21 Number: 2 2010 2010_2

Transkript

I
ISSN 1016-3573
ETLİK MERKEZ VETERİNER KONTROL ve
ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ
ANKARA
Test
AB-0048-T
ETLİK VETERİNER
MİKROBİYOLOJİ
DERGİSİ
JOURNAL OF ETLIK VETERINARY MICROBIOLOGY
ANKARA – TURKEY
Cilt/Volume 21 ♦ Sayı/Number 2 ♦ 2010
II
III
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi
Cilt/Volume 21 ♦ Sayı/Number 2 ♦ 2010
Journal of Etlik Veterinary Microbiology
Yılda iki kez yayımlanır / Published two times per year
ISSN 1016-3573
Sahibi
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Adına
Dr. Nahit Yazıcıoğlu
Enstitü Müdürü
Editörler Kurulu / Editorial Board
Adres / Address
Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü
Baş Editör / Editor-in Chief
06020 Etlik – Ankara / TÜRKİYE
Dr. Nahit Yazıcıoğlu
Tel : 90 (312) 326 00 90 (10 hat)
Faks : 90 (312) 321 17 55
Editör Yardımcıları / Co-Editors *
Dr. Erhan Akçay
URL : http://www.etlikvet.gov.tr/yayinlar.htm
Uzm. Yıldız Ayaz
E-posta : [email protected] / [email protected]
Dr. Asiye Dakman
Dr. Arife Ertürk
Dr. Uğur Küçükayan
Dr. H. Kaan Müştak
Dr. Yavuz Ulusoy
Dr. Armağan Erdem Ütük
Uzm. M. Kadri Yavuz
IV
Danışma Kurulu / Advisory Board *
Prof.Dr. Levent Aydın
Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Ayşegül Bildik
Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı
Yrd.Doç. Dr. Alper Çiftçi
Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Yrd.Doç. Dr. Arzu Fındık
Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç.Dr. Ergün Göksoy
Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Doç.Dr. Semih Gümüşsoy
Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Fatih Hatipoğlu
Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı
Doç.Dr. Ziya İlhan
Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Müjgan İzgür
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Doç.Dr. Mahmut Karapehlivan
Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı
Prof.Dr. Firuze Kurtoğlu
Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı
Doç.Dr. Yahya Kuyucuoğlu
Afyon Kocatepe Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Prof.Dr. Mehmet Nizamlıoğlu
Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı
Prof.Dr. Haydar Özdemir
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Bölümü
Prof.Dr. Yavuz Selim Sağlam
Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı
Yrd.Doç. Dr. Esra Şeker
Afyon Kocatepe Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
* İsimler soyada göre alfabetik dizilmiştir ve bu sayıda görev alanlar yazılmıştır.
ULAKBİM Yaşam Bilimleri Veritabanı kapsamında bulunan “çift hakemli” bir dergidir.
Copyright © Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi 2010, Her hakkı saklıdır / All rights reserved
Basım Tarihi / Publishing Date: Aralık / December 2010, Baskı adedi / Circulation: 500
Tasarım ve Baskı / Printing
M
MEDİSAN
Medisan Yayinevi Ltd.Şti.
Çankırı Cad. 45 / 347 Ulus - Ankara, Türkiye
Tel : +90 312 311 24 26 – 311 00 57
V
İçindekiler / Contents
Araştırma Makaleleri / Research Articles Sayfa /Page
UHT süt ve peynir örneklerinde aflatoksin M1 varlığının belirlenmesi
Detection of aflatoxin M1 in UHT milk and cheese samples
Ali Gücükoğlu, Özgür Çadırcı, Necati Özpınar................................................................................................................................. 45
Ege Bölgesi’ndeki sığırların süt ve dışkı örneklerinden Escherichia coli O157:H7 izolasyonu ve verotoksinlerinin belirlenmesi
Isolation of Escherichia coli O157:H7 in milk and feaces of cattle in Aegean Region and determination of their verotoxin
Erdem Çiçek, Serap Savaşan............................................................................................................................................................. 51
Klorprifos’un ratlarda ince bağırsak üzerine etkisi ve kuersetin ve kateşin’in koruyucu rolü
Chlorpyrifos induced small intestine toxicity in rats and protective role of quersetin and catechin
Feriha Özmen, Fatma Gökçe Uzun, Filiz Demir, Yavuz Ulusoy....................................................................................................... 57
Sığır ve koyun brusellozisinin serolojik teşhisinde konvansiyonel testler ile Kompetitif-ELISA’nın karşılaştırılması
Comparison of conventional tests with Competitive-ELISA in serological diagnosis of bovine and ovine brucellosis
Asiye Dakman, Uğur Küçükayan, Ufuk Ülker, H. Kaan Müştak...................................................................................................... 63
Laktasyon dönemindeki Merinoslarda ve Ile de France × Akkaraman melezlerinde yapağı iz element (Fe, Cu, Zn, Mn, Co,
Se) düzeyleri
Wool trace element (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se) levels in lactation period in Merinos and Ile de France × Akkaraman sheeps
Gizem Işıl Bektaş, Arif Altıntaş......................................................................................................................................................... 71
Sığır karkas orijinli Escherichia coli O157 izolatlarının rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA-polimeraz zincir reaksiyonu
ile genotiplendirilmesi
Genotyping of beef carcass isolates of Escherichia coli O157 by random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction
Ertan Emek Onuk, Gökhan İnat, Arzu Fındık, İnci Ülkü Çelikel, Alper Çiftci................................................................................. 79
Determination of serum total sialic acid and ceruloplasmin concentrations in Toxoplasma gondii seropositive dogs
Toksoplazma gondii yönünden seropozitif köpeklerin serum total sialik asit ve seruloplazmin düzeylerinin belirlenmesi
Cevat Nisbet, Sena Çenesiz, Taraneh Öncel, Gül Fatma Yarım, Gülay Çiftci, Erol Handemir......................................................... 85
Derleme / Review
Kedi ve köpeklerde üropatojenik Escherichia coli infeksiyonları
Uropathogenic Escherichia coli infections in cats and dogs
Müjgan İzgür, Orkun Babacan........................................................................................................................................................... 91
VI
Etlik Vet Mikrobiyol
Derg, 21,
- 50, 2010
Araştırma
45
Gücükoğlu
A,45
Çadırcı
Ö, Özpınar N. Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
21, 45 Makalesi
- 50, 2010/ Research Article
UHT süt ve peynir örneklerinde aflatoksin M1 varlığının belirlenmesi
Ali GÜCÜKOĞLU1, Özgür ÇADIRCI1, Necati ÖZPINAR2
Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı, Samsun; 2Erciyes
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye
1
Geliş Tarihi / Received: 24.03.2010, Kabul Tarihi / Accepted: 16.06.2010
Özet: Bu çalışma, Erzincan ilinde tüketime sunulan UHT süt ve peynir örneklerinde aflatoksin M1 (AFM1) varlığını ve
düzeylerini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, 36 UHT süt, 18 beyaz peynir, 17 kaşar peyniri, 10 tulum peyniri, 10 eritme peyniri ve 9 dil peyniri olmak üzere toplam 100 örnek çalışma materyali olarak kullanılmıştır. Örnekler
ELISA yöntemiyle analiz edilmiştir. Analiz edilen UHT süt ve peynir örneğinin 67’sinde (%67) farklı düzeylerde AFM1
tespit edilmiş ve örneklerin 13’ünde (%13) Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri
Hakkında Tebliğ’de belirtilen düzeylerden yüksek bulunmuştur. AFM1 tespit edilen UHT süt numunelerinin %5.6’sı,
beyaz peynir numunelerinin %5.6’sı, kaşar peyniri numunelerinin %29.4’ü ve dil peyniri numunelerinin %55.5’inin
yasal limitleri aştığı saptanmıştır. Sonuç olarak, analiz edilen örneklerin bazılarında AFM1 seviyesinin limit sınırlarının
üstünde olduğu belirlenmiş ve AFM1’in halk sağlığına olan zararlı etkileri göz önüne alındığında analiz edilen değerlerin daha aşağılara çekilmesine yönelik uygulamaların gerekli olduğu düşünülmektedir.
Anahtar sözcükler: Aflatoksin M1, ELISA, peynir, UHT süt.
Detection of aflatoxin M1 in UHT milk and cheese samples
Summary: This study was undertaken to determine the presence and levels of aflatoxin M1 (AFM1) in UHT milk and
cheeses consumed in the province of Erzincan. For this purpose, a total of 100 samples containing 36 UHT milk, 18
white cheese, 17 kashar cheese, 10 tulum cheeses, 10 processed cheeses and 9 dil cheeses were used as the study material. The cheese samples were purchased randomly from different markets. The samples were analyzed by ELISA
method. Different levels of AFM1 were detected in 67 (67%) of the 100 UHT milk and cheese samples tested, and in
13 of the samples (13%) the amount of AFM1 was found over the levels permitted by the Turkish Food Codex. Among
these, 5.6% of UHT milk, 5.6% of white cheese, 29.4% of kashar cheese and 55.5% of dil cheese exceeded the Turkish
safety limits. It was therefore concluded that, the aflatoxin contain of the some investigated samples exceed the tolerance
levels. AFM1 has hazardous effect for the public health for this reason the AFM1 levels must be decreased.
Key words: Aflatoxin M1, cheese, ELISA, UHT milk.
Giriş
Aflatoksinler, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus ve çeşitli toksijenik Aspergillus soyu ile bazı
Penicillium ve Rhizopus soyuna bağlı küfler tarafından sentezlenen mikotoksinlerdir (18, 38). Aflatoksinler, aflatoksin B1, B2, G1, G2, M1 ve M2 olmak
üzere başlıca altı ana bileşikten oluşurlar. Aflatoksin bileşikleri arasında en toksik, karsinojenik ve en
yaygın olanı ise aflatoksin B1’dir (AFB1). AFM1 ise
AFB1’in karaciğerde metabolize olduktan sonra süt
ile atılan türevidir (3, 30).
Çiftlik hayvanları AFB1’i yemler vasıtasıyla
kolayca alır ve alınan bu toksinin %85-90’ı ilk 24
saat içerisinde dışkı ve idrar ile atılır. Vücutta kalan
AFB1 karaciğerde metabolize olup AFM1’e dönüşür
ve yemlerle birlikte ilk alımından 12-24 saat sonra
sütle atılmaya başlar. Bazı yazarlara göre, süt ile atılan AFM1 miktarı yemler vasıtasıyla alınan toplam
AFB1 miktarının %0.4-3’ü oranında olduğu bildirilmiştir (39, 43).
Mikotoksinlerin gıda ve yemlerle alım miktarı
ve süresi göz önüne alındığında, canlılarda çeşitli etkilerinin görülebileceği ve bu nedenle de en güvenli
tolerans düzeyinin sıfır olması, yani alınan gıda ve
yemlerde mikotoksin bulunmaması gerektiği kabul
edilmektedir. Ancak mikotoksinlerin gıda ve yemlerde yaygın bir şekilde doğal olarak bulunması nedeniyle bulunabilecek maksimum tolerans değerleri
ölçüt olarak kullanılmaktadır (37).
Dünyada yapılan çeşitli çalışmalarla süt ve
süt ürünlerinde AFM1 varlığının önemi ortaya ko-
Yazışma adresi / Correspondance: Ali Gücükoğlu, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi
Anabilim Dalı, Kurupelit Kampüsü, Kurupelit, Samsun, Türkiye. E-posta: [email protected]
46
Gücükoğlu A, Çadırcı Ö, Özpınar N. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 45 - 50, 2010
nulmuştur. Domagala ve ark. (8) 30 süt örneğinin
%20’sinde, Markaki ve Melissari (21) 81 pastörize
süt örneğinin %77.77’sinde, Meerarani ve ark. (23)
325 süt örneğinin %11’inde, Galvano ve ark. (14)
59 süt örneğinin %86’sında, Galvano ve ark. (15)
161 süt örneğinin %78’inde, Lopez ve ark. (20) 77
süt örneğinin %23.4’ünde, Sassahara ve ark. (34) 42
adet süt örneğinin %24’ünde, değişen seviyelerde
AFM1’e rastlamışlardır.
Türkiye’de yapılan çalışmalarda ise, Bakırcı
(5) 90 adet süt örneğinin %87.77’sinde, Özmenteşe
(27) 187 süt örneğinin %79.3’ünde 15 adet peynirin
%100’ünde, 15 adet yoğurt örneğinin %100’ünde,
Günşen ve Büyükyörük (16) 125 adet taze kaşar
peyniri örneğinin %68.8’inde, Mavuş (22) 90 süt
örneğinin %90’ında Akdemir ve Altıntaş (1) 48 adet
süt örneğinin %70.83’ünde, Ayçiçek ve ark. (4) 183
beyaz peynir örneğinin %65’inde, Seyrek (35) 110
adet beyaz peynir örneğinin %91.8’inde değişen
seviyelerde AFM1 tespit etmiştir. Benzer şekilde
Sarımehmetoğlu ve ark. (33) her birinden 100’er
adet olmak üzere beyaz peynirlerinin %82’sinde,
tulum peynirlerinin %81’inde, kaşar peynirlerinin
%85’inde, eritme peynirlerinin %79’unda, değişen
seviyelerde AFM1’e rastlamışlardır.
AFM1’in gıdalarda sağlık açısından risk oluşturabilecek düzeyleri “Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerinde Belirli Bulaşanların Maksimum Seviyelerinin Belirlenmesi Hakkında Tebliğ”de belirtilmiştir
(41). Mevcut tebliğ’de AFM1 için belirlenen kabul
edilebilecek üst sınır seviyeleri; süt için 0.05 ppb
(50 ppt [ng/l]), beyaz peynir, kaşar peyniri, tulum
peyniri, dil peyniri ve eritme peynirleri için 0.25
ppb (250 ppt [ng/kg]) olarak belirlenmiştir.
Bu çalışma, Erzincan ilinde tüketime sunulan
UHT süt ve peynirlerde AFM1 varlığı ile düzeylerinin belirlenmesi ve yasal düzenlemelere göre halk
sağlığı açısından güvenilirliğini saptamak amacıyla
planlanmıştır.
Materyal ve Metot
Bu çalışmada Erzincan ilinde Ocak 2008 – Kasım
2008 tarihleri arasında satışa sunulan çeşitli markalara ait toplam 100 UHT süt ve peynir örneği (36
UHT süt, 18 beyaz peynir, 17 kaşar peyniri, 10 tulum peyniri, 10 eritme peyniri ve 9 dil peyniri) materyal olarak kullanıldı. Örnekler soğuk zincir altında, mümkün olan en kısa süre içinde Erzincan B tipi
Gıda Kontrol Müfreze Komutanlığı’nın toksikoloji
laboratuvarına getirilerek analiz edildi.
Örneklerde AFM1 varlığı ve seviyeleri ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) yöntemi ile
Ridascreen Aflatoksin M1 (r-biopharm, M1 30/15)
test kiti kullanılarak belirlendi. Kullanılan test kitinin ölçme limiti 5 ppt, örneklere göre duyarlılık
limiti ise süt için 5 ppt, peynirler için 50 ppt olarak
belirtilmiştir. Geri alma oranı süt için ortalama %95,
peynir örnekleri için ortalama %102’dir (31).
Süt örneklerinin hazırlanması: Yağın alınması
amacıyla süt, soğutmalı santrifüjde 3500 devirde,
10°C’de 10 dk santrifüj edildi. Santrifüj işlemini
takiben tüpün üst kısmındaki yağ tabakası pastör
pipeti kullanılarak uzaklaştırıldı ve yağı alınmış süt
(yağsız supernant) testte direk olarak kullanıldı. Bu
şekilde hazırlanan süt örnekleri için dilüsyon faktörü 1 olarak hesaplandı.
Peynir örneklerinin hazırlanması: Peynir örnekleri homojenize edilip 2 gr tartılarak stomacher torbasına alındı, üzerine 40 ml diklorometan ilave edildi
ve stomacher’de 2 dk homojenize edildi. Bu şekilde
hazırlanan süspansiyon filtre kağıdından (Whatman
filtre No:1, 125 mm) filtre edildi. Elde edilen ekstrakttan deney tüpüne 10 ml alınarak 60°C’de zayıf
nitrojen gazı altında tüpün dibinde yağlı tabaka kalıncaya kadar buharlaştırıldı. Yağlı kalıntı bulunan
deney tüpüne sırasıyla, 0.5 ml metanol, 0.5 ml PBS
buffer ve 1 ml heptan ilave edilerek iyi bir şekilde
karıştırıldı. Karışım soğutmalı santrifüjde 2700 devirde, 15°C’de, 15 dk santrifüj edildi. Santrifüjden
sonra üstteki heptan tabakası alındı. Metanolik sıvı
fazla heptan tabakası arasındaki çok ince faz pastör
pipeti kullanılarak alındı. Aşağıda kalan metanolik
sıvı fazdan 100 µl alındı, 400 µl buffer 1 ilavesi ile
%10’luk metanol içeriği haline getirildi ve bu içerikten 100 µl alınarak analizde kullanıldı. Bu şekilde hazırlanan peynir örnekleri için dilüsyon faktörü
10 olarak hesaplandı.
ELISA testinin uygulanması: Standart solüsyonları ile hazırlanan süt ve peynir örnekleri için yeterli sayıda mikrotiter kuyucuk pleyte yerleştirildi.
Standart solüsyonların ve hazırlanan örneklerin her
birinden 100 µl alındı ve kuyucuklara ilave edildi.
Oda ısısında, karanlık ortamda 60 dk inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda pleyt PBS ile iki
kez yıkandı. Her bir kuyucuğa 100 µl dilüe edilmiş
enzim konjugat ilave edildi. Oda ısısında, karanlık
ortamda 60 dk inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon
sonunda pleyt üç kez PBS ile yıkandı. Her bir kuyucuğa sırayla 50 µl substrat ve 50 µl kromojen ilave
edilerek iyice karıştırıldı ve oda ısısında, karanlık
ortamda 30 dk inkübasyona bırakıldı. Her bir kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu konularak iyice karıştırıldı ve absorbans değeri ELISA okuyucuda (Chopin, TKA-040544) 450 nm’de okutuldu. Okumanın
60 dk içerisinde yapılmasına dikkat edildi.
47
da, toplam 100 örneğin 67’sinde (%67) tespit edilebilir seviyelerde AFM1 saptanmış, 33 örnekte (%33)
ise saptanamamıştır. Analiz edilen UHT süt, beyaz
peynir, kaşar peyniri, tulum peyniri, eritme peyniri
ve dil peyniri numunelerinin %88.9, %66.7, %76.5,
%0, %20 ve %88.9’unda AFM1 tespit edilmiştir
(Tablo 1). Aflatoksin bulunan örneklerin 13’ünde
(%13) Türk Gıda Kodeksi Türk Gıda Kodeksi Gıda
Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri
Hakkında Tebliğ’de (41) belirtilen maksimum düzeylerini aşan seviyelerde AFM1 tespit edilmiştir.
Süt numunelerinin %5.6’sı, beyaz peynir numunelerinin %5.6’sı, kaşar peyniri numunelerinin %29.4’ü
ve dil peyniri numunelerinin %55.5’inin Türk Gıda
Kodeksine göre yasal sınırları aştığı saptanmıştır
(Tablo 2).
Bulgular
Ocak 2008 – Kasım 2008 tarihleri arasında, Erzincan ilinde satışa sunulan toplam 100 UHT süt ve
peynir örneği (36 UHT süt, 18 beyaz peynir, 17 kaşar peyniri, 10 tulum peyniri, 10 eritme peyniri ve 9
dil peyniri) üzerine yapılan AFM1 analizi sonucun-
Tablo 1. UHT süt ve peynir örneklerindeki AFM1 miktarı (ppt=ng/kg).
<5–50
n (%)
51–150
n (%)
151–250
n (%)
251–450
n (%)
451–650
n (%)
>651
n (%)
Toplam
n (%)
UHT süt
34 (94.4)
2 (5.6)
-
-
-
-
36 (100)
Beyaz peynir
9 (50)
6 (33.3)
2 (11.1)
1 (5.6)
-
-
18 (100)
Kaşar peyniri
5 (29.4)
5 (29.4)
2 (11.8)
4 (23.5)
-
1 (5.9)
17 (100)
Tulum peyniri
10 (100)
-
-
-
-
-
10 (100)
Eritme peyniri
8 (80)
1 (10)
1 (10)
-
-
-
10 (100)
Dil peyniri
1 (11.1)
-
3 (33.3)
2 (22.2)
3 (33.3)
-
9 (100)
Tablo 2. AFM1 saptanan UHT süt ve peynir örneklerinin Türk Gıda Kodeksi limitlerine göre dağılımı (ppt=ng/kg).
Örnek (n)
Yasal limitler altında kalan
örnek sayısı ve yüzdesi
Yasal limitleri aşan örnek
sayısı ve yüzdesi*
UHT süt (36)
34 (%94.4)
2 (%5.6)
Beyaz peynir (18)
17 (%94.4)
1 (%5.6)
Kaşar peyniri (17)
12 (%70.6)
5 (%29.4)
Tulum peyniri (10)
10 (%100)
-
Eritme peyniri (10)
10 (%100)
-
Dil peyniri (9)
4 (%44.5)
5 (%55.5)
*Süt için: >50 ng/kg; peynir ürünleri için: >250 ng/kg.
Tartışma ve Sonuç
Peynir türlerinde AFM1’in bulunma oranının süt
örneklerine göre daha yüksek olması AFM1’in kazeine olan ilgisinden kaynaklanmaktadır (13, 42).
Peynirlerin içerdiği kazein oranı süte oranla çok
daha yüksektir. Nitekim analiz edilen peynir örneklerinde AFM1’in bulunma oranı ile düzeyleri süt örneklerine göre çok daha yüksek olması bu görüşü
desteklemektedir.
Süt ve süt ürünlerinde AFM1 miktarı mevsimsel
ve bölgesel (coğrafi) farklılıklardan etkilenmektedir.
48
Taze ve yeşil ot tüketim miktarının arttığı, kesif yem
tüketim miktarının azaldığı ilkbahar ve yaz aylarında süt ve süt ürünlerinde AFM1 miktarı düşerken,
kesif yem tüketiminin arttığı kış aylarında AFM1
miktarı yükselmektedir (13, 33). Bu görüşün aksine,
Markaki ve Melissari (21) ise süt ve süt ürünlerinde
bulunabilecek AFM1 miktarının mevsimsel değişikliklerle ilgisi olmadığını bildirmişlerdir.
Bu çalışmada, incelenen toplam 100 UHT süt
ve peynir örneğinin 67 (%67)’sinde AFM1 saptanmış, 13 (%13) örnekte ise AFM1 değerinin Türk
Gıda Kodeks’ine göre kabul edilebilir sınırların
üzerinde olduğu belirlenmiştir. UHT süt örneklerinde AFM1’in bulunma oranı yüksek olmasına karşın
(%88.9), yasal limitleri aşan seviyeleri düşük (%5.6)
oranda tespit edilmiştir. Ancak, kaşar ve dil peyniri örneklerinde AFM1’in bulunma oranı (%76.5 ve
%88.9) ile yasal limitleri aşan seviyeleri (%29.4 ve
%55.5) yüksek miktarda saptanmıştır.
Yapılan literatür taramalarında bu çalışmaya
benzer bulguları olan süt ve süt ürünlerinde AFM1
varlığı ile ilgili pek çok araştırma mevcuttur. Shundo ve Sabino (36) Brezilya’nın Sao Paulo ve Marilia şehirlerinde, 2002 ile 2003 yıllarında, 79 süt
örneğinde %73.8 AFM1 tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Roussi ve ark. (32), Yunanistan’da pastörize,
UHT ve konsantre sütlerden oluşan toplam 114 örnekte AFM1 sırasıyla %85.4, %82.3 ve %93.3 gibi
yüksek oranda bulunmuştur. İkinci yıl yapılan çalışmada pastörize süt, çiğ tank sütü, çiğ inek, koyun
ve keçi sütü örneklerinde sırasıyla %79.6, %78.3,
%64.3, %73.3 ve %66.7 oranlarında AFM1 saptamışlardır. Araştırmacıların bulguları ile yapılan bu
çalışmada elde edilen sonuçlarda benzer şekilde
AFM1’in bulunma sıklığının yüksek olduğu görülmektedir. Alborzi (2) İran’ın Shiraz şehrinde yaptığı çalışmada 624 pastörize süt örneğinin tümünde
(%100’ünde) AFM1’e rastladığını ve 111 süt örneğinde (%17.8’inde) AFM1 seviyesinin 50 ppt’nin
üzerinde olduğunu bildirmiştir. Oliveira ve ark. (24)
Brezilya’nın Sao Paulo şehrinde yaptıkları araştırmada, 48 süt örneğinde %77.1 oranında değişen seviyelerde AFM1 tespit etmişlerdir. Bognanno ve ark. (7)
İtaya’nın Sicilya şehrinde 240 koyun sütü örneğinin
%81’inde değişen seviyelerde AFM1 saptamışlardır.
Örneklerin sadece 3’ünde (%1.25) maksimum tolerans limiti olan 50 ppt’yi aşan seviyede AFM1 bulunmuştur. Elgerbi ve ark. (9) Libya’nın kuzey batısında, 49 çiğ inek sütü ve 20 beyaz peynir örneğinde
yaptıkları çalışmada 49 süt örneğinin %71.4’inde,
20 beyaz peynir örneğinin %75’inde değişen seviyelerde AFM1 tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Hisada ve ark. (19) Japonya’da yaptıkları çalışmalarda,
126 adet peynir örneğinin %44.44’ünde, 128 adet
peynir örneğinin %86.71’inde, 32 adet peynir örneğinin %40.62’sinde, 132 adet peynir örneğinin
%90.9’unda değişen seviyelerde AFM1 tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Türkiye’de son yıllarda AFM1
konusunda yapılan ve bulunma sıklığı ve miktarı
bakımından bu çalışmada çıkan sonuçlar ile yakın
değerlere sahip araştırmalardan biri olan, Oruç ve
Sonal (25) 10 süt örneğinin %10’unda, 57 peynir
örneğinin %89.47’sinde değişik seviyelerde AFM1
tespit ettiklerini, peynir örneklerinin %12.28’inde
bulunan değerlerin peynir için maksimum tolerans
limiti olarak kabul edilen 250 ppt’nin üstünde olduğunu ve tam yağlı bir beyaz peynirde en yüksek 810
ppt seviyesinde AFM1 bulduklarını bildirmişlerdir.
Yapılan çalışmalarda, bu çalışmanın aksine
daha düşük değerlerde AFM1 saptanan çeşitli araştırmalar bulunmaktadır. Finoli ve Vecchio (11),
İtalya’nın Sicilya şehrinde, analiz ettikleri 40 süt
örneğinde %30, 30 peynir örneğinde ise %13.3 oranında değişen seviyelerde AFM1’i tespit ettiklerini
bildirmişlerdir. Pereira ve ark. (28) Brezilya’nın
Minas şehrinde çiğ ve pastörize sütlerden oluşan
örneklerde yaptıkları çalışmada, 36 çiğ süt örneğinin %52.8’inde, 34 pastörize süt örneğinin ise
%38.2’sinde AFM1 tespit ettiklerini bildirmişlerdir.
Piva ve ark. (29) 1984 yılında İtalya’da 225 Almanya kaynaklı süt örneğinin %13.8’inde 88 Fransa
kaynaklı süt örneğinin %2.5’inde, toplamda ise 313
süt örneğinin %13.41’inde değişen oranlarda AFM1
tespit etmişlerdir. Aynı çalışmada Fransa kaynaklı
82 peynir örneğinin %19.5’inde, Almanya kaynaklı
34 peynir örneğinin %26.5’inde, Hollanda kaynaklı
43 peynir örneğinin %53.5’inde, toplamda ise 159
peynir örneğinin %30.18’inde düşük seviyelerde
AFM1 tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Piva ve ark.
(29) 1985 yılında yaptıkları ikinci çalışmalarında
ise 276 süt örneğinin %25.3’inde AFM1 tespit ettiklerini 416 peynir örneğinin ise %31.3’ünde AFM1
tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Finoli ve ark. (10)
İtalya’da, 50 adet peynir örneğinin %8’inde AFM1
tespit ettiklerini, Stoloff ve ark. (40) 1979 yılında
Amerika’da, yağsız süt, vanilyalı dondurma, yoğurt, cheddar peyniri ve ev yapımı peynirlerden
oluşan örneklerde yaptıkları çalışmada, toplam
992 örnekten sadece 1 cheddar peynirinde 80 ppt
seviyesinde AFM1 tespit ettiklerini, Fritz ve Engst
(12) ise 60 süt örneğinin sadece %6.66’sında AFM1
tespit ettiklerini, inceledikleri diğer süt ürünlerinde
AFM1 bulamadıklarını bildirmişlerdir. Barbieri ve
ark. (6) İtalya’nın Modena bölgesinde parmesan
peynirlerinde yaptıkları araştırmada, inceledikleri
200 peynir örneğinin sadece %9’unda AFM1’i tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Gürses ve ark. (17)
Erzurum’da 21 farklı marketten topladıkları 23 beyaz peynir örneğinin %39.13’ünde, 14 kaşar peyniri
örneğinin %42.85’inde 11 tulum peyniri örneğinin
%63.63’ünde, 9 civil peyniri örneğinin %44.44’ünde
ve 6 lor peyniri örneğinin %33.33’ünde değişen seviyelerde AFM1 tespit etmişlerdir. Özkaya ve ark.
(26) 360 süt örneğinin %44.3’ünde AFM1 tespit etmişler ve örneklerin %13.3’ünde >50 ppt düzeyinde
saptamışlardır.
Sonuç olarak; süt ve süt ürünlerinde AFM1
varlığı halk sağlığı açısından büyük bir risktir. Bu
nedenle hayvan yemlerinde başta Aspergillus türleri
olmak üzere diğer küf türlerinin üremesinin ve aflatoksin oluşumunun önlenmesi çok önemlidir. Bu
amaçla hayvanlarına verilen yemlerin depolanma
koşullarının uygunluğu sağlanmalı ve gerekli kontroller yapılarak süt üreticileri bu konuda bilinçlendirilmelidir. Ayrıca, süt ve süt ürünlerindeki AFM1
miktarının minimum düzeylerde tutulabilmesi için,
modern tekniklerle üretim yapılmalı ve ürünlerin
raf ömürlerinde optimum şartlar sağlanmalıdır.
Kaynaklar
1. Akdemir Ç, Altıntaş A, (2004). Ankara’da İşlenen Sütlerde
Aflatoksin M1 Varlığının ve Düzeylerinin HPLC ile Araştırılması. Ankara Üniv Vet Fak Derg. 51, 175-179.
2. Alborzi S, (2004). Determination of the quantity of aflatoxin
M1 in pasteurised milk in Shiraz. 14th European Congress
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1-4 May
2004, Prague/Czech Republic.
3. Applebaum RS, Brackett RE, Wiseman DW, Marth EH,
(1982). Responses of dairy cows to dietary aflatoxin: feed
intake and yield, toxin content and quality of milk of cows
treated with pure and impure aflatoxins. J Dairy Sci. 65,
1503-1508.
4. Aycicek H, Yarsan E, Sarımehmetoğlu B, Çakmak Ö,
(2002). Aflatoxin M1 in white cheese and butter consumed
in İstanbul, Turkey. Vet Hum Toxicol. 44(5), 295-296.
5. Bakırcı İ, (2001). A study on the occurrence of aflatoxin M1
in milk and milk products produced in Van province of Turkey. Food Cont. 12, 47-51.
6. Barbieri G, Bergamini C, Ori E, Resca P, (1994). Aflatoxin
M1 in Parmesan cheese: HPLC determination. J Food Sci.
59(6), 1313-1331.
49
7. Bognanno M, La Fauci L, Ritieni A, Tafuri A, De Lorenzo
A, Micari P, Di Renzo L, Ciappellano S, Sarullo V, Galvano F, (2006). Survey of the occurrence of aflatoxin M1 in
ovine milk by HPLC and its confirmation by MS. Mol Nutr
Food Res. 50(3), 300-305.
8. Domagala J, Kisza J, Blüthgen A, Heeschen W, (1997).
Contamination of milk with aflatoxin M1 in Poland. Milchwissenschaft. 52 (11), 631-633.
9. Elgerbi AM, Aidoo KE, Candlish AA, Tester RF, (2004).
Occurrence of aflatoxin M1 in randomly selected North African milk and cheese samples. Food Addit Contam. 21(6),
592-597.
10. Finoli C, Bellavita VM, Cerruti G, (1983). Sula presenza
di aflatossina M1 in latte e derivati. Ltte Latticini Conserve
Anim. 8(9), 611-625.
11. Finoli C, Vecchio A, (2003). Occurrence of aflatoxins in
feedstuffs, sheep milk and dairy products in Western Sicily.
Ital J Anim Sci. 2, 191-196.
12. Fritz W, Engst R, (1981). Survey of selected mycotoxins in
food. J Environ Sci Health, Part B: Pestic, Food Contam,
Agric Wastes. 16(2), 193-210.
13. Galvano F, Galofaro V, Galvano G, (1996). Occurence
and stability of aflatoxin M1 in milk and milk product: a
worldwide review. J Food Protec. 59 (10), 1079-1090.
14. Galvano F, Galofaro V, Angelis A, Galvano M, Bognanno M, Gavano G, (1998). Survey of the Occurrence of
Aflatoxin M1 in Dairy products Marketed in Italy. J Food
Protec. 61(6), 738-741.
15. Galvano F, Galofaro V, Ritieni A, Bognanno M, De Angelis A, Galvano G, (2001). Survey of the occurrence of
aflatoxin M1 in dairy products marketed in Italy: second
year of observation. Food Add Cont. 18(7), 644-646.
16. Günşen U, Büyükyörük İ, (2003). Piyasadan temin edilen
taze kaşar peynirlerinin bakteriyolojik kaliteleri ile aflatoksin M1 düzeylerinin belirlenmesi. Turk J Vet Anim Sci. 27,
821-825.
17. Gürses M, Erdoğan A, Çetin B, (2004). Occurrence of
aflatoxin M1 in some cheese types sold in Erzurum, Turkey.
Turk J Vet Anim Sci. 28, 527-530.
18. Harvey RB, Philips TD, Ellis JA, Kubena LF, Huff WE,
Peterson HD, (1991). Effects on aflatoxin M1 residues in
milk by addition of hydrated sodium calcium aluminosilicate to aflatoxin contaminated diets of dairy cows. Am J Vet
Res. 52(9), 1556-1558.
19. Hisada K, Yamamoto K, Tsubouchi H, Sakabe Y, (1984).
Natural occurrence of aflatoxin M1 in imported and domestic cheese. J Food Hyg Soc Japan. 25, 543-548.
20. Lopez CE, Ramos LL, Ramadan S, Bulacio LC, (2003).
Presence of Aflatoxin M1 in milk for human consumption in
Argentina. Food Cont. 14, 31-34.
21. Markaki P, Melissari E, (1997). Occurrence of aflatoksin
M1 in commercial pasteurized milk determined with ELISA
and HPLC. Food Addit Contam. 14(5), 451-456.
22. Mavuş H, (2003). Kayseri yöresinde satışa sunulan sütlerden aflatoksin tayini. Yüksek Lisans Tezi, GÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
23. Meerarani S, Ramadass P, Padmanaban VD, Nachimuthu K, (1997). Incidence of Aflatoxin M1 in Milk Sam-
50
ples around Chennai (Madras) City. J Food Sci Tech. 34(6),
506-508.
24. Oliveira CA, Rosmaninho J, Rosim R, (2006). Aflatoxin
M1 and cyclopiazonic acid in fluid milk traded in Sao Paulo, Brazil. Food Addit Contam. 23(2), 196-201.
25. Oruç HH, Sonal S, (2001). Determination of aflatoxin M1
levels in cheese and milk consumed in Bursa, Turkey. Vet
Hum Toxicol. 43(5), 292-293.
26. Özkaya Ş, Başaran A, Kaymak T, Dikmen O, Kocabey
M, Demirkazık G, Altındiş N, Ramis R, (2002). Türkiyede üretilmekte olan süt ve peynirlerde aflatoksin M1 aranması. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Koruma Kontrol Genel
Müdürlüğü, Gıdalarda Katkı-Kalıntı ve Bulaşanlarının İzlenmesi II, Bursa, 80-92.
27. Özmenteşe N, (2002). İstanbul piyasasından sağlanan süt
ve süt ürünlerinin aflatoksin B1 ve M1 içerikleri yönünden
yüksek basınçlı sıvı kromotografisi yöntemi ile araştırılması. Doktora Tezi, MÜ Sağlık Bilimleri Enstitüsü, İstanbul.
28. Pereira MMG, De Carvalho EP, Prado G, Da Rocha Rosa
CA, Veloso T, De Souza LAF, Ribeiro JMM, (2005). Detection of aflatoxins in dairy cattle feed and milk in Lavras,
Minas Gerais-Brazil. Cienc Agrotec. 29(1), 106-112.
29. Piva G, Pietri A, Galazzi L, Curto O, (1988). Aflatoxin M1
occurrence in dairy products marketed in Italy. Food Addit
Contam. 5(2), 133-139.
30. Rao SBN, Chopra RC, (2001). Influence of sodium bentonite and activated charcoal on aflatoxin M1 excretion in
milk of goats. Small Rum Res. 41, 203-213.
31. Ridascreen Aflatoxin M1, (2006). Enzyme immunoassay
for the quantitative analysis of aflatoxin M1, Art. No.:R1101.
R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany.
32. Roussi V, Govaris A, Varagouli A, Botsoglou NA, (2002).
Occurrence of aflatoxin M1 in raw and market milk commercialized in Greece. Food AdditContam. 19(9), 863-868.
33. Sarımehmetoğlu B, Kuplulu Ö, Çelik TH, (2004). Detection of aflatoxin M1 in cheese samples by ELISA. Food
Cont. 15, 45-49.
34. Sassahara M, Netto DP, Yanaka EK, (2005). Aflatoxin occurrence in foodstuff supplied to dairy cattle and aflatoxin
M1 in raw milk in the North of Parana State. Food Chem
Toxicol. 43, 981-984.
35. Seyrek K, (2001). Türk Silahlı Kuvvetleri’ne bağlı birliklerde tüketilen beyaz peynirlerdeki aflatoxin M1 seviyesinin
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) metodu ile
saptanması. Vet Hek Der Derg. 55-58.
36. Shundo L, Sabino M, (2006). Aflatoxin M1 in milk by immunoaffinity column clean up with TLC/HPLC determination. Braz J Microbiol. 37(2), 1517-1523.
37. Sonal S, Oruç HH, (2000). Bursa bölgesindeki tavuk çiftliklerinden sağlanan yemlerde mikotoksin düzeyleri. Y Y Ü
Vet Fak Derg. 11(2), 1-6.
38. Steyn PS, (1998). The biosynthesis of mycotoxins. Revue
Med Vet. 149(6), 469-678.
39. Stoloff L, (1980). Aflatoxin M1 in Perspective. J Food Prot.
43, 226-230.
40. Stoloff L, Wood G, Carter L, (1981). Aflatoxin M1 in manufactured dairy products produced in the United States in
1979. J Dairy Sci. 64(12), 2426-2430.
41. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği (2008). Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ.
Erişim adresi: http://www.kkgm.gov.tr/TGK/Teblig/200826.html. Erişim tarihi: 22.03.2010.
42. Wiseman DW, Marth EH, (1983). Behaviour of aflatoxin
M1 during manufacture and storage of queso Blanco and
Bakers’ cheese. J Food Prot. 46 (10), 910-913.
43. Yiannikouris A, Jouany JP, (2002). Mycotoxins in feeds
and their fate in animals: a review. Anim Res. 51, 81-99.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg,Çiçek
21, 51
56, 2010S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, Araştırma
Makalesi / Research Article
51
E,-Savaşan
51 - 56, 2010
Ege Bölgesi’ndeki sığırların süt ve dışkı örneklerinden Escherichia coli
O157:H7 izolasyonu ve verotoksinlerinin belirlenmesi*
Erdem ÇİÇEK, Serap SAVAŞAN
Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın, Türkiye
Özet: Escherichia coli O157:H7 serotipi; insan patojeni olarak ilk kez 1982 yılında ABD’de meydana gelen iki ayrı
hemorajik kolitis salgını sonucu tanımlanmaya başlamıştır ve en sık izole edilen enterik patojenlerden biridir. E. coli
O157:H7 ile infekte olan kişiler asemptomatik olabilir veya kanlı yada kansız diare, hemorajik kolitis (HC), hemolitik
üremik sendrom (HUS) ve trombotik trombositopenik purpura (TTP) semptomları gösterebilir. Shiga-benzeri toxin
üreten E. coli (STEC), Vero toxin-üreten E.coli (VTEC) olarak da adlandırılır. İnfeksiyonu gıda kaynaklıdır ve sığırlar
STEC infeksiyonunun birincil rezervuarı olarak kabul edilmektedir. STEC infeksiyonlarının patogenezinde rol alan
en önemli virülens faktörleri, şigatoksinler, hemolizin, intimin yapışma faktörü, pO157 plazmidi ve tip III sekresyon
sistemi olarak belirtilmektedir. Bu çalışmada, incelenen 150 süt ve 150 dışkı örneğinden 2’si süt ve diğer 2’si ise dışkı
örneklerinden olmak üzere 4 (%1.3) E. coli O157:H7 izole edildi. Süt örneklerinden izole edilen suşlardan 1’inin VT1
ürettiği belirlendi.
Anahtar sözcükler: E. coli O157:H7, izolasyon, sığır, verotoksin.
Isolation of Escherichia coli O157:H7 in milk and feaces of cattle in Aegean Region and
determination of their verotoxin
Summary: Escherichia coli O157:H7 was first identified as a human pathogen following two geographically separate
outbreaks of hemorrhagic colitis in the United States in 1982. E. coli O157:H7 was one of the most frequently isolated
enteric pathogen. Persons infected with E. coli O157:H7 may be asymptomatic or symptoms such as diarrhea, bloody
diarrhea, hemorrhagic colitis (HC), hemolytic-uremic syndrome, and thrombotic thrombocytopenic purpura may be
observed. Infections caused by Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC), also known as Vero toxin-producing E. coli
(VTEC), in humans is food-borne and infected cattle act as a primer reservoir for STEC infection. The most important
virulence factors which act role in the pathogenesis of STEC infections are reported as shiga toxins, hemolysin, intimin
adherence factor and type III secretion system. In this study, 4 (1.3%) E. coli O157:H7, two of them were from milk
samples and the other two from faeces samples were isolated from 150 milk samples and 150 faeces samples. We determined that one strain isolated from milk samples produced VT1.
Key words: Cattle, E. coli O157:H7, isolation, verotoxin.
Giriş
Escherichia coli, Enterobacteriaceae familyasına
ait Escherichia genusunun en önemli türüdür. İnsan
ve çoğu sıcakkanlı hayvanın doğal bağırsak florasında bulunmaktadır (1, 3, 4, 32). Toplam fekal
floranın küçük bir bölümünü oluşturmasına rağmen
insan bağırsağında baskın fakültatif anaerob türdür
ve normalde sembiyotik olarak bulunur. Bunun yanı
sıra patojenik özellik gösteren bazı E. coli suşları
insanlarda ishale yol açan infeksiyonlar, idrar yolları infeksiyonları, menenjit, septisemi gibi çeşitli
hastalıklara neden olabilmektedir (11, 22).
1982’de ABD’de Michigan ve Oregon eyaletlerinde aynı restorant zincirinden hamburger yiyen
47 kişinin benzer klinik belirtilerle (kramp, karın
ağrısı, sulu ve hemorajik ishal şikayetleriyle) başvurması sonucu E. coli O157:H7 serotipi hemorajik
kolitis (HC) ve hemolitik üremik sendrom (HUS)’a
neden olan bir patojen olarak tanımlanmıştır (4, 9,
18, 26, 29).
E. coli O157:H7’yi diğer E. coli suşlarından
ayıran üç temel özellik vardır. Sorbitolü fermente edememesi (10, 21), 4-methylumbelliferone
glucuronide’i (MUG) hidrolize eden β-glukuronidaz
enzim aktivitesine sahip olmaması ve 44-45°C ve
Yazışma adresi / Correspondance: Erdem Çiçek, Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
Işıklı, Aydın, Türkiye. E-posta: [email protected]
* İlk yazarın yüksek lisans tezinden özetlenmiştir. Bu çalışma ADÜ bilimsel araştırma projeleri (VTF-07-12 no’lu proje) tarafın-dan desteklenmiştir.
Çiçek E, Savaşan S. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 51 - 56, 2010
52
üzerindeki sıcaklıklarda gelişememesidir (5, 9, 19).
E. coli O157:H7’yi ayıran diğer bir özellik ise 60
Md (pO157) plazmid taşımasıdır (31, 33).
Elliden fazla serotipi bulunan Entero Hemorajik E. coli (EHEC)’in en yaygın tipi olan E. coli
O157:H7; Shigella dysenteriae tip I tarafından oluşturulan toksine benzerliğinden dolayı şigatoksinler
olarak adlandırılan (Stx 1 ve Stx 2) toksinler üretmektedir. Bunlara Shiga-benzeri toxin üreten E. coli
(STEC) denilmektedir. Şigatoksinler Vero hücre
kültürlerine sitotoksik etkili olduğundan verotoksinler (Vt 1 ve Vt 2) olarak da adlandırılmaktadır. Bu
toksinlerin EHEC suşlarının insanlardaki virulensi
açısından önemli roller üstlendiği düşünülmektedir
(1, 8, 9, 12, 28, 31).
Stx’lerin patojenik mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Fakat diare, HC, HUS ve trombotik
trombositopenik purpura (TTP) gelişimine katkıda
bulundukları düşünülmektedir. HC’nin Stx’lerin intestinal sisteme bırakıldıktan sonra ortaya çıktığı ve
HUS/TTP’nin de yine Stx’lerin kana karışmasından
sonra ortaya çıktığı tahmin edilmektedir (9, 20).
HUS’lu hastalarının kanlarında da Stx’lere rastlanmıştır. Stx 2 ve Stx 2c’nin insan klinik izolatlarında
en sık rastlanılan toksinler olduğu belirtilmektedir
(1). Stx 1 ve Stx 2’nin in vitro ve hayvanlarda değişik patojeniteleri görülmüştür (9, 13, 20).
STEC/EHEC E. coli patotipinde zoonotik orijinli tek patojenik gruptur ve birçok hayvan türünün bağırsak florasında bulunabilir. Bununla birlikte ruminantlar STEC’nin ve özellikle E. coli
O157:H7’nin birincil rezervuarı olarak belirtilmektedir. Yapılan son çalışmalarda, insan için yüksek
derecede virulent olan bu türün sadece kontamine
gıda veya suyun tüketilmesiyle değil, STEC pozitif
hayvanlar veya ortamlarla temas ile de infeksiyona
neden olduğu bildirilmektedir (6, 9).
Bu çalışmada, Ege Bölgesi’nde bulunan sığırlardan alınacak süt ve dışkı örneklerdeki E. coli
O157:H7 bakterisinin varlığı ve verotoksin üretip
üretmediğinin belirlenmesi amaçlandı.
Materyal ve Metot
Bu çalışmada Ege Bölgesi’nde bulunan çeşitli çiftlikler ve köy evleri ziyaret edilerek farklı yaş ve
cinsiyetteki sağlıklı sığırlardan 150 dışkı ve süt
örneği toplandı. Çalışmada ilk 50 sığırdan hem süt
hem dışkı örneği alındı. Diğer 100 süt ve dışkı örneği farklı sığırlardan alınarak toplamda 250 farklı
sığırdan örnek toplandı. Dışkı örnekleri her hayvan
için farklı rektal muayene eldiveni ve steril plastik
dışkı kabı kullanılarak rektumdan, çiğ süt örnekleri
ise hayvanların memelerinden enjektör ile 50 ml’lik
steril cam şişeler içerisine alındı. Örnekler soğuk
zincirde laboratuvara ulaştırıldı.
Örneklerden E. coli O157:H7 izolasyonu amacıyla ön zenginleştirme besiyeri olarak novobiocin
katkılı modifiye Tryptic Soy Broth (mTSB, Oxoid)
kullanıldı. Selektif-diferansiyel katı besiyeri olarak
Sefiksim-Tellürit (CT) (Oxoid) ilave edilmiş Sorbitol MacConkey Agar (SMAC, Oxoid) kullanıldı.
37ºC’de aerobik koşullarda 24 saat inkübe edildi.
CT-SMAC agarda üreyen sorbitol fermentasyonu
ve β-glukuronidaz negatif renksiz koloniler şüpheli
olarak değerlendirildi (15). Gram boyama ve API
20E test kiti ile örneklerin E. coli olup olmadığı incelendi. E. coli O157 şüpheli olarak belirlenen izolatlara E. coli O157 Latex Test (Oxoid) uygulandı.
Aglutinasyon gösteren izolatlar, E. coli O157 olarak
belirlendi (9, 15). E. coli O157 olarak saptanan suşların H antijen tipinin belirlenmesi amacıyla Escherichia coli Antisera (Denka Seiken Co. Japonya)
kullanıldı. Son olarak yapılan incelemelerle E. coli
O157:H7 olduğu tespit edilen suşların toksin üretip
üretmediğinin belirlenmesi amacıyla VTEC-RPLA
toksin belirleme kiti (Oxoid TD960) kullanıldı.
Bulgular
Toplam 300 dışkı ve süt örneğinden E. coli O157:H7
izolasyon oranı ve verotoksin test sonucu Tablo 1’de
belirtilmiştir.
Tablo 1. E. coli O157:H7 izolasyon oranı ve verotoksin üreten suşların yüzdesi.
Örnekler
Örnek sayısı (n)
İzolasyon oranı (%)
VT1 (%)
VT2 (%)
Dışkı Örnekleri
150
2 (%1.3)
-
-
Süt Örnekleri
150
2 (%1.3)
1 (%50)
-
Çalışmada 250 farklı sığırdan elde edilen örneklerden izole edilen E. coli O157:H7 suşlarından 3’ünün
2 yaş üzerindeki sığırlara, 1’inin ise 2 yaş altındaki
sığırlara ait olduğu belirlendi. İzole edilen E. coli
O157:H7 suşlarının yaşa göre dağılımı Tablo 2’de
belirtilmiştir.
Tablo 2. Örneklerden izole edilen E. coli O157:H7 suşlarının yaşa göre dağılımı.
Yaş grubu
Örnek sayısı (n)*
İzolasyon oranı (%)
2 yaş altı
82
1 (%1.2)
2 yaş ve üzeri
168
3 (%1.8)
Toplam
250
4 (%1.6)
* Çalışmada ilk 50 sığırdan hem süt hem dışkı örneği alındı. Diğer 100
süt ve dışkı örneği farklı sığırlardan alınarak toplamda 250 farklı sığırdan örnek toplandı.
Çalışmada kullanılan 150 sığıra ait rektal dışkı örneğinin 3’ünden (%2) E. coli O157 izole edilirken, E. coli antiserum testi sonucunda 2 örnek
(%1.3) E. coli O157:H7, 1 örnek ise (%0.7) E. coli
O157:H- olarak belirlendi. Benzer şekilde 150 çiğ
süt örneğinin 3’ünden (%2) E. coli O157 izole edilirken bunlardan 2’si (%1.3) E. coli O157:H7, 1’i
(%0.7) E. coli O157:H- olarak tespit edildi.
Elliden fazla serotipi bulunan EHEC’in en yaygın
tipi olan E. coli O157:H7, insanlarda kanlı veya
kansız diyare, hemorajik kolit, hemolitik üremik
sendrom ve trombotik trombositopenik purpura olarak tanımlanan ciddi ve genellikle letal etkili infeksiyonlara neden olarak son yıllarda adından sıkça
söz ettirmektedir (1, 9, 30, 35). E. coli O157:H7 her
yıl ABD’de yaklaşık 73000 infeksiyona neden olmaktadır ve 1982-2002 yılları arasında toplam 350
salgın ortaya çıkmıştır. Bu salgınlar her yıl ortalama
50 ölüme neden olmuştur (13, 14, 26).
E. coli O157:H7’nin kontrolü birçok faktöre
bağlı olarak değişmektedir. E. coli O157:H7 sağlıklı
sığırlarda kolonize olabilir, gıda ve suda yaşayabilir,
asitli ortamlara dirençlidir ve en önemlisi infeksiyon
dozu çok düşüktür. Bu yüzden her aşamada kontrol
yapılması gerektiği belirtilmektedir (6, 13).
Sığırlar E. coli O157:H7 infeksiyonun en
önemli kaynağı olarak belirtilmektedir. Sığırların
normal bağırsak mikroflorasının bir parçası olan E.
coli O157:H7 varlığı sığırların yaşıyla da değişim
53
göstermektedir. Yapılan çalışmalarda genç sığırların
dışkılarında özellikle sütten kesildikten sonra erişkinlerdekine göre çok daha yoğun ölçüde bu patojene rastlanmıştır. Ayrıca yapılan bazı çalışmalarda
da yaz aylarında E. coli O157:H7 sayısının arttığı
tespit edilmiştir (6, 9).
E. coli O157:H7’ye sığırlar dışında koyun, keçi,
domuz, köpek ve at gibi evcil hayvanların yanı sıra
geyik, kuş gibi vahşi hayvanlarda da rastlanmıştır.
Vahşi hayvanlarla temas eden evcil hayvanlara bulaşmanın olabileceği belirtilmiştir (6, 9).
E. coli O157:H7 infeksiyonlarında ilk sırayı,
doğrudan veya dolaylı olarak sığır dışkısıyla kontamine olmuş etlerin yeterince pişirilmeden tüketilmesinin aldığı düşünülmektedir. Diğer bir bulaşma
kaynağı ise dışkıyla kontamine olmuş meyve, sebzelerin tüketilmesidir. Süt ve ürünleri de önemli bir
bulaşma kaynağıdır. Özellikle çiğ sütün veya çiğ süt
ile yapılan peynir, tereyağı gibi ürünlerin tüketilmesi infeksiyonlara neden olmaktadır. Son yıllarda insanlar arasında bulaşma ve su kaynaklı salgınların
sayısında belirgin artışlar gözlemlenmiştir. Özellikle kontamine olmuş içme suları ve halka açık yüzme
havuzları büyük salgınlara neden olmaktadır. Son
on yılda hayvanat bahçesi veya çiftlik ziyaretlerinde
hayvanlarla temas sonucu ortaya çıkan salgınların
sayısında da büyük bir artış görüldüğü belirtilmektedir (6, 26).
E. coli O157:H7 serotipinin çeşitli gıda, klinik
ve çevre örneklerinde aranmasına yönelik olarak
klasik ve gelişmiş olmak üzere 2 ana grupta toplanabilecek çeşitli yöntemler bulunmaktadır. Klasik
yöntemler biyokimyasal testler üzerine kurulmuştur
ve büyük çoğunluğu selektif zenginleştirme ve katı
besiyerlerine ekim aşamalarını içeren var/yok testleridir. Gelişmiş testler ise genellikle serolojik yöntemler üzerine dayandırılmıştır ve genellikle araştırma laboratuvarlarında uygulanmaktadır (15).
STEC/EHEC E. coli grubu içerisinde zoonotik
orijinli tek patojenik gruptur. Sığır populasyonlarında yapılan çalışmalarda E. coli O157:H7 prevalansının ABD’de %1-5 (35), çeşitli Avrupa ülkelerinde
%1-13 arasında olduğu bildirilmektedir (3). Wells ve
ark. (32), 1266 sağlıklı sığırdan aldıkları süt örneklerinin 18’inde (%1.4) E. coli O157:H7 izolasyonu
gerçekleştirdiklerini bildirmiştir. ABD’nin Washington eyaletinde 3570 dışkı örneği alınarak yapılan
bir çalışmada ise 10 adet (%0.28) E. coli O157:H7
izolasyonu gerçekleştiği bildirilmiştir (16).
54
Ülkemizde de sığır ve süt ineklerinde E. coli
O157:H7 izolasyonuna yönelik çalışmalar yapılmıştır. Van yöresinde yapılan bir çalışmada, sağlıklı
süt sığırlarından alınan 312 dışkı örneğinden 4’ünde
(%1.28) E. coli O157:H7 saptandığı belirtilmiştir
(7). Yılmaz ve ark. (34), Türkiye’deki sığırlarda E.
coli O157:H7’ye rastlanma sıklığını araştırdıkları
bir çalışmada, İstanbul’dan alınan 330 rektal svap
örneğinin 88’inde (%26.7) SMAC agarda sorbitolnegatif koloni gözlemlendiğini, bunlardan 13’ünden
(%3.93) de E. coli O157:H7 izolasyonu gerçekleştiğini bildirmişlerdir.
Bu çalışmadaki %1.3’lük izolasyon oranı
Türkiye’de ve diğer ülkelerde yapılan çalışmalarla
paralellik göstermektedir.
Çiğ sütlerden E. coli O157:H7 izolasyonuna
yönelik yapılan çeşitli çalışmalarda, çiğ sütlerde
prevalansın oldukça düşük olduğu ve %0 ile %10
arasında değiştiği belirtilmektedir (24). Heuvelink
ve ark. (17), yaptıkları çalışmada, 1011 çiğ süt örneğinden E. coli O157 izole edemediklerini bildirmişlerdir. İtalya’da yapılan sorbitol-negatif E. coli suşlarının araştırıldığı bir çalışmada ise, inek ve keçilere ait toplam 144 çiğ süt örneğinin sadece 1’inden
E. coli O157:H- izole edildiği belirtilmiştir (25).
Arjantin’de immunomanyetik separasyon yöntemi
kullanılarak yapılan bir çalışmada, 150 süt örneğinin hiçbirinden STEC O157 izolasyonu yapılmadığı
belirtilmiştir (27). Türkiye’de Öksüz ve ark.’ın (23)
çiğ süt ve çiğ sütten yapılmış peynirlerde E. coli
O157 insidansına yönelik yaptıkları bir çalışmada
100 çiğ süt örneğinden sadece 1’inde (%1) E. coli
O157 tespit edildiği bildirilmiştir.
Bu çalışmada 150 çiğ süt örneğinin 2’sinden
(%1.3) E. coli O157:H7 tespit edildi. Bu sonuç
Türkiye’de ve diğer ülkelerde yapılan çalışmalarla
paralellik göstermektedir.
Wells ve ark. (32), farklı yaşlardaki sığırlarda
E. coli O157:H7 prevalansını araştırdıkları bir çalışmada; 210 buzağının 5’inde (%2.3), 394 düvenin
12’sinde, fakat 662 yetişkin sığırın sadece 1’inde
(%0.15) E. coli O157:H7 izolasyonu gerçekleştirdiğini bildirmiştir. Yılmaz ve ark. (34), sığırlarda
yaptıkları çalışmada, izolasyonun genellikle iki yaşındaki hayvanlardan yapıldığını bildirmiştir. Ayrıca yapılan bazı çalışmalarda da yaz aylarında E. coli
O157:H7 sayısının arttığı tespit edilmiştir (6, 9).
Bu çalışmada izole edilen suşların 3’ünün
(%1.8) 2 yaş üzerindeki sığırlara, 1’inin (%1.2) ise
iki yaş altındaki sığıra ait olduğu belirlendi. Çalışmada yetişkin sığırlardan gerçekleşen izolasyon
oranın genç sığırlardakine göre yüksek çıkması diğer çalışmalarla farklılık göstermektedir. Bu farklılıkta coğrafik açıdan değişkenlerin etkili olabileceği
düşünüldü.
Wang ve ark. (31), 81 E. coli O157:H7 suşunun
virulans faktörlerini araştırdıkları bir çalışmada, 32
(%39) suşun VT1, 68 suşunda VT2 (%83) ürettiklerini belirtmişlerdir.
Çalışmada izole edilen 4 E. coli O157:H7 suşundan 1’inin (%25) VT1 ürettiği tespit edildi.
İzole edilen suşlardan hiç birinin VT2 üretmediği
belirlendi. Bu sonucun diğer çalışmalarla farklılık
göstermesi izolatların sayısının yeterli olmaması ile
açıklanabilir.
Bu çalışma ile Ege Bölgesi’nde bulunan sığırlardan kültürel ve serolojik yöntemler kullanılarak
E. coli O157:H7 izolasyonu ve identifikasyonu gerçekleştirildi ve Türkiye’de gerçekleştirilen birçok
çalışmadan farklı olarak suşların verotoksin üretip
üretmedikleri belirlendi. Sunulan bu çalışmanın,
Türkiye’de gerçekleştirilecek E. coli O157:H7 izolasyonuna ve verotoksin araştırmalarına yönelik
diğer çalışmalar için yarar sağlayabileceği düşünülmüştür.
Kaynaklar
1. Baets LD, Taelen IVD, Filette MD, Pierard D, Allison
L, Greve HD, Hernalsteens JP, Imberechts H, (2004).
Genetic Typing of Shiga Toxin 2 Variants of Escherichia
coli by PCR-Restriction Fragment Lenght Polymorphism
Analysis. Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6309-6314.
2. Bekar M, (1997). Enterobacteriaceae Familyası Mikroorganizmaların Genel Karakterleri ve Tanı Yöntemleri. Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü, Yayın No.
97–1 Ankara.
3. Blanco J, Blanco M, Blanco JE, Mora A, Alonso MP,
Gonzales EA, Bernardez MI, (2001). Epidemiology of
Verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) in Ruminants.
In: Verocytotoxigenic Escherichia coli. G. Duffy, P. Garvey,
McDowell D.A. eds. Trumbull, Connecticut, USA: Food &
Nutrition Press. p.113-148.
4. Boerlin P, Mceven SA, Petzold FB, Wilson JB, Jhonson
RP, Gyles CL, (1999). Associations Between Virulence
Factors of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli and
Disease in Humans. J Clin Microbiol. 37 (3), 497-503.
5. Brooks GF, Butel JS, Morse SA, (2004). Enteric Gram
Negative Rods (Enterobacteriaceae). Chapter 16 in:Jawetz
Melnick and Adelberg’s Medical Microbiology. Twenthy
Third Edition, Mcgraw Hill Education, Boston. p. 252255.
6. Caprioli A, Morabito S, Brugere H, Oswalt E, (2005). Enterohemorrhagic Escherichia coli: Emerging Issues on Virulence and Modes of Transmission. Vet Res. 36, 289-311.
7. Çabalar M, Boynukara B, Gülhan T, Ekin İH, (2001). Prevalence of Rotavirus, Escherichia coli K99 and O157:H7
in Healthy Dairy Cattle Herds in Van, Turkey. Turk J Vet
Anim Sci. 25, 191-196.
8. Dean-Nystrom EA, Bosworth BT, Moon HW, O’brıen
AD, (1998). Escherichia coli O157:H7 Requires Intimin
for Enteropathogenicity in Calves. Infect Immun. 66 (9),
4560–4563.
9. Dunn JR, (2003). The Epidemiology of Shiga – Toxigenic
Escherichia coli O157:H7 in Louisiana Dairy Cattle, Beef
Catle and White – Tailed Deer. J Wildlife Dis. 40 (2), 361365
10. Durso LM, Smith D, Hutkins RW, (2004). Measurements
of Fitness and Competition in Commensal Escherichia coli
and E. coli O 157:H7 Strains. Appl Environ Microbiol. 70
(11), 6466-6472.
11. Franzolin MR, Alves RCB, Keller R, Gomes TAT, Beutin
K, Barreto ML, Milroy C, Strina A, Riberio H, Trabusi
LR, (2005). Prevalence of Diarrheagenic Escherichia coli
in Children with Diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz. 100 (4), 359-363.
12. Friedrich AW, Bielaszewska M, Zhang W, Pulz M, Kuczius T, Ammon A, Karch H, (2002). Escherichia coli Harboring Shigo Toxin 2 Gene Variants: Frequency and Association with Clinical Symptomes. J Infect Dis. 185, 74-84.
13. Gorbach , Barleth, Blacklow, (2004). Infectious diseases.
Chapter 70, Escherichia coli and Other Shıga-Toxin Producing E. coli. Lippincott, Philedelphia. p.643-647.
14. Gupro A, Hunter SB, Bidol SA, Dietrich S, Kincaid
J, Salehi E, Nicholson L, Genese CA, Weinstein ST,
Marengo L, Kimura AC, Brooks JT, (2004). Escherichia
coli O157 Cluster Evalation. Emerg Infect Dis. 10 (10),
1856-1858.
15. Halkman AK, Noveir MR, Doğan HB, (2001). Escherichia coli O157:H7 serotipi. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Sim Matbaacılık Ltd,
Şti, Ankara s:46.
16. Hancock DD, Besser TE, Kinsel ML, Tarr PI, Rice DH,
Paros MG, (1994). The prevalence of Escherichia coli
O157:H7 in dairy and beef cattle in Washington State. Epidemiol Infect. 113 (2), 199-207.
17. Heuvelink AE, Bleumink B, Van Den Biggelaar FL, Te
Gıffel MC, Beumer RR, De Boer E, (1998). Occurence
and survival of verocytotoxin-producing Escherichia coli
O157 in raw cow’s milk in Netherlands. J Food Protect. 61,
1597-1601.
18. Jin HY, Tao KH, Li YX, Li FO, Li SQ, (2005). Microarry
Analysis of Escherichia coli O 157:H7. W J Gastroenterolo.
11 (37), 5811-5815.
19. Kim JY, Kiro SH, Kwon NH, Bae WK, Lim JY, Koo
HC, Kim JM, Noh KM, Jong WK, Park KT, Park YH,
(2005). Isolation and Identification of Escherichia coli O
157:H7 Using Differend Detection Methots Molecular De-
55
termination by Multiplex PCR and RAPD. J Clin Microbiol.
6 (1), 7-19.
20. Kusumato M, Okitsu T, Nishiya Y, Suzuki R, Yamai S,
Kawamura Y, (2001). Spontaneous Reactivation of Shiga
Toxins in Escherichia coli O157:H7 Cells Caused by Transposon Excision. J Biosci and Bioengineer. 92 (2), 114-120.
21. Maldonado Y, Fiser JC, Nakatsu CH, Bhunia AK, (2005).
Cytotoxicity Potential and Genotypic Characterization of
Escherichia coli Isolated from Environmental and Food
Sources. Appl Environ Microbiol. 71(4), 1890-1898.
22. Orlandi PP, Magalhaes GF, Matos NB, Silva T, Penatti
M, Nogueira PA, Peraira da Silva LH, (2006). Etiyology
of Diarrheal Infections in Children of Porto Velho ( Rondonia, Western Amazon Region, Brazil). Brazilian J Med
Biologic Res. 39 (4), 507-517.
23. Öksüz Ö, Arıcı M, Kurultay S, Gümüs T, (2004). Incidence of Escherichia coli O157 in raw milk and pickled
cheese manifactured from raw milk in Turkey. Food Cont.
15, 453-456.
24. Padhye NY, Doyle MP, (1991). Rapid procedure for detecting enterohemorrhagic Escherichia coli O157 in food.
Appl Environ Microbiol. 57, 2693-2698.
25. Picozzi C, Foschino R, Heuvelink A, Beumer R, (2005).
Phenotypic and genotypic characterization of sorbitolnegative or slow-fermenting (suspected O157) Escherichia
coli isolated milk samples in Lombardy region. Lett Appl
Microbiol. 40, 491-496.
26. Rangel JM, Sparling PH, Crowe C, Griffin PM, Swerdlow DL, (2005). Epidemiology of Escherichia coli O
157:H7 Outbreaks, United States 1982-2002. Emerg Infect
Dis. 11 (4), 603-609.
27. Roldan ML, Chinen I, Otero Jl, Mılıwebsky ES, Alfaro
N, (2007). Isolation, characterization and typing of Escherichia coli O157:H7 strains from beef products and milk.
Revista Argentina de Microbiología. 39, 113-119.
28. Topçu Aİ, Söyletir G, Doğanay M, (2002). Bakteriyel İnfeksiyonlar. İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyoloji, cilt 1,
Nobel Tıp Kitapevi, İstanbul, s.1564-1575.
29. Tsai WL, Miller CE, Richter ER, (2000). Determination
of the Sensitivity of a Rapid Escherichia coli O157:H7 Assay for Testing 375-Gram Composite Samples. Appl Environ Microbiol. 66 (9), 4149–4151.
30. Ünlütürk A, Turantaş F, eds., (1998). Gıda Mikrobiyolojisi, 1. Basım, Mengi Tan Basımevi, İzmir. s:605.
31. Wang G, Clark CG, Rodgers FG, (2002). Detection in Escherichia coli of the Genes Encoding the Major Virulance
Factors, the Genes Defining the O 157:H7 Serotype and
Components of the Type 2 Shiga Toxin Family by Multiplex
PCR. J Clin Microbiol. 40 (1), 3619-3619.
32. Wells JG, Shipman LD, Greene KD, Sowers EG, Green
JH, Cameron DN, Downes FP, Martin ML, Griffin PM,
Ostroff SM, Potter ME, Tauxe RV, Wachsmuth IK,
(1991). Isolation of Escherichia coli serotype O157:H7 and
other shiga-like-toxin-producing E.coli from dairy cattle. J
Clin Microbiol. 29, 985-989.
33. Yang ZM, Kovar J, Kim J, Nietfelt J, Smith DR, Moxley
RA, Olson ME, Fey PD, Benson AK, (2004). Identification of Common Subpopulations of Non-Sorbitol-Ferment-
56
ing, ß-Glucuronidase- Negative Escherichia coli O 157:H7
from Bovina Production Environments and Human Clinical
Samples. Appl Environ Microbiol. 70 (11), 6846-6854.
34. Yılmaz A, Gun H, Yılmaz H, (2002). Frequency of Escherichia coli O157:H7 in Turkish cattle. J Food Protect. 10,
1637-1640.
35. Zhao T, Doyle MP, Shere J, Garber L, (1995). Prevalence of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in
a Survey of Dairy Herds. Appl Environ Microbiol. 61(4),
1290-129.
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21,
57 - F61,
Araştırma
57
Özmen
ve2010
ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 57
- 61, 2010Makalesi / Research Article
Klorprifos’un ratlarda ince bağırsak üzerine etkisi ve kuersetin ve kateşin’in
koruyucu rolü
Feriha ÖZMEN1, Fatma Gökçe UZUN1, Filiz DEMİR1, Yavuz ULUSOY2
Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü; 2Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü
Patoloji Laboratuvarı, Ankara, Türkiye
1
Özet: Bu çalışmada organofosfatlı bir pestisit olan ve yaygın olarak kullanılan klorprifos’un ratların ince bağırsakları
üzerine olumsuz etkileri ve kuersetin ve kateşin’in bağırsakları koruyucu özelliği araştırıldı. Bu amaçla erkek ratlara
klorprifos (5.4 mg/kg 1/25 LD50), kateşin (20 mg/kg), kuersetin (20 mg/kg), kateşin(20 mg/kg) + klorprifos (5.4 mg/kg
1/25 LD50) ve kuersetin (20 mg/kg) + klorprifos (5.4 mg/kg 1/25 LD50) kombinasyonları oral olarak dört hafta süre ile
uygulandı. Uygulamadan dört hafta sonra ratların ince bağırsak dokuları histopatolojik incelemeler için alındı ve ışık
mikroskobunda kontrol grubu ile kıyaslamalı olarak incelendi. Kateşin ve kuersetin uygulanan gruplar ile kontrol grubu
ratların ince bağırsak dokularında histolojik olarak farklılık gözlenmedi. Klorprifos uygulanan ratların ince bağırsak
dokusunda villuslarda atrofi, nekroz ve muskular mukozada ödem gözlendi. Kateşin + klorprifos ve kuersetin + klorprifos uygulanan gruplarda mikroskobik bulguların hafif şiddette olduğu gözlendi. Sonuç olarak kateşin ve kuersetinin,
klorprifosun meydana getirdiği hasarı azalttığı tespit edildi.
Anahtar sözcükler: Kateşin, klorprifos, kuersetin, histopatoloji, ince bağırsak.
Chlorpyrifos induced small intestine toxicity in rats and protective role of quersetin and
catechin
Summary: In this study we investigated that chlorpyrifos which is a widely used an organophosphorous pesticide induced small intestine toxicity and protective role of quersetin and catechin. For this reason, chlorpyrifos (5.4 mg/kg 1/25
LD50), catechin (20 mg/kg), quercetin (20 mg/kg), catechin (20 mg/kg) + klorprifos (5.4 mg/kg 1/25 LD50) and quercetin
(20 mg/kg) + chlorpyrifos (5.4 mg/kg 1/25 LD50) were given to male rats orally for four weeks. At the end of fourth
week, histopathological changes in the small intestine tissues were investigated using light microscope comparatively
with control group. At the end of the 4th week, there were no histopathological changes between the catechin-treated
and quercetin-treated groups compared to the control group. After four weeks of chlorpyrifos exposure shortening and
necrosis in intestinal villi and edema in muscular mucosa were observed in the small intestine tissues. Milder histopathological changes were observed in animals co-treated with catechin plus chlorpyrifos or quercetin plus chlorpyrifos. As a
result, it appears that catechin and quercetin moderated chlorpyrifos-induced toxicity.
Key words: Catechin, chlorpyrifos, histopathology, quercetin, small intestine.
Giriş
Organofosfatlı (OP) pestisitler tarımsal alanlarında
yaygın olarak kullanılmaktadır ve çevre kirliliği ile
birlikte insan ve hayvanlarda akut ve kronik zehirlenmelere yol açmaktadırlar (17). Organofosfatlı
pestisitler asetilkolinesterazın (AChE) ve pseudokolinesteraz aktivitesinin inhibisyonu sonucu toksik
etki oluştururlar (13, 21). OP’li bileşikler hem insanlarda hem de hayvanlarda merkezi sinir sistemi
(3), immun sistem (9), üriner sistem (10), üreme sistemi (22, 23), kardiyovasküler sistem (11) gibi pek
çok sistemi, dokuyu ve organı etkilemektedir.
Organofosfatlı bir insektisit olan klorprifos
(O,O-diethyl-O-(3,5,6-trichloro-2-pyridyl)
phosphorothionate)’un hepatik disfonksiyon, immunolojik anormallikler, genototoksisite ve terotojenik etkilere neden olduğu ve DNA’da hasar meydana getirdiği bilinmektedir (24). Klorprifos’un
ratların pek çok doku ve organlarında antioksidan
enzim seviyelerinde değişiklikler meydana getirdiği
belirtilmiştir (18, 24, 25).
Flovanoidler doğada yaygın olarak bulunan
düşük molekül ağırlıklı fenolik bileşiklerdir (19).
Flavonoidler anti-inflamatuar, antialerjik, antiviral,
antibakteriyel ve antitümöral aktivite (5) ve serbest
Yazışma adresi / Correspondance: Fatma Gökçe Uzun, Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü, 06500, Ankara,
Türkiye. E-posta: [email protected]
58
Özmen F ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 57 - 61, 2010
radikalleri toplayıcı antioksidan aktivite göstermektedirler (1). Kuersetin ve kateşin yaygın olarak
kullanılan flavonoidlerdir (1). Yapılan çalışmalarda
kuersetinin antialerjik, antiülseratif, antiviral, antiinflamatuvar etkilerinin olduğu belirtilmiştir (2).
Kateşinin de anti-inflamatuar, anti-kanserojenik etkilerinin olduğu bilinmektedir (14) ve bu iki bileşiğin koruyucu etkilerini antioksidan aktivite göstererek meydana getirdiği bilinmektedir (4, 16).
Bu çalışmanın amacı, klorprifosun ratlarda ince
bağırsaklar üzerine histopatolojik etkilerinin saptanması ve bu değişikliklerin önlenmesinde kuersetin
ile kateşinin koruyucu rolünü araştırmaktır.
Materyal ve Metot
Hayvanlar: Bu çalışmada Lemali Hayvancılık
Merkezi’nden temin edilen 300-320 gr ağırlığındaki
36 adet erkek Wistar rat kullanıldı. Ratlar uygulama yapılmadan 10 gün önce karantina altına alındı.
Ratlar özel kafesler içerisinde bakılarak, standart laboratuvar diyeti ve su ile beslendi. Ratlara 18-22°C
oda sıcaklığında, 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık
fotoperiyodu uygulandı. Ratlar kontrol ve uygulama gruplarındaki her kafeste 6 hayvan bulunacak
şekilde yerleştirildi. Bu çalışma için Etlik Merkez
Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Yerel Etik Kurulu’ndan onay alınmıştır.
Kimyasallar: %99 saflıkta organofosfatlı bir insektisit olan klorprifos National Measurement Institue
(Australian)’den temin edildi. Kateşin, kuersetin
ve dimetil sülfoksit (DMSO) Sigma-Aldrich marka
kullanıldı.
Hayvanlara uygulama planı: Ratlar kontrol grubu
(n=6) ve uygulama grubu (n=30) olmak üzere iki
gruba ayrıldı. Uygulama grubu da kendi içerisinde
beş gruba ayrıldı. Bunlar: klorprifos uygulanan grup
(n=6), kateşin uygulanan grup (n=6), kuersetin uygulanan grup (n=6), kateşin + klorprifos uygulanan
grup (n=6), kuersetin + klorprifos uygulana grup
(n=6). Uygulamalar sabah saatlerinde (09.00-10.00)
aç olmayan ratlara yapıldı. Uygulamanın yapıldığı
ilk gün deneyin 0’ıncı günü olarak kabul edildi.
Kontrol grubu: Her bir rata günlük 1 ml/kg dozda
%0.5 dimetil sülfoksit (DMSO) gavaj yoluyla verildi.
Kateşin muameleli grup: Her bir rata günlük 20
mg/kg dozda kateşin, %0.5 DMSO içinde çözülerek
gavaj yoluyla verildi.
Kuersetin muameleli grup: Her bir rata günlük
20 mg/kg dozda kuersetin, %0.5 dimetil sülfoksit
(DMSO) içinde çözülerek gavaj yoluyla verildi.
Klorprifos muameleli grup: Her bir rata günlük
5.4 mg/kg (1/25 LD50) dozunda klorprifos, %0.5
dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülerek gavaj
yoluyla verildi.
Kateşin + klorprifos muameleli grup: Her bir
rata günlük 20 mg/kg dozda kateşin, %0.5 dimetil
sülfoksit (DMSO) içinde çözülerek uygulandı. Uygulamadan yarım saat sonra her bir rata 5.4 mg/kg
(1/25 LD50) dozunda klorprifos %0.5 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülerek gavaj yoluyla verildi.
Kuersetin + klorprifos muameleli grup: Her bir
rata günlük 20 mg/kg dozda kuersetin, %0.5 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülerek uygulandı.
Uygulamadan yarım saat sonra her bir rata 5.4 mg/
kg (1/25 LD50) dozunda klorprifos %0.5 dimetil sülfoksit içinde çözülerek gavaj yoluyla verildi.
Işık mikroskobu incelemeleri: Histopatolojik incelemeler için dokular %10 nötral formalin fiksatifi
içinde 24 saat tespit edildi. Dokular akarsu altında
yaklaşık 1 gece yıkandı ve artan alkol serilerinden
geçirilerek dehidrasyon işlemleri yapıldı. Ardından
dokular parafin bloklar haline getirildi. Hazırlanan
parafin bloklardan mikrotom (Microm) ile 6-7 µ
kalınlığında kesitler alındı. Alınan kesitler hematoksilen-eozin boyası ile boyandı, fotoğraf makinesi ataçmanlı mikroskopta (Olympus E-330, Tokyo,
Japan) incelendi ve fotoğrafları çekildi.
Bulgular
Kontrol grubu ve kateşin ile kuersetin uygulamalı ratların ince bağırsak dokularındaki villuslar ve
üzerindeki epitel hücreleri normal yapıda gözlendi
(Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3). Klorprifos muamelesinden 4 hafta sonra ratların ince bağırsak dokusunda
villuslarda nekroz, atrofi ve muskular mukozada
ödem gözlendi (Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6). Kateşin +
klorprifos ve kuersetin + klorprifos uygulanan grupların ince bağırsak dokularında daha hafif olmak
üzere bazı villuslarda epitel hücrelerinde lümene
dökülme ve bazı bölgelerde nekrotik alanlar tespit
edildi. Kas tabakasının ise düzenli ve normal yapıda
olduğu gözlendi (Şekil 7, Şekil 8).
59
Şekil 1. Kontol grubu ratların ince bağırsaklarının histolojik yapısı. L: Lümen, ▲:Villus, :Kas, HE x 100.
Şekil 4. Klorprifos muamelesinden 4 hafta sonra ratların
ince bağırsaklarında villuslarda nekrotik alanlar (N), HE
x 200.
Şekil 2. Kateşin grubu ratların ince bağırsaklarının histolojik yapısı. L: Lümen, ▲:Villus, : Kas, HE x 100.
Şekil 5. Klorprifos muemelesinden 4 hafta sonra ratların
ince bağırsaklarında villus atrofisi (), HE x 100.
Şekil 3. Kuersetin grubu ratların ince bağırsaklarının histolojik yapısı. L: Lümen, ▲:Villus, : Kas, HE x 100.
Şekil 6. Klorprifos muamelesinden 4 hafta sonra ratların
ince bağırsaklarında villuslarda nekrotik alanlar (N) ve
muskular mukozada ödem (), HE x 200.
60
LD50 oranında erkek ratlara verildi ve uygulamadan
4 hafta sonra ince bağırsak dokusunda meydana gelen patolojik değişiklikler gözlendi. Deney süresi
boyunca ratlarda ölüm gözlenmedi. Bu çalışmada
klorprifos muamelesinden sonra villuslarda atrofi,
nekroz ve muskular mukozada ödem tespit edilmiştir. Bu patolojik değişiklikler klorprifosun ince
bağırsakta hücre hasarına neden olmasıyla meydana
gelmiş olabilir.
Şekil 7. Kateşin + klorprifos muamelesinden 4 hafta sonra ratların ince bağırsaklarında yüzey epitelinde dökülme
ve bazı bölgelerde nekrotik alanlar (), HE x 100.
Kateşin ve kuersetin antioksidan bileşiklerdir
(4, 16). Kateşin ve kuersetin, biyomoleküllere zarar veren serbest radikalleri ortamdan uzaklaştırarak antioksidan aktivite göstermektedirler (4). Bu
çalışmada kateşin ve kuersetin, klorprifos’un neden
olduğu doku hasarını azaltmıştır. Bu koruyucu etkilerini klorprifos’un neden olduğu serbest radikal
hasarına karşı antioksidan özellikleriyle sağladığı
düşünülmüştür. Benzer şekilde antioksidan özelliği
olan vitaminlerle yapılan çalışmalarda doku hasarına karşı koruyucu oldukları görülmüştür (12).
Sonuç olarak klorprifos’un ratların ince bağırsak dokusunda histopatolojik değişikliklere neden
olduğu, kateşin ve kuersetin’in klorprifos’un meydana getirdiği hasarı azalttığı tespit edilmiştir.
Kaynaklar
Şekil 8. Kuersetin + klorprifos muamelesinden 4 hafta
sonra ratların ince bağırsaklarında yüzey epitelinde dökülme ve bazı bölgelerde nekrotik alanlar (), HE x
100.
Organofosfatlı pestisitler ratların çeşitli dokularında histopatolojik değişikliklere neden olmaktadır
(12, 23). Organofosforlu pestisitlerin ince bağırsak
dokusunda villuslarda dejenerasyon, hücre infiltrasyonu gibi histopatolojik değişikliklere yol açtığını
gösteren çalışmalar mevcuttur (6, 20).
Ayrıca yapılan çalışmalarda klorprifos’un ratların karaciğer (7), akciğer (15) gibi pek çok dokusunda histopatolojik değişikliklere yol açtığı bildirilmiştir. Klorprifos’un oral LD50 dozu erkek ratlarda 135 mg/kg’dır (8). Bu çalışmada klorprifos 1/25
1. Ajay M, Achike FI, Mustafa AM, Mustafa MR, (2006).
Effect of kuersetin on altered vascular reactivity in aortas
isolated from streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes Res Clin Pract. 73, 1–7.
2. Anjaneyulu M, Chopra K, (2003). Kuersetin, a bioflavonoid, attenuates thermal hyperperalgesia in a Mouse
model of diabetic neuropathic pain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 27, 1001–1005.
3. Betrosian A, Balla M, Kafiri M, Kofinas G, Marki R,
Kakouri A, (1995). Multiple systems organ filure from organophosphate poisoning. J Toxicol Clin Toxicol. 33 (3),
257–260.
4. Chander V, Singh D, Chopra K, (2003). Kateşin, a natural
antioxidant protects against rhabdomyolysis-induced myoglobinuric acute renal failure. Pharm Res. 48, 503–509.
5. Coşkun O, Kanter M, Korkmaz A, Oter S, (2005). Kuersetin, aflavonoid antioxidant, prevents and protects streptozocin-induced oxidative stres and β-cell damage in rat
pancreas. Pharm Res. 51, 117–123.
6. Çetin A, Ulusoy Y, Öğütcü A, Uzun, FG, Demir F, (2008).
Dichlorvos’un ratların ince bağırsak dokusu üzerine etkisi
ve vitamin C ve vitamin E’nin koruyucu rolü. Etlik Vet Mikrobiyol Derg. 19, 47–52.
7. Goel A, Dani V, Dhawan DK, (2007). Zinc mediates normalization of hepatic drug metabolizing enzymes in klorprifos-induced toxicity. Toxicol Let. 169, 26–33.
8. Goel A, Vijayta D, Dhawan DK, (2005). Protective effects
of zinc on lipid peroxidation, antioxidant enzymes and hepatic histoarchitecture in klorprifos-induced toxicity. Chem
Biol Interact. 156, 131–140.
9. Handy RD, Abd-El Samei HA, Bayomy MFF, Mahran
AM, Abdeen AM. El-Elaimy EA, (2002). Chronic diazinon exposure: pathologies of spleen, thymus, blood cells,
and lymph nodes are modulated by dietary protein or lipid
in the Mouse. Toxicology. 172, 13-34.
10. Kalender S, Kalender Y, Durak D, Ogutcu A, Uzunhisarcıklı M, Cevrimli BS, Yıldırım M, (2007). Methyl
Parathion Induced Nephrotoxicity in Male Rats and Protective Role of Vitamins C and E. Pestic Biochem Phys. 88,
213–218.
11. Kalender S, Kalender Y, Ogutcu A, Uzunhisarcıklı M,
Durak D, Acıkgöz F, (2004). Endosulfan-induced cardiotoxicity and free radical metabolism in rats: the protective
effect of vitamin E. Toxicology. 202, 227-235.
12. Kalender S, Uzun FG, Durak D, Demir F, Kalender Y,
(2010). Malathion-induced hepatotoxicity in rats: The effects of vitamin C and E. Food Chem Toxicol. 48, 633–638.
13. Kalender Y, Uzunhisarcikli M, Ogutcu A, Acikgoz F,
Kalender S, (2006). Effects of diazinon on pseudocholinesterase activity and haematological indices in rats: the
protective role of vitamin E. Environ Toxicol Pharmacol.
22, 46–51.
14. Kalender Y, Yel M, Kalender S, (2005). Doxorubicin hepatotoxicity and hepatic free radical metabolism in rats: The
effects of vitamin E and kateşin. Toxicology. 209, 39–45.
15. Karaoz E, Gultekin F, Akdogan M, Oncu M, Gokcimen
A, (2002). Protective role of melatonin and combination of
vitamin C and vitamin E on lung toxicity induced by klorprifos-ethyl in rats. Exp Toxic Pathol. 54, 97–108.
16. Korish AA, Arafah MM, (2008). Kateşin combined with
vitamisn C and E ameliorates insulin resistance (IR) and
atherosclerotic changes in ages rats with chronic renal failure (CRF). Arch Gerontol Geriat. 46, 25–39.
61
17. Lasram MM, Annabi AB, Elj N, Selmi S, Kamoun A, ElFazaa S, Gharbi N, (2009). Metabolic disorders of acute
exposure to malathion in adult Wistar rats. J Hazard Mater.
163, 1052-1055.
18. Mansour SA, Mossa AH, (2009). Lipid peroxidation and
oxidative stress in rat erythrocytes induced by klorprifos
and the protective effect of zinc. Pestic Biochem Phys. 93,
34-39.
19. Morales AI, Vicente-Sanchez C, Santiago Sandoval JM,
Egido J, Mayoral P, Arevalo MA, Fernandez-Tagarro
M, Lopez-Novoa JM, Perez-Barriocanal F, (2006). Protective effect of kuersetin on experimental chronic cadmium
nephrotoxicity in rats is based on its antioxidant properties.
Food Chem Toxicol. 44, 2092–2100.
20. Ögütcü A, Ulusoy Y, Kahraman K, Uzunhisarcıklı M,
Uzun FG, Taştan H, (2007). Metil Parathion’un sıçanların
ince bağırsak dokusu üzerine etkisi ve vitamin C ve E’nin
koruyucu rolü. Etlik Vet Mikrobiyol Derg. 18, 21–26.
21. Rezg R, Mornagui B, El-Fazaa S, Gharbi N, (2008). Caffeic acid attenuates malathion induced metabolic disruption in rat liver, involvement of acetylcholinesterase activity. Toxicology. 250, 27–31.
22. Uzun FG, Kalender S, Durak D, Demir F, Kalender Y,
(2009). Malathion-induced testicular toxicity in male rats
and the protective effect of vitamins C and E. Food Chem
Toxicol. 47, 1903–1908.
23. Uzunhisarcikli M, Kalender Y, Dirican K, Kalender S,
Ogutcu A, Büyükkömürcü F, (2007). Acute, subacute and
subchronic administration of methyl parathion-induced testicular damage in male rats and protective role of vitamins
C and E. Pestic Biochem Phys. 87, 115–122.
24. Verma RS, Mehta A, Srivastava N, (2007). In vivo klorprifos oxidative stress: Attenuation by antioxidant vitamins.
Pestic Biochem Phys. 88, 191–196.
25. Yu F, Wang Z, Ju B, Wang Y, Wang J, Bai D, (2008).
Apoptotic effect of organophosphorus insecticide klorprifos
on mouse retina in vivo via oxidative stress and protection
of combination of vitamins C and E. Exp Toxicol Pathol.
59, 415–423.
62
Etlik Vet Mikrobiyol Derg, Dakman
21, 63 - 69,
Araştırma
63
A ve2010
Sığır ve koyun brusellozisinin serolojik teşhisinde konvansiyonel testler ile
Kompetitif-ELISA’nın karşılaştırılması*
Asiye DAKMAN1, Uğur KÜÇÜKAYAN2, Ufuk ÜLKER2, H. Kaan MÜŞTAK2
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, 1Kanatlı Hastalıkları Teşhis Laboratuvarı; 2Yetiştirme
Hastalıkları Laboratuvarı, Ankara, Türkiye
Özet: Bu çalışmada Brucella S19 genç aşısı ile aşılanan danalar ile Brucella spp. ile infekte sığırlar ve Brucella Rev1
genç aşısı ile aşılanmış kuzular ile Brucella spp. ile infekte koyunlara ait kan serumları; konvansiyonel testler ve Kompetatif-ELISA (C-ELISA) ile incelenerek, oluşan humoral immun yanıt değerlendirilmiştir. Doğal infekte sığırların
%94’ü Rose Bengal Plate Test (RBPT), %98’i Serum Aglütinasyon Test (SAT), %92’si Komplement Fikzasyon Test
(CFT) ve %95’i C-ELISA ile pozitif bulunmuştur. Aşı yapılan danalara ait antikor titrelerinde test zamanlarına göre testler arasında farklılıklar meydana gelmiştir. Doğal infekte koyunların %91.16’sı RBPT, %91.16’sı SAT, %85.63’ü CFT
ve %86.74’ü C-ELISA ile pozitif bulunmuştur. Sonuç olarak brusellozisin teşhisinde, C–ELISA’nın özellikle CFT’ye
alternatif olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.
Anahtar kelimeler: Brucella, Kompetatif-ELISA, koyun, sığır.
Comparison of conventional tests with Competitive-ELISA in serological diagnosis of
bovine and ovine brucellosis
Summary: In this study, blood sera from calves vaccinated with Brucella S19 vaccine and cattle infected by Brucella
spp. and lambs vaccinated with Brucella Rev1 vaccine and sheep infected by Brucella spp. were tested with conventional tests and Competitive-ELISA (C-ELISA) in order to evaluate the humoral immune response. In naturally infected
cattle group, 94% with Rose Bengal Plate Test (RBPT), 98% with Serum Agglutination Test (SAT), 92% with Complement Fixation Test (CFT) and 95% with C-ELISA were found positive. Differences between the tests were found in
antibody titers on the basis of testing times. In naturally infected sheep group, 91.16% with RBPT, 91.16% with SAT,
85.63% with CFT and 86.74% with C-ELISA were found positive. It was concluded that, in the diagnosis of brucellosis
C-ELISA could be used as an alternative test especially to CFT.
Key words: Brucella, cattle, Competitive-ELISA, sheep.
Giriş
Brusellozis dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi
ülkemizde de yaygın olarak görülen ve ekonomik
öneme sahip olan zoonoz bir hastalıktır. Hastalığa
Brucella genusu içerisinde yer alan türler neden olmaktadır. Bu türler arasında bulunan B. abortus, B.
melitensis, B. ovis, B. canis ve B. suis hayvanlarda
görülen önemli brusellozis etkenleridir.
Brusellozisin kesin teşhisi etken izolasyonu ve
identifikasyonuna bağlıdır. Ancak etkenin hücre içi
yerleşmesi, izolasyonunun uzun zaman alması, çok
sayıda hayvan söz konusu olduğunda pratik olmamasından dolayı, serolojik testler rutin teşhiste daha
çok tercih edilmektedir (3, 5, 6).
Brucella infeksiyonlarına karşı primer immun
yanıt, IgM sınıfı antikorların üretimiyle sekonder
immun yanıt ise IgG’lerin ortaya çıkmasıyla karakterizedir. SAT ile nötral veya hafif düşük pH’da
aktif aglutininlerin en önemli kısmını teşkil eden
IgM’lerin varlğı ortaya konulurken, RBPT ile hem
IgM hem de IgG’ler reaksiyona girer. CFT’de ise
rol oynayan antikorlar IgG1’lerdir IgM’lerin etkinliği inaktivasyon derecesinden dolayı azdır(12, 14).
Pirimer bağlanma testlerinden biri olan C-ELISA; antijenle kaplı mikropleyte test edilecek serum
ile Monoklonal antikor (Mab) ilave edilerek serumda bulunan antikorlar ile Mab’ın yarışması, antijenantikor kompleksine enzimle işaretli anti-mouse
antikorlarının bağlanması ve reaksiyonun substrat
ilavesi ile renklendirilmesi esasına dayanmaktadır.
Yazışma adresi / Correspondance: Asiye Dakman, Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Kanatlı Hastalıkları
Teşhis Laboratuvarı, 06020, Ankara, Türkiye. E-posta: [email protected]
* Bu çalışma TAGEM tarafından TAGEM/HS/01/02/05/101 no’lu proje ile desteklenmiştir.
64
Dakman A ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 63 - 69, 2010
C-ELISA‘da O-polisakkarit için spesifik Mab kullanıldığı için indirekt ELISA ya göre daha spesifik olduğu bildirilmiştir (10,13,16). ELISA’da kullanılan
lipopolisakkarit antijeni polisiteren matrikse lipid
A ucundan bağlandığı, antijen olarak o-polisakkarit seçildiğinde ise matrikse bağlanmanın epitop1,
epitop2 ya da her iki ucdan birlikte gerçekleştiği
bildirilmiştir (13). Bu şekilde ortamda antijenin antikor ile bağlanmaya hazır epitop2 ucu daha fazla
bulunur. Brucella S19 aşısı ile aşılanmış hayvanlarda epitop1’e karşı oluşan antikorlar büyük bir kısmını teşkil ederken doğal infekte hayvanlarda ise
hem epitop1 hem de epitop 2ye karşı oluşan antikorlar bulunmaktadır. Bu nedenle aşılı hayvanlarda
oluşan antikorların Mab ile yarışması ve bağlanma
affinitesi göstermesi zordur. Ancak infekte hayvanlar antijene bağlanma affinitesi gösterir ve MAb ile
yarışabilirler (13).
Her bir serolojik testin farklı immunglobulinleri tespit etmesi, aşıdan kaynaklanan immun yanıt ile
doğal enfeksiyonun karışabilmesi, inkübasyon döneminde etkene karşı immun yanıtın oluşmaması ve
brusella ile diğer bakterilerin kros-reaksiyon verebilmesi gibi olumsuzlukların üstesinden gelebilmek
için günümüze kadar birçok farklı serolojik yöntem
geliştirilmiş ve bazılarının tanıda birlikte kullanılması öngörülmüştür (2, 5, 6, 8).
Office International des Epizooties (OIE)’de sığır brusellozisinin teşhisinde kullanılan testler arasında standart test olarak kabul edilen CFT’nin yanı
sıra C-ELISA’da bulunmaktadır. C-ELISA yöntemi;
CFT’den çok daha kolay uygulanabilir olması, kısa
sürede çok daha fazla serum örneğinin test edilmesine olanak tanıması, aşılamalardan kaynaklanan
yalancı pozitifliklerin eliminasyonunu sağlaması ve
diğer bakterilerden ileri gelen kros-reaksiyonların
çoğunu önlemesi nedeniyle rutin olarak kolaylıkla
kullanılabilmektedir (3, 5, 6, 10, 16).
Bu çalışmada sığır ve koyun brusellozisinin serolojik tanısında rutin olarak kullanılan CFT, SAT
ve RBPT ile C-ELISA testinin karşılaştırılması;
aşılı sığır ve koyunlar ile doğal infekte hayvanların
ayırt edilmesinde C-ELISA’nın rolünün araştırılması amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot
Serum grupları: Etlik Merkez Veteriner Kontrol
ve Araştırma Enstitüsü’ne gelen atık yaptıkları yavrularından B. abortus izole edilen 26 adet sığır ve B.
melitensis izole edilen 29 adet koyuna ait kan serum
örnekleri standart pozitif grup olarak kabul edildi.
Brusellozis öyküsü olmayan, düzenli sağlık
kontrolleri yapılan ve hayvan hareketlerinin takip
edildiği, bruselladan ari sığır ve koyun sürülerinde
bulunan 6 aylık, 28 adet aşısız dana ile 6 aylık, 32
adet aşısız kuzuya ait kan serum örnekleri standart
negatif grup olarak kullanıldı.
Doğal infekte sığır ve koyun grupları ise pozitif
gruptaki hayvanlar ile Brucella spp. ile infekte sürülerde atık yapmış hayvanlardan oluşturuldu (Tablo
1).
Tablo 1. Doğal infekte sığır ve koyunlardan toplanan kan serum sayıları
Doğal infekte sığırlar
Doğal infekte koyunlar
Toplam
Atıklarından Brucella spp. izole edilen hayvanlar
26
29
55
İnfekte sürüde atık yapmış hayvanlar
94
152
246
Toplam
120
181
301
Aşılı grupların oluşturulması için seçilen dana
ve kuzulara, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’nün ürettiği ve Türkiye’de halen kullanılan aşılar uygulandı. Bu amaçla, Polatlı Tarım
İşletmesi’nden alınan 6 aylık 29 adet dana, genç
Brucella S19 canlı aşısı ile deri altı olarak; yine aynı
işletmeden alınan 6 aylık 32 adet kuzu ise genç Brucella Rev1 canlı aşısı ile deri altı olarak aşılanarak
aşılı gruplar oluşturuldu.
Hem sığır hem de koyunlarda aşı yapılan ilk
gün 0 kabul edilerek; 0, 21, 45, 90, 120, 180 ve
270’inci günlerde kan serum örnekleri toplanarak
değerlendirildi. Pozitifliği devam eden hayvanlardan 2 ayda bir kan serum örneği alınarak 1 yıl süre
ile takip edildi.
Rose Bengal Plate Test (RBPT) ve Serum Aglütinasyon Testi (SAT): Her iki testte kullanılan
antijenler, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma
Enstitüsü’nden temin edildi. Testler kan serum örneklerine, Alton ve ark. (3)’ın bildirdiği şekilde
uygulandı. RBPT’de 4-5 dakika içinde oluşan aglütinasyon pozitif, homojen görüntü negatif olarak
kabul edildi. SAT’ta ise sığırlarda 1/40, koyunlarda
1/20 “++” ve üstü pozitif olarak değerlendirildi (4).
Komplement Fikzasyon Testi (CFT): Antijen olarak; Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından üretilen ve Brucella abortus S99 suşundan hazırlanan tüp aglütinasyon test antijeninin
tuzlu su ile 3 defa yıkanarak fenolünün giderilmesiyle elde edilen antijen kullanıldı. Testte kullanılan komplement ve amboseptor, Alton ve ark. (3)’ın
bildirdiği yönteme göre hazırlandı. Test OIE (5) ve
Alton ve ark. (3)’ın bildirdiği yönteme göre uygulandı. Sığırlarda 1/10 “++” ve üstü koyunlarda ise
1/5 dilusyonda “++” lık değer pozitif olarak değerlendirildi (4).
Kompetatif-ELISA (C-ELISA): Brucella abortus
smooth lipopolisakkarit (sLPS) antijeniyle kaplanmış 96 gözlü mikrotiter pleyt kullanılan ticari kit
(Svanova Biotech) ile prosedürüne uygun olarak
yapıldı. Antijen kaplı pleyte, önce serum örnekleri daha sonra spesifik monoklonal antikorlar ilave
edilerek oda sıcaklığında inkübe edildi. İnkübasyon
sonrasında pleytler iyice yıkanarak bağlanmayan
antikorlar ortamdan uzaklaştırıldı. Pleyte enzimle
işaretli anti-mouse IgG antikor konjugatı konularak
oda sıcaklığında inkübasyona bırakıldı. Yıkama işleminin ardından reaksiyonu görüntülemek amacıyla substrat konuldu ve reaksiyon stop solusyonu ile
durdurularak ELISA okuyucuda 450 nm’de okundu.
PI (Percent Inhibition) değeri ≥%30 pozitif , <%30
ise negatif kabul edildi.
İstatistiksel değerlendirme: Analizlerde COCHRAN Q testi kullanıldı. İstatistiksel önemliliklerin
65
değerlendirilmesinde χ2 (Ki–kare) dağılımı, farklı
yöntemlerin tespitinde de güven aralıklarından yararlanıldı (1).
Bulgular
Sığır kan serumlarının değerlendirilmesi: Standart pozitif ve standart negatif gruplarda CFT ve
C-ELISA’dan tam olarak aynı sonuçlar elde edildi. Bununla birlikte C-ELISA testinin spesifitesi ve
sensitivitesi ise %100 bulundu. Doğal infekte sığırlardan elde edilen sonuçlar Tablo 2’de gösterilmiş
olup, bu grupta yer alan ve Brucella spp. izole edilen sığırların tamamı, bütün testlerde pozitif sonuç
elde edildi.
Tablo 2. Doğal infekte sığır grubuna ait pozitif sonuçlar
(%).
RBPT SAT
Doğal infekte
sığırlar (n: 120)
CFT
C-ELISA
113
117
110
114
(%94) (%98) (%92) (%95)
Aşılı sığırların kan serum örneklerinden elde
edilen sonuçlar Tablo 3’de ve Şekil 1’de karşılaştırmalı olarak gösterildi. Bu sonuçlara göre 0’ıncı
günde 1 hayvanda maternal antikor varlığı tespit
edildi. Bütün aşılı sığırlar içerisinde ise sadece 1
hayvanda, bütün testlerde pozitifliğin 1 yıl boyunca
devam ettiği görüldü. Aşılı sığırlarda sadece 90’ıncı
ve 120’nci günlerde, testler arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulundu (p<0.05). Yapılan Ki
kare testi ile CFT ve C-ELISA arasında bu günlerde fark yok iken diğer testlerde ise fark istatistiksel
olarak önemli bulundu.
Tablo 3. Aşılı sığır grubuna ait pozitif sonuçlar.
0’ıncı gün
21’inci gün
45’inci gün
90’ıncı gün
120’nci gün
180’inci gün
270’inci gün
RBPT
%3
%100
%93
%17
%17
%3
%3
SAT
%3
%100
%83
%0
%0
%0
%0
CFT
%3
%90
%96.5
%31
%14
%3
%3
C-ELISA
%3
%93
%96.5
%55
%14
%3
%3
66
Şekil 1. Aşılı sığır grubuna ait pozitif sonuçların grafik gösterimi.
Koyun kan serumlarının değerlendirilmesi:
Standart pozitif ve standart negatif gruplarda CFT
ve C-ELISA sonuçları tam olarak benzer sonuçlar
alındı. C-ELISA testinin spesifite ve sensitivitesi ise
%100 bulundu. Doğal infekte koyunlardan elde edilen sonuçlar Tablo 4’de ve Şekil 2’de gösterilmiş
olup, bu grupta yer alan ve Brucella melitensis izole
edilen koyunların tamamından, bütün testlerle pozitif sonuç elde edildi.
Tablo 4. Doğal infekte koyun grubuna ait pozitiflik sonuçlar (%).
RBPT
Doğal infekte
koyunlar (n: 181)
SAT
CFT
C-ELISA
165
165
155
157
(%91.16) (%91.16) (%85.63) (%86.74)
Çalışmada aşılı koyunlar sığır grubundan farklı olarak daha kısa aralıklarla daha uzun bir süre
takip edildi. Aşılı koyunların ikisine ait kan serumundaki anti-komplementer özellikten dolayı
CFT’leri değerlendirilemedi. Bu nedenden dolayı
aşılı koyunların istatistiksel çalışmaları 30 hayvan
üzerinden değerlendirildi. Aşılı koyunların ikisinde
ise pozitifliğin bir yıl süreyle devam ettiği görüldü.
İstatistiksel olarak, 45’inci günde RBPT ve CFT ile
C-ELISA arasındaki fark önemli bulundu (p<0.05).
90’ıncı günde SAT ve C-ELISA ile RBPT arasındaki fark; SAT ve C-ELISA ile CFT arasındaki fark
önemli bulundu (p<0.05). 120’inci günde ise RBPT
ile CFT, SAT ile CFT, CFT ile C-ELISA arasındaki
farklar önemli bulunurken (p<0.05). 180’inci günde
SAT ile CFT arasındaki farklar da önemli bulundu
(p<0.05). Aşılı koyunlara ait sonuçlar Tablo 5’te
gösterilmiştir.
Tablo 5. Aşılı koyun grubuna ait pozitif sonuçlar.
0’ıncı gün 14’üncü gün 21’inci gün 45’inci gün 90’ıncı gün 120’inci gün 180’inci gün 270’inci gün
RBPT
%0
%96.66
%100
%86.66
%47
%10
%7
%7
SAT
%0
%96.66
%90
%76.66
%16.66
%0
%0
%0
CFT
%0
%93.33
%100
%96.76
%60
%30
%16.66
%10
C-ELISA %0
%76.66
%83.33
%60
%20
%7
%7
%7
67
Şekil 2. Aşılı koyun grubuna ait pozitif sonuçların grafik gösterimi.
Ülkemizde 1984 yılından beri Brusellozis Mücadele Programı uygulanmaktadır. Mücadele programı
gereği 3-8 aylık danalar Brucella S19, 3-8 aylık koyunlar ise Brucella Rev1 aşısı ile aşılanmaktadır. Bu
çalışmada Brucella S19 genç aşısı ile aşılanan danalar ile Brucella spp. ile infekte sığırlar ve Brucella
Rev1 genç aşısı ile aşılanmış koyunlar ile Brucella
spp. ile infekte koyunlara ait kan serumları RBPT,
SAT, CFT ve C-ELISA ile test edilerek hayvanlardaki humoral immun yanıt değerlendirildi.
B. abortus izole edilen sığırların bulunduğu
sürülerde atık yapmış hayvanların %94’ü RBPT,
%98’i SAT, %92’si CFT ve %95’i C-ELISA ile pozitif bulundu. Enfekte koyun grubunda ise bu oran
aynı testler ile sırasıyla %91.16, %91.16, %85.63
ve %86.74 olarak tespit edildi. İnfekte sığır ve koyunlarda bütün testlerle oldukça yüksek pozitif sonuç alındı. Ancak RBPT ve SAT ile alınan pozitiflik
oranlarının CFT ve C-ELISA’ya göre nispeten yüksek olduğu görüldü. Bu sonuçlar etken izole edilen
ve infeksiyonun akut seyrettiği sürülerdeki atık yapmış hayvanlara ait sonuçlardır.
Aşılı sığırlarda SAT’da titrelerin 21’inci gün,
aşılı koyunlarda ise 14’üncü gün pik yaptığı, sığırlarda 90’ıncı günden itibaren bütün hayvanlar negatif bulunurken, koyunlarda aynı dönemde pozitiflik
oranı %16.66’ya düştüğü görüldü. 120’nci günde
ise koyunlara ait bütün serum örnekleri negatif bu-
lundu. Buna rağmen SAT’ın aşılı sığır ve koyunların infekte hayvanlardan ayırt edilmesinde önemli
bir değeri bulunmamaktadır.
Aşılamadan 21 gün sonra sığırlardan elde edilen pozitif sonuçların RBPT ile CFT ve C-ELISA’ya
göre daha kısa sürede pik yaptığı görüldü. Bu durumun RBPT’nin, IgG1 antikorlarının yanı sıra, CFT
ve C-ELISA’dan farklı olarak humoral immun yanıtın başlangıcında ortaya çıkan IgM antikorlarını da
tespit etmesinden kaynaklandığı düşünüldü.
Nielsen ve ark. (13), yapmış oldukları bir çalışmada Plate Aglütinasyon Test, CFT, İndirekt-ELISA ve C-ELISA yöntemleri ile sığır serumlarını test
etmişler, aşılı hayvanlarda C-ELISA testinin diğer
testlere göre daha duyarlı olduğunu bildirmişlerdir.
Gall ve ark. (9) yapmış oldukları çalışmada RBPT
ve CFT pozitif bulunan sığır kan serumları ile yapmış oldukları çalışmada C-ELISA-OC ve C-ELISAsLPS ile test etmişler sonuçlar %96.08 ve %96.51
düzeyinde uyumlu bulunmuştur.
Samartino ve ark. (15), çalışmalarında brusellanın teşhisinde İndirekt-ELISA ile C-ELISA yöntemlerini konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırmışlar, C-ELISA yöntemini aşılanmış hayvanlarda
diğer testlere göre daha spesifik olduğunu, bu testin
istenmeyen serolojik reaksiyonların eliminasyonunu sağladığını ve B. abortus S-19 aşılaması yapılan
ülkelerde, brusellozis kontrol ve eradikasyon prog-
68
ramını tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılmasını önermişlerdir.
Stournara ve ark. (17), yapmış oldukları bir çalışmada ergin ve genç koyunları Brucella Rev1 aşısı ile konjiktival yolla aşılayarak aşılamanın 21’inci
gününden itibaren düzenli aralıklarla 330’uncu güne
kadar Fluorescence Polarization Assay, RBPT, CFT,
modified-Rose Bengal Test, İndirekt-ELISA ve CELISA ile serolojik immun yanıtı takip etmişlerdir.
Çalışmada 3-6 aylık koyunlarla yapılan çalışmada
RBPT, CFT ve C-ELISA ile sırasıyla %100, %89.79
ve %79.59 oranında pozitif sonuç almışlardır.
45’inci günden itibaren bütün testlerde antikor titreleri düşme eğilimi göstermiş olup 91’inci günden
itibaren antikor titreleri önemli düzeyde düşmüştür.
125’inci günde bütün testlerden negatif sonuç alındığını bildirmiştir.
Bu çalışmada aşılı sığırlardan 1 (%3), aşılı koyunlarda ise 2 (%7) hayvan bir yıl süre ile pozitif
sonuç vermiştir. Aşılı kuzulardan 28 (%93)’inde
180. günde negatif sonuç alınmıştır. Subkutan canlı
aşı uygulamalarında persiste infekte hayvanların ortaya çıkması mümkündür. Bu nedenle konjunktival
yolla aşılama gibi aşılama yöntemleri geliştirilmiştir
(7, 11). Stournara ve ark. (17)’ın yapmış oldukları
çalışmada Brucella Rev1 aşısını konjunktival yolla
uygulamaları, ülkemizde ise subkutan uygulanması
elde ettiğimiz pozitiflik oranlarının yüksek kalmasına sebep olabilir.
Çalışmamızda aşılı koyunların ikisine ait kan
serumları antikomplementer etki gösterdiklerinden
CFT ile sonuç alınamazken, aynı serumlar C-ELISA
ile değerlendirilmiştir. Stack ve ark. (1999), yapmış
oldukları çalışmada CFT testi ile değerlendirilemeyen kötü kalitedeki 50 adet serumu C-ELISA testi
ile doğru olarak değerlendirebildiklerini bildirmişlerdir. Bu durum CFT testi ile değerlendirilemeyen
hemolizli ve antikomplementer etkili serum örneklerinin C-ELISA ile değerlendirilebileceğini gösterdi.
Sonuç olarak aşılı sığırlardan benzer sonuçların
alınması, daha kolay uygulanabilir bir test olması
ve kısa sürede sonuç vermesi gibi nedenlerden dolayı C-ELISA, altın standart test olarak kabul edilen
CFT ile karşılaştırıldığında brusellozisin teşhisinde
CFT’ye alternatif olarak kullanılabileceği düşünüldü. Aşılı koyunlarda ise C-ELISA testi ile CFT’den
çok daha kısa sürelerde negatif sonuç alınması bu
testin aşılı ve infekte hayvanların ayrımında oldukça önemli olduğunu göstermektedir.
Kaynaklar
1. Agresti A (2002). Categorical data analysis. 2nd edition.
Wiley-Interscience Publishers, New York.
2. Alton GG, Jones LM, Pietz DE (1975). Laboratory Techniques in Brucellosis. 2nd ed. Geneva, World Health Organisation, Monograph Series, No: 55.
3. Alton GG, Jones LM, Angus RD, Verger JM (1988). Techniques for the Brucellosis laboratory. I.N.R.A. Paris.
4 Anon (1990): Brucellosis mücadele talimatnamesi. III.Baskı,
Hayv. Araşt. Ens.Md.lüğü Ofset Tesisleri., Lalahan – Ankara, No:189.
5. Anon (2009a). Bovine brucellosis. In: OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. Vol. 2, section 2.4, chapter 2.4.3.
6. Anon (2009b). Caprine and ovine brucellosis (excluding
Brucella ovis). In: OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. Vol. 2, section 2.7, chapter
2.7.2.
7. Diaz-Aparicio E, Aragon V, Marin C, Alonso B, Front M,
Moreno E, Perez-Ortiz S, Blasco JM, Diaz R, Moriyon
I (1993). Comperative analysis of brucella serotype A and
M and Yersinia enterocolitica 0:9 polysaccharides for serological diagnosis of brucellosis in cattle, sheep and goats. J
Clin Microbiol, 31(29): 3136-3147.
8. Fekete A, Bantle JA, Halling MS, Sanborn MR (1990).
Preliminary development of a diagnostic test for brucella
using polymerase chain reaction. J App Bacteriol, 69: 216227.
9. Gall D, Colling A, Marino O, Moreno E, Nielsen K, Perez
B, Samartino L (1998). Enzyme immunoassays for serological diagnosis of bovine brucellosis: A trial in Latin
America. Clin Diag Lab Immunol, 5(5): 654-661.
10. Mac Millan A (1990). Conventional serological tests. In:
Animal Brucellosis. Eds: Nielsen K, Duncan JR, CRC
press Boca Raton Florida. 154-197.
11. Marin CM, Moreno E, Moriyon I, Diaz R, Blasco JM
(1999). Performance of competitive and indirect enzymelinked immunosorbent assays, gel immunoprecipitation
with native hapten polysaccharide, and standard serological tests in diagnosis of sheep brucellosis. Clin Diagn Lab
Immunol, 6, 269-272.
12. Nielsen K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology.
Vet Microbiol 90: 447-459.
13. Nielsen KH, Kelly L, Gall D, Nicoletti P, Kelly W (1995).
Improved competitive enzyme immunoassay for diagnosis
of bovine brucellosis. Vet Immunol Immunopathol, 46(3-4):
285-291.
14. Quinn PJ, Carter ME, Markey B, Carter GR (1994).
Clinical Veterinary Microbiology. Wolfe publishing,
Spain.:261-267.
15. Samartino L, Gall D, Gregoret R, Nielsen K (1999).
Validation of enzyme-linked immunosorbent assays for the
diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol, 70 (3-4):
193-200.
16. Stack JA, Perrett LL, Brew SD (1999). Competitive ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality
samples. Vet Rec, 145: 735-736.
69
17. Stournara A, Minas A, Bourtzi-Chatzopoulou E, Stack
J, Koptopoulos G, Petridou E, Sarris K (2007). Assessment of serological response of young and adult sheep to
conjunctival vaccination with Rev-1 vaccine by fluorescence polarization assay (FPA) and other serological tests
for B. melitensis. Vet Microbiol, 119(1): 53-64
70
Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
21, 71
- 77,
2010A. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21,Araştırma
Makalesi / Research Article
71
Bektaş
GI,
Altıntaş
71 - 77, 2010
Laktasyon dönemindeki Merinoslarda ve Ile de France × Akkaraman
melezlerinde yapağı iz element (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se) düzeyleri*
Gizem Işıl BEKTAŞ1, Arif ALTINTAŞ2
Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Biyokimya Laboratuvarı, 2Ankara Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
1
Özet: Çalışmada, Ankara Polatlı ilçesine bağlı TİGEM tarım işletmesinde birbirine yakın yaşta, aynı bakım-besleme ve
hijyen şartlarındaki 30 baş Merinos ve 30 baş Akkaraman × Ile de France (G2 melezi) koyundan materyal olarak yararlanılmıştır. Laktasyonun ilk ayında (Mart) iki ırktan 30’ar adet olmak üzere, toplam 60 adet yapağı örneği hayvanların sırtyan bölgelerinden dipten kesilerek toplanmıştır. Alınan yapağı örnekleri mikrodalga fırında yakılmış ve Mn, Co ve Se
analizleri GF-AAS ile Fe, Cu, Zn, analizleri FL-AAS cihazı ile gerçekleştirilmiştir. Merinoslarda ve Akkaraman melezlerinde yapağı iz element ortalama değerleri (ppm) sırasıyla Cu için 19.35±15.16 ve 12.18±9.86; Zn için 68.46±13.19 ve
73.35±15.62; Fe için 107.69±87.47 ve 94.39±65.91; Se için 7.07±4.96 ve 3.75±1.89; Mn için 3.31±2.02 ve 4.26±1.80;
Co için 1.22±2.68 ve 0.36±0.63 olarak hesaplanmıştır. Laktasyondaki her iki ırkta da yapağı Cu, Zn, Fe ve Co düzeyleri
normal, Se düzeyi yüksek, Mn düzeyleri ise düşük bulunmuş ve yapağı değerlerinin özellikle Se ve Mn açısından rasyon
iz element içeriğini tam olarak yansıttığı ve Akkaraman melezlerinin özellikle Cu, Zn ve Co yetersizliklerine meyilli
oldukları kanaatine varılmıştır. Çalışma sonunda; Merinos yapağılarının özelikle Cu ve Se yönünden Ile de France ×
Akkaraman melezlerine ait değerlerden önemli düzeyde yüksek olduğu (p<0.001) tespit edilmiş ve farklılığın merinos
yapağısının ondülasyon kalitesi ile ilişkili olabileceği kanısına varılmıştır.
Anahtar sözcükler: Akkaraman × Ile de France melezi, iz element, koyun, merinos, yapağı.
Wool trace element (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se) levels in lactation period in Merinos and Ile
de France × Akkaraman sheeps
Summary: Ankara Polatlı in TIGEM the Merinos and Ile de France × Akkaraman (G2 hybrid) sheep which has close
together in age, nutrition and the maintenance of hygienic conditions, 30 pieces from Merinos and 30 pieces from Ile
de France × Akkaraman (G2 hybrid) at the beginning of lactation wool samples were collected. Received wool, feed
and water samples were digested with the appropriate method in microwave oven; Fe, Cu and Zn analysis FL-AAS,
Se, Mn and Co analysis were also in GF-AAS. Mean values of trace elements in Merino and Akkaraman hybrids wool
(ppm), respectively for Cu 19.35±15.16 and 12.18±9.86; for Zn 68.46±13.19 and 73.35±15.62; for Fe 107.69±87.47 and
94.39±65.91; for Se 7.07±4.96 and 3.75±1.89; for Mn 3.31±2.02 and 4.26±1.80; for Co 1.22±2.68 and 0.36±0.63 were
calculated. In lactation both races wool Cu, Zn, Fe and Co levels in normal, Se levels high and Mn levels were lower
and wool Mn and Se levels correctly reflects the ration of Se and Mn content was concluded. At the end of study, Merino
wool especially in terms of the Cu and Se (respectively 19.35±15.16 and 7.07±4.96 ppm) was significantly higher than
(p<0.001) Akkaraman hybrids (respectively 12.18±9.86 ve 3.75±1.89 ppm) have been identified and the difference may
be related to ondulation quality of merino wool, was concluded.
Key words: Akkaraman × Ile de France hybrid, merinos, sheep, trace element, wool.
Giriş
Ile de France × Akkaraman melezleri iri yapılı, hızlı
gelişen, et verimi yüksek, iyi kalitede karkas veren,
ince kuyruk yapısına sahip ve uyum yeteneği yüksek bir koyun tipidir. Merinoslar ise özellikle kaliteli yapağı verimi yanında et için de yetiştirilen bir
koyun ırkıdır (1).
Koyun yetiştiriciliğinde karbonhidrat ve yağ
gibi temel besin maddelerinin yanında çeşitli mineral maddelere de gereksinim duyulmaktadır (27).
Bunlar, vitaminlerle birlikte fetusun ve yavrunun
sağlıklı büyümesi ve gelişmesi, et, süt, döl ve yapağı veriminin ve dayanıklılığın artırılması, üremenin devamlılığı için gerekli olan birçok metabolik
fonksiyonun oluşmasında rol almaktadır (24, 35).
Özellikle ko-faktör rolleri ile metallo-enzimlerin
Yazışma adresi / Correspondance: Gizem Işıl Bektaş, Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Biyokimya
Laboratuvarı, 06020, Etlik, Ankara, Türkiye. E-posta: [email protected]
* İlk yazarın doktora tezinden özetlenmiştir. Bu çalışma TAGEM/HS/09/06/02/150 no’lu proje ile desteklenmiştir. Tez çalışması etik kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
72
Bektaş GI, Altıntaş A. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 71 - 77, 2010
fonksiyonlarında oldukça önemli olup bu elementlerin eksikliği veya fazlalığı hayvanlarda çeşitli bozukluklara ve verim düşüklüğüne, dolayısıyla ekonomik kayıplara neden olmaktadır (17).
Yapağı ya da kılın hayvanlarda ve insanlarda
biyolojik materyal olarak kullanılabileceği (16, 22)
ve hatta örnek alımı ve muhafazasının çok kolay
olması nedeniyle bazı mineraller için diğer vücut
sıvıları ve dokularına tercih edilebileceği (16) bildirilmektedir. Organizmanın mineral durumunun
göstergesi olarak kıl ya da yapağı mineral düzeyleri
kullanılabilir (8, 10, 12, 19, 23, 28, 34, 36). Çünkü
olgunlaşmış kıl sekesterize olmuş bir doku olup metabolik olarak aktiftir (12). Ölçülen yapağı ya da kıl
mineral düzeyi örneğin alındığı durumu değil daha
önceki vücut mineral durumunu yansıtır (16). İz minerallerin kıl ya da yapağıda serum ve idrardakinden
en az 10 kat daha yüksek düzeylerde birikebileceği
bildirilmektedir (26).
Bu çalışmada, Türkiye koyun popülasyonunda
önemli yer tutan, Merinos ve Ile de France × Akkaraman (G2 melezi) koyunlarının, laktasyon döneminde yapağı iz element (Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se)
düzeylerinin tespit edilmesi, değerlerin literatürde
verilen kritik değerlerle karşılaştırmalı olarak incelenmesi ve laktasyon döneminde iz element düzeylerindeki değişimin izlenmesi amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot
Ankara Polatlı ilçesine bağlı TİGEM tarım işletmesinde birbirine yakın yaşta (1-2), aynı bakımbesleme ve hijyen şartlarında yetiştirilen Merinos
ve Akkaraman × Ile de France melezi koyunlardan
30’ar adet olmak üzere, 60 adet yapağı örneği usulüne uygun şekilde alınmıştır. Hayvanlar araştırma
süresince fizyolojik değişiklikler bakımından izlenmiştir. Yapağı örnekleri Mart ayında paslanmaz çelik bir makasla hayvanların sırt-yan bölgelerinden
dipten kesilerek alınmış ve analize kadar temiz naylon poşetlerde saklanmıştır. Hayvanlara verilen yem
ve sudan da temiz poşetlere ve polietilen kaplara
örnekler alınmıştır. Toplanan yapağı örneklerinden
hassas terazide 1 g tartılarak teflon kaplara alınmış
ve üzerine 5 ml HNO3 (%65) eklenerek kapakları
kapatılmıştır. Yönteme uygun olarak gerçekleştirilen yakma işleminin sonunda teflon kaplar, kapakları açılmadan 15 dakika süre ile çeker ocakta soğumaya bırakılmış ve sürenin sonunda açılarak kapak
ve teflon kap iç duvarı aşağı doğru deiyonize su ile
yıkanmıştır. Ardından süzgeç kâğıdından süzülerek 15 ml’lik polietilen tüplere alınmış ve üzeri 15
ml’ye kadar bidistile su ile tamamlanmıştır. Analize hazır hale gelen örnekler analize kadar +4°C’de
buzdolabında bekletilmiştir.
Buğday ve kuru yonca örneklerinden 0.3 g tartılarak teflon kaplara alınmış, üzerine 5 ml HNO3
(%65) eklenerek kapakları kapatılmış ve yöntemin
prosedürüne uygun şekilde mikrodalga fırında yakma işlemi tamamlanmıştır. Su örneğinden 15 ml
teflon kaba alınmış üzerine hazırlanan çözelitiden
[Potasyum peroksid sülfatan (K2S2O8) 12.5 g, Sodyum hidroksit (NaOH, 1 mol/L) 5ml alınıp 250 ml
sulandırıldı] 15 ml eklenerek yönteme uygun şekilde mikrodalga fırında yakma işlemi yapılmıştır.
Yapağı, yem ve su örneklerinde mikrodalga yakma
ile hazırlanan materyallerde Mn, Co ve Se analizleri Grafit Fırın ile donanımlı Atomik Absorpsiyon
Spektrofotometre Fe, Cu, Zn, analizleri Alevli AAS
cihazı ile gerçekleştirilmiştir (6).
Örnek hazırlanmasından amaç örneklerin içerdiği organik moleküllerin tamamen yakılması ve
bunu takip eden mineral bileşenlerin asit içerisinde
çözünmesidir. Bu amaçla mikrodalga yakma yöntemi kullanılmıştır. Mikrodalga yönteminde kapalı
sistem içerisinde yüksek basınç ve sıcaklık altında
organik moleküllerin parçalanması sağlanmıştır
(20). Çalışmada yapağı, yem ve su Zn, Cu, Fe, Se,
Mn ve Co miktarları Etlik Merkez Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Biyokimya Laboratuvarındaki Perkin Elmer Analysis 800 Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi (AAS) ile ölçülmüştür.
AAS analiz edilecek her element için 1000 ppm’lik
stok çözeltisinden hazırlanan farklı yoğunluklardaki standartlar ile kalibre edilmiştir. Elde edilen
veriler bilgisayar programı ile değerlendirilmiştir.
Çalışma sonunda elde edilen ortalama değerlerin
istatistiksel değerlendirilmesi SPSS (14.0.1) istatistik paket programı ile yapılmıştır. Gruplara ait istatistik hesaplamalar ve grupların ortalama değerleri
arasındaki farklılığın önemliliği için varyans analizi
(ANOVA) ve Duncan testi uygulanmıştır (13).
Bulgular
Hayvanlara verilen yem ve suda Fe, Cu, Zn, Mn, Co
ve Se değerleri Tablo 1’de sunulmuştur. Laktasyon
dönemindeki Merinoslarda ve Ile de France × Akkaraman melezlerinde yapağı iz element ortalama
değerleri ve ırklar arası farkın istatistiksel olarak
önemliliği Tablo 2’de sunulmuştur.
73
Tablo 1. Rasyonda hayvanlara verilen yonca, buğday ve suda iz element değerleri (mg/kg KM = ppm).
Rasyon
Bakır
Çinko
Demir
Selenyum
Mangan
Kobalt
K.Yonca
0.68
8.48
16.10
3.02
0.005
0.180
Buğday
0.00
13.40
14.90
6.10
2.460
0.013
Su
0.00
0.15
0.02
3.43
2.790
0.000
Tablo 2. Merinos ve Ile de France × Akkaraman melezlerinde laktasyon döneminde yapağı iz element değerleri ve
gruplar arası farkın istatistiksel önemliliği.
Metaller
Yapağı
(ppm)
Cu
Zn
Fe
Se
Mn
Co
Ort.±SD
Ort.±SD
Ort.±SD
Ort.±SD
Ort.±SD
Ort.±SD
(En alt-En üst) (En alt-En üst) (En alt-En üst) (En alt-En üst) (En alt-En üst) (En alt-En üst)
Merinos
N=30
19.35 a
±15.16
10.05 – 85.0
68.46 a
±13.19
50.3 – 107.8
107.69 a
±87.47
31.8 – 390.2
7.07 a
±4.96
1.80 - 22.05
3.31 a
±2.02
0.99 – 10.20
1.22 a
±2.69
0.01 – 14.11
Ile de France × 12.18 b
Akkaraman
±9.86
N=30
7.26 – 39.40
73.35 a
±15.62
46.4 – 121.9
94.39 a
±65.91
12.9 – 246.5
3.75 b
±1.89
2.35 – 12.60
4.26 a
±1.80
1.36 – 8.67
0.36 a
± 0,63
0.01 – 3.33
Aynı sütunda farklı harflerle (a, b) gösterilen gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.001).
Çalışma süresince, hayvanların fizyolojik durumlarında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir.
Hayvanlarda yapağı Cu, Zn, Fe ve Co düzeyleri
normal, Se düzeyi yüksek, Mn düzeyleri ise düşük
bulunmuş ve yapağı iz element düzeylerinin özellikle Se ve Mn açısından rasyon iz element içeriğini
tam olarak yansıttığı kanaatine varılmıştır.
Laktasyon dönemine ait yapağı Cu ve Se değerleri açısından iki ırk arasında istatistiksel olarak
önemli (p<0.001) farklılıklar saptanmış; Merinoslarda değerlerin Akkaraman melezlerindekinden
daha yüksek olduğu gözlenmiş (Tablo 2) ve bu
farklılığın, özellikle Cu düzeyleri ile ilgili olanın,
Merinos yapağısının yüksek ondülasyon derecesi ve
kalitesi ile ilişkili olabileceği kanısına varılmıştır.
Çalışmada hayvanlara verilen kuru yonca Zn düzeyinin 8.48 ppm, buğdayın 13.4 ppm, yoncanın Cu
değerinin 0.68 mg/kg olduğu, buğdayın Cu değerinin ise tespit limitinin altında olduğu [Lamand
(25)’a göre yemde yetersizlik için limit değer 8
ppm]; yoncanın 16.1 mg/kg; buğdayın ise 14.9 mg/
kg Fe içerdiği, yoncanın Mn düzeyinin 0.005 mg/
kg, buğdayınsa 2.46 mg/kg olduğu tespit edilmiştir
(Tablo 1).
Alp ve ark. (3), Marmara bölgesindeki 55 ayrı
yerden aldıkları yöresel yem bitki örneklerinde
Zn değerini kuru yoncada 14.5-21.76, buğdayda
13.41-27.03 mg/kg; Cu değerini yoncada 2.78-7.59,
buğdayda 5.20-7.70 mg/kg; Fe miktarını yoncada
32.88-164.59, buğdayda 49.28-110.47 mg/kg, Mn
düzeyi yoncada 14.09-33.72, buğdayda 22.46-91.17
mg/kg olarak tespit etmişlerdir. Alp ve ark. (3)’nın
verileri göz önüne alındığında çalışmadaki kuru
yonca çinko değerinin normale yakın, Cu, Fe ve Mn
düzeylerinin normalden düşük olduğu, buğdayda
çinko değerinin normal, Cu, Fe ve Mn değerlerinin
normalden düşük olduğu söylenebilir.
Hayvanların günlük olarak aldıkları bazı iz element miktarları normalden düşük olmasına rağmen
klinik herhangi bir belirti gözlenmemiştir. Hayvanlara verilen içme suyunun düzeyleri de Tablo 1’de
verilmiştir. İçme suyunun Se ve Mn açısından Dünya Sağlık Örgütü’nün bildirdiği değerlerden (Se<10
ppb, Mn<16 ppb) yüksek olduğu söylenebilir.
Koyun rasyonlarının her kg kuru maddesinde bulunması gerekli ortalama çinko düzeyi: McDowell
(27)’e göre 20-33 mg/kg; Aytuğ ve ark. (7)’na göre
40-50 mg/kg’dır. Çinko noksanlığına bağlı klinik
belirtilerin görülmeye başlaması için bu rakamın
çayır ve meralar ile birlikte rasyonda 10 mg/kg’ın
altına düşmesi gerekmektedir. Çinko yetersizliğinin
74
oluşmaması için koyunların rasyonunda kullanılan
kaba ve karma yemlerin kg kuru maddesinde bulunması gereken ortalama çinko düzeyi; tahıl samanında 6.0-7.6 mg, mera otunda 16-55 mg, arpada 14-25
mg ve karma yemlerde 37-89.9 mg olmalıdır (2).
Ancak; okzalat, Cu ve yüksek düzeyde selüloz Zn
emilimini olumsuz etkiler (14). Literatür verileri ile
karşılaştırıldığında, koyunların yem ve su ile günlük
olarak aldıkları Cu, Fe ve Mn değerlerinin düşük,
Se düzeylerinin yüksek, Co ve Zn düzeylerinin ise
normal olduğu söylenebilir (Tablo 1). Koyunlarda
diyet hoşgörü sınırı Cu için 10 ppm; Zn için 150
ppm; Co için 30 ppm; Se için 3 ppm olarak bildirilmiştir (4).
Fazlalık açısından problem oluşturacak iz element sadece Se olmuştur. Hayvanların kuru ot, buğday ve su ile günde toplam olarak aldığı Se miktarı (12.55 ppm) literatürde verilen tolere edilebilir
günlük Se düzeyinin (3 ppm) çok üzerinde olduğu
görülmektedir (Tablo 1). Bu da, yetersizliğinde olduğu gibi hayvanlarda olumsuz bir durum oluşturmaktadır.
Selenyum özellikle Vit E ile birlikte hücre ve
diğer biyolojik zarları oksidatif hasardan korur ve
bilhassa gevişen hayvanlarda bağışıklık sisteminin
görevini sağlıklı sürdürebilmesini sağlar. Fazla alınması halinde Se özellikle kıl, yapağı ve tırnak dokularında kükürtlü aminoasitlerin “S” ile yer değiştirerek birikim gösterir ve hayvanlarda Se toksikasyonu
belirtileri gözlenir (4, 14).
Rasyonda Co değeri toplam olarak 0.193 ppm
hesaplanmıştır (Tablo 1). Ruminantlarda rasyonda
Co gereksinimi için 0.1-0.2 ppm değerler bildirilmiştir (21). Hayvanların rasyonla aldıkları Co miktarı normal sınırlar içinde değerlendirilmiştir.
İçme suyunda Co düzeyi ise genel olarak 1-2
ppb olarak bildirilmiştir (21). Bu çalışmada hayvanların rasyonla birlikte aldıkları suda Co değeri
AAS ile ölçülemeyecek kadar düşük düzeylerde bulunmuştur. Yetersizlik belirtileri görülebilmesi için
rasyonda Co düzeyinin 0.07 ppm’in altına düşmesi
gerektiği ifade edilmiştir (21). Ruminantlarda kobaltın hemen hemen tamamı rumen mikroorganizmaları tarafından Vit B12 sentezinde kullanılır.
Kurt ve ark. (24), Diyarbakır yöresindeki Akkaramanlardan aldıkları yapağı örneklerinde Zn
düzeyini, en düşük 76.88 µg/g en yüksek 119.88
µg/g (ortalama 98.75 µg/g) olarak bildirmektedirler.
Koyunlar için yapağı Zn ortalama değeri Burns ve
arkadaşları (11), tarafından 115 μg/g, Kargın ve ark
(18), 54.2-74.7 µg/g, Göksoy ve arkadaşları (15) tarafından ise Akkaraman yapağılarında 58.12±3.31
ppm olarak bildirilmektedir. Yankassa koyunlarında yapağı Zn düzeyleri 1 yaşın altındakilerde 156.6
μg/g ve 2 yaş ve üzerindekilerde ise 163.3 μg/g olarak (23), sığır kıllarında ise siyah renklilerde 181±92
μg/g ve 122±8.5 μg/g, renksizlerde 117±7.6 μg/g
olarak hesaplanmıştır. Çalışmada yapağı Zn düzeyleri ortalama değeri Merinoslarda 68.46±13.19 ve
Akkaraman melezlerinde 73.35±15.62 μg/g olarak
hesaplanmış (Tablo 2) ve iki ırk arasında önemli bir
fark olmadığı tespit edilmiştir (Tablo 2). Çalışma
sonuçlarımız literatür değerlerin altında kalmaktadır. Ancak yurdumuz Akkaramanlarında Göksoy
ve ark. (15) bulgularıyla uyum içindedir. Bu bulgu yurdumuz Akkaraman koyunlarında yapağı Zn
değerlerinin kritik düzeylerde bulunduğunu göstermektedir. Çünkü Zn yetersizliği için limit değer
insan saç örneklerinde 40 μg/g (ppm) olarak tespit
edilmiştir (32). Koyunlar için kritik değere literatürde rastlanmamış olduğundan bu veri esas alınmıştır. Çalışmada elde edilen değerler bu limit değerin
hemen üzerindedir. Hayvanların tükettikleri yem ve
su örneğinde toplam Zn düzeyi 22.03 ppm olarak
hesaplanmıştır (Tablo 1). Yemlerde yetersiz Zn düzeylerini ifade etmek için limit değer olarak 45 ppm
verilmektedir (23). Ancak yetersizliğe bağlı klinik
belirtilerin ortaya çıkması için rasyonda 10 ppm’in
altında Zn bulunması gerektiği bildirilmektedir (2,
9). Mevcut değerler itibariyle yem Zn düzeyinin yetersiz olduğu ancak klinik belirtilerin ortaya çıkacağı düzeyde düşük olmadığı söylenebilir.
Bakır, koyunlarda yapağı ondülasyonunda
önemli rol oynamaktadır. Eksikliğinde yapağı kıvrımlarının kaybolması, yumuşaklığını kaybederek
sertleşmesi ve yapağı kalitesinin düşmesi çok belirgindir. Kuzularda siyah renkli kısımlarda, beyaz
şeritlerin oluşması devamlı görülen bir belirtidir.
Yapağı bakır düzeyini Kurt ve ark. (24) 6.18-9.11
µg/g, Onwuka ve ark. (30) 9.8 µg/g, Kargın ve ark.
(18) 2.1-3.06 µg/g, Karagül ve ark. (17) 3 -15 µg/g
olarak bildirmektedirler. Bayşu ve ark. (8) yapağıda Cu düzeyini 8.6±0.68 µg/g verirlerken; Göksoy ve ark. (15) Akkaraman koyun yapağılarında
Cu ortalama değerini 4.29±0.25 ppm/kuru madde
olarak tespit etmişlerdir. Yapağıda yetersizlik limit
değeri Cu için 7 µg/g olarak bildirilmiştir (25). Çalışmadan elde ettiğimiz bakır yapağı değerleri söz
konusu araştırmalarla uyumlu olarak Akkaraman
melezlerinde 12.18±9.86 µg/g ve Merinoslarda
19.35±15.16 µg/g tespit edilmiştir (Tablo 2). Merinos yapağılarında Cu değeri Akkaraman melezlerine ait yapağı Cu değerlerinden önemli düzeyde yüksek bulunmuştur. Bu durum, ondüle olmuş Merinos
yapağısının kalitesiyle ilişkilendirilebilir. Çünkü
yapağı Cu değerinin ondülasyonda gerekli olduğu
ve dolayısıyla kalitenin belirlenmesinde önemli rol
oynadığı bilinmektedir (29).
Koyunlarda yapağı Fe değerleri ile ilgili olarak, Burns ve ark. (11) 50.00 µg/g; Rashed (31)
188.00–996.00 µg/g değerler bildirmektedirler. Bu
değerler çalışmada elde edilen değerler ile kısmen
paralellik göstermektedir. Bu çalışmada laktasyon
başında yapağı Fe miktarı Akkaraman melezlerinde 94.39±65.19 µg/g; Merinoslarda 107.69±87.47
µg/g olarak tespit edilmiştir (Tablo 2). Hayvanların
günlük olarak düşük düzeyde Fe almalarına (yem
ve su ile toplam 31.02 ppm) rağmen yapağı Fe değerleri Rashed (31)’in sonuçlarından düşük; Burns
ve ark. (11)’nın değerlerinden yüksek olarak değerlendirilmiştir. Merinoslarda yapağı Fe düzeyinin
Akkaramanlardakinden daha yüksek olduğu görülmektedir.
Koyun yapağısında Se miktarını, Sheppard ve
ark. (33) 0.027–0.070 µg/g; Wuyi ve ark. (37) 0.125
µg/g olarak bildirmektedirler. Diğer yandan, yapağı
Se düzeyi 0.25 ppm yetersizlik için kritik düzey, 10
ppm toksik düzey olarak bildirilmiştir (4). Çalışmada, yapağı Se miktarı ile ilgili olarak Akkaramanlarda 3.75±1.89 µg/g; Merinoslarda 7.07±4.96 µg/g
değerler tespit edilmiştir (Tablo 2). Değerler yetersizlik için bildirilen kritik düzeyin çok üstünde fakat
toksikasyon için bildirilen kritik değerin altında kaldığı saptanmıştır. İki ırk arasındaki fark istatistiksel
olarak önemlidir (p<0.001). Merinos yapağılarında
Se düzeyinin daha yüksek olduğu tespit edilmiş ve
bunun Merinos için yün kalitesinin oluşmasında görev aldığı düşünülmüştür. Çalışmadan elde edilen
Se miktarının diğer çalışmalara oranla yüksek olduğu görülmektedir. Bu artış rasyonla yüksek düzeyde
Se alımı ile (Tablo 1) ilişkilendirilebilir.
Koyunlarda yapağı Mn değerleri ile ilgili
olarak, Burns ve ark. (11) 25 mg/kg, Rashed (31)
23–55 ppm değerler bildirmektedirler. 70 ppm yapağı Mn düzeyi toksikasyon için kritik düzey olarak
belirtilmiştir (4). Literatür taramada yetersizlik için
limit değerlere rastlanmamıştır. Koyun yapağı Mn
75
değerleri bu çalışmada Merinoslar için 3.31±2.02
ppm Akkaramanlar için 4.26±1.80 ppm olarak bulunmuştur (Tablo 2). Yapılan diğer çalışmaların sonuçlarına göre çalışmada elde ettiğimiz yapağı Mn
değerlerinin belirgin şekilde düşük olduğu gözlenmektedir. Muhtemelen bu düşüş hayvanların günlük
olarak aldıkları Mn düzeyinin yetersiz olması ile
ilişkilidir. Hayvanlara verilen yem ve su ile toplam
5.255 ppm Mn aldıkları hesaplanmıştır (Tablo 1).
Burns ve ark. (11) koyunlarda yapağı Co değerlerini 0.003 ppm, Rashed (31) ise 1.75±0.70 ppm
olarak vermektedirler. Bu çalışmada elde edilen yapağı Co değerleri Akkaraman melezleri ve Merinoslar için sırasıyla 0.36±0.63 ve 1.22±2.69 ppm olarak
hesaplanmıştır (Tablo 2). Çalışmadan elde edilen
değerler Rashed (31) tarafından bildirilen yapağı
Co değerleri ile uyumlu kabul edilebilir. Ancak,
Merinos yapağısının Co değeri Akkaraman melezi
yapağı Co değerlerinden belirgin derecede yüksek
bulunmuş fakat istatistiksel olarak önemsiz olduğu
saptanmıştır (p>0.05). Büyük farkın istatistiksel olarak önemsiz olmasının değerlerin büyük varyasyon
göstermesiyle ilişkili olabileceği düşünülmektedir.
Hayvanların günlük olarak aldıkları Co miktarı ile
yapağı Co durumu uyumlu bulunmuştur. Literatür
verilere göre alınan Co düzeyi ve yapağı Co değerleri normal düzeylerde bulunmuştur (Tablo 1 ve
Tablo 2).
Daha önce yapılan bir çalışmada (5), Akkaraman melezlerinde klinik olarak yapağı dökülmesi
gözlenmiş ve bunun fizyolojik bir olay olduğu sonucuna varılmıştır.
Her iki ırkta da yapağı Cu, Zn ve Fe düzeyleri
normal, Se düzeyi yüksek, Mn ve Co düzeyleri ise
düşük bulunmuş hayvanlara verilen yem ve suda Cu,
Fe ve Mn düzeylerinin düşük, Se düzeyinin yüksek
ve Co ve Zn değerlerinin ise normal olduğu saptanmıştır. Günlük gereksinimin altında Cu almalarına
rağmen koyunların yapağı Cu değerlerinin normal
bulunması yapağıda Cu birikimi ve güçlü bir Cu
homeostazisinin varlığı ile açıklanabilir. Yüksek
yapağı Se değerleri rasyonla günlük gereksinimin
üzerinde Se alınması ve yapağının önemli bir Se deposu olması ile ilişkili olabilir.
İz element düzeylerinde Akkaraman melezlerine göre Merinos lehine tespit edilen önemli farklılıklar merinos yapağı kalitesi ile ilişkilendirilebilir. Laktasyondaki her iki ırkta da yapağı Se ve
Mn düzeylerinin rasyon Se ve Mn içeriğini tam ve
76
doğru olarak yansıttığı kanaatine varılmıştır. Her iki
ırk için mart ayında alınan yapağı iz element düzeylerinin aslında laktasyonun başlangıç dönemini
yansıttığı söylenebilir. Çünkü yapağı ya da kıldaki
mineral miktarının yapağının/kılın alındığı andaki
değil daha önceki vücut mineral durumunu yansıttığı bildirilmiştir (16). Bu sürenin kılın filizlenme
süresi (yaklaşık birkaç ay) kadar olduğu ileri sürülmektedir (28). Kılın normal gelişimi ve matriksde
hücre bölünmesi için Zn, yapağının renk ve kıvrımlarının teşekkülünde ve dolayısıyla kalitesinde ise
Cu iz mineralleri esansiyeldir (35).
Her iki ırkta da yapağı Zn, Cu, Fe, ve Co düzeylerinin bu konudaki benzer çalışma sonuçlarıyla
kısmen uyumlu, Se düzeyinin yüksek, Mn düzeyinin ise düşük olduğu görülmektedir. Selenyum ve
Mn seviyelerindeki değişikliklerin hayvanlarda herhangi bir klinik belirtiye sebep olmadığı gözlenmiştir (8, 11, 15, 18, 31).
Merinos ile Ile de France × Akkaraman melezleri arasında bir karşılaştırma yapıldığında; laktasyon döneminde yapağı Cu ve Se değerlerinin önemli derecede farklı olduğu (p<0.001) ve Merinoslarda
değerlerin Akkaraman melezlerindekinden yüksek
olduğu tespit edilmiştir. Laktasyonda Fe, Zn, Mn ve
Co hariç diğer yapağı iz element düzeyleri (Cu, Se)
açısından iki ırk arası önemli farklılıkların (p<0.001)
melez yapağılarının bazılarının hafif de olsa renkli
olmalarından ve Merinos yapağı kalitesinden kaynaklanabileceği görüşündeyiz.
İncelenen iz elementlerden sadece Cu ve Se
açısından iki ırk arasında önemli farklılık (p<0.001)
tespit edilmiş ve her iki iz element düzeylerinin Merinoslarda Akkaraman melezlerinden daha yüksek
olduğu saptanmıştır (Tablo 2). Buradan hareketle,
Akkaraman melezlerinin özellikle Cu, Zn ve Co
yetersizliklerine meyilli oldukları söylenebilir kanısındayız.
Kaynaklar
1. Akçapınar H, (2000). Koyun yetiştiriciliği. İsmat matbaacılık. Ankara.
2. Alkan F, (1998). Konya ve Bölgesindeki Koyunlarda Görülen Piyetenin Etiyolojisinde Çinko ve Bakırın Rolü. Doktora Tezi, Selçuk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
3. Alp M, Kahraman R, Kocabağlı N, Özçelik D, Eren M,
Türkmen İ, Yavuz M, Dursun Ş, (2000). Marmara Bölgesindeki Yem Bitkilerinin Mineral Madde Düzeylerinin Saptanması ve Koyunlarda Beslenme Bozuklukları ile İlişkisi.
Turk J Vet Anim Sci. 25: 511-520.
4. Altıntaş A, (1990). Mineral madde metabolizmasına bir bakış. Tarımda kaynak (TAKVA). Tarımsal Kalkınma Vakfı
Yayın Organı, 1(2): 19-21.
5. Altıntaş A, Uysal H, Yıldız S, Goncagül T, (1991). Yapağısını Döken Ve Dökmeyen Akkaraman Koyunlarında Karşılaştırmalı Serum Ve Yapağı Mineral Durumu. Lalahan Hayvancılık Araştırma Enstitüsü Dergisi, 31(3-4): 48-54.
6. AOAC, (2000). Official Methods of Analysis of AOAC
İnternational. 17th Ed., AOAC International Gaithersburg.
Md, Usa Offical Method 999.10. Chapter 9, p:16.
7. Aytuğ CN, Alaçam E, Özkoç Ü, Yalçın BC, Türker H,
Gökçen H, (1990). Koyun - Keçi Hastalıkları ve Yetiştiriciliği, TÜM VET Hayvancılık Hizmetleri Yayınları, No:
2, İstanbul.
8. Baysu N, Dündar Y, Bayrak, S, (1984). Koyun ve Kuzularda Yün ve Kan Bakır Değerleri Arasındaki İlişki ve Bunun
Diagnostik Önemi. Doğa Bil Dergisi 8(1): 117-122.
9. Belgemen T, Akar N, (2004). Çinkonun Yaşamsal Fonksiyonları Ve Çinko Metabolizması İle İlişkili Genler. Ankara
Üniversitesi Tıp Fakültesi Mecmuası 57(3): 161-166.
10. Bınot H, Lomba F, Chauvaux G, Et Bienfet V, (1968). La
signification de la teneur en Manganese des poils Chez les
bovins. Ann Med Vet. 112(8): 649-688.
11. Burns RH, Johnston A, Hamilton JW, Mccolloch RJ,
Duncan WE, Fisk HG, (1964). Minerals In Domestic
Wools. J Anim Sci. 23, 5-11.
12. Combs DK, Goodrıch RD, Meıske JC, (1982). Mineral
concentrations in hair as indicators of mineral status. J
Anim Sci. 54(2): 391-398.
13. Dawson B, Trapp RG, (2001). Basic and Clinical Bioistatistics 3rdedn. Lange Medical Books/McGnaw-Hill Medical Publishing Division, New York.
14. Ergün A, (2001). Mineral Elementler. Ergün. A., Şakir,
D.T.eds. Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları, s: 7791.
15. Göksoy K, Tükenme, İ, Morçöl T, Gücüş Aİ, (1983). Wool
Sheding In Sheep And Its Relation With Some Essantiol Element Deficienci. Turkish J Nuc Sci. 10(2): 105-111.
16. Hılderbrand DC, White DH, (1974). Trace element Analysis In Hair. An Evaluation Clin Chem. 20(2): 148-151.
17. Karagül H, Altıntaş A, Fidanci UR, Sel T, (2000). Mineral Madde Metabolizması. Klinik Biyokimya. s: 229-254.
18. Kargın F, Seyrek K, Bildik A, Aypak S, (2003). Determination of the Levels of Zinc, Copper, Calcium, Phosphorus
and Magnesium of Chios Ewes in the Aydın Region. Turk J
Vet Anim Sci. 28: 609-612.
19. Kellaway RC, Sitorus P, Meibholz JML, (1978). The use
copper levels in hair to diagnosis hypocuprosis. Res Vet
Sci. 24(3): 352-357.
20. Kınık Ö, Uysal H, Akbulut N, (2001). Süt ve Süt Ürünlerinde İz Elementler. Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları, İzmir. 549: 1-122.
21. Kim JH, Gıbb HJ, Howe PD, (2006). Cobalt And İnorganic
Cobalt Compounds. Switzerland. WHO Press.
22. Kleway LM, (1972). Hair as a biopsy material. Amer J
Clin Nutr. 25: 263.
23. Kumaresan A, Kapioh MA, (1984). Hair as indicator of
mineral status in Yankassa Sheep. Rev Elev Med Vet PaysTrop. 37(1): 61-64.
24. Kurt DD, O Kanay Z, Güzel C, Ceylan K, (1999). Diyarbakır Bölgesi Akkaraman Koyunlarında Kan Serumunda
Zn, Se ve Yünde Cu, Zn Düzeylerinin Araştırılması. Turk J
Vet Anim Sci. 25: 431-436.
25. Lamand M, (1975). Les minéraux et les vitamines. Point
Vet. (1): 135-142.
26. Maugh TH, (1978). Hair; A diagnostic tool to complement
blood serum and urine. Science. 202: 1271.
27. Mc Dowell LR, (1992). Minerals in Animal and Human
Nutrition: Comparative Aspects to Human Nutrition (Animal Feeding and Nutrition). p:3 ve 265-292.
28. Nougues C, Lamand M, (1972). Possibilites et limites de
l’utilisation du poil dans le diagnostic de la carence en zinc
chez le bovin. Ann Rech Veter. 3(3): 505-509.
29. O’mary CC, Bell MC, Sneed NN, Jr Butts WT, (1970).
Influence of ration copper on minerals in hair of Hereford
and Holstain calves. J Anim Sci. 28(1): 268-271.
30. Onwuka SK, Avwıoro OG, Olaifa AK, (2000). Preliminary Observations On Trace Element Contents Of The Skin
And Pelage Of West Afrıcan Dwarf [Wad] Goat. African
Journal of Biomedical Research. 3(3): 149 -152.
77
31. Rashed MN, Soltan ME, (2005). Animal Hair As Biological Indicator For Heavy Metal. Environmental Monitoring
and Assessment. 110: 41–53.
32. Shapcott D, Vobecky JS, Vobecky J, Demers PP, (1985).
Plasma Hair and Red Blood cell Zinc in relation to Dietary
Zinc Intake. Mılls, C.F., Bremner, I., Chesters, J.K. eds.
Trace elements in Man and Animal. p: 595-596.
33. Sheppard AD, Blom L, Grant AB, (1984). Selenium Levels In Miscellaneous Materials. New Zealand Vet J. 32(6):
97-98.
34. Suttle NF, (1983). Use of erythrocyte Copper: Zinc superoxide dismutase activity and hair or fleece copper concentrations in the diagnosis of hipocuprosis in ruminants. Res
Vet Sci. 35, 47-52.
35. Underwood ET, (1977). Trace elements in human and animal nutrition. 4th ed. New York, Academic Press.
36. Vernichenko AF, (1975). Hairs as indicators of calcium
and phosphorus status in cattle. Sel’skokhozyaistvernaya
Biologiya 10(6): 938-940.
37. Wuyi W, Sheila D, Thornton I, (1987). The Selenium
Status of Sheep in Britain as Indicated by Wool Selenium
Concentration. Environmental Geochemistry and Health.
9(2): 48-51.
78
79EE
- 84,
Araştırma
79
Onuk
ve2010
Sığır karkas orijinli Escherichia coli O157 izolatlarının rastgele çoğaltılmış
polimorfik DNA-polimeraz zincir reaksiyonu ile genotiplendirilmesi
Ertan Emek ONUK1, Gökhan İNAT2, Arzu FINDIK3, İnci Ülkü ÇELİKEL4, Alper ÇİFTCİ3
Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi 1Klinik Öncesi Bilimler Bölümü, 2Besin Hijyeni ve Teknolojisi
Anabilim Dalı, 3Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Samsun; 4Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji
Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
Özet: Bu çalışma, sığır karkas orijinli 32 adet Escherichia coli O157 izolatının iki farklı random primerin (M13 ve
ERIC2) kullanıldığı rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA-polimeraz zincir reaksiyonu (RAPD-PCR) metodu ile genotiplendirilmesi ve farklı primer bağlanma ısılarının (32, 36, 38 ve 40°C) RAPD bant paternleri üzerine etkisinin
değerlendirilmesi amacıyla yapılmıştır. İzolatlar M13 primeri ile 7, ERIC2 primeri ile 5 farklı genotip içerisinde dağıldı.
Çalışmada kullanılan primer bağlanma ısılarının RAPD bant paternlerinin çeşitliliğini dikkate değer bir şekilde etkilemediği görüldü. Sonuç olarak E. coli O157 izolatları arasındaki çeşitliliklerin belirlenmesinde M13 primerinin daha
uygun olduğu ve epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabilir olduğu belirlendi.
Anahtar sözcükler: Escherichia coli O157, genotiplendirme, primer bağlanma ısısı, RAPD-PCR.
Genotyping of beef carcass isolates of Escherichia coli O157 by random amplified
polymorphic DNA-polymerase chain reaction
Summary: This study was performed to genotype 32 E. coli O157 isolates originating from bovine carcasses by random
amplified polimorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR) methods using two different random primers
(M13 and ERIC2) and to evaluate the effect of the different (32, 36, 38 and 40°C) annealing temperatures on RAPD
band patterns. Isolates were distributed into 7 and 5 different genotypes using M13 and ERIC2 primers, respectively. It
was observed that different annealing temperatures used in this study had not considerable effect on RAPD band variability. In conclusion, it was determined that M13 primer was more convenient to detect genetic variability among E.
coli O157 isolates and was useful in epidemiological studies.
Key words: Escherichia coli O157, genotyping, primer annealing temperature, RAPD-PCR.
Giriş
Escherichia coli türünün birçok üyesi, insan ve
hayvanların gastro-intestinal kanalında kommensal
olarak bulunmaktadır. Ancak, immun sistemi baskılanmış konakçılarda veya gastro-intestinal bariyerin
bozulduğu durumlarda patojenik olmayan E. coli
suşları bile enfeksiyona neden olabilmektedir (16).
E. coli’nin antijenik yapısı oldukça komplikedir ve özellikle, patojen suşlarda bu yapılar önem
taşımaktadır. Geleneksel olarak E. coli suşlarının
karakterizasyonu O (somatik), K (kapsül) ve H (flagella) antijenlerine göre serotiplendirme esasına dayanarak yapılmaktadır (17). İnsan ve hayvanlarda
enterik hastalıklara neden olan patojenik E. coli suşları; enterohemorojik E. coli (EHEC), enteropatojenik E. coli (EPEC), enterotoksijenik E. coli (ETEC),
enteroinvaziv E. coli (EIEC), enteroagregatif E. coli
(EAggEC) ve diffuzadeziv E. coli (DAEC) olarak
gruplandırılmaktadır (16, 6). Bunlardan EHEC grubu aynı zamanda verositotoksijenik E. coli (VTEC)
olarak da bilinmektedir (6).
Verositotoksin üreten E. coli’ler insan patojenidir ve insanlarda nonspesifik diyare, hemorajik
kolitis (HC) ve hemolitik üremik sendroma (HUS)
neden olmaktadır (8, 10). Bu grup içerisinde en yaygın olarak görülen serotip E. coli O157’dir (4). İnsanlarda enfeksiyon nedeni olarak ilk sırada kesim
sırasında sığır dışkısıyla kontamine olmuş etlerin
yeterince pişirilmeden tüketilmesi gösterilmektedir. (6, 20) Ayrıca insandan insana temas yoluyla
veya kontamine su ile de bulaşmanın olduğu bildirilmektedir (6). VTEC suşları hayvanlarda yaygın
bir dağılım göstermekte ve özellikle ruminantların
Yazışma adresi / Correspondance: Ertan Emek Onuk, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi Klinik Öncesi Bilimler
Bölümü, 55139, Kurupelit, Samsun, Türkiye. E-posta: [email protected]
80
Onuk EE ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 79 - 84, 2010
bu grubun doğal rezervuarı olduğu düşünülmektedir
(11).
tarıldı ve çalışmalarda kullanılmak üzere -20°C’de
saklandı.
Shiga toksin üreten E. coli O157 suşları arasında ayrım yapmak bu grubun klonal doğası nedeniyle oldukça karmaşıktır (9). Günümüze kadar
E. coli suşlarının karakterizasyonu ve genotiplendirilmesinde pulsed-field jel electroforezis (PFGE),
ribotiplendirme, faj ile tiplendirme (7), rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA-polimeraz zincir reaksiyonu (RAPD-PCR) amplikonlarının restriksiyon
endonükleaz analizi (9) ve sekans analizi (2) gibi
çok çeşitli moleküler tabanlı metotlar kullanılmıştır.
Bu metotlar ile izolatlar arasındaki farklılıklar ortaya konulabilmesine rağmen maliyetlerinin yüksek
olması, yoğun iş gücü ve zaman gerektirmesi gibi
nedenler bu metotların kullanımlarını sınırlamaktadır.
RAPD-PCR ile genotiplendirme: E. coli O157
suşlarının RAPD paternlerinin belirlenmesi amacıyla ERIC-2 (5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG
AGC G-3’) ve M13 (5’-GAG GGT GGC GGT
TCT-3’) primerleri kullanıldı. Amplifikasyon aşaması Versalovic ve ark. (26) tarafından bildirilen
metodun modifiye edilmesiyle gerçekleştirildi. Bu
aşamada her bir primer için ayrı ayrı olmak üzere
DEPC-treated water, 1×PCR Buffer, 2.5 mM MgCl2, 200 μM her bir dNTP, 2.5U Taq DNA polimeraz, 25 pmol primer ve 5 μl template DNA içeren
25 µl’lik bir RAPD master karışımı oluşturuldu.
Bu karışım 94°C‘de 5 dk ön denatürasyonu takiben
94°C‘de 1 dk denatürasyon, 36°C‘de 1 dk primer
bağlanma, 72°C‘de 3 dk uzama olmak üzere 40
siklus ve 72°C‘de 7 dk final uzama koşullarında
amplifikasyon işlemine tabi tutuldu. Amplifikasyon
ürünleri etidium bromid (2µg/ml) içeren %1.5’luk
agaroz jel elektroforezi sonrasında UV transilluminatör ile görüntülendi.
RAPD-PCR metodu basit, duyarlı ve nispeten
düşük maliyetinden dolayı genetik çeşitlilik/farklılık çalışmalarında uygulanabilen, iyi bilinen (22,
23) ve bakterilerin karakterizasyonunda yaygın olarak kullanılan (25) DNA tabanlı bir tekniktir. RAPD
metodunun yüksek hıza sahip olması, tiplendirme
çalışmalarında ilk gösterge olarak kullanılması gerekliliğini ortaya koymaktadır (19). Bu teknik çok
çeşitli patojen mikroorganizmanın moleküler olarak
tiplendirilmesinde ve epidemiyolojik çalışmalarda
başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (13, 18). Bu
çalışmanın amacı sığır karkaslarından izole edilmiş
olan E. coli O157 suşlarını RAPD metodu ile genotiplendirmek, aynı seroguruba ait suşlar arasındaki
genetik farklılıkları ortaya koymak ve RAPD analizi üzerine primer bağlanma ısısının etkisini belirlemektir.
Materyal ve Metot
Bakteri suşları ve DNA ekstraksiyonu: Çalışmada
Samsun ilinde 2 farklı mezbahada kesilen sığırların
karkaslarından izole edilmiş ve serotiplendirilmiş
olan toplam 32 adet E. coli O157 suşu kullanıldı.
Şuşların DNA ekstraksiyonu kaynatma yöntemiyle
yapıldı. İzolatlar Triptik Soy Agar’da 37°C’de 24
saat kültüre edildi. Üreyen saf koloniler, 500 µl steril
distile su içeren DNase/RNase free ependorf tüplerinde süspanse edildi. Süspansiyonlar 100°C’lik su
banyosunda 10 dk bekletildi. Kaynatma sonrasında
9000 rpm’de 5 dk santrifüj edildikten sonra, süpernatantlar DNase/RNase free ependorf tüplerine ak-
Primer bağlanma ısısının RAPD paternlerin çeşitliliğine olan etkinliğinin değerlendirilmesi amacıyla 32, 36, 38 ve 40°C primer bağlanma ısılarında
amplifikasyon siklusu uygulandı.
Oluşan RAPD paternlerinin dendogramları UPGMA (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Averages) ile CHEF-DR® III, Quantity
One® yazılımı (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA) kullanılarak çizildi. Şuşlar arasındaki genetik
ilişki %70 benzerlik katsayısı göz önüne alınarak
belirlendi.
Tekrarlanabilirlik: RAPD analizinin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek üzere, rastgele 5 suş seçildi
ve analizler her iki primer (M13 ve ERIC 2) kullanılarak arka arkaya 3 kez tekrarlandı.
Bulgular
Toplam 32 adet E. coli O157 izolatının hem ERIC-2
hem de M13 primerleri ile değişken bant paternleri
verdiği saptandı. Amplifikasyon aşamasında farklı
primer bağlanma ısılarının (32, 36, 38 ve 40°C) kullanılması ile oluşturulan siklusların, her iki primer
ile elde edilen RAPD bant paternlerinin çeşitliliğini
dikkate değer bir şekilde etkilemediği belirlendi.
RAPD metodunda ERIC-2 primerinin kullanılması ile beş farklı RAPD bant paterni saptandı (Tip
E1-E5). İzolatlar %70 benzerlik katsayısına göre iki
“unique” tip (E2 ve E3 nolu genotip) ve bir küme
içerisinde gruplandı. Bu kümenin üç genotip (E1,
E5 ve E4 no’lu genotip) içerdiği belirlendi. İzolatların 28 adetinin (%87.5) predominant tip olan E1
genotipine dahil olduğu, diğer genotiplerde ise birer
adet izolatın (%3.125) bulunduğu saptandı (Şekil
1). RAPD genotiplerinin %36 ile %90.3 arasında
değişen oranlarda benzerlik gösterdiği belirlendi
(Tablo 1). ERIC-2 primeri ile belirlenen RAPDPCR tiplerine dahil edilen izolat numaraları Şekil
1’de gösterilmektedir.
81
Tablo 1. ERIC-2 primerinin kullanıldığı RAPD-PCR’de
genetik benzerlik matriksi (benzerlik katsayısı %70).
1
2
3
4
5
1
100.0
38.1
48.6
84.5
79.8
2
38.1
100.0
46.6
36.0
37.9
3
48.6
46.6
100.0
55.0
56.7
4
84.5
36.0
55.0
100.0
90.3
5
79.8
37.9
56.7
90.3
100.0
Şekil 1. ERIC-2 primeri ile oluşturulmuş örnek RAPD-PCR paternleri ve bu paternlerden elde edilmiş UPGMA dendogramı. a: 40°C annealing sıcaklığı kullanılarak elde edilmiş RAPD bantları, b: 32°C annealing sıcaklığı kullanılarak
elde edilmiş RAPD bantları.
M13 primeri ile izolatların %22 ile %74.8 arasında değişen oranlarda benzerlik gösteren (Tablo
2) yedi farklı RAPD bant paterni (M1, M2, M3, M4,
M5, M6, M7) oluşturduğu belirlendi. İzolatlar %70
benzerlik katsayısına göre iki “unique” tip (M5 ve
M4 no’lu genotipler) ve iki küme içerisinde gruplandı. İlk kümenin, iki genotip (M6 ve M1 no’lu genotipler), ikinci kümenin ise üç genotip (M3, M7 ve
M2 no’lu genotip) içerdiği belirlendi (Şekil 2). M13
primeri ile yapılan RAPD-PCR’da M1, predominant
82
tip olarak belirlendi ve izolatlardan 22 (%68.75), 4
(%12.5) ve 2 (%6.25) adetinin sırasıyla M1, M2
ve M3 no’lu genotipe dahil olduğu M4, M5, M6
ve M7 no’lu genotiplerde ise sadece 1’er (%3.125)
adet izolatın bulunduğu belirlendi. M13 primeri ile
belirlenen RAPD-PCR tiplerine dahil edilen izolat
numaraları Şekil 1’de gösterilmektedir.
Tekrarlanabilirlik: Her iki primerle arka arkaya
yapılan 3 RAPD analizi sonunda aynı bant paternleri belirlendi ve tekrarlanabilirlik %100 olarak bulundu.
Tablo 2. M13 primerinin kullanıldığı RAPD-PCR’de genetik benzerlik matriksi (benzerlik katsayısı %70).
1
2
3
4
5
6
7
1 100.0
72.6
72.8
33.8
46.8
73.1
69.0
2
72.6
100.0
71.1
22.1
38.2
55.7
74.8
3
72.8
71.1
100.0
29.4
40.5
65.6
73.5
4
33.8
22.1
29.4
100.0
41.8
31.8
22.0
5
46.8
38.2
40.5
41.8
100.0
49.5
32.1
6
73.1
55.7
65.6
31.8
49.5
100.0
59.6
7
69.0
74.8
73.5
22.0
32.1
59.6
100.0
Şekil 2. M13 primeri ile oluşturulmuş örnek RAPD-PCR paternleri ve bu paternlerden elde edilmiş UPGMA dendogramı. a: 40°C annealing sıcaklığı kullanılarak elde edilmiş RAPD bantları, b: 32°C annealing sıcaklığı kullanılarak
elde edilmiş RAPD bantları.
Önceleri barsak kanalının zararsız bir florası olarak
önemsenmeyen E. coli, son yıllarda insan ve hayvanlarda hastalığa neden olma yeteneğindeki dikkate değer değişkenliği nedeniyle patojenik bir tür
olarak görülmektedir (16). E. coli türünün üyeleri
insanlarda nonspesifik diyare, HC, HUS, sepsis ve
menenjitis gibi çeşitli enfeksiyonlara neden olabilmektedir (5, 8, 10). İnsanlarda hastalık oluşturan
STEC (=VTEC) grubuna ait serotiplerin sayısının
artmasına rağmen, E. coli O157 serotipi bu gruptaki
baskın serotip olmaya devam etmektedir (1).
E. coli O157 ile ilgili epidemiyolojik araştırmalar, çoğu kez basit ve birçok laboratuvara uygulanabilir ayırt edici tiplendirme metodunun eksik-
liğinden dolayı aksamaktadır. Faj tiplendirmesinin
kullanışlı olduğu ancak referans laboratuvarlar ile
kısıtlı olduğu bildirilmiştir. Son yirmi yıldır, PCR
tabanlı genotiplendirme metotları, bakteriyel tiplendirme şemalarında önemli bir rol oynamıştır. Bu
PCR tabanlı metotlardan biri olan RAPD-PCR’ın
kolaylığı ve fazla sayıda izolatın analizinde sağladığı faydadan dolayı kullanışlı bir metot olduğu
kanıtlanmıştır (3, 15). Bu teknikte rastgele seçilmiş
DNA bölgeleri genellikle 10 nükleotid uzunluğundaki oligonükleotid primerlerin kullanıldığı PCR
metodu ile amplifiye edilmektedir (24). Bu tip amplifikasyonda komplike DNA ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerekmemektedir. Türlerin kesin
nükleotid sekansının bilinmesine de gerek yoktur.
Bu tiplendirme metodu, çoklu yanlış eşleşmelere
izin verecek düşük ısı aralıklarında hedef sekansa
primer bağlanması temeline dayanmaktadır (25).
Günümüze kadar çeşitli kaynaklardan izole
edilmiş E. coli O157 suşlarının RAPD-PCR ile genotiplendirilmesine ve moleküler karakterizasyonuna ilişkin çeşitli araştırmalar yapılmıştır (12, 21).
Bununla birlikte Türkiye’de E. coli O157 suşlarının
RAPD-PCR analizine ilişkin bilgiye rastlanmamıştır. Çeşitli kaynaklardan izole edilen E. coli O157
suşlarının RAPD-PCR ile tiplendirilmesinde, 1247,
1290 (9), M13, ERIC-1, ERIC-2 (3), DAF4 (27)
gibi çeşitli primerler kullanılmıştır. Bu çalışmada
ise ERIC-2 ve M13 primerleri kullanılarak, sığır
karkas orijinli E. coli O157 izolatlarının RAPD paternleri belirlendi.
Tutenel ve ark. (21)’nın yaptığı bir çalışmada,
25 adet sığır karkasından izole edilen ve ayrıca biri
domuz karkasından ve biri de sığır kıymasından izole edilen toplam 27 adet E. coli O157 suşu, readyto-go-RAPD analiz primeri kullanılarak tiplendirilmiş ve %77.36 benzerlik düzeyinde 6 farklı RAPD
paterni belirlenmiştir. Birch ve ark. (3) tarafından
yapılan ve E. coli izolatlarının RAPD ile genotiplendirildiği çalışmada ise, kullanılan 6 farklı primerden sadece ikisinin (M13 ve 970-11) kullanışlı
olduğu ve M13 ile 5 RAPD tipi belirlendiği, ERIC-2
primerinin de dahil olduğu diğer 3 primerin identik
bant paternleri verdiği, birinin ise sadece 2 patern
oluşturduğu bildirilmiştir. Bu araştırmacılar RAPD
tiplerini %95 benzerlik düzeyinde değerlendirmişlerdir. Bu çalışmada, M13 ve ERIC-2 primerleri ile
gerçekleştirilen RAPD analizleri sonunda sırasıyla
5 ve 7 farklı RAPD paterni %70 benzerlik düzeyi
83
esas alınarak belirlendi. Birch ve ark. (3)’nın bildirdiği bulgular ile bu çalışmanın bulguları arasındaki
farklılığın, temel alınan benzerlik eşik değerlerindeki farklılık ile suşlar arası çeşitlilik farklılıklarından
kaynaklanmış olabileceği düşünüldü.
Vogel ve ark. (27), E. coli suşlarının epidemiyolojik olarak tiplendirmesinde RAPD-PCR, ribotiplendirme ve serotiplendirme yöntemlerini karşılaştırmalı olarak kullanmışlardır. Epidemiyolojik
olarak ilişkisiz olan 32 adet E. coli izolatını, M13 ve
DAF4 primerlerinin kullanıldığı RAPD ile 29 farklı
tipe ayırmışlardır. Bu çalışmada tespit edilen RAPD
tip sayısının Vogel ve ark. (27)’nın yaptığı çalışmada belirlenmiş tip sayısına göre daha az olması, bu
çalışmadaki izolatların aynı bölgeden (Samsun İli)
ve aynı bölgede bulunan mezbahalara gelen sığır
karkaslarından izole edilmiş olmasına bağlanabilir.
Bu çalışmada, ERIC2 primeri ile elde edilen
RAPD tipleri içinde predominant olduğu belirlenen
E1 tipinin toplam 28 (1-6, 9-22, 24-28, 30-32 no’lu
suşlar) izolat içerdiği, bununla birlikte M13 primeri
ile gerçekleştirilen RAPD-PCR’de aynı izolatların
M1 (9-22, 24-32 no’lu suşlar), M2 (1-3, 5 no’lu suşlar) ve M3 (4, 5 no’lu suşlar) genotiplerine dağıldığı
belirlendi. Ayrıca benzerlik matriksi incelendiğinde,
M13 ile yapılan RAPD-PCR analizinin hem izolatlar arasındaki heterojeniteyi daha açık bir şekilde
ortaya koyduğu hem de izolatların çeşitliliğini ortaya koymada ERIC primerine göre daha kullanılabilir olduğu saptandı.
PCR’de primer bağlanma ısısı yüksek olduğunda, primer bağlanma problemleri ortaya çıkarken,
düşük primer bağlanma ısıları, yanlış eşleşmelere
neden olmaktadır (14). Bu çalışmada dört farklı primer bağlanma ısısının (32, 36, 38 ve 40°C), her iki
primer ile gerçekleştirilen RAPD-PCR paternlerini
dikkate değer şekilde değiştirmediği belirlendi. Bu
bulgu, ERIC-2 ve/veya M13 primeri kullanarak yapılacak RAPD-PCR analizlerinde, bu dört primer
bağlanma ısısından herhangi birinin kullanılabileceğini göstermektedir.
Sonuç olarak, sığır karkas orijinli E. coli 0157
izolatlarının moleküler genetik ayırımında kullanılan RAPD-PCR analizinin hızlı, basit ve tekrarlanabilir bir teknik olduğu ortaya konmuştur. Ayrıca
RAPD-PCR analizinde kullanılan M13 primerinin
izolatlar arasındaki çeşitliliği belirlemede daha yararlı olduğu belirlenmiş ve benzer çalışmalarda kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
84
Kaynaklar
1. Armstrong GL, Hollingsworth J, Morris GJ, (1996).
Emerging foodborne pathogens: Escherichia coli O157:H7
as a model of entry of a new pathogen into the food supply
of the developed world. Epidemiol Rev. 18, 29-51.
2. Ateba CN, Bezuidenhout CC, (2008). Characterisation of
Escherichia coli O157 strains from humans, cattle and pigs
in the North-West Province, South Africa. Int J Food Microbiol. 128, 181-188.
3. Birch M, Denning DW, Law D, (1996). Rapid genotyping
of Escherichia coli O157 isolates by random amplification
of polymorphic DNA. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 15,
297-302.
4. Chapman PA, (1999). Escherichia coli O157: 14 years’ experiance. Stewart DD, Flint HJ. eds. Escherichia coli O157
in Farm Animals. CABI Publishing, New York. p.99-121.
5. Eisenstein BI, Jones GW, (1988). The spectrum of infections and pathogenic mechanisms of Escherichia coli. Adv
Intern Med. 33, 231-52.
6. Erol İ, (2007). Gıda Hijyeni ve Mikrobiyolojisi. Ankara: Po
zitif Matbaacılık Ltd. Şti., p 78-92.
7. Grif K, Karch H, Schneider C, Daschner FD, Beutin L,
Cheasty T, Smith H, Rowe B, Dierich MP, Allerberger F,
(1998). Comparative Study of Five Different Techniques for
Epidemiological Typing of Escherichia coli O157. Diagn
Microbiol Infect Dis. 32, 165-176.
8. Griffin PM, Tauxe RV, (1991). The epidemiology of infections caused by Escherichia coli O157:H7, other enterohaemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic uremic
syndrome. Epidemiol Rev. 13, 60-98.
9. Hopkins KL, Hilton A, (2001). Restriction endonuclease
analysis of RAPD-PCR amplicans derived from Shiga-like
toxin-producing Escherichia coli O157 isolates. J Med Microbiol. 50, 90-95.
10. Karmali MA, (1989). Infection by Verocytotoxin-producing
Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 2, 15-38.
11. Karmali MA, Gannon V, Jan M, Sargeant JM, (2010).
Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC). Vet Microbiol. 140, 360-370.
12. Krüger A, Padola NL, Parma AE, Lucchesi PMA,
(2006). Intraserotype diversity among Argentinian verocytotoxigenic Escherichia coli detected by random amplified
polymorphic DNA analysis. J Med Microbiol. 55, 545-549.
13. Lawung R, Charoenwatanachokchai A, Cherdtrakulkiat R, Thammapiwan S, Mungniponpan T, Bülow L,
Prachayasittikul V, (2010). Antibiograms and randomly
amplified polymorphic DNA-polymerase chain reactions
(RAPD-PCR) as epidemiological markers of gonorrhea. J
Clin Lab Anal. 24(1), 31-37.
14. McPherson MJ, Moller SG. (2000) PCR. Oxford: BIOS
Scientific Publishers Limited.
15. Moore JE, Watabe M, Millar BC, McMahon MA, McDowell DA, Rooney RJ, Loughrey A, Goldsmith CE,
(2008). Molecular characterisation of verocytoxigenic Escherichia coli O157:H7 by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) typing. Br J Biomed Sci. 65(3), 161163.
16. Nataro JP, Kaper JB, (1998). Diarrheagenic Escherichia
coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-201.
17. Orskov I, Orskov F, Jann B, Jann K, (1977). Serology,
chemistry, and genetics of O and K antigens of Escherichia
coli. Bacteriol Rev. 41, 667-710.
18. Ramalivhana JN, Obi CL, Samie A, Labuschagne C,
Weldhagen GF, (2010). Random amplified polymorphic
DNA typing of clinical and environmental Aeromonas hydrophila strains from Limpopo province. South Africa J Health Popul Nutr. 28(1), 1-6.
19. Renders N, Romling U, Verbrugh H, Van Belkum A,
(1996). Comparative Typing of Pseudomonas aeruginosa
by Random Amplification of Polymorphic DNA or PulsedField Gel Electrophoresis of DNA Macrorestriction Fragments. J Clin Microbiol, 34(12), 3190-3195.
20. Russell JB, Diez-gonzales F, Jarvis GN, (2000). Invited
rewiev: Effects of diet shifts on Escherichia coli in cattle. J
Dairy Sci. 83, 863-873.
21. Tutenel AV, Pierard D, Van Hoof J, Cornelis M, De Zutter L, (2003). Isolation and molecular characterization of
Escherichia coli O157 isolated from cattle, pigs and chickens at slaughter. Int J Food Microbiol, 84, 63-69.
22. Welsh J, McClelland M, (1990). Fingerprinting genomes
using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18,
7213-7218.
23. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA,
Tingey SV, (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Res. 18, 6531-6535.
24. Vaneechoutte M, (1996). DNA fingerprinting techniques
for microorganisms. Mol. Biotechnol. 6, 115-142.
25. Venugopal G, Mohapatra S, Salo D, Mohapatro S,
(1993). Multiple mismatch annealing: Basis for random
amplified polymorphic DNA fingerprinting. Biochem Biophys Res Commun. 197, 1382-1387.
26. Versalovic J, Koeuth T, Lupski R, (1991). Distribution
of repetitive DNA sequences in eubacteria and application
to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res.
19(24), 6823-6831.
27. Vogel L, Van Oorschot E, Maas HME, Minderhoud B,
Dijkshoorn L, (2000). Epidemiologic typing of Escherichia coli using RAPD analysis, ribotyping and serotyping.
Clin Microbiol Infect. 6, 82-87.
85 -C89,
85
Nisbet
ve 2010
ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 85Araştırma
Determination of serum total sialic acid and ceruloplasmin concentrations in
Toxoplasma gondii seropositive dogs
Cevat NİSBET1, Sena ÇENESİZ1, Taraneh ÖNCEL2, Gül Fatma YARIM1, Gülay ÇİFTCİ1, Erol
HANDEMİR3
1
Ondokuzmayis University Faculty of Veterinary Medicine Department of Biochemistry, Samsun; 2Parasitology
Laboratory Pendik Veterinary Control and Research Institute, Istanbul: 3Parasitology Laboratory Konya Veterinary
Control and Research Institute, Konya, Turkey
Summary: This study aimed to investigate serum total sialic acid (TSA) and ceruloplasmin (CP) levels and their possible correlation in Toxoplasma gondii seropositive dogs. The study was conducted on the dogs that had been kept in
doghouses located in the province of Istanbul. Based upon indirect fluorescence antibody test (IFAT) results, 15 T.
gondii seronegative dogs and 25 seropositive infected dogs were included in the study. Blood samples were collected
from each dog and serums were obtained. Subsequently, TSA and CP concentrations were measured. For serum TSA
concentration, no significant difference was found between control (17.20±0.55 mg/dl) and infected dogs (15.97±0.55
mg/dl) (p>0.05). On the other hand, serum CP concentration was significantly higher in seropositive dogs (16.49±1.11
mg/dl) compared to control dogs (10.28 ±1.63 mg/dl) (p<0.01). No correlation was found between serum TSA and serum CP. Absence of a significant difference between groups for serum TSA might be related to the fact that the disease
was in chronic stage, and the severity of cellular damage might have been decreased. Elevation of serum CP in T. gondii
infected dogs is most likely related to cellular damage as a consequence of infection. We suggest that serum CP can be
used as an additional prognostic parameter in toxoplasmosis in support to other serologic parameters.
Key words: Ceruloplasmin, dog, sialic acid, Toxoplasma gondii.
Toksoplazma gondii yönünden seropozitif köpeklerin serum total sialik asit ve
seruloplazmin düzeylerinin belirlenmesi
Özet: Bu çalışmada, İstanbul’un çeşitli barınaklarında bulunan ve Toxoplasma gondii seropozitif olan köpeklerin serum
sialik asit (TSA) ve seruloplazmin (CP) düzeylerinin araştırılması ve bu düzeylerin arasında olası ilişkinin incelenmesi
hedeflendi. Bu amaçla indirekt floresan antikor testi (IFAT) sonuçlarına göre T. gondii seronegatif bulunan 15 sağlıklı
köpek ile seropozitif bulunan 25 enfekte köpekten kan örnekleri alındı ve serumları çıkarıldı. TSA ve CP değerleri
ölçüldü. Yapılan analizlerde hasta ve kontrol gruba ait TSA düzeyleri sırası ile 17.20±0.55 mg/dl ve 15.97±0.55 mg/dl
olarak tespit edildi. Buna göre hasta ve kontrol gruba ait serum TSA düzeyleri arasında istatistiksel olarak önemli bir
fark bulunmadı (P>0.05). Serum SP ortalamaları hasta ve kontrol gruplarda sırasıyla 16.49±1.11 mg/dl ve 10.28±1.63
mg/dl olarak bulundu. Hasta grubun serum CP düzeyleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yüksek
bulundu (P<0.01). Diğer taraftan hasta ve kontrol grubuna ait serum TSA ile CP düzeyleri arasında herhangi bir korelasyon bulunamadı. Gruplar arası serum TSA düzeyinin anlamlı bulunmaması hastalığın kronik döneminde olduğunu
ve hücresel hasarın ortadan kalktığını düşündürmektedir. T. gondii ile enfekte köpeklerde yüksek serum seruloplazmin
düzeyinin, bu enfestasyon sonucunda oluşan hücre hasarının bir sonucu olduğu ve serum seruloplazmin düzeyinin bu
hastalığın serolojik bulgularına yardımcı olarak kullanılabileceği kanaatine varılmıştır.
Anahtar sözcükler: Köpek, seruloplazmin, sialik asit, Toksoplazma gondii.
Introduction
Toxoplasma gondii is an intracellular parasite that
causes infection in human and animals. The main
hosts of the parasite are the felidae; however, a number of animal species including dog, cattle, species
causing human disease needs rephrasing as poorly
articulated (1, 21). In addition to fecal-oral route of
infection, T. gondii is transmitted among definitive
hosts and intermediate hosts by carnivorism, transplasental route, consumption of inadequately pasteurized milk, infected chicken eggs, infected soil,
congenital route, blood tranfusion and via some
antropodia (1, 22). Approximately 50% of canine
toxoplasmosis is associated with clinical sings re-
Yazışma adresi / Correspondance: Cevat Nisbet, Ondokuz Mayıs University Faculty of Veterinary Medicine Department of
Biochemistry, 55139, Kurupelit, Samsun, Turkey. E-posta: [email protected]
86
Nisbet C ve ark. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 85 - 89, 2010
lated to the respiratory system. Other important
signs include nervous and digestive systems disorders. In dogs, the disease is also associated with in
appetence, weight loss, pneumonia (15, 23).
Acute phase proteins (APP) are important
not only for diagnosis and prognosis of a number
of diseases IN several animal species but also for
determination of treatment modalities. Among the
acute phase proteins is ceruloplasmin (CP) which
is synthesized in the liver and recognized as copper carrier as it binds to 95% of plasma copper (8,
12). Due to its potential of scavenging reactive oxygen radicals, seruloplasmin is also recognized as a
part of plasma antioxidant system (8). Sialic acid,
which binds to glycoproteins and glycolipids in tissues and cellular fluids, is an acetylated derivative
of neuronimic acid. Due to their acidic nature making the cell surface negatively charged, sialic acids
take important roles in intercellular communication,
cell-matrix interaction, and transfer of biological information (12, 14, 18).
In this study, due to its potential for scavenging
activity, we measure TSA and CP concentrations in
dogs with an IgG antibody titer of 1:64 or higher
confirmed by IFAT, a diagnostic test comparable to
Dye-Test, a reference test for toxoplasmosis and to
investigate correlation between serum concentrations of TSA and CP.
Material and Method
Collection of samples: A total of 150 stray dogs
were sampled by random selection from various
dog rehabilitation centre (DRC) and kennels of Istanbul and were examined for antibodies to T. gondii. Canine toxoplasmosis was diagnosed on the
basis of history, results of serological examination,
serum biochemical analyses, and clinical findings.
In the study, 25 naturally infected T. gondii dogs
confirmed serologically (see below) constituted the
infected groups. Another 15 dogs with no seropositivity for toxoplasmosis and without any clinical
disorders were included as control groups. All dogs
tested were serogically negative for Leishmania infections. 10 ml blood samples were collected from
each dog. Serum was obtained following centrifuging of blood samples at 3000 rpm for 10 min and
kept at -80°C until assayed.
Serological examination: Sera were tested for
anti-T. gondii antibodies using an indirect immunofluorescent antibody test (IFAT). This test was
performed using standard procedures at the Parasitology Laboratory of the Konya Veterinary Control
and Research Institute. T. gondii RH strain which
were used as antigen for IFAT were obtained by 48
hours intraperitoneal passages from 3-5 weeks old
white mice (Mus musculus variety albino). Toxoplasma tachyzoites were washed by centrifugation
and then resuspended at a concentration of 2×106
ml-1 in saline buffer. Sera samples were diluted from
1:16 until 1:4096 in phosphate buffered saline (PBS
0.015 M, pH 7.2). Ten microlitres of each diluted
sera was pipetted in each delimited circle on the
slides previously adsorbed with T. gondii antigen
from tachyzoites. The slides were incubated at 37°C
for 30 min in a wet chamber. Then they were washed
three times in PBS, dried and were incubated for 30
min, at 37°C with a FITC conjugated anti-dog IgG
antibody (Sigma F-4012) diluted 1:32 in PBS. The
slides were washed and air dried. A drop of glycerol
buffer was added and each slide was covered with a
coverslip. Finally, the samples were observed under
the immunofluorescent microscope (Olympus Mod
BH2, Tokyo, Japan). Titres of 1:64 and above were
accepted as positive (20). Positive and negative control sera were obtained from dogs previously tested
by conventional serological assays (Sabin-Feldman
dye test and IFAT).
Biochemical analyses: Serum TSA concentration
was measured using the Warren method (26). Serum
CP analysis was conducted by a spectrophotometric
method, which included P-phenyldiamine dichloride (PPD) use (4).
Statsitical analysis: Data obtained from control
and experiment groups were compared by One-way
Anova test using a statistical software package program (SAS 82005). The correlation between serum
TSA and serum SP was analyzed by Pearson correlation analysis test. P<0.05 was considered significant.
Findings
Serum TSA and serum CP concentrations in dogs
diagnosed either T. gondii negative (control) or positive (infected) are presented in Table 1. For TSA
concentration, no statistical difference was found
between seropositive dogs (17.20±0.55 mg/dl) and
control dogs (15.97±0.55 mg/dl) (p>0.05). On the
other hand, serum CP was significantly higher in seropositive dogs (16.49±1.11 mg/dl) compared with
87
control dogs (10.28±1.63 mg/dl) (p<0.01). There
was no correlation between serum TSA and serum
CP either in seropositive or control dogs.
Table 1. Serum total sialic acid and serum ceruloplasmin concentrations in T. gondii seropositive and control dogs.
Seropositive dogs (n=25)
Control dogs (n=15)
Level of significance
TSA (mg/dl)
17.20±0.55
15.97±0.55
>0.05
CP (mg/dl)
16.49±1.11
10.28±1.63
<0.01
Discussion and Conclusion
Toxoplasmosis is a zoonotic enfestation with a high
prevalence. As T. gondii can localize to various organs and tissues, toxoplasmosis is associated with
different clinical signs, depending on the organs
and tissues affected. Thus, its differential diagnosis
is often difficult as toxoplasmosis can be confused
with a number of infectious and non-infectious
diseases. Due to late diagnosis, toxoplasmosis can
spread easily (17).
Serological detections of specific IgM and IgG
antibodies are still the current diagnostic tools for
toxoplasmosis; however, specific IgM antibodies
may not be detected during the early phase of the infection. The advance techniques indicated that tests
of IgM detection are not sufficient in diagnosis due
to presence of either residual specific IgMs or naturally interfering IgMs in individuals having no acute
infections. Besides, it has also been reported that no
IgM elevations occurs in children with congenital
toxoplasmosis and in individuals with a reactivated
infection. Therefore, additional tests are needed in
diagnosis as well as determination of ongoing status
of toxoplasmosis (9). It has been reported that IgG
concentration elevates towards the end of the first
month of infection. Maintained as high titers for 6-8
months, IgG concentration declined during the subsequent 1-2 months (19).
T. gondii rapidly proliferates during the
tachyzoite period in the intermediate host, and destroys the invaded cells. During this period, a large
number of cells are destroyed. In the present study,
serum concentration of TSA, indicative of cell damage, was investigated in T. gondii seropositive dogs.
TSA is incorporated into the structures of glycoproteins, mucopolysaccharides and glycolipids in tissues and mucosal secretions, and its serum concen-
tration is elevated during infection (18). Biochemical and morphological changes in the cell membrane caused by any agent during infections result
in changes of serum TSA concentration. Increase in
TSA concentration is a consequence of similarly resulted from sialidase enzyme activity, cleavage of
serum glycoproteins by sialyltranferase, release of
sialic acid from the cell membrane (12) and synthesis of sialoglycoproteins in the liver in response to
some acute phase reactions and their release into circulation (14, 18, 25). It has been reported that serum
TSA concentration is elevated during several infectious diseases, chronic liver diseases, arteritis, parasitic diseases and malignant tumors (5, 18). Serum
TSA concentration is higher in T. gondii seropositive
dogs; however, the difference is not large enough to
create a statistical significance. Following its substantial release as a consequence of degenerations
and structural changes in the cell membrane due to
parasitic manifestation, sialic acid elevates in circulation. Therefore, serum sialic acid concentration is
directly related to severity of the damage and extent
of infection (16). Absence of a significant elevation
in serum TSA concentration in seropositive dogs is
most likely related to the fact that the infection was
either in chronic phase or in recovery phase, during
which the cellular damage and degenerations are
minimized. Such data can indicate whether the animal is infected as well as the extent of infection and
prognosis. Acute phase proteins are plasma proteins
that are elevated in response to acute inflammation
and play a role in immunoglobulin synthesis, tissue
repair and complex immune reactions in response
to hydroxyl effects of oxygen radicals (7, 10, 13).
APP are important in clinical diagnoses and prognoses of animal diseases as well as determination of
fundamentals of treatment (8). The mechanism of
APP fluctuations during various inflammations and
88
tissue damages is not completely known; however,
there are reports indicating a cytokine involvement
in induction of APP (10, 11). APP concentrations
during acute and chronic inflammation vary among
animal species. For instance, the first response during bacterial infections in cattle is given by haptoglobulins while serum amyloid A is mildly affected
(7). While C-reactive proteins and serum amyloid
A protein are important infection and inflammation
indicators in humans (7), ceruloplasmin is an acute
phase protein that responses mildly to inflammation
and tissue damage (12). Some researchers pointed
out that there are positive correlations between acute
phase reactants and the severity of lesions as well as
prognosis (3, 11). In the present study, ceruloplasmin concentration was higher in T. gondii seropositive dogs compared to control dogs (P<0.01). The
number of studies on APP response during parasitic
diseases of the dog is limited; however, it was reported that serum seruloplasmin concentration was
elevated in dogs during gastrointestinal nematode
manifestations (2). The higher serum ceruloplasmin
concentration in T. gondii seropositive dogs compared to control dogs was interpreted as if the seropositive dogs were not completely recovered from
inflammation which was developed in response to T.
gondii invasion. Besides, previous studies also support the notion that elevation of serum ceruloplasmin concentration can occur during the beginning
and recovery phases of inflammation (11). Previous
studies also indicated that elevation in serum TSA
concentration was dependent on various factors. Especially sialyltransferase activity is much higher in
tumorogenesis and metastatic events (24). Wilson et
al., (27) reported that the enzyme sialidase is highly
functional on sialic acid transfer during parasitic
diseases and may play a crucial role in pathogenesis
of parasitic diseases. Gungor et al. (12) reported that
there is no meaningful relationship between APP
and serum TSA. Other studies indicated that serum
TSA concentration is elevated depending on several
factors (14, 18, 25). In correlation analyses conducted in the present study found no correlation between
serum TSA and CP in seropositive dogs.
In conclusion, absence of a significant difference between seropositive and control dogs for
serum TSA concentration, a marker for cell damage, may indicate that the disease is in the bradyzoit
phase during which bradyzoits are encapsulated
by cysts and thus the cellular damage is minimum.
Increased serum concentration of CP suggests that
toxoplazmozis cases studied in the present study are
in chronic stage and tissue damage is not completely
repaired. Importantly, serum concentration of CP, a
normally stable protein, may be a useful prognostic
parameter in toxoplasmosis.
References
1. Canon-Franco WA, Bergamaschi DP, Labruna MB, Camargo lM, Silva JC, Pinter A, Gennari SM, (2004). Occurrence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in dogs in
the urban area of Monte Negro, Rondonia, Brazil. Vet Res
Com. 28, 113- 118.
2. Cetin M, Gunes N, Aydin L, (1995). Gasterointestinal nematodlarla enfekte köpeklerin plazma vitamin C, seruloplazmin ve total protein düzeylerindeki değişimler. Veterinarium. 6, 76-78.
3. Chen CL, Tang FT, Chen HC, Chung CY, Wong MK,
(2000). Brain lesion size and location: effects on motor
recovery and functional outcome in stroke patients. Arch
Phys Med Rehabil. 81, 447-452.
4. Colombo JP, Richterich R, (1964). Zur Bestimmung Des
Caeruloplasmin im plasma. Schweiz Med Wochen. 94,
715-720.
5. Cooper ES, Ramdath DD, Whyte-alleng C, Howell S, Serjeant BE, (1997). Plasma proteins in children with trichuris dysentery syndrome. J Clin Pathol. 50, 236–240.
6. Eckersall PD, Hall FR, Brown CGD, (2003). The protozoan parasite, Theileria annulata, induces a distinct acute
phase protein response in cattle that is associated with pathology. Int J Parasitol. 33, 1409-1418.
7. Eckersall PD, Young FJ, Mccomb C, Hogarth CJ, Safi
S, Weber A, Mcdonald T, Nolan AM, Fitzpatrick JL,
(2001). Acute phase proteins in serum and milk from dairy
cows with clinical mastitis. Vet Rec. 148, 35-41.
8. Floris G, Medda R, Padiglia A, Musci G, (2000). The
physiopathological significance of ceruloplasmin A possible therapeutic approach. Biochemical Pharmacol. 60,
1735-1741.
9. Foudnier F, Chemia CM, Pinon J, (1995). Value of specific
immunglobulin A detection by two immunocapture assays
in the diagnosis of toxoplasmosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 14, 585-590.
10. Glass EJ, Craigmile SC, Springbett A, Preston PM, Kirvar E, Wilkie GM, Eckersall PD, Hall FR, Brown CG,
(2003). The protozoan parasite, Theileria annulata, induces a distinct acute phase protein response in cattle that is
associated with pathology. Int J Parasitol. 12, 1409-1418.
11. Glurich I, Grossi S, Albini B, Ho A, Shah R, Zeid M,
Baumann H, Robert J, Genco RJ, Nardin FD, (2002).
Systemic inflammation in cardiovascular and periodontal
disease: comparative Study. Clin Diagn Lab Immunol. 9,
425-432.
12. Gungor O, Sunar B, Ozcelik F, Aktas Z, Gokmen SS,
(2004). Serum sialic acid levels in acute myocardial infar-
ction and relationship to ceruloplasmin. Turk J Biochem.
29, 226- 231.
13. Halliwell B, Gutteridge JM, (1990). The antioxidants of
human extracellular fluids. Arch Biochem Biophys. 280,
1-8.
14. Hsu CC, Lin TW, Chang WW, Wu CY, Lo WH, Wang
PH, Tsai YC, (2005). Soyasaponin-I-modified invasive behavior of cancer by changing cell surface sialic acids. Gynecol Oncol. 96, 415-422.
15. Kaufmann J, (1996). Parasitic Infections of Domestic
Animals. A Diagnostic Manual. Birkhauser Verlag. BaselBoston-Berlin.
16. Keles I, Ertekin A, Karaca M, Erkin S, Akkan HA,
(2000). Sığırların leptospirozisinde serum sialik asit ve
lipid-bağlı sialik asit düzeyleri üzerine araştıma. Yuzuncu
Yıl Üniv Vet Fak Derg, 11, 121-122.
17. Kurdova R, Krüger D, Janitschke K, (1998). Polymerase
chain reaction (PCR) in the laboratory diagnosis of acute
toxoplasmosis. Exp Pathol Parasitol. 1, 55-61.
18. Ponnio M, Alho H, Nikkari ST, Olsson U, Rydberg U,
Sillanaukee P, (1999). Serum sialic acid in a random sample of the general population. Clin Chem. 45, 1842-1849.
19. Ronday MJH, Ongkosuwito JV, Rothova A, Kijlstra A,
(1999). Intraocular Anti- Toxoplasma gondii IgA Antibody
Production in Patients With Ocular Toxoplasmosis. Amer J
Ophthalmol. 127, 294-300.
20. Silva DAO, Cabral DD, Bernardina BLD, Souza MA,
Mineo JR, (1997). Detection of Toxoplasma gondii specific
89
antibodies in dogs. A comparative study of immunoenzymatic, immunoflurescent and haemagglutination titres.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 92, 785-789.
21. Tanaka T, Abe Y, Inoue N, Kim WS, Kumura H, Nagasawa H, Igarashi I, Shimazaki K, (2004). The detection of
bovine lactoferrin binding protein on Trypanosoma brucei.
J Vet Med Sci. 66, 619-625.
22. Tenter AM, Heckeroth AR, Weiss lM, (2000). Toxoplasma gondii from animal to humans. Int J Parasitol. 30, 12171258.
23. Tuzer E, Toparlak M, (1999). Veterinary Parasitology
Lecture Notes. Istanbul University, Faculty of Veterinary
Medicine:105, Istanbul.
24. Verazin G, Riley WM, Gregory J, Tautu C, Prorok JJ,
Alhadeff JA, (1990). Serum sialic acid and carcinoembryonic levels in the detection and monitoring of colorectal
cancer. Dis Colon & Rectum. 33, 139-142.
25. Wang P, Zhang J, Bian H, Wu P, Kuvelkar R, Kung TT,
Crawley Y, Egan RW, Billah MM, (2004). Induction of
lysosomal and plasma membrane-bound sialidases in human T-cells via T-cell receptor. Biochem J. 380, 425-433.
26. Warren L, (1959). The thiobarbituric acid assay of sialic
acids. J Biol Chem. 234, 1971-1975.
27. Wilson JC, Kiefel MJ, Albouz-abo S, Von-itzstein M,
(2000). Preliminary 1H NMR investigation of sialic acid
transfer by the trans-sialidase from Trypanosoma cruzi.
Bioorg Med Chem Lett. 10, 2791-2794.
90
Etlik Vet Mikrobiyol Derg,
21, 91
97, 2010O. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 91 - 97, 2010
İzgür
M, -Babacan
Derleme / Review
91
Kedi ve köpeklerde üropatojenik Escherichia coli infeksiyonları
Müjgan İZGÜR, Orkun BABACAN
Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye
Özet: Üriner sistem infeksiyonlarına neden olan Escherichia coli suşları üropatojenik E. coli (UPEC) veya ekstraintestinal patojenik E. coli (ExPEC) olarak isimlendirilirler. Üropatojenik E. coli’ler insan ve hayvanlarda özellikle de kedi
ve köpeklerde fırsatçı patojen olarak çeşitli hastalıklara neden olurlar. E. coli üriner sistem infeksiyonlarında en sık
rastlanan patojendir. Üropatojenik E. coli’lerin bilinen genel özelliklerinin yanı sıra patogeneziste rol oynayan virülens
faktörleri, serum direnci ve antijenik özellikleri bulunmaktadır.
Anahtar sözcükler: E. coli, kedi, köpek, üropatojenik.
Uropathogenic Escherichia coli infections in cats and dogs
Summary: Escherichia coli strains that cause urinary tract infections are named as uropathogenic E. coli (UPEC) or
extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). Uropathogenic E. coli is an opportunistic pathogen in human and animals
especially in dogs and cats. E. coli is the most commonly isolated agent from urine of dogs and cats with urinary system
infection. Besides the general features of known, uropathogenic E. coli has serum resistance, virulence factors and antigenic factors. These factors also play a role in pathogenesis.
Key words: Cat, dog, E. coli, uropathogenic.
Giriş
Escherichia coli, üriner sistem infeksiyonlarında en
sık rastlanan patojendir (2, 19). Üriner sistem infeksiyonlarına neden olan E. coli suşları üropatojenik
E. coli (UPEC) veya ekstraintestinal patojenik E.
coli (ExPEC) olarak isimlendirilirler ve bu suşlar
intestinal florada normal olarak bulunabilirler (11,
23).
Üropatojenik E. coli’ler insan ve hayvanlarda
özellikle de kedi ve köpeklerde fırsatçı patojen olarak çeşitli hastalıklara neden olurlar. Bu etkenler,
üriner sistem infeksiyonları dışında vaginitis ve piyometraya da neden olmaktadırlar (2, 5).
Üropatojenik E. coli’lerin bilinen genel özelliklerinin yanı sıra (Gram negatif çomak, katalaz pozitif, oksidaz negatif, laktozu ve sorbitolü fermente
eder, indol testi ve Metil Red testleri pozitif, Voges
Preskauer testi ve sitrat testleri negatif) patogeneziste rol oynayan virülens faktörleri, serum direnci
ve antijenik özellikleri bulunmaktadır (9).
Patogeneziste rol oynayan virulens faktörleri
a) Adezinler: Adezinler (Fimbrialar), ince, saç benzeri, bakterinin hücre duvarında bulunan adeziv or-
ganellerdir. Protein alt ünitelerinden oluşurlar. Çok
sayıda ve farklı karakterlere sahip tipleri belirlenmiştir. Fimbrialar bakterinin sitoplazmasından orijin alırlar ve hücre duvarı boyunca yerleşmişlerdir.
Üriner sistem epitel hücrelerinde glikoprotein ve
glikolipidleri bağlarlar ve bu sayede bakteriler epitele bağlanır ve üriner sisteme dahil olurlar. Sıklıkla
rastlanan fimbrial proteinler üropatojenik E. coli infeksiyonları ile ilişkilidir ve bunlar Tip 1, Tip P ve
Dr fimbrialardır (7, 14, 22).
Üropatojenik E. coli suşları çeşitli genler tarafından kodlanan fimbrialara sahiptir. Fimbrialar,
reseptör spesifitesine ve adezyon özelliklerine göre
sınıflandırılırlar. Fonksiyonel olarak ise mannoz duyarlı ve mannoz dirençli olarak iki gruba ayrılırlar.
Bu ayrım bakterinin eritrosit veya epitel hücrelerine
yapışmasını bloke etme durumuna göre yapılmaktadır.
Mannoz duyarlı fimbrialar genellikle Tip 1
fimbrialardır. Tip 1 fimbrialar, üropatojenik E.
coli’lerin %80’i tarafından sentezlenen ve en sık
rastlanan virulens faktörleridir. Bakteriyel adezyonu sağlamakla birlikte, buna karşı olan yangısal yanıtı artırırlar (7, 16, 25). Tip 1 fimbria common pili
Yazışma adresi / Correspondance: Müjgan İzgür, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 06110
Dışkapı, Ankara, Türkiye. E-posta: [email protected]
92
İzgür M, Babacan O. Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 21, 91 - 97, 2010
olarak da adlandırılmaktadır. Tip 1 fimbria, vajina
ve idrar kesesinde kolonizasyon oluşturmaya katkıda bulunur. Ayrıca hücrelere bağlanmayı destekler.
İdrar kesesi içerisinde, Tip 1 fimbria, idrar kesesi
yüzey epitelinde bulunan mannozlu glikoproteinlere ve üroplakinlere bağlanır. Genellikle sistitis ve
pyelonefritis olgularından izole edilmektedir (10).
Bu bağlantı üromukoid madde tarafından inhibe
edilebilir (4, 9, 17, 18, 21, 22).
Mannoz dirençli fimbrialar ise P fimbria, S/
F1C fimbrialardır. P fimbrialar, ikinci en sık rastlanan virulens faktörleridir. Özellikle, pyelonefritis
olgularının patogenezisinde önemli role sahiptirler.
P fimbrialar, epitel hücre aktivasyonunu sağlayan
ve IL-6 ve IL-8 gibi sitokinleri üreten oligosakkarit reseptörlere bağlanarak etki gösterirler ve sitokin
üretimine neden olurlar (4, 7, 14, 22). P fimbriaların
piyelonefritis, sepsis ve prostatitisle güçlü epidemiyolojik ilişkileri vardır. P fimbrialar patogeneziste
Gal-Gal reseptörleri ile üriner sistem epitel hücrelerine bağlanırlar. (4, 10). P fimbriaların oluşumunda
ana yapı taşı papA’dır (10).
S/F1C fimbria ise üriner sistem infeksiyonları
ve bakteriyemiden sorumludur. Mukoza ve endotel
hücrelerine bağlanırlar (4). Vajina, idrar kesesi ve
bağırsak epitel hücrelerinde reseptörleri bulunur.
Bu fimbriaya sahip etkenler vajinada kolonize olurlar (10).
Dr adezin ailesi, fimbrial adezinler olan Dr adezinlerini ve non- fimbrial olan Afa-I, Afa-II, Afa-III,
Afa-IV, Nfa-I ve Dr-II adezinlerini içermektedir
(18). E. coli tarafından sentezlenen komplement
regulatör proteinler ile epitel hücrelerine bağlanarak etki gösterirler. Bu fimbrialar daha çok sistitis
ve pyelonefritis olgularından sorumludurlar (7, 14,
22). Dr adezinleri ayrıca O75X adezinlerini de barındırmaktadır (12). Renal interstisyum, Bowman
kapsülü, tubulus bazal membran hücreleri, transisyonel epitel ve idrardaki eksfoliyatif epitel hücrelerine bağlanmaktadır (10).
b) Aerobaktin: Demir, tüm hücreler için gerekli bir mineraldir. E. coli, demiri oksijen transportu
ve depolanması, DNA sentezi, elektron transportu
ve peroksit metabolizması için kullanır. E. coli’de
siderofor aerobaktin sistemi, demir elde edilmesi
için en etkili sistemdir. Aerobaktin, iki lizin ve bir
sitrat molekülünden oluşmuş küçük bir moleküldür.
Aerobaktin, E. coli tarafından salgılandıktan sonra,
demiri, konakçının demir bağlayan ve hücre duva-
rı reseptör proteinlerinden ekstrakte eder. Siderofor
sistem, enterobaktin ve aerobaktini de kapsar, IreA,
IroN ve Iha reseptörlerini içerir. Iha reseptörleri
aderens özelliklerini gösterir (16). Aerobaktin sisteminin pek çok avantajı bulunmaktadır. E. coli,
ferrikromu diğer sideroforların yokluğunda düşük
demir içeren koşullarda, sitrat transportu yapmadan ve sentezlemeden kullanabilmektedir (9, 10).
Aerobaktin sistemi, beş genden oluşan bir operon
tarafından kodlanmakta ve bu genler de hücre duvarı reseptör proteinleri tarafından kodlanmaktadır.
İut geni demir-aerobaktin kompleksi için reseptörü
kodlamakta olup, iuc geni ise demir alımı için gereklidir. Diğer genler ise transport mekanizmasında
kullanılmaktadır. Aerobaktin determinantları plasmid ve kromozomlarda bulunmaktadır. Aerobaktin
üretimi demir konsantrasyonlarına bağlı olarak regüle edilmektedir (9, 10).
c) Hemolizin: Hemolizinler ise alfa ve beta hemolizin olarak iki tipte bulunurlar. Alfa hemolizin sıklıkla üriner sistem ve ekstra intestinal infeksiyonlara
neden olan E. coli’ler tarafından sentezlenir. Isıya
duyarlı ekstraselüler proteinlerden oluşurlar ve
plazmidler veya kromozomal olarak determine edilirler (14, 22). Beta hemolizin ise hücre ilişkili hemolizindir ve hemolitik aktivitesi alfa hemolizinle
benzerdir (14, 22). Hemolizin üretimi hayvanlarda
plasmidlerde, insanlarda ise kromozomlarda lokalize olmuş ve hly olarak isimlendirilen, dört genden
oluşan bir operon tarafından kodlanmaktadır.
d) Sitotoksik nekrotizan faktör: Sitotoksik nekrotizan faktör-1, üropatojenik E. coli’lerde en iyi
tanımlanış olan virulens faktörlerinden biridir.
Kromozomal olarak kodlanan CNF-1, sıklıkla alfa
hemolizin ile beraber üretilir. Üriner sistem infeksiyonlarında CNF-1’in spesifik rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Genel olarak CNF-1 üretimi
infeksiyonu tetikler. Ayrıca konak hücre fonksiyonlarında ve morfolojisinde bozukluklar, hücre siklusunun durdurulması ve hücre lizisine neden olurlar.
Deneysel amaçlı olarak yapılan çalışmalarda çeşitli
ve çok sayıda histopatolojik değişikliklere sebep
olduğu, fakat bakteriyel kolonizasyonla ilişkili olmadığı gözlenmiştir (1, 9, 10). CNF-1, idrar kesesi epitel hücrelerine tutunmayı ve invazyonu sağlar, nötrofil lökositleri öldürme kapasitesini artırır,
yangısal reaksiyonlara neden olur ve üriner sistem
epitel hücrelerini apoptozis mekanizması ile öldürür
(9, 10).
Serum direnci
Bakteriler, normal serumda bulunan komplement
sistemi aktivitesi tarafından öldürülmektedirler. Antikor yokluğunda komplement sistemin klasik yolu,
lipid A tarafından aktive edilir. Lipid A, hücre duvarında lokalize olur (10).
Serumun öldürücü etkisine karşı bakterilerin
duyarlılığı, serum inkübasyonundan sonra bakterilerin tekrar üremeleri veya dilüe edilmiş serum
konsantrasyonlarında üretilmelerine bakılarak belirlenir. 1/16’dan büyük serum dilusyonlarının bakterilerin ölümüne neden olan komplement aktivitesi
için yetersiz olduğu saptanmıştır (10).
Üropatojenik E. coli’lerin antijenik özellikleri
a) Somatik ‘’O’’ antijeni: Somatik ‘’O’’ antijenleri polisakkarit özelliğinde olup, ısıya dirençli yüzey antijenleridir. E. coli’lerin serogruplandırılmasında önem taşırlar. Makro ve mikro aglütinasyon
testleriyle ortaya konulabilirler. Ancak kapsüler ve
fimbrial antijenlere sahip E. coli’lerde, somatik antijenlerin ortaya konulması güçlük yaratmaktadır.
Bu nedenle bu tür suşlar 120°C’de 2 saat ısıtıldıktan
sonra aglütinasyona tabi tutularak somatik ‘’O’’ antijeni tespit edilir (10).
‘’O’’ antijen polisakkaritlerinin diziliş sıralarının değişmesiyle serumdaki komplement aktivasyonunun neden olduğu lizise karşı koruma sağlanabilir. Üropatojenik E. coli’lerin antijenik yapıları
oldukça komplekstir ve serolojik olarak tiplendirmede de büyük öneme sahiptirler (10).
Üropatojenik E. coli’lerin serogruplandırılması
spesifik O-polisakkarit antijenlerle yapılmaktadır.
Üropatojenik E. coli’ler sık kullanılan O antiserumları ile tiplendirilebilirler (10).
b) Flagella antjeni: Flagellar ‘’H’’ antijenleri, hareketli suşlarda bulunmakta olup protein yapısında
ve ısıya dayanıksızdırlar. Flagella, hücre duvarından köken alan, kemotaksis ve hareketi sağlayan
organeldir. Bazal cisimcik, dirsek ve filamentten
oluşur. Flagella sentezi için gerekli olan genler üç
sınıf altında toplanırlar. Birinci sınıf genler, sınıf 2
genlerinin transkripsiyonu için gerekli transkripsiyon faktörü kodlarlar. Bunlar flhDC genleridir. Sınıf 2 genler, bazal cisimciği kodlarlar ve bunlara ek
olarak sınıf 3 genlerin transkripsiyonu için spesifik
olan fliA ve fliM genlerini içerirler. Sınıf 3 genler
ise hareket ve kemotaksis için gerekli olan filament
93
ve protein ilişkili genleri kodlarlar ve fliC olarak
isimlendirilirler. Ozmolarite ve pH gibi çevresel
koşullara bağlı olarak E. coli’nin flagella sentezlemesi regüle edilebilmektedir. Optimal ve artan ozmolarite ile düşük pH seviyeleri (pH 5.5) kombine
edildiğinde flagella sentezlenmektedir. Moleküler
yöntemlerle flagella sentezinde görev alan tüm bu
genler tespit edilmektedir. Serolojik olarak ise özel
olarak hazırlanmış E. coli spesifik poli H antiserumları veya spesifik H antiserumları kullanılarak aglütinasyon testleri ile ortaya konulurlar (13, 16).
c) Kapsül antijeni: Kapsüler ‘’K’’ antijenleri polisakkarit (N-asetil neuramik asit) özelliğinde olup,
kapsül taşıyan E. coli suşlarında ‘’O’’ somatik antijeninin üzerinde bulunur. Kapsüler polisakkaritler
karbonhidratlar, aminoasit ve lipid bileşenlerine
göre 80’den fazla tipe ayrılmaktadır. Kapsüler tiplerin belirlenmesinde K-spesifik fajlar kullanılmaktadır. Ayrıca tavşan anti kapsüler antiserumları ile de
belirlenebilmektedir. Serogruplandırmada önemli
olan bu antijenler iki önemli komponentten oluşur.
Bunlardan birincisi olan K(A) antijenleri 120°C’de
2 saatte tahrip olurlar. İkinci komponent olan K(B)
antijenleri ise 100°C’de tahrip olurlar ve polisakkarit yapıdadırlar (8, 10). Bakteriye antifagositik
özellik kazandırarak polimorf nuklear lökositlerin
fagositik aktivitelerinden kurtulmayı sağlarlar. Ayrıca kapsüler polisakkaritler C3 konvertaz enziminin
formasyonunu etkilerler ve komplement aktivasyonunu bloke ederler (10).
Üropatojenik E. coli infeksiyonlarındaki major
serogruplar
Kedi ve köpeklerden fekal ve ekstra-intestinal olarak izole edilen E. coli’lerden yapılan serolojik tiplendirme çalışmasında O2, O4, O6, O8, O9, O22,
O35, O75 ve O83 grupları fekal ve ekstra-intestinal
izolatlar arasında yani üropatojeniklerde dominant
olarak bulunmuştur. Bu gruplar arasında da en sık
izole edilenler O4 ve O6 gruplarıdır (2). Kedi ve
köpeklerin üropatojenik ve fekal E. coli’lerinde enterotoksin ve shiga-toksin tespit edilmemiştir (2).
Kedi ve köpeklerin fekal ve ekstra-intestinal
infeksiyonlarından elde edilen E. coli suşlarının
serogrup düzeyinde belirlenmesinin yanı sıra virulens faktörleri ile ilişkileri de belirlenmiştir (4). Alfa
hemolizin, P fimbria, CNF-1 üretimi ve aerobaktin
gibi tipik virulens faktörleri saptanmıştır (2). O4:H5
ve O6:K13:H1 yüksek oranda P fimbria’ya sahip
olan serotiplerdir (1).
94
Patogenezis
E. coli’lerde patogenezis aşağıda belirtilen 3 aşamada gerçekleşir.
a) Kolonizasyon: İnfeksiyonun meydana gelebilmesi için bakterilerin konak doku ve hücrelerine invaze olması ve burada kalıcı olması gerekmektedir.
Üropatojenik E. coli’ler üriner sistem epitel hücrelerine invaze olabilirler ve hücrelerin içerisinde
çoğalabilirler. Bu durum E. coli’nin immun sistemden korunup yaşamasını sağlar. E. coli, adezyonu
sağlayan organelleri ile idrar kesesi ve böbreklerde
kolonize olabilir (18).
b) Bakteriyel üreme: İdrar kesesine kolonize olan
bakterilerin infeksiyon oluşturabilmesi için bakteriyel üremenin gerçekleşmesi gerekmektedir. Kimyasal kompozisyon, ozmolarite ve idrarın pH’sı bakteriyel üremeyi etkiler. Ayrıca, idrarda aminoasit
ve glukoz yeterli konsantrasyonlarda ise bakteriyel
üreme stimüle olur. Üre ve organik asitler gibi diğer bileşenler ise bakteriyel üremeyi inhibe ederler
(22).
c) Doku hasarının oluşması: Üropatojenler idrar
kesesi epitelinde yeterli populasyona ulaştıklarında
semptomatik hasarlar meydana getirirler. E. coli,
özellikle sitotoksik alfa hemolizin’i sayesinde doku
hasarı meydana getirir. Sitotoksik nekrotizan faktör
ise protein toksinidir. Bakterilere ait olan ve patogeneziste rol oynayan faktörler, infeksiyon boyunca
yangısal cevabı stimüle ederler (22).
Üropatojenik E. coli infeksiyonlarında immun
yanıt
Bakteriler, üriner sistem epitel hücreleri ile temas
ettiğinde, immun sistem aktif hale gelerek immun
yanıt başlamaktadır. Bakteriye ait lipopolisakkarit
ve fimbria gibi virülens faktörleri epitel hücre reseptörlerinin aktivasyonuna neden olmaktadır (14,
23).
Konakçıya ait faktörler, doğal savunma mekanizmaları ve kazanılmış savunma mekanizmaları
olarak iki grupta toplanmaktadır. Doğal savunma
mekanizmaları, idrar akışı gibi genel savunma faktörleri, Tamm-Horsfall protein ve katyonik antimikrobiyal peptid olan defensinlerdir (14).
Vajinal ve periüretral kolonizasyon üriner sistem infeksiyonları için sıklıkla primer basamağı
oluşturur. Üropatojenler, üriner sisteme girdiğinde
karşılaştıkları ilk engel idrar akışıdır. Üst üriner sis-
temde idrar belirli periyotlar halinde kesede birikir
ve daha sonra dışarıya atılır. Bu şartlar normal olarak etkili bir temizlik mekanizmasıdır ve mukozal
yüzeyde bakteriyel kolonizasyonu engelleyerek patojenlerin yaşamasını önler. İdrarın rezidüel olarak
kalması veya anatomik anomaliler gibi nedenlerle
idrar akışının kesilmesi sonucu bakteriler kolonize
olabilirler. Doğal mekanizma, E. coli, Klebsiella
spp., Proteus mirabilis gibi sık rastlanan fimbrial
veya non-fimbrial adezinlere sahip üropatojenlerin
epitelde kolonizasyonunu engeller (9, 17, 18, 21,
22). İdrar kesesinde, müsin tabaka tarafından kese
transisyonel epitel hücrelerini bakteriyel adezyona
karşı korumak amacıyla glukozamin sekresyonu
vardır. Düşük pH, tuz ve üre, üriner sistemde bakteri yaşamını azaltıcı faktörlerdir (14).
Uromukoid (Tamm-Horsfall protein) olarak bilinen bir glikoprotein, Henle kulbu ve tubulus epitel
hücreleri tarafından sentezlenmektedir ve üropatojenik E. coli tarafından sentezlenen tip 1 fimbria için
adezyonu önleyici antiaderens bir faktördür (14).
Yüksek katyonik özellikte ve antimikrobiyal
peptidler olan defensinler moleküler yapılarına göre
alfa, beta ve teta olarak üç gruba ayrılırlar. Alfa ve
beta defensinler makrofaj, nötrofil, bronş epitel hücreleri, gastrointestinal sistem ve böbrek hücrelerinde bulunmaktadır. Patojenlere aşırı şekilde maruz
kalmış üriner sistem tarafından da sentezlenirler.
Bakteri, mantar ve bazı virusları öldürme yeteneğine sahiptirler. Mikroorganizmaların hücre duvarında bulunan anyonik reseptörlere tutunarak hücre
membranı fonksiyonlarını bozar, geçirgenliği artırır
ve hücrenin ölümüne neden olur. Ayrıca, nötrofil kemotaksisi ve IL- 8 üretimini sağlamaktadır (14).
Üriner sistem infeksiyonlarında antikorların
serumda belirlenmesi zordur. Ancak idrar kesesi
ve üretra’ da lokal antikorlar tespit edilmiştir. Lenf
sisteminden üriner sistemde bulunan lamina propria
tabakasına B lenfosit göçleri olur. Sekretör IgA’nın
rolü ise henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Fakat bu
antikorun bakteriyel kolonizasyonu engellediği ve
mukozaya bakterilerin yapışmasını azalttığı belirtilmiştir (14).
Laboratuvar tanısı
Üriner sisteme E. coli’nin kolonizasyonu sonrası klinik olarak semptomlar görülebilir. Kültür için idrar
örnekleri toplanırken alt üriner sistem bölümlerinde
diğer bakteriler tarafından kontaminasyon meydana
gelebilir. Bu nedenle idrar örnekleri hayvanlardan
kateterizasyon ile toplanabilir ve kontaminasyon
elimine edilmiş olur. Ayrıca ürinasyon sırasında da
hayvanlardan idrar örneği alınabilir (6).
İdrar örneği steril olarak alındıktan sonra direkt
ekim yapılır ve ayrıca santrifüje edilerek bakterilerin dibe çökmesi sağlandıktan sonra çöküntüden de
ekim yapılmalıdır (6).
İdrar kültüründe bakteri sayımı yapılarak infeksiyon olup olmadığı hakkında bilgi sağlanır. İdrar kültüründen bakteri sayımında 100.000 bakteri/
ml sınır olarak kabul edilir. 100.000 bakteri/ml’den
fazla bakteri sayıldığı durumlarda identifikasyon ve
duyarlılık testleri aşamasına geçilir (2, 6).
İdentifikasyon aşamasında klasik olarak kullanılan kanlı agar, Mac Conkey agar ve Eozin Metilen
Blue agardan farklı olarak üropatojenlere özel selektif besiyerleri kullanılmaktadır.
Bromtimol-blue Lactose Cystine Agar (CLED
Agar, Brolacin Agar), in vitro yapılan standart mikrobiyolojik analizlerde idrardaki bakterilerin sayımı
ve identifikasyonu için kullanılır. İdrar yolları infeksiyonlarının belirlenmesi için önerilen katı bir besi
yeridir. Bileşiminde pepton, maya ve et ekstraktları, laktoz, L-sistin, bromtimol mavisi ve agar-agar
bulunur. Normal rengi yeşil olan besi yerinin pH’sı
7.3’tür. 35°C’de 18-24 saat inkubasyondan sonra E.
coli’nin laktozu fermente edebilme özelliğinden dolayı asidik pH meydana gelir ve E. coli etrafı sarı
zonlu altın sarısı renkli koloni oluşturur (20).
Ayrıca Urichrom Agar ya da enzim-substrat
agar olarak da tanımlanan bir besi yeri üropatojenlerin izolasyonu ve identifikasyonu için geliştirilmiştir. E. coli, beta glukuronidaz enzimi sentezler
ve agarın bileşiminde bulunan kromojenik substrat
olan beta glukuronidi parçalayarak küçük pembe
renkli koloniler oluşturur (15).
Ayrıca, moleküler teşhis yöntemleri kullanılarak E. coli’nin sahip olduğu virülens faktörleri, bu
faktörleri kodlayan genlere (papA, fimH, focG, drb,
sfa, cnf1, iut, hlyA) spesifik primerler yardımıyla
belirlenebilir (12, 24).
Sağaltım ve korunma
Antibiyotiklerin idrardaki konsantrasyonları plazmadaki konsantrasyonlarından daha önemlidir.
Çoğu antibiyotik böbreklerin yaptığı eliminasyonu
geçer, buna bağlı olarak idrarda pik seviyeye ula-
95
şır. Kullanılacak antibiyotik seçiminde antibiyotiğin
etki spektrumu ve idrardaki konsantrasyonun yanında, uygulama yolu, yan etkileri ve fiyatı da göz
önünde bulundurulmalıdır. Özellikle erkek köpeklerde, antibiyotiklerin prostat sıvısındaki aktiviteleri
de değerlendirilmektedir. Prostat sıvısı plazmadan
daha asidiktir ve antibiyotikler kan- prostat bariyerini geçtikten sonra iyon formuna geçebilirler.
Kültür ve antibiyotik duyarlılık testleri sonucunda
duyarlı olan antibiyotikler idrardaki minimal inhibitör konsantrasyonları ile karşılaştırılarak en etkili
antibiyotik seçilmelidir (3).
Ampisilin ve amoksisilin bakterisidal etkili ve
Penisilin G’ye göre toksik olmayan ve etki spektrumları daha geniş antibiyotiklerdir. Yüksek idrar
konsantrasyonuna ulaştıklarında E. coli üzerine etkili olabilirler. Ampisilinin absorpsiyonu oral yolla
daha iyi sağlanmaktır ve bu sebeple amoksisiline
oranla daha etkilidir. Diğer yandan penisilin grubu
antibiyotikler zayıf asit karakterde olduklarından
prostat sıvısında etkili olamamaktadırlar (3).
Amoksisilin-klavulanik asit kompleksi Gram
negatif bakteriler üzerinde daha geniş bir spektruma
sahiptir. Klavulanik asit, beta laktamaz enzimine irreversible olarak bağlanır ve bakteriyel patojenler
ile amoksisilin arasında bağlantı kurar. Bu kombinasyon, beta laktamaz sentezleyen E. coli’lerin neden olduğu infeksiyonlarda oldukça etkilidir (3).
Sefalosporin grubu antibiyotikler, beta laktamazlar üzerine penisilinlerden daha etkilidirler ve
E. coli infeksiyonlarında da çok kullanılmaktadırlar.
Seftiofur, enjeksiyon yoluyla uygulanan bir sefalosprin grubu antibiyotiktir ve özellikle köpeklerde E.
coli tarafından meydana getirilen üriner sistem infeksiyonlarında etkilidir. Enjeksiyon sonrası seftiofur hızlı bir şekilde desfuroylseftiofura metabolize
olur ve bu metabolit farklı bir etki mekanizmasına
sahiptir. E. coli üzerine minimal inhibitorik konsantrasyonu 4 µg/ml’dir (3).
Trimetoprim/sülfonamid sinerjik etki gösteren
iki farklı antibiyotikten oluşur. Trimethoprim bakteriyostatik etkili olup yarılanma ömrü iki buçuk
saattir. Sülfonamidler bakteriyostatik etkili ve asidik karakterdedir ve yarılanma ömürleri uzun olup
6-24 saat arasındadır. Kan-prostat bariyerini geçmesine rağmen irin içerisinde inaktive olur. Bu sinerjistik kombinasyon E. coli üzerine bakterisidal etki
gösterir. Kronik düşük doz tedavilerde kemik iliği
96
supresyonu ve keratokonjuktivitis gibi yan etkilere
neden olmaktadır (3).
Üriner sistem infeksiyonlarında antibiyotik sağaltımı, hastaya, antibiyotiklerin etki mekanizması
ve spektrumlarına ve bakteriyel virulens faktörlerine bağlıdır. Florokinolonlar ve aminoglikozid grubu
antibiyotikler kısa süreli sağaltımlar için uygundur.
Prostatitis, piyelonefritis veya idrar taşları ile birlikte meydana gelen infeksiyonlarda 4-6 hafta süreli
antibiyotik sağaltımına gerek duyulur (3).
Eğer üriner sistem infeksiyonları yılda bir veya
iki kez meydana geliyorsa, akut komplike olmamış
olgular olarak değerlendirilip sağaltılabilirler. Eğer
daha sık olarak meydana geliyor ve predispoze faktörler belirlenemiyorsa kronik düşük doz sağaltım
uygulanır. Kronik düşük doz sağaltımda amoksisilin, ampisilin, amoksisilin-klavulanik asit, sefalosporin grubu antibiyotikler kullanılabilir. Trimetoprim/sülfonamid kombinasyonu da kullanılabilir
fakat kemik iliği supresyonu ve keratokonjuktivitis
yan etkilerini önlemek amacıyla folik asit ilavesi
yapılır. Kronik düşük doz sağaltım süresince her 4-6
haftada bir idrar kültürü tekrarlanır. Kültür sonucu
negatif çıksa bile tedaviye 6 ay boyunca devam edilir. Fakat tekrarlayan infeksiyonlar göz önünde bulundurularak sağaltım yıllarca devam ettirilebilir. Bu
infeksiyonlar daha önceden idrarda bulunan çeşitli
bakteri türlerinden kaynaklanmaktır. Bu bakteriler,
özellikle, yetersiz antibiyotik dozu uygulamalarında antibiyotiklere karşı direnç kazanarak infeksiyon
oluştururlar (3).
Üriner sistem infeksiyonlarından izole edilen
E. coli’lerin hücre duvarı proteinleri iki boyutlu jel
elektroforez yöntemiyle ayrıştırılmış ve 23 hücre
duvarı antijeni elde edilmiştir. Bu antijenler, antiserumlar ve kütle spektrofotometre ile identifiye edilmiştir. Bu antijenler, infeksiyonun patogenezisinde
rol oynayan proteinleri de kapsamaktadır. Buna
bağlı olarak bu antijenlerden E. coli’nin neden olduğu üriner sistem infeksiyonlarına karşı aşı geliştirme çalışmaları yapılmaktadır (2).
Kaynaklar
1. Andreu A, Stapleton AE, Lockman HA, Xercavins M,
Fernandez F, Stamm WE, (1997). Urovirulence Determinants in Escherichia coli Strains Causing Prostatitis. J
Infect Dis. 176, 464- 469.
2. Beutin L, (1999). Escherichia coli as a pathogen in dogs and
cats. Vet Res. 30, 285- 289.
3. Dowling PM, (1996). Antimicrobial Theraphy of Urinary
Tract Infections. Can Vet J. 37, 438- 441.
4. Emody L, Kerenyi M, Nagy G, (2003). Virulence Factors of Uropathogenic Escherichia coli. Int J Antimicrob
Agents. 22, 29-33.
5. Gupta K, Stamm WE, (2005). Urinary Tract Infections.
http://www.medscape.com/viewarticle/505095,
Erişim
Tarihi: 20.04.2008.
6. Hamaide AJ, Martinez SA, Hauptman J, Walker RD,
(1998). Prospective Comparison of Four Sampling Methods (Cystocentesis, Bladder Mucosal swab, Bladder Mucosal Biopsy and Urolith Culture) to Identify Urinary Tract
Infections in Dogs with Urolithiasis. J Am Anim Hosp Assoc. 34, 423- 430.
7. Hooton TM, ( 2000 ). Pathogenesis of urinary tract infections: an update. J Antimicrob Chemother. 46, Suppl. S1,
1- 7.
8. İzgür M, (2006) Escherichia coli İnfeksiyonları. Aydın N,
Paracıkoğlu J. eds. Veteriner Mikrobiyoloji (Bakteriyel
Hastalıklar). İlke-Emek Yayınları, Ankara. p. 110- 116.
9. Johnson JR, (2003). Microbial virulence determinants and
the pathogenesis of urinary tract infection. Infect Dis Clin
N Am. 17, 261- 278.
10. Johnson JR, (1991). Virulence Factors in Escherichia coli
Urinary Tract Infection. Clin Microbiol Rev. 4(1), 80- 128.
11. Johnson JR, Thomas AR, (2002). Extraintestinal pathogenic Escherichia coli: ‘’ The other bad E. coli’’. J Lab Clin
Med. 139(3), 155- 162.
12. Johnson JR, Delavari P, Kuskowski M, Stell AL, (2001).
Phylogenetic Distribution of Extraintestinal Virulence-Associated Traits in Escherichia coli. J Infect Dis. 183, 7888.
13. Kathamegos N, (2004). The Role of Escherichia coli Flagella in Urinary Tract Infection. UW-L JUR. Volume VII
(Microbiology) 1- 4.
14. Kucheria R, Dasgupta P, Sacks SH, Khan MS, Sheerin
NS, (2005) Urinary tract infections: new insights into a
common problem. Postgrad Med. J. 81, 83- 86.
15. Laksmi V, Satheeshkumar T, Kulkarni G, (2004). Utility
of Urochrome II- A Chromogenic Medium for Uropathogens. Indian J Med Microbiol. 22, 153- 158.
16. Lane MC, Lockatell V, Monterosso G, Lamphier D,
Weinert J, Hebel JR, Johnson DE, Mobley HLT, (2005).
Role of Motility in the Colonization of Uropathogenic
Escherichia coli in the Urinary Tract. Infect Immun. 73,
7644- 7656.
17. Marrs CF, Zhang L, Foxman B, (2005). Escherichia coli
mediated urinary tract infections: Are there distinc uropathogenic E. coli (UPEC) pathotypes? FEMS Microbiol
Lett. 252, 183- 190.
18. Mulwvey MA, (2002). Adhesion and entry of uropathogenic Escherichia coli. Cell Microbiol. 4, 257- 271.
19. Ronald A, (2002). The Etiology of Urinary Tract Infection: Traditional and Emerging Pathogens. Am J Med. 113
(1A).
20. Sandys GH, (1960). A new method of preventing swarming
of Proteus sp.with a description of a new medium suitable
for use in routine laboratory practice. J Med Lab Technol.
17, 224- 233.
21. Silveira WD, Benetti F, Lancelotti M, Ferreira A, Solferini VN, Brocchi M, (2001). Biological and Genetic
Characteristics of Uropathogenic Escherichia coli Strains.
Rev Inst Med Trop S Paulo. 43(6), 303-310.
22. Sussman, M, Gally DL, (1999). The Biology of Cystitis:
Host and Bacterial Factors. Annu Rev Med. 50, 149- 158.
23. Svanborg C, Bergsten G, Fischer H, Godaly G, Gustafsson M, Karpman D, Lundstedt AC, Ragnarsdottir B,
97
Sevensson M, Wullt B, (2006). Uropathogenic Escherichia coli as a model of host- parasite interaction. Curr Opin
Microbiol. 9, 33- 39.
24. Terai A, Yamamoto S, Mitsumori K, Okada Y, Kurazono H, Takeda Y, Yoshida O, (1997). Escherichia coli
Virulence Factors and Serotypes in Acute Bacterial Prostatitis. Int J Urol. 4, 289- 294.
25. Vranes J, Schonwald S, Sterk-Kuzmanovic N, Ivancic B,
(2001). Low Virulence of Escherichia coli Strains Causing
Exacerbation Of Chronic Pyelonefritis. Acta Clin Croat.
40, 165-170.
98
Yazarlara Bilgi / Instructions for Authors
99
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi Yayım Koşulları
1. Dergi, TC Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Etlik Merkez Veteriner
Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nün hakemli, bilimsel
yayın organı olup, yılda iki defa yayımlanır. Derginin kısaltılmış
adı “Etlik Vet Mikrobiyol Derg” dir.
2. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde veteriner hekimlik
alanında yapılan, başka bir yerde yayımlanmamış olan orijinal bilimsel araştırmalar, güncel derleme, gözlem, kısa bilimsel çalışmalar ve enstitüden haberler yayımlanır. Derleme şeklindeki yazılar;
orijinal olması, en son yenilikleri içermesi, klasik bilgilerin tekrarı
olmaması durumunda kabul edilir. Derlemeyi hazırlayan yazarın, o
konuda ulusal ya da uluslararası düzeyde orijinal yayın ve araştırmalar yapmış olması koşulu aranır.
3. Türkçe ve İngilizce olarak hazırlanacak metinler 12 punto Times
New Roman yazı karakterinde, düz metin olarak, çift aralıklı ve
kenarlarda 30 mm boşluk bırakılarak, A4 formundaki beyaz kağıda
yazılmalıdır. Yazıların tamamı, şekil ve tablolar dahil olmak üzere
orijinal bilimsel araştırmalarda 16, derlemelerde 10, gözlemlerde 6
ve kısa bilimsel çalışmalarda 4 sayfayı geçmemelidir.
4. Microsoft Word formatındaki metin ile en az 300 dpi çözünürlükteki JPEG formatındaki resim/lerin tamamı bir CD’ye kopyalanarak; metin ise dört nüsha (sadece bir kopyasında yazar/lar ve
yazar/lara ait bilgilerin bulunduğu) olarak yayın kuruluna gönderilmelidir.
5. Türkçe orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, İngilizce başlık, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar sırası ile hazırlanmalıdır.
İngilizce orijinal çalışmalar konu başlığı, yazar/yazarların adları,
adresleri, İngilizce özet ve anahtar sözcükler, Türkçe başlık, Türkçe özet ve anahtar sözcükler, giriş, materyal ve metot, bulgular,
tartışma ve sonuç, teşekkür ve kaynaklar şeklinde hazırlanmalıdır.
Kısa bilimsel çalışmaların ve derlemelerin başlık ve özet bölümleri
orijinal çalışma formatında, bundan sonraki bölümleri ise, derlemelerde; giriş, metin ve kaynaklar şeklinde, kısa bilimsel çalışmalarda
ise bölümlendirme yapılmadan hazırlanmalıdır.
6. Orijinal çalışmalar ve gözlemler aşağıdaki sıraya göre düzenlenerek yazılmalıdır.
Başlık, kısa, konu hakkında bilgi verici olmalı ve küçük harflerle
yazılmalıdır.
Yazar(lar)ın, ad(lar)ı küçük, soyad(lar)ı büyük harflerle yazılmalı
ve unvan belirtilmemelidir.
Özet, Türkçe ve İngilizce olarak, tek paragraf halinde ve en fazla
500 sözcük olmalıdır.
Anahtar kelimeler, alfabetik sıraya göre yazılmalı ve 5 sözcüğü
geçmemelidir.
Giriş, konu ile ilgili kısa literatür bilgisi içermeli, son paragrafında
çalışmanın amacı vurgulanmalı ve iki sayfayı geçmemelidir.
Materyal ve Metot, ayrıntıya girmeden, anlaşılır biçimde yazılmalıdır. Başlıklar kalın, alt başlıklar italik yazı tipiyle belirtilmelidir.
Bulgular bölümünde veriler, tekrarlama yapmadan açık bir şekilde
belirtilmelidir. Tablo başlıkları tablonun üstünde, şekil başlıkları
ise şeklin altında belirtilmelidir.
Tartışma ve Sonuç bölümünde, araştırmanın sonucunda elde edilen bulgular, diğer araştırıcıların bulguları ile karşılaştırılmalı ve
literatüre olan katkısı kısaca belirtilmelidir.
Teşekkür bölümü, gerekli görülüyorsa kaynaklardan hemen önce
belirtilmelidir.
Kaynaklar bölümünde, kaynaklar listesi alfabetik ve kronolojik
olarak sıralanmalı ve numaralanmalıdır. Metin içerisindeki kaynak,
yazar soyadı yazılıp sıra numarası ile; cümle sonunda ise sadece
sıra numarası ile parantez içerisinde yazılmalıdır. Cümle sonunda
birden çok kaynak belirtilecek ise kaynak numaraları küçükten bü-
yüğe doğru sıralanmalıdır. Metin içerisinde ikiden çok yazarlı kaynak kullanımlarında ilk yazarın soyadı yazılmalı diğer yazarlar ise
“ve ark.” (İngilizce metinlerde “et al.”) kısaltması ile belirtilmelidir. Dergi adlarının kısaltılmasında “Periodical Title Abbreviations:
By Abbreviation” son baskısı esas alınmalıdır. Kaynaklar listesinde
yazar(lar)ın aynı yıla ait birden fazla yayını varsa, yayın tarihinin
yanına “a” ve “b” şeklinde belirtilmelidir.
Kaynak yazımı ve sıralaması aşağıdaki gibi yapılmalıdır;
Süreli Yayın:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201 (5), 709-713.
Yazarlı Kitap:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
Editörlü Kitap:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
Editörlü Kitapta Bölüm:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
Kongre Bildirileri:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
Tezler:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve immunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. Doktora Tezi, AÜ
Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Anonim:
Anonim, (2009). Contagious equine metritis. Erişim adresi: http://
www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdf, Erişim tarihi: 17.10.2009.
Peter AT (2009). Abortions in dairy cows. Erişim adresi: http://
www.wcds.afns.ualberta.ca.htm, Erişim tarihi: 14.11.2009.
Yazışma adresi, çok yazarlı çalışmalarda yazışma adresi olarak
yazarlardan sadece birinin adı/soyadı, adresi ve e-posta adresi çalışmanın sonunda belirtilmelidir.
7. Latince cins ve tür isimleri italik yazı tipi ile yazılmalıdır. Tüm
ölçüler SI (Systeme Internationale)’ye göre verilmelidir.
8. Dergide yayımlanmak üzere gönderilen makaleler tüm yazarlar
tarafından imzalanan “Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi” ve başvuruya ilişkin bir dilekçe ile birlikte gönderilmelidir. Yayımlanması
uygun görülen çalışmalar, istendiğinde Yayım Komitesi’nin basıma
ilişkin kararı, yazar(lar)ına bildirilir.
9. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’nde yayımlanacak olan,
hayvan deneylerine dayalı bilimsel çalışmalarda “Etik Kurul Onayı
Alınmıştır” ifadesi aranır.
10. Gönderilen yazıların basım düzeltmeleri orijinal metne göre yapıldığından, yazıların her türlü sorumluluğu yazarlara aittir.
11. Ürünlerin ticari adları ile karşılaştırılmalarına yönelik araştırmalar derginin ilgi kapsamı dışındadır.
12. Araştırmaya konu olan maddelerin ve ürünlerin ticari adları
kullanılmamalıdır.
13. Şayet varsa araştırmanın desteklendiği kurum adı ve proje numarası belirtilmelidir.
14. Dergiye gönderilen yazılar geliş tarihine göre yayımlanır.
15. Yayımlanmayan yazılar, yazarına iade edilmez.
100
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Publication Conditions
1. The Journal is a refereed, scientific publication of Turkish Republic of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Directorate
of Etlik Central Veterinary Control and Research Institute and is
published two issues in a year. The abbreviation of the journal is “J
Etlik Vet Microbiol”.
2. In the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, original research
articles, actual reviews, case reports, short communications on the
issue of veterinary medicine whose one part or whole have not been
published in any other place before, and news from the institute
are published. The review articles will be accepted only if they are
original, actual and not repeating the classical knowledge. The author of the review is asked to possess original publications or researches on the subject at national or international levels.
3. Manuscripts that will be prepared in Turkish and English should
be typed as a full text, on A4 paper with 12 pt, in Times New Roman typing character, double-spaced and with 30 mm space in both
sides of the paper. Manuscripts including figures and tables should
not exceed 16 pages for original research articles, 10 pages for reviews, 6 pages for case reports and 4 pages for short communications.
4. Manuscript written in Microsoft Word format and figures in
JPEG format at minimum 300 dpi resolution should be sent in one
CD. Also four copies of manuscript [only one copy must include
the name(s) and information about author(s)] should be sent to the
edition board.
5. Original research articles and case reports should include in following rank: title, name(s) of the author(s), their addresses, abstract
and key words in English, title, abstract and key words in Turkish,
introduction, material and method, findings, discussion and conclusion, acknowledgements and references. In short communications
and reviews, divisions except summaries should be omitted.
6. Original research articles and case reports should be arranged
and composed as in the following.
Title should be brief, explanatory and written in small caps.
Explanation(s) about the study should be written as footnotes.
Author(s) should be mentioned by their names and surnames; their
surnames should be written in capital letters and author(s) title
should not be mentioned.
Summary should be in Turkish and English, single paragraph and
composed of at most about 500 words.
Key Words should be written in alphabetical order and should not
exceed 5 words.
Introduction not exceeding two pages should include a short review of the literature related with the subject and in the end paragraph; the aim of the study should be mentioned.
Material and Method should be written in an essential and comprehensible manner without getting into details. Subtopics should
be mentioned first in bold and after in italic type.
Findings should be shortly explained and data should not be repeated within the text. Legends should be indicated at the top of
each table, whereas should be indicated at the bottom of each figure
and print. Vertical lines are not allowed in tables.
Discussion and Conclusion must include the evaluation and comparison of results with other researchers’ findings. The study’s
contributions to the existing literature should also be explained
briefly.
Acknowledgements must be indicated before references if necessary.
References should be listed alphabetically and chronologically by
numbers. In the body of text, reference must be shown by author’s
surname and list number or only by list number within parenthesis. If there is more than one reference that refers to the same issue, these should be arranged by smallest to biggest reference list
numbers at the end of sentence. If the reference is more than two
authors, the surname of the first author should be written and other
authors should be mentioned with the abbreviation of “et al.”. For
the abbreviation of journals, the latest edition of the “Periodical
Title Abbreviations: By Abbreviation” should be taken as basis. If
the author(s) have more than one publication within the same year,
besides the publication date, it should be mentioned as “a” and “b”
in the list of references.
The writing of the references and their alignment should be as in
the following examples.
For articles:
Dubey JP, Lindsay DS, Anderson ML, Davis SW, Shen SK,
(1992). Induced transplacental transmission of N. caninum in cattle. J Am Vet Med Ass. 201 (5), 709-713.
For books:
Fleiss Jl, (1981). Statistical methods for rates and proportions.
Second edition. New York: John Willey and Sons, p.103.
For edited books:
Balows A, Hausler WJ, Herramann Kl, eds., (1990). Manual of
Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC: IRL Press,
p.37.
For chapter in edited books:
Bahk J, Marth EH, (1990). Listeriosis and Listeria monocytogenes. Cliver DD. eds. Foodborne Disease. Academic press Inc,
San Diego. p.248-256.
For congress papers:
Çetindağ M, (1994). Pronoprymna ventricosa, a new digenic
trematoda from the Alosa fallax in Turkey. Eighth International
Congress of Parasitology (ICOPA VIII), October, 10-14, İzmirTurkey.
For dissertations:
Aksoy E, (1997). Sığır Vebası hastalığının histolojik ve İmmunoperoksidaz yöntemle tanısı üzerine çalışmalar. PhD Thesis, Ankara
University Institute of Health Sciences, Ankara.
Corresponding address, in multiple-author studies, as a correspondence address, only one of the authors’ name/surname, address
and e-mail should be mentioned at the end.
7. Genus and species names in Latin should be written in italic. All
measures should be given according to the SI (Systeme Internationale) units.
8. The articles that are sent to be published in the journal should be
sent with a covering letter and “Publication Rights Transfer Agreement” signed by all of the authors. The selected articles for the
publication, and if asked for, the decision of the editorial committee concerning the publication, are declared to the article’s author/
authors.
9. The wording of “Ethical Commission Permission is obtained”
should appear in scientific studies based on animal experiments,
which will be published in the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
10. As the edition of the sent articles are done in accordance with
the original text, all responsibility of the articles bear on the authors.
11. Researches that aim at comparisons of the products with their
commercial names are out of the journal’s theme scope.
12. The trade marks of materials and products that are subject of the
research should not be mentioned.
13. If the research is supported by a foundation, name of the foundation and project number must be mentioned.
14. The articles that are sent to the journal are published in line with
their coming date.
15. Unpublished papers are not returned to their author.
101
Yayın Hakkı Devri Sözleşmesi
Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi - Ankara
Aşağıda başlığı bulunan ve yazarları belirtilen makalenin tüm sorumluluğu Etlik Veteriner Mikrobiyoloji
Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı’na ulaşıncaya kadar yazar/larına aittir.
Yayının adı: ......................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazar/ların ad/ları: ...........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Aşağıda isim ve imzaları bulunan yazarlar; yayınlamak üzere gönderdikleri makalenin orijinal olduğunu,
daha önce başka bir dergiye yayınlanmak üzere gönderilmediğini ve kısmen ya da tamamen yayınlanmadığını, gerekli düzeltmelerle birlikte her türlü yayın hakkının, yazının yayımlanmasından sonra Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devrettiklerini kabul ederler. Yayımlanmak üzere gönderilen bu makalenin
tüm sorumluluğunu da yazar/lar üstlenmektedir.
Yukarıdaki makalenin tüm hakları Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi’ne devredilmiştir.
Yazar ad/ları
İmza
Tarih
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Yazışma Adresi: ...............................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Copyright Release
Journal of Etlik Veterinary Microbiology Ankara - TURKEY
The undersigned authors release Journal of Etlik Veterinary Microbiology from all responsibility concerning the manuscript entitled;
Title of paper: . .................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Authors names: ................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Upon its submission to the publishing commission of the Journal of Etlik Veterinary Microbiology.
The undersigned author/s warrant that the article is original, is not under consideration by another journal,
has not been previously published or that if has been published in whole or in part, any permission necessary to publish it in the above mentioned journal has been obtained and provided to the Journal of Etlik
Veterinary Microbiology. We sign for and accept responsibility for releasing this material.
Copyright to the above article is hereby transferred to the Journal of Etlik Veterinary Microbiology, effective upon acceptance for publication.
To be signed by all author/s
Authors names
Signature
Date
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Correspondence Address: ................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
102

21 Number: 2 2010 2010_2

Transkript

Benzer belgeler

İnsan elİyle üretİlen ölümcül vİrüs İnsan elİyle üretİlen

Makaleyi PDF Olarak İndirmek İçin Tıklayın...!

evren sezgin_tez - Adnan Menderes Üniversitesi

Volume 25 Number 1 2014 - Veteriner Kontrol Enstitüsü

26. arkeometri sonuçları toplantısı

18 Number: 1-2 2007 2007

Ev Dışı Tüketim

EGİAD Yarın 43. Sayı

Süt Ürünleri Satışına Ambalaj Dopingi

7. Ulusal Zootekni Öğrenci Kongresi

çomü - ziraat fakültesi dergisi - Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

8. Ulusal Zootekni Bilim Kongresi

İndir - Diyarbakır Kitapları