sülfat, 20 g sodyum karbonat (susuz) karıştırılır. Kapalı bir cam kapta tutulması gereklidir.
Teknik
Bir süzgeç kağıdı üzerine çakı ucu kadar aseto test karışımı konur. Üzerine birkaç damla
idrar damlatılır. Patlıcan mor renk asetonun varlığını gösterir.
Not: Ketonlar için kullanılan sodyum nitroprussiyat tepkimesi, birincil keton cismi olan hidroksibütürik asiti değil, aseton ve asetoasetik asiti belirler. Sodyum nitroprussiyatın birincil
olarak asetoasetik asitle tepkidiğini, asetonun asetoasetik asite kıyasla yalnızca %20’lik bir tepkime
yeteneğine sahip olduğunu bilmek önemlidir.
İdrarın Mikroskobik İncelenmesi
İdrar sedimentinin doğru mikroskobik incelemesi üriner sistemi etkileyen infeksiyon,
inflamasyon ve neoplastik durumların erken tanısında önemlidir. Standardize edilmiş ışık
mikroskobisi en yaygın teknik olarak uygulanır. Mikroskobik analizin standardize edilmesi,
belirsizlikleri azaltmak için gereklidir.
İdrar sedimentinin, içindeki şekilli elemanların ve hücrelerin iyi görülebilmesi için, yüksek
osmolariteye ve asit pH’a sahip, taze elde edilmiş sabah idrarından yapılması, tercih edilmelidir.
İdrarda mikroskobik muayene yapılabilmesi için idrar iyice karıştırılır, bir santrifüj tüpüne bir
miktar idrar konur. Dakikada 1500-2000 devir yapan bir santrifüjde, 5 dakika kadar santrifüj edilir.
Üstteki sıvı dökülür. Dipte kalan çökelek, tüp hafifçe laboratuvar masasına vurularak karıştırılır.
Bir damlası temiz bir lam üzerine akıtılır. Hava kabarcıklarının oluşmasına engel olacak şekilde
temiz bir lamel damlanın üzerine kapatılır. Mikroskopta orta büyüteçte, damla incelenir.
Damlanın büyüklüğü lamel kapatılınca lamelin dışına sızmayacak kadar olmalıdır.
NORMAL İdrar Sediment Bileşenleri
Hücreler
Kan Hücreleri:
-Eritrosit
-Lökosit
Epitel Hücreleri
-Skuamöz Epitel
-Hücreleri
-Renal Tübüler Epitel
-Hücreleri
-Ürotelial Epitel
Hücreleri
Kristaller
Asidik İdrar
-Amorf Kristaller
-Ürik Asit Kristalleri
Nötral İdrar
-Kalsiyum Oksalat Kristalleri
-Hipürik Asit Kristalleri
Alkali İdrar
-Triple Amonyum Fosfat
Kristal.
-Amonyum Biürat Kristalleri
-Kalsiyum Karbonat Kristalleri
Silindirler
Hiyalen Silindirler
Granüler Silindirler
Diğerleri
Mukus
Sperm
Mikroorganizmalar
-Bakteri
-Mantar
Kontaminasyon
-Lifler
-Polen
103
ANORMAL İdrar Sediment Bileşenleri
Hücreler
Kan Hücreleri
-Eritrosit
-Lökosit
Epitel Hücreler
-Renal tübüler epitel
hücreler
-Oval yağ cisimcikleri
Kristaller
Asit İdrarda
-Bilirubin kristalleri
-Kolesterol kristalleri
-Sistin kristalleri
-Lösin kristalleri
-Tirozin kristalleri
-İlaca bağlı kristaller
Silindirler
Aselüler Silindir
-Hiyalen silindir
-Granüler silindir
-Balmumu silindir
-Yağ silindir
Selüler Silindir
-Eritrosit silindir
-Lökosit silindir
-Bakteri silindir
-Epitel silindir
Kristal silindir
Diğerleri
Parazit
Hücreler
Kan Hücreleri
Eritrosit: Eritrositler, idrar mikroskobisinde küçük, içi pembe, yuvarlak ve parlak gergin
halkalar şeklindedir. Hipertonik idrarda ise eritrositlerin halkasal gergin görüntüsü kaybolur,
büzülmüş, suyunu kaybetmiş hücreler halinde görülür. Hipotonik idrarda halka büyümüş,
eritrositler şişkin bir manzara arz ederler. Eritrositler çekirdeksiz olup, asetik asit ilavesiyle
çözünürler.
Mantarlar (özellikle Candida sporları), yağ damlaları, hava kabarcıkları, bazı kristaller
(özellikle atipik kalsiyum oksalat kristalleri) mikroskobik muayene de eritrositler ile karıştırılabilir.
Candida sporları boya almamakla eritrositlere benzer, fakat renksizdirler ve oval olup tomurcuklar
şeklinde çoğunlukla ikili, üçlü sıralar teşkil ederler. Atipik kalsiyum oksalat kristalleri çok keskin
kenarlarıyla, boya alması ve irili ufaklı olmasıyla eritrositlerden ayrılırlar.
Normal bir şahsın santrifüj edilen idrarından elde edilen sedimentin bir mikroskop
sahasında incelenmesi ile 2 eritrositten fazlası, genellikle patolojik kabul edilir. Bu miktar, 1mL
kanın beşte birinin idrara karışması olarak düşünülebilir.
Lökosit: idrarda lökositler, eritrositlerden daha büyük, yuvarlak içlerinde nüvelerin veya
granüllerin görülebildiği hücrelerdir. Lökositler asetik asitte erimezler, tek tük veya kümeler
halinde bulunurlar.
Lökosit
Eritrosit
Büzülmüş Eritrosit
Lökositlerin normal atım oranı, her üç sahada bir lökosit kadardır. Bu da mL’de 3000 hücre
veya yaklaşık 200.000 hücresaat’e karşılık gelir. Yükselmiş lökosit sayısı (4.000.000 hücre/saat)
104
İdrar yolları infeksiyonunda, Glomerülonefritte, Analjezik Nefropatide, Renal Kolikte
saptanabilir.
Epitel Hücreleri
Renal Tübüler Epitel Hücreleri: Lökositten biraz daha büyük, yuvarlak, santral nükleuslu
20 nm büyüklüğündedir. İdrarda seyrek olarak bulunur. Epitel bazal membranında ve tübüler
yaralanmalarda sayıları artar.
Skuamoz Epitel Hücreleri: Mikroskobik görünümü, büyük, şişman, irregüler şekilli
hücrelerdir. Küçük santral çekirdek içerir.
Ürotelial Epitel Hücreler: Yuvarlak veya armut şeklinde olan epitel hücrelerinin, kuyruk
benzeri çıkıntısı bulunur. Normalde idrarda nadir saptanırken, mesane ve renal pelvis
hastalıklarında sayısı artar.
Epitel hücreleri
Oval Yağ Cisimcikleri: Yüksek kırıcılığı olan, lipitle yüklü renal epitel hücrelerdir. İdrarda
saptanması halinde, tübüler epitel dejenerasyonu sonucu proteinin fazla miktarı akla getirilmelidir.
Oval yağ cisimcikleri nefrotik sendrom için patognomoniktir.
Yağ Damlacıkları: Hücresel yapısı yoktur, serbest olarak bulunabilir. Yüksek kırıcılığı olan
damlacıkların büyüklükleri farklıdır. Normalde idrarda saptanmaz. Kontaminasyonda veya şiddetli
renal disfonksiyonda gösterilebilir.
Kristaller
Kristalin oluşumu, partiküllerin satürasyonuna veya kristalin çözünebilirlik özelliklerindeki
değişikliğine dayanır. İdrar pH’sı gözlenen kristalin tipinde önemli bir rol oynar. Taş oluşumu,
metabolik bozukluklar veya tedavi düzenlenmesi dışında kristallerin klinik önemleri azdır. Kristal
oluşumu, çeşitli kimyasal bileşenlerin doygun olduğu an veya idrar daha soğuk ısılarda
saklandığında, değişmiş çözünürlüklere maruz kaldığında, meydana gelir. Albümin gibi bazı
kimyasallar kristalizasyona engel olur. 37C’ye ısıtıldığında birçok kristal kaybolur.
105
Triple Amonyum Fosfat Kristalleri: İdrar, idrar yollarında iken veya idrar atıldıktan
sonra, alkalik fermantasyona uğramışsa, mikroskopta triple amonyum fosfat billurları görülür.
Ancak, nötral veya asit idrarda da meydana gelebilir. Triple amonyum fosfat kristalleri renksizdir,
en çok tabut biçiminde olur, bazen yıldız şeklinde de görülebilir. Asetik asitte çözünür.
Kronik piyelitte, paraplejide, kronik sistitte bu kristallere idrarda rastlanabilir.
Kalsiyum Oksalat Kristalleri: İdrarda normalde de bulunabilen bu kristaller, hidroklorik
asit içinde çözünebilir, ama asetik asitte çözünmez. Renksiz olan kristaller, zarf şeklinde, köşeden
köşeye çizgileşme gösteren, parlak kristallerdir. Sıklıkla asidik idrarda görülürse de nötr veya alkali
idrarda da saptanabilir.
Diabetes mellitusta, kronik karaciğer ve böbrek hastalıklarında, etilen glikol
zehirlenmelerinde idrarda bu kristallerin sayısı fazlaca görülür. Normal bireylerde, oksalattan
zengin beslenme sonrası veya yüksek C vitamini alımından sonra bulunabilir.
Triple fosfat (hızlı oluşmuş kristal)
Triple fosfat (yavaş oluşmuş kristal)
Kalsiyum oksalat kristalleri
106
Kalsiyum Karbonat Kristalleri: Renksiz, küçük küresel şekilli, büyük miktarda veya
parçalar halinde olabilir. Alkali pH’da meydana gelir. Asetik asitte çözünebilir. Klinik önemleri
yoktur.
Kalsiyum Fosfat Kristalleri: Renksiz, uzun, ince prizmalar veya iğne kümeleri şeklindedir.
Alkali idrarda oluşurlar ve asetik asitte çözünürler.
Kalsiyum Sülfat Kristalleri: İdrarda ender bulunur ve yalnız asit idrarlarda oluşur. İnce,
uzun, renksiz iğneler halinde kristalleşir. Asetik asitte erimezler. Bulunması, klinik önem arz
etmez.
Amorf Ürat Kristalleri: Sarı veya kırmızı renkli, küçük granüller şeklindedir. Soğutmada
pembe presipitasyon (çökelti) verir. Asit veya nötral pH’da oluşurlar. 60C’de ve alkalide
çözünürler. Asetik asitte çözünmez, klinik önemleri yoktur.
Sodyum Ürat Kristalleri: Rengi sarıdan renksize kadar değişir. İğne veya desteler
şeklindedir. Klinik önemleri yoktur.
Ürik Asit Kristalleri: Limon benzeri, kama, rozet ya da halter şeklinde kristallerdir. Sarıkahverengi renkli olan kristaller genelde asit idrarda bulunur. Alkali solüsyonlarda çözünebilir
(Sodyum Hidroksit), alkol ve asit içinde çözünmez. İdrarda saptanması patolojik bir durumu
göstermez. Fazla miktarda ürik asit kristalleri böbrek taşlarında, gut’da, akut ateşli durumlarda,
kronik nefritte saptanabilir.
107
Ürik asit kristalleri
Asidik idrarda,
A. Çeşitli formlarda ürik asit kristalleri
B. Kalsiyum oksalat kristalleri
C. Amorf ürat kristalleri
Hipürik Asit Kristalleri: Renksiz ya da sarı-kahverengi renkli, uzamış prizmalar veya ince
iğneler şeklinde olabilirler. Asit ya da nötr idrarda bulunur. Alkali solüsyonda, su içinde
çözünebilir, asetik asitte çözünmez. Yüksek miktarda benzoik asit içeren meyve ve sebze
diyetleriyle ilişkilidir.
Sistin Kristalleri: Renksizdir. Eşit veya eşit olmayan kenarlı altıgen tablolar halinde
kristalleşir. Tek veya gruplar halinde görülür. Asit idrarda bulunur. HCl, amonyakda çözülür.
Asetik asit, alkol eter ve suda çözünmez. Sistin reabsorbsiyonunu önleyen kalıtsal hastalıklarda,
Doğumsal Sistinozis veya Sistinüride, böbrek taşlarında idrarda fazla miktarda sistin kristallerine
rastlanır.
Lösin Kristalleri: Sarı veya kahverengi renkli ışınsal ve konsantrik çizgilenmeler içeren
küreler şeklindedir. Asit idrarda bulunur. Sıcak asetik asit, sıcak alkol ve alkalide çözünür, HCl’de
108
çözünmez. Maple Syrup ve ağır karaciğer hastalığında lösin ve tirozin beraber bulunabilir.
Karaciğerin terminal sirozunda ve viral hepatitte idrarda lösin kristallerine rastlanabilir.
Tirozin Kristalleri: Buğday demeti şeklinde ve siyah renktedir. Asit idrarda bulunur. Asetik
asit, alkol ve eterde çözünmez. Normalde idrarda bulunmaz. Tifo, çiçek, lösemi, ağır karaciğer
hastalığında, tirozinozisde idrarda tirozin kristallerine rastlanabilir.
Kolesterol Kristalleri: Muntazam, bazen de gayri muntazam, renksiz, saydam tablalar
şeklindedir. Asit veya nötr idrarda bulunur. Kloroform, eter ve sıcak alkolde çözünebilir. İdrarda
ender görülür. Büyük doku yıkılmaları, nefrit, nefrotik sendrom, lipidüri, lenfotik tıkanıklık
durumlarında idrarda saptanabilir. Kolesterol, dipteki idrar çökeleğinde olmayıp, üstteki berrak
sıvının üzerinde bir zar halinde bulunur.
Bilirubin Kristalleri: Kahverengi-sarı renkli, granüler veya kümeler şeklindedir. Asit
idrarda bulunur. Kloroform, asit ve alkalide çözünür, alkolde ve eterde çözünmez. Tıkanma
sarılığında idrarda gözlenir.
Sülfonamit Kristalleri: Sarı-kahverengi renkli, iğne benzeri kümeler veya desteler şeklinde
görülür. Asit idrarda bulunur. Sülfonamit terapisinde idrarda sülfonamit kristalleri ve onların asetil
türevleri görülür.
Ampisilin Kristalleri: Renksiz, ince uzun iğne şeklindedir. Asit pH’de çözülür. Yüksek doz
parenteral ampisilin uygulamasında idrarda görülür.
Sistin kristalleri
Hipürik asit kristalleri
a. Lösin kristalleri
b. Tirozin kristalleri
Kolesterol kristalleri
Sülfonamid kristalleri
109
SİLİNDİRLER
İsminden de anlaşılacağı gibi sedimentin bu elemanları silindir şeklinde, kenarları paralel,
uçları yumuşak ve protein yapısında elemanlardır. Genellikle distal tübülüslerde akımın yavaş,
osmolaritenin ve H+ iyon derişiminin yüksek olduğu zamanlarda silindirlerin oluşumu kolay
olmaktadır.
Silindirler, üromükoitten (Tamm-Hosfall mukoprotein) oluşur. Üromükoit henle kulpunun
çıkan kolundaki renal tübüler hücreler tarafından üretilir. Silindirler, çöken üromükoiti takiben
idrar stazının bir sonucu olarak meydana gelir. Silindir oluşumuna eşlik eden faktörler artmış
protein derişimi, tuzlar ve düşük idrar pH’sıdır.
Oluşmuş bu silindirik elementlerin görünümü orijinal olarak şekillendikleri renal tübüler
lümenin şekli ve çapını yansıtır.
Hiyalen Silindirler: Mikroskopta çok güç görülürler. Silindirlerin bir ucu yuvarlak, diğer
ucu ise bıçakla kesilmiş gibidir. Bazen içlerinde bir veya birkaç hücre bulunabilir. Hiyalen
silindirler yalnız protein pıhtısından meydana gelir. Akut Nefrotik Sendrom, Akut
Glomerülonefrit ve Nefrotik Sendromda rastlanabilir. Dehidrate çocuklarda, böbrek sağlam
olmasına rağmen bu silindirlere sıklıkla rastlanır. Sağlıklı bireylerde ağır egzersiz sonrası
bulunabilir.
Granüler Silindirler: Çeşitli glomerülonefritlerde görülen granüllü silindirler daha önce
varolan hücre silindirlerinde eritrosit, lökosit veya epitellerin dejenere olup, parçalanması
sonucunda oluşurlar. Granüler silindirler kenarları düzgün, içi bazen ince taneciklerle dolmuş
silindirlerdir. Uçları yuvarlak veya kesiktir. Çeşitli Nefritik ve Nefrotik Sendromda, bilhassa Akut
Glomerülonefritde bol miktarda bulunur. Sağlıklı bireylerde ağır egzersiz sonrası oluşabilir.
Yağ Silindirleri: Yağ globülleri, oval yağ cisimcikleri şeklinde veya serbest haldedir. Çeşitli
büyüklükte olabilirler. Yüksek kırıcılık indeksine sahiptir. Normalde idrarda bulunmaz. Nefrotik
Sendrom, Diabetes mellitus, Çinko zehirlenmesi, Ezici Yaralanmalarda idrarda saptanabilir.
Mum Silindirleri: Yüksek kırıcılık indeksine sahip silindirler, muhtemelen granüllü
silindirlerin dejenere olmasıyla oluşur. Tirbüşondaki kıvrımları andıran, sarımtırak renkte
silindirlerdir, büyüklükleri değişiktir. Normalde idrarda saptanmazken, uzamış stazlarda, tübüler
obstrüksiyonda, akut kronik renal hastalıklarda, malin hipertansiyonda, Diabetes mellitusta
saptanabilir.
Epitel Hücre Silindirleri: Kökenlerine göre büyüklükleri değişir. Tübülerden gelenlerin
eni dar, üreterden gelenlerin ise eni geniştir.
Eritrosit Silindirler: Eritrosit silindirleri, eritrositten meydana gelmiştir. Varlığı aşikar bir
glomerüler lezyonu ve özellikle aktif bir glomerülonefriti gösterir. Akut Nefrotik Sendrom için
patognomoniktir.
Lökosit Silindirler: Hiyalen silindir içine tıka basa lökositlerin girmesi ile ortaya çıkar. Bol
piüri ile beraber görülürse, interstisyel bir nefrit (piyelonefrit) için karakteristik kabul edilebilir.
Eritrosit silindirleri ile beraber görüldüğünde glomerülonefrit düşünülmelidir. Normalde idrarda
bulunmaz. Renal İnflamasyon, Piyelonefrit, Kronik Renal Hastalık, Akut Glomerülonefritte
gözlenir.
110
Karışık Silindirler: İçlerinde şekilleri bozulmamış lökosit, eritrosit, epitel hücreler, yağ
silindirlerin hepsini veya bir kaçını birden içeren, aynı zamanda granülasyon gösteren silindirlerdir.
Normalde idrarda yoktur. Varlığı nefronun iki ayrı parçasının da olaya iştirak ettiğini gösterir.
Nefritik ve Nefrotik Sendromda görülebilir.
Diğerleri
1-Sperm
2-İdrar yolları filamanları
3-Doku artıkları
4-Bakteriler
5-Maya hücreleri
6-Parazit
7-Yabancı cisimler:
-Nişasta tanecikleri
-Saç, tüy, kas lifleri
-Yağ tanecikleri
-İplik, pamuk
Çoğu kez yeterli hijyene dikkat edilmeyen örneklerde görülürler.
a. keten lifleri
c. tavuk tüyü
e. patates nişastası granülleri
g. buğday nişastası granülleri
i. kas lifleri
l. yağ globülleri
b. pamuk lifleri
d. saç
f. pirinç nişastası granülleri
h. hava kabarcıkları
k. bitki hücreleri
111
OR AL G LU K OZ T OL E R AN S T E ST İ
112
Laboratuvar
Oral Glukoz Tolerans Testi
12
ORAL GLUKOZ TOLERANS TESTİ
Genel Bilgi
Oral Glukoz Tolerans Testi
Oral glukoz tolerans testi, (OGTT) ağız yoluyla belli miktarda glukoz verilmesinden önce
ve sonra plazma glukoz düzeylerinin seri ölçümüne dayanan bir testtir. Günümüzde sağlıklı
bireylerde elde edilmesi gereken düzeylerle, çeşitli hastalık durumlarında gözlenen değerler
saptanmış durumdadır.
OGTT Yapılmadan Önce Uyulması Gereken Kurallar:
1. Testten 3 gün önce kişi günlük 150-200g karbohidrat alacak şekilde diyetini ayarlamalı,
2. Aktivitesini normal olarak devam ettirmeli,
3. 10-16 saat açlıktan sonra teste başlanmalı,
4. Bağırsak paraziti yönünden kişi kontrol edilmelidir.
Uygulama:
Erişkinler için önerilen ideal yükleme miktarı 75g susuz glukozdur. Bazı kaynaklar 100 g da
önermektedir. Çocuklar için önerilen miktar 1,75g kg’dır.
Önce açlık plazma glukoz düzeyini belirlemek amacıyla kan alınır. Kan alımından sonra, 75g
glukoz 250-300 mL su (2 adet limonun suyu ile karıştırılarak) içinde çözülerek, 5 dakika içerisinde
hastanın içmesi sağlanır. Glukoz alımını izleyen 2 saat boyunca her 30 dakikada tekrar kan alınır.
Eş zamanlı idrar alımı da önerilir.
113
O’sullivan testi: Hamilelerde ise farklı bir tarama testi yapılmaktadır. Açlık kan şekeri için
kan alımından sonra, 50g susuz glukoz yüklemesi yapılır. Eğer 1. saat plazma glukoz düzeyi 140
mg/dl üzerinde ise esas yükleme testi yapılması tercih edilir.
OGTT, Diabetes mellitus (DM) tanısı koymak için nadiren gerekmektedir. Birçok diabetik
hastanın açlık ya da postprandiyal kan şekeri düzeyine bakılarak ve klinik ile uyumu dikkate
alınarak hastalık tanısı koyulabilmektedir.
Laboratuvarda
OGTT
değerlendirilmesi
enzimatik
glukoz
tayin
yönteminden
yararlanılarak yapılacaktır.
Glukoz Miktar Tayini(Trinder Yöntemi)
Prensip: Glukoz oksidaz (GOD) enzimi glukozun glukonik asit ve hidrojen perokside
oksidasyonunu katalizler.
Glukoz Oksidaz
βD - Glukoz  O2 
 Glukonikas it  H 2O2
Peroksidaz
H 2O2  Redükte kromojen (renksiz) 
 Okside kromojen (renkli)  H 2O
Açığa çıkan H2O2, Peroksidaz (POD) enzim varlığında kromojenik oksijen akseptörü olan
4-aminoantipirin ve fenol eklenmesiyle kırmızı renkli kinon (kinonimin) bileşiği oluşturur. Oluşan
rengin yoğunluğu örnekteki glukoz konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Ayıraçlar :
Ayıraç A
: Fosfat tamponu 100 mmolL
Fenol 9 mmolL, pH 7,5
Stabilize ediciler.
Ayıraç B
: 4-aminoantipirin 0,5 mmolL
POD  2000
GOD 
Standart
UL
10 KUL
: 100 mgdl (5,5 mmolL) glukoz standardı.
114
Not: Glukoz oksidaz enzimi sadece -D-Glukoz ile tepkime verdiğinden ortama
mutarotaz enzimi eklenerek -D-Glukoz önce -D-Glukoza dönüşerek reaksiyonun yürümesi
sağlanır.
Kromojen ayıracın hazırlanması: Ayıraç B içeriği Ayıraç A’ya eklenir. Birkaç dakika
dikkatlice ve yavaşça karıştırılır. Kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesi beklenmelidir.
Kromojen ayıracının stabilitesi: 2-8 oC’de 60 gün
Örnek: Serum, plazma, BOS ve idrar olabilir.
İdrar glukozuna bakılırken, örnek 110 oranında distile su ile sulandırılır.
Analiz Yöntemi:
Dalga boyu
510 nm
Küvet kalınlığı
1 cm
37 oC
Isı
Kör
Ayıraç körü
Reaksiyon
Son nokta
ÖrnekAyıraç (ideal)
1100
Uygulama:
Ayıraç körü
Örnekler
Standart
Distile su (L)
50


Örnek (L)

50

Standart (100mg/dl) (L)


50
Kromojen ayıraç (mL)
3,0
3,0
3,0
Tüpler karıştırılır, 37 oC’de 15 dakika inkübe edilir. Ayıraç körüne karşı 510 nm’de örneğin
(AÖ) ve standardın (As) absorbansları ölçülür. Oluşan renk eğer direkt güneş ışığına maruz
kalmazsa en az 2 saat dayanıklıdır.
115
Hesaplama :
Örnek derişimi (glukoz mg/dL) =
AÖ
x 100
AS
ya da
Örnek derişimi (glukoz mmol/L) =
AÖ
x 5,5mmol/L
AS
Glukoz Referans Değerleri:
Serum-Plazma (Açlık)
60-110 mgdL
(3,3-6,0 mmolL)
BOS
45-80 mgdL
(2,5-4,7 mmolL)
İdrar
 0,5 g24 saat
( 28 mmol24 saat)
Yöntemin doğrusallığı  600 mgdL’dir.
OGTT’nin Yapılması Gereken Durumlar;
1. Gestasyonel DM tanısı,
2. Bozulmuş glukoz toleransının tanısı (açlık glukoz düzeyi 100-140 mg dL arasında olanlarda),
3. Açıklanamayan nefropati, nöropati ya da retinopatisi olup da rastgele bakılan plazma glukoz
düzeyi 140mg dL’nin altında olan bireylerde,
4. Epidemiyolojik veriler için populasyon taramaları için OGTT’inden yararlanılır.
Yorum:
WHO’ya göre 75g’lık OGTT sonuçlarının yorumu:
Açlık
2 saat
Normal
<140 mg dL (7,8 mmol/L)
<140 mg dL (7,8 mmol/L)
BozulmuşGlukozToleransı
<140 mg dL (7,8 mmol/L)
140-200 mg dL (7,8 – 11,1 mmol/L)
DM
140 mg dL (7,8 mmol/L)
ya da  200 mg dL (11,1 mmol/L)
116
Glukoz Yükleme Grafiği
180
170
Glukoz konsantrasyonu (mg/dL)
160
150
140
130
Normal
Abnormal
120
110
100
90
80
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Glukoz yükleme sonrası zaman (saat)
Ayrıca gebelik, oral kontraseptif kullanımı, hipertiroidi, kronik renal yetmezlik gibi
durumlarda da glukoz tolerans bozukluğu gözlenebilir.
Kronik renal yetmezlikte insulin rezistansına bağlı olarak glukoz tolerans bozukluğu
oluştuğu düşünülmektedir.
Gebelikte açlık plazma glukozu genellikle hafifçe düşer, fakat postprandiyal glukoz
derişimi yükselir. Hamilelik glukoz tolerans bozukluğuna yol açabilir. Bu muhtemelen artan seks
hormonlarının derişimi bağlı olarak insulin rezistansının gelişmesi ile ilişkilidir.
Gestasyonel Diabetes mellitus açısından özellikle obes’ler, DM aile öyküsü olanlar ve daha
önce 4 kg ya da üzerinde bebek doğurma öyküsü olanlar en fazla risk grubu taşıyanlardır. Ancak
tüm gebelerde tarama testinin yapılması önerilmektedir. Ayrıca gebelerde sık görülen glukozüri de
klinisyenleri bu testi istemeye zorlamaktadır. Ancak dikkat edilmesi gereken nokta, gebelerde renal
glukoz eşik değerinin (Normal sınır: 180 mgdL) düşmesi nedeniyle glukozüri olmaktadır. Ancak
her glukozüri saptanan gebede gestasyonel glukoz tolerans bozukluğu ya da DM saptanacak diye
bir kural yoktur.
117
OGTT’ yi Etkileyen Faktörler:
OGTT’si açlık plazma glukoz düzeyinin tayininden daha duyarlı olmasına rağmen, birçok
faktörlerce etkilenmesinden dolayı değişkenlik gösterebilmektedir. Bu faktörler:
Testten Önce;
 Karbohidrat alımı,
 Gastrointestinal cerrahi ve malabsorbsiyon,
 Östrojenler,
 Yaş,
 Kilo.
Test Sırasında;
 Postür,
 Anksiyete,
 Kafein alımı,
 Sigara içimi,
 Günün hangi saatinde yapıldığı.
ÜR E A N AL İZİ
117
Laboratuvar
Üre Analizi
13
GENEL BİLGİ
Amino asitlerden elde edilen amino gruplarının esas atılış şeklidir. İdrarda bulunan azotlu
bileşiklerinin %90’ını oluşturur. Üredeki azotlardan birisi NH3’den, diğeri ise aspartattan elde
edilirken, karbon ve oksijen CO2’den elde edilir. Üre döngüsü karaciğerde gerçekleşir. Kan yoluyla
böbreklere taşınarak %90’ı idrarla, %10’u da sindirim sistemi yolu ile atılır.
Şekil 1. Üre molekülünün açık formülü.
Nonprotein Nitrojen Bileşikleri
Serumun nonprotein nitrojen (NPN) kısmı, protein dışındaki bütün nitrojenli bileşikler
içinde bulunan nitrojenden oluşur. Plazmada on beşten fazla NPN bileşikleri vardır. Üre nitrojeni
toplamın %45’ini oluşturur. Ürenin günlük atılımı 25-30 gramdır. Plazmada ve idrardaki bulunan
NPN bileşikleri ve oranları Tablo 1’de gösterilmiştir.
Tablo 1. Plazma ve idrarda bulunan NPN bileşikler.
Molekül
Plazma
İdrar
Üre
%45
%55-90
Amino asit
%20
%1
Ürik asit
%20
%1-1,5
Kreatinin
%5
%2-3
Kreatin
%1-2
NH3
%0.2
%10-20
Üre Ölçüm Yöntemleri
1- İndirekt Yöntemler
Üreaz ile hidroliz sonucu oluşan amonyum miktarı ölçümüne dayanır. Temel tepkime
aşağıdaki gibidir.
ÜR E A N AL İZİ
118
a) Nessler yöntemi.
b) Berthelot yöntemi. Bu yöntemin prensibi, ürenin üreaz ile hidrolizi sunucu oluşan
amonyum iyonunun hipoklorit ve fenol ile tepkimeye girerek alkali ortamda indofenol
oluşturması esasına dayanır.
NH2

Üreaz
H2O
C=O + H2O  2NH3 + CO2  2NH  + CO 2
4
3
o

NH2
37 C
HO
NH4 + 5NaOCl
+ Fenol
 İndofenol + 5NaCl
+ 5H2O
Tepkimeyi katalize etmek için nitroprussid kullanılır. İndofenolün absorbansı 560 nm dalga
boyunda okunur.
c) Glutamat dehidrogenaz yöntemi
d) Oksidoredüktaz yöntemi
İndirekt yöntemler üre veya amonyum tuzları ile standardize edilebilir. Bu yöntemler
amonyum kontaminasyonu riski taşımaz.
2- Direkt yöntemler
a) Fearon yöntemi
b) Fosse yöntemi
Fearon tepkimesi şu şekildedir;
Diasetil monoksim
+ H2 O
 Diasetil
+ Hidroksilamin
Isı
Üre + Diasetil
 Diazin
+ 2H2O
Ortama tiyosemikarbazit ve Fe III ilave edilerek renk stabilize edilir.
Örnekleme
Üre miktarı analizinde hem serum hem plazma yanında idrar da kullanılır. Antikoagülan
olarak amonyum ve florür tuzu kullanılmamalıdır. Üre serumda oda sıcaklığında 2-3 gün
kararlıdır. 4-8oC’de birkaç gün, -20oC’de 2-3 ay saklanabilir. İdrarda üre bir sulandırma
uygulandıktan sonra (tipik olarak 1:20 ile 1:50) analiz edilebilir. Üreyi hidroliz eden bakterilerle
kontaminasyonu sık görülür. Bu tip mikroorganizmaların hızla üremesi üre kaybına ve amonyak
oluşumuna neden olur. Bu nedenle idrar örneği pH 4 olacak şekilde saklanmalıdır.
ÜR E A N AL İZİ
119
UYGULAMA
İndirekt Nesslerizasyon ile Üre Azotu Analizi
Prensip: Üreaz enzimi ile serum veya plazmadaki üre amonyum karbonata (NH4CO3)
çevrilir. Amonyum iyonu Nessler ayıracı ile sarı renkli kompleks oluşturur, oluşan renk şiddeti
ortamdaki amonyum derişimi ile doğru orantılıdır.
NH2

Üreaz
H2O
C=O + H2O  2NH3 + CO2  2NH  + CO 2
4

NH2
3
o
37 C
Ayıraçlar
1- Stok Standart (Amonyum sülfat): 100oC’de kurutulmuş saf amonyum sülfattan 0,236 g
tartılır, yaklaşık 75 mL saf suda çözülür. Üzerine 1-2 damla derişik H2SO4 eklenir, saf suyla 100
mL’ye tamamlanır. Derişim 0,5 mg/mL azota eşittir.
2- Günlük Standart: Stok amonyum sülfat çözeltisinden 1 mL alınıp 50 mL’ye tamamlanır.
Derişim 0,01 mg/mL azota eşittir.
3- Standart Üre: 322 mg üre tartılır, saf suyla 500 mL’ye tamamlanır. Üzerine 1-2 damla
kloroform eklenir. Çözelti 0,3 mg/mL üre azot içerir.
4- Nessler Ayıracı: 15 g KI, 500 mL’lik balona konulur, 10 mL saf su ile eritilir. Üzerine
11,25 g iyot ilave edilip çözülür. Daha sonra 15 mL civa dikkatle tartılır, her ilavede dikkatle
karıştırılıp musluk altında soğutularak azar azar iyotlu çözeltiye ilave edilir. Karıştırma işlemine
civa siyahımsı partiküller görünümüne gelene kadar devam edilir. Oluşan sarımsı solüsyon dipteki
civa artıkları alınmadan berrak bir biçimde 100 mL’lik balon jojeye aktarılır. Çözeltiden 5 mL
alınıp %1’lik nişasta ile mavi mor renk oluşturuncaya kadar iyot eriği eklenir. Saf su ile 100 mL’ye
tamamlanır. Daha önceden hazırlanmış ve titre edilmiş %10’luk 485 mL NaOH üzerine
hazırlanan 100 mL’lik solüsyon eklenir. Dikkatle karıştırılır.
5- %10’luk Çinko Sülfat (ZnSO4): 10 g ZnSO4 saf su ile çözülüp 100 mL’ye tamamlanır.
6- 0,5 N NaOH
7- %3’lük Sodyum Sülfat (Na2SO4): 3 g Na2SO4 tartılıp 100 mL’ye tamamlanır. Çözelti
izotoniktir.
8- Üreaz Çözeltisi: 25 mg Üreaz 1 mL saf suda çözülür, hemen kullanılır. Soğukta saklanır,
günlük hazırlanır.
Standart Eğri Çizimi
Örnek çalışmalarının değerlendirilmesi için önceden standart bir eğrinin hazırlanması
gerekir. Standart eğri çizimi için aşağıdaki süreç uygulanır.
Çözeltiler (mL)
Kör
1
2
3
4
5
6
Günlük standart
0,01 mg/mL (NH4)2SO4
Saf su
Nessler ayıracı
0,0
0,5
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
7,0
1,0
6,5
1,0
6,0
1,0
5,0
1,0
4,0
1,0
3,0
1,0
2,0
1,0
Derişim (mg/dL ÜreN)
0
5
10
20
30
40
50
ÜR E A N AL İZİ
120
Deney tüpleri iyice karıştırılır, 10 dk. bekletilir. Oluşan renk şiddeti 505 nm dalga boyunda
köre karşı değerlendirilerek eğri çizilir.
Abzorbans
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
mg/dL Üre N
Şekil 2. Standart Eğri Grafiği
Yöntem
ÜreN olarak örneğin derişimin hesaplanması için üç tane santrifüj tüpüne aşağıdaki
pipetleme yapılır.
Çözeltiler (mL)
%3 Sodyum sülfat
Üreaz çözeltisi
Örnek serum
Standart üre (30 mg/dL ÜreN)
Kör
3,2
0,2
-
Standart
3,0
0,2
0,2
Örnek
3,0
0,2
0,2
-
Tüm tüpler iyice karıştırılır. 37oC’deki su banyosunda 30 dk. inkübasyona bırakılır. İzotonik
bir ortam oluşturmak amacıyla %3’lük sodyum sülfat kullanılır. Protein denatürasyonunu
sağlamak için süre sonunda alınan tüplere %10’luk ZnSO4 ve 0,5 NaOH eklenir.
%10’luk ZnSO4 (mL)
0,5 N NaOH (mL)
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
Santrifüj tüpleri iyice karıştırılır. 10 dakika 2000 rpm’de santrifüj edilir. Bu sırada üç tane
deney tüpü alınır, santrifüjden çıkarılan tüplerin üst kısımları bulandırmadan bu tüplere aktarılır.
Saf Su (mL)
Süpernatan (mL)
Nessler ayıracı (mL)
5,0
2,0
1,0
5,0
2,0
1,0
5,0
2,0
1,0
Tüpler karıştırılırdıktan sonra 5 dakika beklenip, 505 nm’de köre karşı abzorbansları
okunur. Sonuçlar standart eğriden veya standart ile oranlanarak hesaplanır.
Örnek   OD
OD
Örnek
Std
 Standart 
ÜR E A N AL İZİ
121
Problem 1.
Örnek OD=0,25
Std OD =0,22
Std kons=30 mg/dL Üre N
Örnek kons= ? mg/dL üre
0.25
 30  34 mg/dL Üre N
0.22
Yukarıda verilen problemde sonuç Üre cinsinden istenmiş olsa idi; Üre molekülü içindeki
azotun oranının hesaplanması gerekirdi. Bu nedenle Ürenin molekül ağırlığın 60, Üre içindeki
azotun moleküler ağırlığının ise 2 x 14 = 28 olmasından yola çıkarak sonucumuzun
60
 2,14
28
değeri ile çarpılması gerekecektir. Buna göre Üre değeri:
34  2,14  72,76 mg/dL  73 mg/dL' dir
Günümüzde klinik biyokimyada sonuçların mmol/L olarak verilmesi yaygınlaşmaktadır. Bu
dönüşüm için 1 mol Üre 60 gram olduğunu bilmek gerekir. Buna göre yukarıdaki örneğin Üre
derişimi:
0,730
 0,0122 mol/L  12,2 mmol/L' dir.
60
değeri
Bir mol üre içinde 2 tane azot bulunduğundan sonuç. Üre N olarak verildiğinde örnek
12,2  2  24,4 mmol/L Üre N olacaktır.
Üre azotunun normal sınırları serumda 6-20 mg/dL ve 4,3-14,3 mmol/L’dir.
Ürenin Klinik Önemi
Üre analizi, böbrek işlevlerinin incelenmesinde çok değerli bir parametredir. Kanda üre
tayini üre azotu ve üre olarak yapılmaktadır. Kan üre azotu (Blood Urea Nitrogena: BUN) daha
sıklıkla kullanılmaktadır. Üre sonuçlarının kreatinin ile birlikte değerlendirilmesi daha uygundur.
Kan üre artışı (hiperüremi) nedenleri üç grupta incelenebilir.
1- Prerenal kaynaklara bağlı hiperüremi: Aşırı su kaybı, aşırı protein katabolizması,
gastrointestinal kanamalardan sonra proteinlerin yeniden emilimi, kardiyak atım azalması, şok gibi
nedenlere bağlıdır.
2- Renal kaynaklara bağlı hiperüremi: Böbreğe bağlı kronik ve akut böbrek yetmezliği
3- Postrenal kaynaklara bağlı hiperüremi: Üriner yol tıkanmalarına bağlıdır. Bunlar bilateral
üreter obstrüksiyonu (tıkanması), üretrada tıkanma, prostat hipertrofisine bağlı olabilir.
ÜRİK ASİT ANALİZİ
122
Laboratuvar
14
Ürik Asit
GENEL BİLGİ
Ürik asit insanda pürin metabolizmasının son ürünüdür. Pürinler, nükleik asitlerin yapı
taşları olan nükleotidlerin yapısında bulunan azotlu bazlardır. Hücrelerde nükleoprotein
metabolizması sonunda ortaya çıkan pürinlerin bir kısmı organizmada tekrar kullanılır. Geri kalanı
ise ksantin üzerinden ürik asite çevrilerek idrarla atılır.
Ürik asitin kandaki miktarının normal değerlerin üzerine çıkmasına “hiperürisemi”
denilmektedir. Ürik asitin sulu ortamda çözünürlüğü çok az olduğu için hiperürisemi
durumlarında çeşitli dokularda, bilhassa eklemlerde ürik asit birikebilir. Bunlara “tofüs”
denilmektedir. Bu şekilde ortaya çıkan hastalık tablosu ise “gut” adını almaktadır. Hiperürisemi
bazı genetik defektler sonucunda veya lösemi, gebelik toksikozu ve böbrek fonksiyonunun
bozukluğu gibi durumlarda sekonder olarak ortaya çıkabilir.
Kandaki ürik asit miktarının normal sınırların altına inmesine ise “hipoürisemi” adı verilir.
Bazı enzim defektlerinde ve gut tedavisi sonrasında görülebilir.
Ürik asit, gut tedavisinin takibinde ve kemoterapi alan hastaların böbrek taşı oluşumu ve
sonuçta böbrek fonksiyon bozukluğunu izlemede önemlidir. Plazma ürik asit düzeyleri karaciğer
fonksiyonundan ve çekirdekli hücrelerin yapım-yıkımının arttığı durumlardan da etkilenir. Plazma
düzeyleri son derece değişkendir. Aynı kişide günlük ve mevsimlik değişiklikler gösterebilir.
Hiperürisemi nedenleri; gut, böbrek yetmezliği, lösemi, lenfoma, multiple myeloma,
kemoterapi, hemolitik anemi, orak hücreli anemi, gebelik toksemisi, Lesch-Nyhan sendromu,
Down sendromu, Polikistik böbrek hastalığı, kurşuna bağlı kronik nefropati.
Hipoürisemi nedenleri; Wilson hastalığı, Fanconi sendromu, Hodgkin hastalığı, uygunsuz
ADH sendromu, ksantinüri, düşük pürinli diyet.
Ürik asit tayini için açlık kanından elde edilen serumda veya fosfotungstat yöntemi için
oksalat, ürikaz yöntemi için EDTA ve florür antikoagülanları dışındaki antikoagülanlarla alınan
plazmada çalışılır. İdrarda kantitatif olarak 24 saatlik idrarda çalışılmalıdır.
ÜRİK ASİT TAYİNİ
Prensip: Ürik asitin alkalik ortamda fosfotungstik asit ile mavi bir kompleks oluşturma esasına
dayanır. Oluşan mavi renk şiddeti spektrofotometrede 620 nm dalga boyunda ölçülür.
Ayıraçlar:
1. %20'lik Trikloroasetik Asit (TCA)
2. %14,85 Sodyum Karbonat
3. FolinDenis
4. Standart Ürik Asit
5. Günlük Standart
ÜRİK ASİT ANALİZİ
123
Teknik: Bir santrifüj tüpüne 2 mL serum, 2 mL %20 TCA konup, karıştırılır ve santrifüj edilir. Üç
deney tüpü alınır; kör, standart ve örnek olarak işaretlenir.
Kör
3.7
1.0
0.3
Standart (mL)
Süpernatan (mL)
Saf su (mL)
Sodyum karbonat (mL)
FolinDenis (mL)
Std
1.0
2.7
1.0
0.3
Örnek
0.5
3.2
1.0
0.3
Bundan sonra eğri çizimindeki gibi devam edilir. Örneğin optik dansitesine eğriden karşılık
gelen derişim bulunur. Ayrıca derişimi bilinmeyen örneğin optik dansitesi (OD1), belli derişimde
hazırlanan standardın optik dansitesi (OD2) ile oranlanarak da bulunabilir.
Örneğin Derişimi 
OD1
OD 2
 Standardın Derişimi
Referans değerleri: 3 - 5 mg/dL
137
EKLER
138
Ol�iim Birimleri
Anlamh bir ols;i.im, ols;i.im degeri ve birimi ile birlikte goster:ilmelidir. Birim, ols;i.imi.i yaptlan
nesnenin boyutlanm (kiitle , hacim, uzunluk, deri�im vb.) tammlar. Gi.ini.imi.iz laboratuvarlannda
l1Iuslararas1 birim sistemi olarak kabul edilen SI (System� International d'Unites) kullamlmaktadrr;
Agg1da baz1 SI bi1imleri ve doni.i�i.imle1i tablolannu�tlr.
SI ve ingiliz Birim Donii�iimlleri
_l'iziksel Miktar
SI_ Biri��--------- ---��vim1e
1.Jzunluk
Fakrorii
Metre (m)
lkm=0,6214 mil
1m==39,37 inc;:
1 inc;: =0,02540m =2,540cm
liacim
Mctrekup (rn3)
[litre(L)]
11.=10·3 rn3=1dm3=103 mL
loz(slvl) =29,57mL
Ki.itle
Kilogram (kg)
[gram (g)]
llb=453,6 g
lkg=2,205 lb
1 Pa= 1N/m2
Bas me;:
Paskal (Pa)
1 atm==101,325 kPa=760 torr
1 atm== 14,7lb/ inc;:2 (psi)
[atmosfer (atm)]
S1cakhk
Kelvin (K)
[Santigrad derece (°C)]
Enerji
Joule
leal.= 4,184]
(I)
[Kalo1i(�L___________g?tu=1054]____
-�
_
SI on ekleri
-4::>n ek
Permo
1--:j.Y1CO
:\fano
f-: '
.\llicro
1- Mili
D�r:----- -
-
-
-
--t-
Ktsaltma
--
-
-
-
�-0-_
15 �--�-====-- - .10-12 ---n_____
_____
_ __1 0-9
:-="7
l0
�-'_ -6
10-3 _________
m_______
_ ____
____
__
------
-
·---- . ------
-----·
-10-2 _______ -·- -- c
cr-l
10- ------.k- 3
10
____
M
106
-
1--:santi
-Desi
Kilo
Mega
f_Qij;a
Tera
-·-----
_
____
1�
10
_ 12 �=====-l====
----
---
Stcakhk birimleri:
Laboratuvar temtometreleri geneUihle santigrad d.erece
(0C)
-- Omek
--t
1():-;
f - -- -- · -----;-:
: -1-;:5- =-;-;
j
l :g
·1
2
= 1 ��10
_E___
G
T
=====-
lQ-9 g =
10-6
ln_g_
·
g = lElL_
J()-3 g=
lrr.:fz____
10-2 g= leg
1o-1
--
g
=
103 g =
106 g =
lc!f:=---
_
l�g___l
--!
1�'·"'--
109 g = Gg_
--
===1Q12 g = If'-=-=--=--
s1cakbk birimini kullanrrlar. Kul1amm1
pek yaygm olmamakla birlikte, Fahrenheit derec:e C'F) Slcakhlc birimi banda ozellihle endi.isri.de
geni� kullamm alam bulur. Bir diger s1cakhk birimi, mutlak s1cakJlk skalas1 olarak da adlandrrtlan
Kelvin (°K) derecesidir. S1cakhklar, bir birimden di1�erine a5;ag1daki e�itlikler kullantlarak kolayhkla
di:ini.i�ti.iri.ilebilmektedir .
. ·c=�CF-32)
9
·p 2cc+ .32)
=
5
OK='C-t-273
139
Yunan Alfabesi
Yunan harfi
A
B
a
�
[' y
f.. 8
E
e
�
H 11
s 8
I t
z
Yunan ad1
Yunan harfi
Alpha
N
v
Nu
Beta
.::.
Xi
Gamma
0
(.,"
'T�
Pi
---
----·--
Delta
TI
Epsilon
p
0
Rho
(J
Sigma
'C
Tau
·�
Eta
T
Theta
<D
Iota
<p
X
X
K
K
Kappa
A
'A
Lambda
n
Mu
Omicron
p
Zeta
\f
M fl
Yunan ad1
---··--·--------·---·---
\jf
(J)
Phi
Chi
Psi
Omega

biyokimya uygulama el kitabı - Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi

Transkript

Benzer belgeler

Bileşik Formülü Yazma Kimyasal Tepkimeler 1.Yanma Tepkimeleri 2

Kalıtsal Metabolik Hastalıklar

ASİTLER VE BAZLAR

Gıdalarda C vitamini tayini - Erciyes Üniversitesi | Gıda Mühendisliği

Revitacare Broşürü

İdrar yolu iltihabına Cranberry iyi geliyor

Bölüm 5 Çalışma Soruları

Sadece Hayvan Sağlığında Kullanılır

Super Green

Asitler-Bazlar - Giresun Bilim