Klinik Proteomikle İlgili Yanlış Olan Nedir

Klinik Proteomikle İlgili Yanlış Olan Nedir?
Moderatörler: Ashley Di Meo1 ve Eleftherios P. Diamandis2,3,4*
Uzmanlar: Henry Rodriguez5, Andrew N. Hoofnagle6, John Ioannidis7 ve Mary Lopez8
1Yüksek
Lisans Öğrencisi, Tıbbi Laboratuvar ve Patobiyoloji Bölümü, Toronto Üniversitesi,
Toronto, Ontario, Kanada; 2Başkan, Klinik Biyokimya Birimi, Tıbbi Laboratuvar ve Patobiyoloji
Bölümü, Toronto Üniversitesi, Toronto, Ontario, Kanada; 3Başkan, Klinik Biyokimya Birimi,
Patoloji ve Tıbbi Laboratuvar Bölümü, Mount Sinai Hastanesi, Toronto, Ontario, Kanada; 4Baş
Biyokimyacı, Klinik Biyokimya Bölümü, Üniversite Sağlık Ağı, Toronto, Ontario, Kanada; 5Büro
Yöneticisi, Kanser Klinik Proteomik Araştırmalar Bürosu, Stratejik Bilimsel İnsiyatifler
Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD; 6Başkan, Klinik Kimya Birimi, Yönetici, Klinik
Kitle Spektrometri, Yönetici Yardımcısı, Klinik İmmünoloji, Yönetici, Beslenme ve Obezite
Araştırmaları Merkezi, Analitik Çekirdek, Washington Üniversitesi, Seattle, WA; 7Tıp
Profesörü, Stanford Üniversitesi Hastalıkları Önleme Kürsüsü, Başkan, Stanford Önleme
Araştırmaları Merkezi, Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi, Stanford, CA; 8Yönetici, BRIMS
Merkezi, Thermo Fisher Scientific, Cambridge, MA.
Bu yazarın iletişim bilgileri: Department of Pathology and Laboratory Medicine, Mount Sinai
Hospital, 6th Floor, Rm 6-201, Box 32, 60 Murray St., Toronto, Ontario, Canada MST 3L9. Faks
416-619-5521; e-posta [email protected].
Standart dışı kısaltmalar: MS, kitle spektrometri; FDA, Gıda ve İlaç Yönetimi; PSA, prostata
özgü antijen; MRM, çoklu tepkime izleme; CDx, yardımcı diyagnostikler.
Proteomik terimi proteinler, özellikle de yapıları ve işlevleri ile ilgili yapılan büyük ölçekli
çalışmaları tanımlamak için kullanılır. Klinik proteomik ise bu alandaki yeni keşif ve
teknolojilerin hasta bakımına uyarlanmasını amaçlar. Proteomik konusundaki yapı
taşlarından biri kitle spektrometrisidir (MS). Son birkaç yılda MS-temelli proteomik alanında
büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Birkaç saat içinde karmaşık vücut sıvıları, dokuları ve
hücrelerinin protein yapısının neredeyse tamamen anlaşılması mümkün hale gelmiştir. Kitle
spektrometri cihazlarının daha hızlı ve daha duyarlı hale gelmesiyle proteinlerin birincil
yapıları, geçiş sonrası dönüşümleri, eklenme değişkenlikleri ve mutasyonları hakkında
ayrıntılı bilgiler elde edilmiştir. Karmaşık karışımlarda bulunan proteinlerin saptanmasındaki
duyarlılığın artışı halen proteomikin ilgi alanındaki bir konudur. Yeni cihazlar ve yeni numune
hazırlama yöntemleri geliştirilmekte ve karmaşık karışımlardaki bileşenlerin daha hızlı ve
daha duyarlı bir şekilde ölçülmesi sağlanmaktadır. Bu yöntemler antikorlar ve diğer
bağlayıcılar kullanılarak bileşen zenginleştirme aşamalarına gerek duyabilirler.
Bu gelişmeler ışığında MS-temelli proteomikin protein yapısı ve işlevi ile ilgili yeni bilgiler
sağlaması ve yeni keşiflerin kliniğe uyarlanması ile tıbbi bilimlerde bir devrim yaratması
beklentisi oluşmuştur. Konuyu daha da açmak gerekirse tanı, takip ve tedavi belirleme
aşamalarında kullanılacak yeni belirteçlerin keşfedilmesi umudu doğmuştur. MS-temelli
proteomikin çok parametreli olması farklı biyolojik sıvıların incelenmesinin klinik uygulamaya
girmesine olanak sağlamıştır.
Ancak 15 yıllık bir çabaya rağmen MS-temelli proteomik sayesinde yeni bir belirteç
bulunamamıştır. NIH gibi kamu otoriteleri ve diyagnostik firmaları şimdiden yüzlerce milyon
dolar harcadığına göre, bu sorun maddi kaynakların yetersizliğinden kaynaklanmıyor gibi
görünmektedir.
Bu soru-yanıt bölümünde dört uzmanla neden böyle olduğunu ve gelecekte neler
beklenebileceğini tartışıyoruz.
Proteomikten biyolojik
kaynaklanmıştır?
belirteçlerin
yeni
neslinin
doğacağı
beklentisi
nereden
Henry Rodriguez: 2000 yılının sonlarında insan genomunun
taslağı (genomik) ortaya konduktan sonra
bilimsel
karşılığına (proteomik) yönelik ilgi artmaya başlamıştır.
Temel üç katmanlıdır: birincisi, proteinlerin hücrenin yük
atları, yani yapısını ve işlevselliğini oluşturan mekanizma
olduğu, dolayısıyla fenotip özellikleri belirlediği biyolojik
olarak gösterilmiştir; ikincisi, araştırıcılar olası genetik
ürünlerin kaynaklarını belirleyebilmiştir (insan genomu);
üçüncüsü, ilaç endüstrisi bizzat kendileri protein olan ya da
proteinleri hedefleyen ürünler geliştirmeye başlamıştır.
Bu gerçeklerle birlikte çok sayıda protein ve geçiş sonrası
modifikasyonlarının teknolojik gelişmeler sayesinde
belirlenir hale gelmesi bu alanın niye bu kadar ilgi çektiğini
anlaşılır kılmaktadır. Sorulacak soru araştırmacıların bugün için elde bulunandan fazlasını
bekleyip beklemediğidir. Bugün için genom dizilimi için yapılanların büyük ölçekte proteinleri
anlamayı kolaylaştıracağını söylemek, zor olsa da karşılanabilir bir beklentidir.
Andrew N. Hoofnagle: Son 25 yılda kademeli olarak insan
genomundaki nadir görülen polimorfizm ve epigenetik
modifikasyonları saptamanın ve yorumlamanın zor
olduğunu öğrendik. Belki daha da önemlisi, özgün genetik
modifikasyonların yakın ya da uzak diğer genetik
modifikasyonlar ve çevre ile nasıl etkileşeceğini ve
proteinlerin ekspresyonunu, yerleşimini ve geçiş sonrası
düzenlenmesini ne şekilde etkileyeceğini bilmenin imkansız
olduğunu gördük. Sonuç olarak, insan genomunun istenen
şekilde belirlenmesi genomun kendisinin değil, oluşturduğu
proteinlerin ekspresyonu, bu proteinlerin hücrelerdeki
yerleşimi ve geçiş sonrası değişimlerinin anlaşılmasıdır
denebilir. Böylece genom ile çevrenin insanın oluşumuna
birlikte nasıl etki ettiği açığa çıkacaktır.
Bir hastanın fenotipi gerçekte milyarlarca farklı hücrenin proteom ve metabolomu olarak
tanımlanır. Genotip fenotip belirleyicilerinden yalnızca bir tanesidir. İnsan organizmasının
belli bir zaman noktasındaki durumunun değerlendirilmesinde fenotipin genotipe göre çok
daha önemli olduğu varsayıldığından, proteomikten bir hastalığın tanısı, prognozunun
belirlenmesi ve tedavi etkinliğinin izlenmesinde kullanılacak yeni biyolojik belirteçler
oluşturması yönünde büyük bir beklenti ortaya çıkmıştır.
John Ioannidis: Proteomik te büyük ölçüde diğer omik
teknolojilerinin (genomik, transkriptomik, gen ekspresyon
profilinin belirlenmesi, metabolomik, farmakogenomik, vs.)
izlediği yoldan geçmiştir. Bu alanlardaki gelişmelerin
bireysel ve mutlak etkili bir tıp geliştirilmesine yol açacağı
yönünde yapay bir beklenti oluşmuştur. Proteomikin
önemli bir yönü, yirminci yüzyılda klinik uygulamaya giren,
başarılı olan ya da başarılı gibi görünen biyolojik
belirteçlerin çoğunun protein yapısında olmasıdır. Böylece
tek bir protein ya da peptidin değil de, bütün proteomun
ortaya konmasının tanı, prognoz ve önceden belirleme
alanlarındaki yeteneğimizi geometrik olarak arttıracağı
beklentisi oluşmuştur. Oysa gerçek bundan farklıdır.
Mary Lopez: Fikirler ve kavramlar çok parlak görünmekle
birlikte sorunlarla karşılaşılmıştır. Proteinleri analiz etmek
genlerden çok daha zordur. Genomik alanında çok hızlı
gelişmeler olduğundan proteomikin de arkadan takip
edeceği düşünülmüştür. Teknolojinin fikirleri yakalamak
için bir zamana gerek duyduğu doğrudur; ancak proteinleri
doğru olarak saptamak ve ölçmek için duyarlı aletler
geliştirecek yeteri kadar zaman geçmiştir.
Gerek ulusal ya da uluslararası kurumlardan, gerekse özel
kuruluşlardan klinik proteomiki geliştirmeye yönelik
yeterince kaynak sağlanmış mıdır?
Henri Rodriguez: Biyomedikal bir araştırmacı olarak ilgi alanım bilimsel bilginin hasta
bakımına yansımasının sağlanmasıdır. Herkesin bildiği gibi bu bir zaman ve kaynak
sorunudur. Büyük resime bakıldığında, maddi kaynaklar sadece klinik proteomik alanına ait
bir sorun değildir. Biyomedikal araştırmaların tümü yetersiz maddi kaynak tehlikesi ile karşı
karşıyadır. Yeni cihazlar ve teknolojilerin geliştirilmesi, proteomik ve genomik gibi omik
tabanlı araştırmalardan elde edilen verilerin toplum erişmine açılması ve bu verilerden elde
edilen bilgilerin genişletilebilmesi (biyoinformatik) gibi pek çok faktörün etkileşiminin söz
konusu olduğu günümüzde bu durum daha da belirgindir.
Çözüm hiç kolay değildir ve kısıtlı bütçelerle çalışmak kaçınılmazdır. Bence önemli olan büyük
resmi görmekten, yani insan sağlığını iyileştirmeye yönelik yeni keşifler yapmaya çalışmaktan
vazgeçmemektir.
Andrew N. Hoofnagle: Bu soruyu yanıtlamadan önce “klinik proteomik” tanımının önemini
anladığımızdan emin olmalıyız. Benim duyduğum ve kullandığım çok sayıda tanım var. Örnek
olarak, (1) biyolojik bir numunede bir hastalıkla ilgili çok sayıda proteinin nicel olarak
ölçülmesi; (2) biyolojik bir numunede bir hastalıkla ilgili proteinlerin belirlenmesi ve nisbi
miktarlarının ölçülmesi; ve (3) sağlığa ilişkin iyileşmelere yol açacak deneyler yapmak üzere
insan numunelerindeki proteinlerin nicel olarak ölçülmesi tanımlarını verebilirim. Bir klinik
kimyacı olarak şüphesiz bunlar içinde en fazla ilgimi çeken üçüncü tanımdır. Ne yazık ki
maddi kaynak bulması en zor olan alan da budur. Ne mutlu ki NIH tarafından desteklenen
Klinik Proteomik Tümör Analiz Konsorsiyumu bu kısırdöngüyü kırmıştır. Programın önemli bir
bölümü tümör biyolojisine aktarılmakla beraber, araştırmacılara yeni tetkik yöntem ve
teknolojileri geliştirmek üzere hatırı sayılır bir kaynak sağlanmaktadır. Bu program yardımı ile
geliştirilecek yeniliklerin klinik laboratuvarlarda uygulama alanı bulacağından umutluyum. Bu
desteğin klinik proteomik açısından çok önemli olduğuna inanıyorum, ancak daha fazla
destek sağlanmasının iyi olacağını düşünüyorum.
John Ioannidis: Toplum için bilime ve araştırmaya yapılacak yatırımdan daha iyisinin
olduğunu düşünmüyorum. Bu nedenle klinik proteomik araştırmalara sağlanacak maddi
desteğin çok daha fazla olması gerektiğine inanıyorum. Ancak gerçekçi düşünmemiz
gerekirse farklı araştırma alanlarına maddi destek sağlanması göz önüne alındığında bugüne
kadar proteomik konusunda sağlanan desteğin hiç de az olmadığını kabul etmeliyiz. Ancak
kaynakların daha verimli kullanılabileceğini söylemeliyim. Bugüne kadarki araştırmalarda
geçiş konusu yeterince aydınlatılamamış ve klinik uygulama hedeflerine ulaşılamamıştır.
Biyolojik belirteç geliştirme, geçerlilik, klinik kullanım ve uygulama alanlarında büyük ölçekli,
çok merkezli çalışmalar için hala maddi desteğe ihtiyaç vardır. Klinik proteomik konusu
sponsorların yeterince ilgisini çekmemektedir.
Mary Lopez: Şüphesiz hiçbir zaman “yeterli” demek mümkün değildir. ABD’de bilim
yapmanın maliyeti çok hızlı bir şekilde artarken NIH bütçesi sabit kalmaktadır. Bu da daha
düşük maddi kaynak için daha fazla rekabet etme zorunluluğunu getirmektedir. Riskten
kaçınma yaklaşımının bir yansıması olarak yenilikçi projelere ayrılan para azalmaktadır.
Bardağın dolu tarafına baktığımızda ise bu durum akademik camia ile endüstri arasında
bilimsel ilerlemelere zemin hazırlayacak daha yakın bir işbirliği doğmasına neden olmaktadır.
Klinik proteomikin hedeflerine ulaşmasını engelleyen başlıca faktörler nelerdir?
Henri Rodriguez: Biyomedikal araştırmalarda göz önünde bulundurulması gereken iki faktör
vardır; bir hastalığın altında yatan mekanizmanın anlaşılması (temel bilimler) ve bunun hasta
bakımına yansımasının öğrenilmesi (klinik bilimler). Proteomik son on yılda çok ciddi mesafe
katetmiştir. Ancak veriler bağımsız laboratuvarlarca doğrulanana kadar belirteç geliştirme
süreci sönük kalacaktır. Klinik proteomik alanında engel teşkil ettiği öne sürülen çok sayıda
bariyer vardır ve Ulusal Kanser Enstitüsü Klinik Proteomik Tümör Analiz Konsorsiyumu gibi
araştırma grupları bunları standardize etmek ve birbiriyle uyumlu hale getirmek için yoğun
çaba harcamaktadır.
Bu noktada belirlenen başlıklar arasında proteomik platformlar arasında veya içinde görülen
teknolojik farklılıklar, biyolojik örneklerin elde edilmesindeki değişkenlikler, düzenleyici bilim,
antikor kitleri (yenilenebilir), testler ve veri tabanlarının toplum erişimine açık olması, veri
analiz araçlarının iyileştirilmesi, çalışma tasarımlarının uygun olması ve multidisipliner
araştırma ekiplerinin katılımı sayılabilir. Proteomik klinik tanı alanına uygulanacaksa, her
aşamanın evrensel düzeyde kabul edilen şekişlde ölçülebilmesi gerekir. Böylece gözlenen
değişikliklerin yöntem farklılıklarını değil, biyolojik durumu yansıttığından emin olunabilir.
Araştırmacılar, sponsorlar, Gıda ve İlaç Yönetimi (FDA), Medicare ve Medicaid Servisleri,
klinisyenler ve klinik kimyacılar arasında iletişim ve işbirliği sağlanması çok önemlidir. Bu
amaçla toplumun uzun vadeli desteği gereklidir. Benim düşünceme göre böylece
beklentilerin karşılanması mümkün olacaktır.
Andrew N. Hoofnagle: Tekrar söylüyorum, tanımlar önemlidir. Eğer beklenen tanı koyma,
prognoz belirleme ve tedavi yönlendirmesi için yeni biyolojik belirteçlerin ortaya konması ise,
başlıca engel en önemli klinik soruları soran iyi tasarlanmış çalışmalardır. Yeni bir biyolojik
belirteç konusunda eksiklik yoktur. Ancak iyi tasarlanmış yeterli sayıda geçerlilik çalışması
yapılmamıştır.
Başka bir engel yeni belirteçlerle ilgili beklentilerdir. Örnek olarak prostata özgü antijen (PSA)
verilebilir. PSA yıllarca birinci basamak hekimleri tarafından biyopsi için ürologa gönderme
kriteri olarak kullanıulmıştır. Ancak bu testin prostat kanseri için özgünlüğünün düşük olduğu
saptanmış ve yetkili makamlar tarafından taram testi olarak kullanılmaması önerilmiştir. Bir
sonrakinin hangi test olacağı konusunda dikkatli davranmakta yarar vardır.
Klinik proteomikten optimal olmayan bir panel yerine mükemmel bir süper belirteç
yaratması bekleniyorsa, bağdaşma konusu da dikkate alınmalıdır. Bu alanda ileriye dönük
klinik çalışma gerçekleştirebilmemiz maliyet ve lojistik sorunları engellenmektedir.
Beklenti yeni klinik proteomik teknolojilerin kullanıldığı testler geliştirmekse, bu hedefe
zaten ulaşılmıştır.
John Ioannidis: En büyük engel beklentilerin fazla yüksek tutulmasıdır. Bu durum berrak
düşünmeyi ve bu teknolojilerden ne gibi gerçekçi yararlar elde edeceğimizi anlamayı
önlemektedir. Mükemmel tanı ve/veya ön belirleme imkanı sağlayacak testlerin geliştirilmesi
mümkün olmayabilir, ancak doğruluk, etkinlik ve hız anlamında ılımlı ve klinik açıdan yararlı
iyileştirmeler sağlanabilir.
Beklentilerin çıtası bu düzeye indirildiğinde mevcut engeller arasında geniş ölçekli
çalışmaların olmaması, standart ve rutin geçerlilik süreçlerinin bulunmaması ve
araştırmacıların klinik uygulamaya yönelik proteomik çalışmaları yapmak hususundaki
isteksizlikleri sayılabilir. Bu alandaki ilginin uyanması için tek ihtiyaç duyulan ilginç bir
gözlemin iyi bir dergide yayınlanmasıdır.
Mary Lopez: Günümüzde en önemli engel yeni biyolojik belirteçlerin rutin klinik
uygulamaların içine alınmasıdır. Yeni biyolojik belirteçin güvenilir ve maliyet-etkin olduğu
gösterildikten sonra klinik kullanıma geçişi hızlanacaktır. Testlerin maliyetlerini düşürmeye
yönelik yeni girişimlere ihtiyaç vardır.
Mevcut klinik testlerde proteomikler tarafından doldurulabilecek boşluklar nelerdir?
Henry Rodriguez: Konvansiyonel immün tetkiklerin eksik yönleri maliyetlerinin yüksek
olması, antikorlar kullanılarak nitelikli sonuçlar elde edilmek istendiğinde uzun bir süreye
ihtiyaç duyulması ve çoğullamanın sınırlılılığıdır. Sağlık ve/veya hastalık durumlarının
incelenmesi için bir test paneline ihtiyaç duyulduğunun farkedilmesi klinik toplumu ileriye
dönük çoğullanabilecek nicel yaklaşımlar geliştirme zorunluluğu konusunda uyarmıştır. Klinik
proteomiklerin dolduracağı boşluk budur.
Deneysel çalışmalarda biyolojik belirteç adayı 1000’den fazla ürün geliştirilmiş, ancak ne
yazık ki bunların çoğu klinik kullanıma girmemiştir. Bu boşluğu kapatmak için laboratuvarlar
çok sayıda tepkime izleme (MRM) şeklinde adlandırılan bir süreç geliştirmiştir. Bu süreçte
biyolojik belirteç adayı geliştirildikten sonra duyarlık ve özgünlüğünü değerlendirerek
geçerliliğinin belirlenmesi hedeflenmektedir. MRM bulgularının 2009 yılında farklı
laboratuvarlarda ve platformlarda tekrarlanabilirliğinin gösterilmesi bir dönüm noktası
olmuştur. Günümüzde hangi immün antikor testlerinin yapıldığı ile ilgili bir kataloga
bakıldığında listenin çok sınırlı olduğu görülür. Ancak MRM aracılığı ile doğrulama
yapıldığında bu sorun ekonomik ve bilimsel kapsamda çözülür. Böylece hangi adayların
pahalı ve zaman alıcı klinik geçerlilik çalışmalarına tabi tutulacağı ayırt edilir ve diyagnostik
geliştirme çabaları daha verimli bir hale gelir. Son MRM çalışmalarında 150 kite kadar
çoğullama yapılabileceği gösterilmiştir. MRM öncesinde immün zenginleştirme yapıldığı
takdirde bu yaklaşımın duyarlılığı dramatik şekilde artmaktadır.
Andrew N. Hoofnagle: Mevcut klinik testlerde (1) özgünlüğün bulunmaması, (2) etkileşen
maddeler olması, (3) yüksek konsantrasyonlarda yanlış sonuçlar elde edilmesi ve (4) farklı
platformlar arasında bağdaşım olmaması gibi sorunlar vardır. Klinik proteomik yeni
proteomik teknolojilerin klinik numunelere uygulanması şeklinde tanımlanırsa teknolojik
perspektiften pek çok sorunun üstesinden gelindiğini söyleyebiliriz. Eğer (1) insan durumu
geçiş sonrası modifikasyona uğramış proteinlerin aktivitelerinin bütünlüğü ve dizilimi
şeklinde tanımlanırsa, (2) insan durumu klinik proteomik yöntemlerce tarif edilebiliyorsa, ve
(3) hastalık klinik proteomik tarafından belirlenen bir durum olarak tanımlanırsa, klinik
proteomikin uygun numunelerde çok sayıda proteinin incelenmesine olanak sağlayarak bu
boşluğu doldurması mümkündür. En azından umut edilen durum budur ve şu anda
incelenme aşamasındadır.
John Ioannidis: Proteomik ya da tanı ve ön belirleme alanında devrim yaratacak yeni bir
teknoloji için en önemli sorun günlük uygulamada kullanılan yöntemler hakkında bildiklerimiz
ve bilmediklerimizle ilişkili sistematik bir yaklaşımımızın olmamasıdır. Tıbbi literatürde tanısal
testlerle ilişkili yalnızca birkaç yüz randomize çalışma vardır ki bu sayı ilaçlarla ilgili olanlardan
200 kat daha azdır. Bir testin klinikte başarılı olması için yüksek tanısal performansa, yani
özgünlük ve duyarlılığa sahip olması gerektiği defalarca gösterilmiştir, ancak bu durum tek
başına yeterli değildir. Özgünlüğü ve duyarlılığı yüksek olan pek çok testin klinik yararı yoktur;
maliyetleri arttırmak, hatta tıbbi bakıma zarar vermekten başka bir işe yaramazlar.
Tanısal kanıtların bir haritasını oluşturmak ve farklı hastalıklar ya da durumlarla ilgili ne tür
boşluklarımız bulunduğunu anlamak için sistematik bir çaba gösterilmesi gereklidir.
Dahası, belli performansa sahip olan yeni özgün tanı ya da önceden belirleme testleri
geliştirmenin farklı endikasyonlar ya da durumlarda yarar sağlayıp sağlamayacağını
değerlendirmek için simülasyon modelleri kullanılabilir. Korkarım ki, kaynakların önemli bir
bölümü hastaya ya da maliyetlere olumlu etki göstermeyecek, dolayısıyla klinikte
kullanılmayacak, ancak analitik açıdan gerçekten mükemmel yeni tetkik yöntemleri
geliştirmek için harcanmaktadır.
Mary Lopez: Genelde en önemli boşluk seçicilik alanı doğrudan bağlantılıdır. Altın standart
immünolojik testler veya ELISA olduğundan, yalancı pozitif sonuç verme oranı yüksek bir
ELISA testi iyileştirme hedeflerinden biridir. Bu duruma iyi bilinen bir örnek PSA testidir. PSA
çok farklı formlarda bulunabileceğinden standart ELISA ile iyi bir seçicilik düzeyi elde etmek
neredeyse imkansızdır. Klinik açıdan anlamlı izoformların miktarının doğru olarak ölçülmesi
ve yalancı pozitiflik oranının düşürülmesi için sıralama seviyesindeki değişkenliklerin
belirlenebilmesi gereklidir.
Standart immünolojik testlerin ötesine geçmeye hazır mıyız ve hazırsak neden?
Henry Rodriguez: İmmünolojik testlerin bu noktada kalmasını söylemek güvenli olmakla
birlikte, sınırlılıkları aşmak üzere MS-temelli tetkiklerin kullanılacağı özel durumlar vardır ve
yenileri de olacaktır. İmmünolojik testler klinik laboratuvarlarda proteinleri tetkik etmek
üzere en yaygın kullanılan tekniklerdir ve FDA bu alanda gerekli düzenlemeleri oluşturacak
deneyime ve bilimsel kanıta sahiptir. Dahası tetkik başına maliyet, yatırım düzeyi ve personel
gereksinimi gibi ekonomik boyutlar da iyi bilinmektedir. Mevcut immünolojik testlerin yerine
yenilerinin kullanılması için alet ve yöntemin geçerliliğinin FDA tarafından onaylanması
gerekli ise de, teknik ya da ekonomik nedenlerle MS-temelli bir yönteme geçilmesinin
zorunlu olduğu durumlar olacaktır. Bilimsel açıdan MRM kullanılarak peptidlerin miktarının
ölçülmesi mutantlar, bütünleşik varyantlar ve geçiş sonrası farklılıklar için geleneksel
immünolojik testlere tercih edilir. Çünkü proteinin birincil yapısındaki değişikliklere özgü
antikorları oluşturmak güçtür.
Teknik nedenlere bir örnek olarak tiroglobülin verilebilir. Toplumun %20’sinde otoantikorlar
standart immünolojik testleri etkileyerek yalancı negatif sonuçlar elde edilmesine neden
olur. Otoantikor etkileşimini aşmak üzere Hoofnagle ve arkadaşları ARUP Laboratories ve
Quest Diagnostics için bir peptid-immüno-MRM MS testi geliştirmiştir (Clinical Chemistry,
2008; 54; 1796-1804 ve 2013; 59; 982-990). Ekonomik açıdan bakıldığında çoklu çalışma
kapasitesi ve otomatizasyon nedeniyle kitle spektrometrisinin test başına maliyeti düşürmesi
beklenmektedir. Bu da klinik laboratuvarlara girişinin önündeki en büyük engeli ortadan
kaldıracaktır. MS platformlarının analitik geçerliğini kolaylaştırmak üzere akademik
araştırmacılar, ilaç endüstrisi ve FDA ile Ulusal Kanser Enstitüsü çoklu testlerin etkinlik ve
güvenilirliğinin değerlendirilme esaslarını yayınlamıştır (Clinical Chemistry, 2010; 56; 165171).
Andrew N. Hoofnagle: Evet, hazırız. İmmünolojik testler özellikle insan numuneleri söz
konusu olduğunda sorun yaratabilen bir kategoridir. Klinik proteomik alanında güvenilir
kalibrasyon, numune hazırlama ve analiz yöntemleri belirleme üzerine önemli bir zaman
harcanmış ve klinik biyokimyacılar teknolojiyi hasta bakımına uyarlama pozisyonuna
itilmiştir. Başarıya ulaşmak için mahir laboratuvar teknojistlerine ihtiyaç yoktur. Referans
laboratuvarları klinik proteomik teknolojilerinin gücünden zaten yararlanmaktadır ve diğer
klinik laboratuvarların da en kısa zamanda bu gücü kullanmaya başlayacağına inancım
tamdır.
John Ioannidis: Teknoloji açısından baktığımızda prensip olarak evet. Ancak standart
immünolojik tetkikler, eğer yeteri kadar doğru sonuç veriyorsa, pek çok durumda tercih
edilebilir. Çünkü daha düşük maliyetle, pek çok laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir.
Daha yeni ve daha karmaşık bir yöntemin daha iyi olması şart değildir.
Mary Lopez: Evet. Standart immünolojik tekniklerin yukarıda belirtilen yalancı pozitif sonuç
verme gibi bazı olumsuz yanları bulunmaktadır. Bu durum yakalama antikorunun özgün
olmamasından, hedef moleküllerin heterojenitesinden, ya da her ikisinden kaynaklanıyor
olabilir. Proteinlerin çoğu budanma, geçiş sonrası değişiklikler veya tek nükleotid
polimorfizmi gibi nedenlerle çoklu formlar halinde görülür. Hastalıklarla ilgili proteinlerin
çoğu aktif ve inaktif formlarda bulunabilir ve yakalama antikorları tarafından ayırt
edilmeksizin tutulur. Dolayısıyla, hastalıklarla ilgili formların sıralama düzeyinde saptanması
gereklidir. Bu özgünlük düşük düzeylerdeki hedefleri zenginleştirmek üzere antikorlar
kullanıldığında bile MS tarafından sağlanabilir.
Bir sonraki aşama kitle spektrometrisi midir?
Henry Rodriguez: Bir test hasta bakımı açısından yararlı olmasının dışında doğru, güvenilir,
otomatize, kolay uygulanır ve maliyet açısından uygunsa klinikte kendine yer bulur. MS
birçok bilimsel alanda öncü bir rol oynamaktadır ve uzun zamandır halk sağlığı
laboratuvarlarında standart olarak kullanılmaktadır. Benim açımdan soru bir sonraki
aşamanın kitle spektrometrisi olup olmadığı değil, ne zaman protein analizleri için
immünolojik testlerin yerine kullanılmak üzere uyarlanacağıdır. Yeterli biyolojik belirteç
bulunmamasına rağmen bu uyarlama sürecinde teknik bir engel yoktur ve yalnızca bir
mühendislik sorunu söz konusudur.
Kitle spektrometrisinin tüm klinik laboratuvarlarda kullanılması biraz zaman alacaktır, ancak
Clinical Chemistry gibi dergilerde yer alan yayınlardan ve gerek internet üzerinden verilen
eğitimlerden, gerekse düzenlenen seminerlerden anlaşıldığı üzere profesyonellerin ilgisinin
artması, yakın bir gelecekte yaygın uygulamaya gireceği izlenimini uyandırmaktadır. Burada
gözden uzak tutulmaması gereken nokta kitle spektrometrisinin immünolojik testlerin yerine
değil, teknolojik avantajlarıyla belli durumlarda tamamlayıcısı olarak kullanılmasıdır.
Andrew N. Hoofnagle: Şu andaki durum zaten budur. Artık kalibrasyon materyallerinin,
güvenilir kitlerin, duyarlı kalite kontrol süreçlerinin ve eğitimli personelin oluşturulmasına
sıra gelmiştir.
John Ioannidis: Burada daha çok lokal parametreler etkindir: rutin testleri uygulayan hangi
laboratuvarlar doğru bir şekilde MS uygulaması yapabilecektir, maliyet ve eğitim sorunları
nasıl aşılacaktır, kliniğe kolay bilgi akışı sağlanabilecek midir? Bu sorular geç dönem (evre 3
ve 4) geçiş çalışmalarının tamamlanması ile yanıtlanabilecektir. Bugüne kadar proteomik
alanında bu tür araştırmalar pek ilgi çekmemiştir.
Mary Lopez: MS klinik tetkik platformlarında bugün için bir devrimdir ve gelecekte de öyle
olmaya devam edecektir. MS özgünlük alanında kritik bir ihtiyacı karşılar. Tüm testleri MS
platformlarına kaydırılmasına gerek olmayabilir,ancak immünolojik testlerin yetersiz kaldığı
durumlarda MS şüphesiz ki boşluğu dolduracaktır.
Klinikte proteomik ile ilgili bildiğiniz başarılı uygulama örnekleri var mı? Mikrobik
enfeksiyonların tanısı bir örnek teşkil edebilir mi?
Henry Rodriguez: Bu soruyu Staphylococcus aureus enfeksiyonu tanısı klinik proteomik
yardımı ile konmuş bir hastaya sorarsanız alacağınız yanıt EVET olacaktır. Klinik MS
sistemlerinin bakterilerin ve mayaların hızla belirlenmesi için FDA tarafından onaylanması
gelecekteki klinik proteomik uygulamaları için umut vaat eden bir gelişme olmuştur.
Klinik proteomik bir hastalığın moleküler mekanizmasının daha iyi anlaşılmasını, dolayısıyla
da hastaya en iyi tıbbi yaklaşımın verilmesini sağlayan bir araç olarak kabul edilmelidir.
Tedavi alanında bir fark yaratacağı düşüncesindeyim. Tedavi ajanları gittikçe belli hasta
gruplarını hedef almaktadır ve bu gruplardaki yararın gösterilmesi yönünde beklentiler
ortaya çıkmıştır. Bu durum onkoloji alanında özellikle belirgindir; tedavi yanıtının önceden
belirlenmesini sağlayan özgün biyolojik belirteçleri taşıyan hastaların saptanmasına ihtiyaç
vardır. Tedaviye yanıt vermeyecek hastalarda yarar sağlayabilecek başka tedavilere hızla
geçilmesi sağlanabilir. Bu tür tetkikler arasında FISH (floresan in situ hibriizasyon),
immünhistokimya, PCR ve DNA/RNA sonraki nesil sıralama sayılabilir. Geliştirilme
aşamasında olan ilaçların yaklaşık 1/3’ü bir genomik ya da proteomik belirteçle ilişkilidir. Bu
oran son iki yılda yaklaşık %50 düzeyinde yükselmiştir. İlaç endüstrisinde faz 1 aşamasını
geçemeyen yeni ürün oranının %92 gibi göz korkutucu bir düzeyde olması göz önüne
alındığında, klinik çalışmalarda proteomik teknikleri ile belirlenen bazı belirteçlerin
kullanılması hem daha doğru kararlar verilmesini, hem daha akılcı yatırımlar yapılmasını,
hem de daha hedefe yönelik ilaçlar geliştirilmesini sağlayacaktır.
Andrew N. Hoofnagle: Klinik laboratuvarda MALDI-TOF MS kullanılarak bakteri ve mayaların
belirlenmesi kitle spektrometrisinin klinik kullanımı açısından büyük bir adım olmuştur.
Ancak MALDI-TOF kullanılarak bakterilerin belirlenmesini sağlamak klinik proteomikin
alanına girer mi konusu tartışmalıdır. Numunelerde bazı küçük proteinlerin yakalandığı
doğrudur, ancak süreç daha çok kitle spektrometrisidir. Spektrumda protein ve lipidlerin de
belirlenmesi işlemin başarısının zirvesi değildir. Bu nedenle ben MALDI-TOF için bir
proteomik platformu değil, bakteri belirleme yöntemi ifadesini tercih ediyorum. İki bakteri
türü arasındaki farkı belirlemek, havadaki bir balondan bakarak Büyük Kanyon’un iki
yakasının arasındaki farkı söylemek gibidir. MALDI-TOF kitle spektrometrileri henüz önemli
sonuçlara yol açabilen pek çok bakteri türünü ayırt etmekten uzaktır. Dahası evre 1 over
kanserli kadınlarla normal kontroller arasındaki fark çok küçüktür ve MALDI-TOF MS ile bu
farkı belirleyebilmek çok zordur.
John Ioannidis: Bu yaklaşımım nedeniyle kötümser olarak damgalanmayı göze alıyorum,
ancak bence bugüne kadar klinik proteomik alanında önemli bir başarı sağlandığını söylemek
mümkün değil. Proteomik teknolojisinin uygulanmasının hastalarda olumlu sonuçlar
sağladığını gösteren büyük ölçekli, randomize çalışmalarda elde edilmiş bir veri yok.
Önceleri MALDI-TOF MS kullanılarak bakteriyel enfeksiyonlarla ilgili elde edilen veriler
oldukça umut verici bulunmuş ve pek çok hastane ile laboratuvar bu tekniği kullanmaya
başlamıştır. Ancak erken tanı koymanın klinik anlamda bize ne kazandırdığını görmemizi
sağlayacak randomize çalışmalar henüz yapılmamıştır. Örneğin, geleneksel yöntemlerden 24
saat önce bir bakterinin saptanması, henüz antibiyotik duyarlık sonucu bilinmese bile, çok
değerli bir bilgi gibi görünmektedir. Ancak bu erken bilginin hastanede kalış süresi,
antibiyotik tedavisine bağlı veya genel istenmeyen olaylar, tedavi başarısı gibi orta vadeli
veya ölüm ya da önemli klinik olaylar gibi ciddi sonuçlar üzerine nasıl bir yarar sağladığı
bilinmemektedir. Bu soruların yanıtlanması için randomize klinik çalışmalara gereksinim
vardır. Erken tanıya yönelik pek çok farklı teknoloji söz konusu olduğundan, bu yöntemlerin
birbiriyle karşılaştırılacağı çalışmalar yapılmalıdır.
Mary Lopez: Çarpıcı bir örnek amiloidoz tanısıdır. Mayo Kliniği’ndeki bir grup araştırmacı
2009 yılında duyarlığı ve özgünlüğü histopatolojik yöntemden daha fazla olan MS tabanlı bir
tetkik yöntemi geliştirmiştir. İlk geliştirme sürecinden sonra test yaygın olarak kullanılmaya
başlanmıştır, çünkü histopatolojik incelemede alt tipleme yapılmasını engelleyen yoğun
zemin boyanması sorununu aşmak mümkün olmuştur.
Klinik proteomik uygulamalarının daha yaygınlaşmasını sağlayacak gelişmeler bekliyor
musunuz?
Henry Rodriguez: Akla gelen iki temel alan analitik gelişmeler (yazılım ve donanım) ve klinik
genomiğin proteomikle eşleştirilmesidir. MS teknolojisi kullanılarak mikrobiyal tanı sağlayan
iki (Bio-Mérieux ve Bruker) ve viral tanı sağlayan bir (BioArray Solutions) testin FDA
tarafından onaylanması yarının klinik laboratuvarları için bir mihenk taşıdır. MS
platformlarının çoklu immünoafinitesi (Clinical Chemistry, 2010; 56; 237-243), immüno-MRM
MS testleri, standardizasyon ve antikor nitelikleri gibi bilgiler yakın gelecekte bu platformları
kullanan klinik laboratuvarların erişimine açık hale gelecektir. Hedefe yönelik MS temelli
proteomik yaklaşımların iyileştirilmesi (otomatizasyondan veri elde etmeye kadar) ve daha
düşük yükle daha yüksek özgünlük düzeyine erişme beklenebilir. Genomik alanındaki
araştırmacılar multipleks DNA kullanmaktadır; bunun proteomikteki yansıması hedefe
yönelik multipleks proteomik olabilir. Henüz araştırma aşamasında olan tek hücre proteomiki
(CyTOF kitle sitometri), MagARRAY (manyetik multipleks protein dizilim) ve NAPPA (nükleik
asit programlanabilir protein dizilimi) gibi yeni teknolojiler bütün laboratuvarlar tarafından
kullanılabilir hale gelebilir.
Henüz araştırma aşamasında olan genomiğin proteomike yansıması konusunda ise çok büyük
potansiyel olduğunu düşünüyorum. Klinik bir perspektiften bakarsak sonraki nesil
sıralamasından elde edilen bilgi terapötik girişimler sınırlı olduğundan her endikasyonda
yarar sağlamayacaktır. Sonraki nesil sıralamasının sağlayacağı veri bütüncül klinik perspektife
bir katkıda bulunmayacaktır. Bu durumda proteomik gibi başka yöntemler daha çok önem
kazanacaktır. Genotipik belirteçler, proteomik belirteçler ve hastalıklar arasındaki bağlantının
daha iyi anlaşılması ile hasta açısından yarar sağlayacak “proteogenomik” testler
geliştirilebilecektir.
Andrew N. Hoofnagle: MS öncesinde proteinlerin veya triptik peptidlerin zenginleştirilmesi
proteomik teknolojisindeki başarılı geçiş açısından çok önemli olacaktır. Kitlerin de
geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
John Ioannidis: Klinik proteomik uygulamalarının artması için teknolojik gelişmelerin gerekli
olduğu düşüncesindeyim. Faz 0 ve 1 araştırmalar ile ilgili on binlerce sayfa yayın var. Gerçek
hayattaki ihtiyacımız ise uygulamada en iyi olması beklenen aday tekniklerin test edilmesidir.
Mary Lopez: Kitle spektrometri cihazlarının duyarlık ve çözünürlüklerinin artması ile beraber
numune hazırlama yöntemlerinin daha etkili hale gelmesi daha düşük konsantrasyonlardaki
hastalık belirteçlerinin ölçülebilmesini sağlamıştır. Bu yöntemler otomasyon ve verimlilik
açısından optimize edildikten sonra yüksek özgünlükleri nedeniyle rutin uygulamaya daha
yüksek oranda girecektir.
On yıl sonra klinik proteomikin tıbbi uygulamalarda yer alacağını düşünüyor musunuz?
Henry Rodriguez: Kesinlikle. İmmünolojik testler 1960’larda küçük moleküllerin ölçülmesi
amacıyla kullanılıyordu. Bu testlerin yerine MS ve protein/antikor dizilim tetkiklerinin
geçmesi ve bugün dünyada yılda milyonlarca testin yapılıyor olması, kullanımlarının daha
büyük moleküllerin (proteinler) belirlenmesi yönünde gelişeceğini öngörmemizi sağlamıştır.
Ancak günümüzdeki yüksek maliyetler ve yetersiz bilgili personel sayısı bir engel olarak kabul
edilebilir. Şahsen teknolojinin ne getireceğini bilemem. Bir multipleks MS ya da
protein/antikor dizilim cihazının hızlı, doğru ve makul bir maliyetle sonuç vereceğini
umuyorum.
İleriye doğru bakarken, yeni teknolojileri pazara sunmadan ve yeni biyolojik belirteçler
keşfetmeden önce arada bir duraklayıp proteogenomik çalışmalardan elde ettiğimiz bilgileri
gözden geçirmemizde yarar olduğunu düşünüyorum. İlaç endüstrisi ile karşılaştırma
yaptığımızda, bir ilacı pazara sunmak için yaklaşık bir milyar dolarlık bir bütçeye ve 10-15
yıllık bir zaman dilimine gerek duyulduğunu görürüz. Başarısızlık oranları ve enflasyon da
hesaba katıldığında bu maliyet 4-11 milyar dolar düzeyine yükselmektedir. Bu rakamlar
değişken olmakla birlikte dudak uçuklatıcıdır.
Klinik proteomik konusunda arada bir duraklama gereği olmasının nedenleri arasında
başlangıçtaki beklentilerin çok yüksek tutulması da vardır. Transkriptomik gibi başka alanlara
baktığımızda klinik uygulamaya girmiş pek çok test olduğunu görüyoruz. Toplum olarak
araştırmacıları, klinisyenleri, laboratuvarcıları ve hasta avukatlarını cesaretlendirmek için
beklentileri daha gerçekçi tutmalıyız. Böyle bir ortak görüş klinik proteomik alanında
gelişmelerin önünü açacaktır. Yeni teknolojiler geliştirilmesi ve biyolojik temelin daha iyi
anlaşılması hastalar açısından daha büyük yararlar sağlayacaktır düşüncesindeyim.
Andrew N. Hoofnagle: Evet: tanı, prognoz ve tedavi açısından daha özgün yöntemlere ihtiyaç
duyan belli hastalarda kitle spektrometrisi immünolojik testlerin yerini alacaktır.
John Ioannidis: Gelecek 10 yılda çok spektaküler bir gelişme olacağını sanmıyorum. Ancak
MS ya da diğer proteomik tetkiklerin bazı endikasyonlar üzerine yoğunlaşarak doğru ve erken
tanı konusunda hasta lehine bazı yararlar sağlayabileceğini düşünüyorum. Yaygın bazı
hastalıkların gelişme olasılığının ya da tedavi yanıtlarının öngörülmesi açısından gelişme
sağlanabileceği konusunda daha az kötümserim. Geçiş sürecinde ilerleme sağlamak için
işbirliği içinde ve iyi tasarlanmış geç dönem çalışmalarını desteklemeliyiz. Aksi halde 10 yıl
sonra birkaç yüz bin sayfa daha yayınla hala başlıca bir uygulamanın bulunmadığı aynı
noktada olabiliriz.
Mary Lopez: Hastalık ile ilişkili protein belirteçleri ve panellerin rutin ölçümünü sağlayan
klinik analiz cihazlarının ortaya çıkması mümkündür. Özgün biyolojik belirteçlerin otomatik ve
rutin olarak ölçülmesi tıbbın daha kişiselleştirilmesine olanak sağlayabilir. Bu teknoloji klinik
açıdan önemli protein izoformları ve varyantları hakkında bilgi sağlaması mümkün olmayan
genomik testleri de daha yararlı hale getirebilir.
Yazar Katkıları: Tüm yazarlar bu makalenin bilimsel içeriğine katkıda bulunduklarını ve şu üç
gereksinimi yerine getirdiklerini ifade eder: (a) kavram ve tasarıma, verilerin toplanmasına
veya analiz edilmesi ve yorumlanmasına anlamlı katkı; (b) makalenin bilimsel içerik açısından
hazırlanması ve gözden geçirilmesi; ve (c) yayımlanma için nihai onay.
Yazarların Olası Çıkar Çatışması Beyanları: Makalenin gönderilmesi aşamasında tüm yazarlar
Olası Çıkar Çatışması Beyan Formu’nu doldurmuştur. Olası çıkar çatışmaları:
İstihdam veya Yöneticilik: E. P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC; A. N. Hoofnagle, Clinical
Chemistry, AACC
Danışmanlık: Bildirilmemiştir.
Hissedarlık: Bildirilmemiştir.
Onursal Ücretler: Bildirilmemiştir.
Araştırma Desteği: A. N. Hoofnagle, Waters tarafından Washington Üniversitesi’ne kurumsal
bağış, Thermo tarafından Washington Üniversitesi’ne kurumsal bağış.
Uzman Tanıklığı: Bildirilmemiştir.
Patentler: A. N. Hoofnagle, ABD patent numarası 7,807,172.