Tümöre Spesifik Eksopeptidazlar Tarafından

Proteomiks ve Protein Belirteçler
Clinical Chemistry 56: 2 ; 262-271 (2010)
Tümöre Spesifik Eksopeptidazlar Tarafından Serum Proteinlerinden Laboratuvar
Ortamında Üretilen Peptitler Over Kanserinin Yararlı Biyobelirteçleri Değildir.
Peptides Generated Ex Vivo from Serum Proteins by Tumor-Specific Exopeptidases
Are Not Useful Biomarkers in Ovarian Cancer
John F. Timms,1*† Rainer Cramer,2† Stephane Camuzeaux,1 Ali Tiss,2 Celia Smith,2 Brian
Burford,3 Ilia Nouretdinov,3 Dmitry Devetyarov, 3 Aleksandra Gentry-Maharaj,1 Jeremy
Ford,1 Zhiyuan Luo, 3 Alex Gammerman,3 Usha Menon,1 and Ian Jacobs 1
GİRİŞ: Serum peptidomu tanısal kanser biyobelirteçlerinin
değerli bir kaynağı olabilir. Öncel kütle spektrometrisi (MS)
incelemeleri farklı kanser tiplerini ayırt edici ilgili peptit
gruplarının tümöre spesifik eksopeptidazlar tarafından
laboratuvar ortamında (ex vivo) bol miktarda bulunan serum
proteinlerinden üretildiğini ileri sürmüştür. Over kanserini iyi
huylu oluşumlardan ve sağlıklı kontrollerden ayırt eden
benzer peptitlerin bulunup bulunmayacağını test etmek için 2
tamamlayıcı serum profili stratejisini test ettik.
dereceleri sağlamıştır. Modellerin bir kör çalışma test
setinde validasyonu sonucu % 71 ( kötü huylu ve
sağlıklı olgular) ve % 65’e (kötü huylu ve iyi huylu
oluşumlar) varan tanısal doğruluk dereceleri elde
edilmiştir.
SONUÇLAR: Over kanseri tanısını doğrulamak için yalnız
başına
değişik MALDI-TOF MS peptit profilleri
kullanılamaz.
© 2009 American Association for Clinical Chemistry
YÖNTEMLER: Sağlıklı gönüllüler ve hastalardan benzer
şekilde toplanmış ve işlenmiş serum numunelerini 2
merkezde MALDI-TOF MS profil testinden önce
oktadesilsilan kaplı manyetik boncuklar ve ayrı ayrı Zip
Tips üzerinden otomatik polipepeptit ekstraksiyon
işlemine tabi tuttuk. İki platform karşılaştırılmış, olgu
kontrol profili verileri analiz edilerek bozulmuş MS
pik intensiteleri saptanmıştır Test veri setlerinden
oluşturulmuş modelleri her iki yöntem için bir körçalışma test setini sınıflandırma yetileri açısından test
ettik.
BULGULAR: Her iki profil oluşturma platformunun
değişkenlik katsayıları (CV) yaklaşık % 15 olup klinik
numunelerin yüksek hacimli analizlerine uygulanabilirdi.
Oluşturulan 2 yöntem birbirleriyle örtüşen peptit
profillerine sahip olup kitlelerin farklı bölgelerindeki
pik intensitelerinde bazı farklılıklar mevcuttu. Çapraz
validasyonda, test verileriyle oluşturulan modeller
ayırıcı tanı açısından over kanserleri ile sağlıklı
kontrollerin ayrımında % 87, iyi ve kötü huylu
numunelerin ayrımında ise % 81’e varan doğruluk
Institute for Women’s Health, University College London, UK; 2 BioCentre and
Department of Chemistry, University of Reading, UK; 3 Computer Learning
Research Centre, Royal Holloway, University of London, UK.
* Address correspondence to this author at: Cancer Proteomics Laboratory,
Institute for Women’s Health, University College London, Cruciform Building
1.1.09, Gower St., London, WC1E 6BT, UK. Fax + 44-20-7679-6334; e-mail
[email protected].
† J.F. Timms and R. Cramer contributed equally to this work.
Received July 7, 2009; accepted November 10, 2009.
Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2009.133363
1
262
-----------------------------------------------------------------------------------
Her yıl 204 000 yeni over kanseri olgusuna tanı
konmaktadır (1). Hastalığa tanınabilir semptomların
ve güvenilir tarama yöntemlerinin yokluğu dolayısıyla
geç tanı konmaktadır Başvuru sırasında hastaların %
70’inden fazlasında hastalık pelvis dışına yayılmıştır
(III. Evre) (Uluslararası Jinekolojik ve Obstetrik
Federasyonu [ International Federation of Gynecology
and Obstetrics (FIGO)4]. Semptomatik hastalar için
başlıca tanısal testler transvajinal ultrasonografi ve
serum kanser antijeni 125’dir (CA-125). Ancak
mezotelden türemiş başka dokular da CA-125
üretmekte olup iyi huylu klinik durumlar ve başka
kanserlerde de artabilmektedir. Erken evre tümörlerin
hepsi CA-125 üretmediklerinden yalancı negatif
sonuçlar da oluşabilmektedir (3). Sonuçta erken evre
over kanserinin saptanması ve tanı konmasında daha
iyi biyobelirteçlere gerek vardır (4).
4
Nonstandard abbreviations: FIGO, International Federation of Gynecology and
Obstetrics; CA-125, cancer antigen 125; MS, mass spectrometry; SELDI-TOF,
surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight; MS/MS, tandem
MS; UCL, University College London; UCLH, University College London Hospital;
UKOPS, United Kingdom Ovarian Cancer Population Study; UKCTOCS, UK
Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening; TFA, trifluoroacetic acid; CHCA,
a -cyano-4-hydroxycinnamic acid; m/z, mass-to-charge; S/N, signal-to-noise ratio; C18, octadecylsilane; kNN, k-nearest neighbor algorithm; SVM, support
vector machine; ESI, electrospray ionization; UoR, University of Reading
MALDI-TOFMS ile OvariyumKanserBiyobelirteçleri
Bir over kanseri biyolojik belirtecinden istenen
performans karakteristikleri spesifik klinik kullanıma
bağlıdır.
Semptomatik
kadınlarda
başlangıç
tedavisinden önce iyi huylu pelvik kitleleri
kanserlerden ayırt etme amacıyla klinik açıdan
görüntüleme testleriyle birlikte halen belirteçler de
kullanılmaktadır. Bu endikasyon için bir belirtecin
mevcut testlerin performansını iyileştirmesi veya
katkıda bulunması gerekecektir.
Bu belirteçler
kombinasyon şeklinde semptomatik over kanserinin
tanınması açısından % 85-90 oranında tanısal
duyarlılığa, iyi huylu oluşumlar için % 85-90
özgüllüğe sahiptir (5). Ayrı ve daha iddialı bir klinik
kullanım asemptomatik over kanserinin erkenden
tanınması için tarama testleri uygulamak olacaktır.
Klinik öncesi asemptomatik kanser için CA -125 ve
ultrasonografi kullanan geniş çaplı çalışmalar % 8090 oranında tanısal duyarlılığa ulaşabilmektedir(6).
Asemptomatik postmenopozal kadınları taramanın
tanısal özgüllüğünün % 98’i aşması gerekecek, ikinci
basamak tarama
testi olarak ultrasonografi
kullanıldığında genel tanısal özgüllük % 99,6’yı
aşacaktır. Yeni kanser biyobelirteçlerini tanımlama
açısından serum polipeptitlerinin analizi umut verici
olup değişik proteomik yaklaşımlar kullanılmıştır
(7-9).Serum proteomu iddialı bir belirteç olup
proteomik profil yöntemiyle birkaç güçlü kanser
biyolojik belirteci tanımlanmıştır.
Kütle spektrometrisine (MS) dayanan profil
oluşturma yöntemiyle tanımlanmış aday belirteçlerin
çoğu bol miktarda bulunan akut faz proteinleri olup
(10, 11) doğru tanı için yararlı spesifik belirteçler
olmaları mümkün değildir (12). Sayısız çalışma
ayrıca numunenin işlenmesi sırasında oluşan
değişiklikleri vurgulamıştır (13-19). Pıhtılaşma
zamanında, geçiş zamanında, ortam ısısında,
depolamada, dondurma-çözündürme döngüleri ve tüp
tipindeki
farklılıklar biyolojik değişkenlikten
bağımsız olarak tümüyle serum profillerini
etkilemektedir. Bu değişiklikler esasen proteolizle
yönlendirildiğinden numunelerin hepsini benzer
işlemlerden geçirmek kritik önem taşımaktadır.
Analizin
yinelenebilirliği
ve
proteomik
biyobelirteçlerin keşfi için kullanılan sınıf ayırt edici
algoritmaların sağlamlığı konusunda kaygılar ortaya
atılmıştır (12, 20, 21).
MALDI-TOF MS ve yüzey güçlendirmeli lazer
dezorpsiyon/iyonizasyon zaman ölçerli (SELDI-TOF)
MS özellikle otomatik numune işleme cihazına
bağlandığında
çok
verimli
bir
profilleme
sağlamaktadır.
Kitlenin ağırlığıyla kısıtlanmış
olmasına rağmen MALDI-TOF MS düşük kütleli
serum ve plazma proteomlarının kompleks yapısını
açıklığa
kavuşturmuştur
(22).
Kombine
fraksiyonlanma, MALDI-MS profillemesi ve tandem
kütle spektrometrisi (MS/MS) dizinlemesinin yaklaşık
20 rutin plazma proteininden beklenmedik şekilde
türemiş 250’yi aşkın plazma peptidini tanımlamış
olması (23) proteolitik klivajların yaygın olduğunu
düşündürmektedir. Bazı proteinlerin klivaj kalıpları
farklı hastalık durumlarıyla ilişkilendirilmiştir (24 ).
Serum taşıyıcı proteinine bağlı peptidomun analizi (25)
peptitlerin Evre I over kanserlerini sağlıklı
deneklerden % 93’lük bir tanısal doğruluk derecesiyle
ayırt edebildiğini saptamıştır. Manyetik boncuklar
kullanan ters fazlı ekstraksiyon yöntemi serum
peptitlerinin profillerini çıkartabilmek için MALDITOF MS ile kombine edilmiş (26) daha sonra meme,
mesane ve prostat kanserini sağlıklı kontrollerden
ayırt edebilen peptit piklerini bulma amacıyla bu
kombine test uygulanmıştır (27). MS/MS ile her
kanser türü için ayırt edici peptitlerin tanımlanması,
bu peptitlerin bol miktarda bulunan serum
proteinlerinden oluşturulmuş ilgili peptit fragmanları
olduğunu ortaya koymuştur. Bu peptitlerin pıhtılaşma
sırasında
vücut
dışında
tümör
kökenli
eksopeptidazların serum konsantrasyonları veya
aktivitelerindeki değişiklikler sonucu oluşan temsili
belirteçler olduğu varsayılmıştır.. Over kanseri
olgularından alınan numunelerde benzer peptit
setlerinin değişikliğe uğrayıp uğramadığını, kontroller,
iyi ve kötü huylu oluşumlar arasında ayrım yapmak
için kullanılıp kullanılmayacağını araştırdık.
Gereçler ve Yöntemler
DENEKLER, NUMUNE TOPLAMA VE KULLANMA
Bu çalışma Üniversite Koleji Londra/ Üniversite
Koleji Londra Hastanesi İnsan Araştırmaları Ortak
Etik
Kurulu
(University
College
London
(UCL)/University College London Hospital (UCLH)
Committees on the Ethics of Human Research
(Committee A) (referans no: 05/Q0505/58) tarafından
onaylanmış, donörlerin hepsinden bilgilendirilmiş
yazılı onam alınmıştır. Hastaların kimliğini
tanımlamaya yönelik herhangi bir veri sağlanmamıştır.
Birleşik Krallık’ta 10 Ulusal Sağlık Hizmet Vakfından
(National Health Service Trusts) katılan kadınlar
Birleşik Krallık Over Kanseri Popülasyon Çalışmasına
(UK Ovarian Cancer Population Study [UKOPS])
alınmıştır. Hastalar jinekolojik onkoloji ana bilim
dallarından, sağlıklı gönüllüler ise UKCTOCS (UK
Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening
[Birleşik Krallık Ortak Over Kanseri Taraması)
çalışmasına katılmış kadınlardan seçilmiştir (6,28).
Over neoplazileri için ameliyat öncesinde hastalardan
serum numuneleri toplanmış, notlar ve histopatoloji
raporlarının bağımsız olarak gözden geçirilmesiyle iyi
veya kötü huylu over tümörü tanısı doğrulanmıştır.
Sağlıklı gönüllülerin soy geçmişinde over kanseri
olmadığı gibi izlem sırasında herhangi bir kanser
tanısı konmamıştır. Over kanseri (n=70), sınırda (n =
11) (29) veya iyi huylu over tümörü (n=89) tanısı
konmuş kadınlarla benzer yaşlarda sağlıklı
kontrollerden (n= 173) serum numuneleri alınmıştır.
Her grubun ortanca yaşları, yaş ortalamaları,
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
263
Table 1. Case control samples used for study.
Malignant
Participant
FIGO
stage I
FIGO
stage II
FIGO
stage III
FIGO
stage IV
Unstaged
Total
Benign
Healthy
Age, years
Median
Interquartile range
Mean
62.6
65.2
63.9
69.2
50.4–73.3
54.7–66.5
54.1–70.9
59.3–73.1
61.4
62.1
61.8
67.9
5
7
2
2
23
4
4
41.2
63.9
58.7
53.6–71.2
48.7–68.5
41.2
61.8
57.2
1
34
14
—
63.9
59.2–69.1
64.1
Malignant
Serous carcinoma
Endometrio
id
carcinoma
Mucinous carcinoma
5
Clear cell carcinoma
3
Mixed carcinoma
3
1
Transitional cell
carcinoma
2
2
Adenocarcinoma
(unspecified)
Borderline
1
7
1
7
1
4
1
3
2
9
2
Benign
89
Healthy
Total
173
33
6
34
histolojik alttipleri ve numune kod numaraları
Tablo 1’de ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
Numunelerin toplanması ve işlenmesinin esası
anlatıldığı gibidir (30).
POLİPEPTİT EKSTRAKSİYONU VE MALDI-TOF MS
‘PROFİLLEMESİ
Numuneleri iki seri halinde işledik ve inceledik:
1. seri (n = 129) 22 over kanseri, 43 iyi huylu tümörü
ve 64 sağlıklı kontrol numunelerinden, 2. seri
(n=214) 22 over kanseri (n= 46 iyi huylu tümörü, 109
sağlıklı kontrol,11 sınırda/düşük malignitede
numuneleri içermekteydi. Her bir serideki numuneler
randomize edildi, çözündürüldü, her bir ekstraksiyon
yöntemi için paylaştırıldı ve profilleri çıkartılmadan
önce -80oC’de yeniden donduruldu.
C18 kaplı manyetik boncuk ekstraksiyonu ve MS profili.
Daha önce bildirilen, biraz modifiye edilmiş ters fazlı
seri ekstraksiyon protokolünü kullanarak serum
numunelerini üçer kez ekstrakte ettik (30) (bkz. bu
makalenin
sanal
ortam
sürümüne
(www.clinchem.org/content/vol56/is-sue2
eşlik
eden Ek Dosya 1). Kısaca oktadesilsilan (C18) kaplı
paramanyetik boncuk süspansiyonunu (5 /µL; 50 g/L),
50 /µL serum içeren 96 kuyucuklu plağın kuyucukları
içine aktardık, numuneyi karıştırdık ve 1 dakika kendi
haline bıraktık. Daha sonra boncukları manyetik alan
yaratarak kenarlara doğru çektik ve üst fazı attık.
264
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
5
3
70
89
173
Boncuklar daha sonra üç kez bir yandan bir yana
mıknatıslarla çekilerek % 0,1 trifloroasetik asit
(TFA) içinde yıkandı, santrifüjleme ile bir araya
toplandı, yeniden 7 µL elüsyon (tasfiye) solventinde
((%50 asetonitril, %0,1 TFA) süspansiyon haline
getirildi ve kenara çekildi. Yıkantı suyunu (eluat)
%36: %56: %8 metanol:asetonitril:su içindeki 35 /µL
α-siyano-4-hidroksisinnamik
asit
(CHCA)
matriksiyle karıştırdık. Eluat/matriks karışımının 1
µl’lık bölüntüleri çelik MALDI hedef plakaları
üzerine damlatıldı ve oda sıcaklığında kurumaya
bırakıldı. Aşamaların hepsi Genesis Freedom 200
sıvı işleme çalışma istasyonunda (Tecan Birleşik
Krallık) otomatik olarak gerçekleştirilmiştir. Her bir
hedef plağı için kalite kontrol amacıyla kullanılan
serum (Sigma-Aldrich; #S7023) dört kez ekstrakte
edilmiş, analiz içi ve analizler arası değişkenliği
izleme amacıyla kullanılmıştır Kalibre edilmiş
Ultraflex
MALDI-TOF/TOF
kütle
spektrometrisinde (ayrıntılar sanal ortamda Ek
Dosya 1’de) doğrusal pozitif modda 700-10 000
kütle/yük (m/z) arasında otomatik olarak spektral
profiller oluşturulmuştur. Kısaca her bir spektrum
100 darbelik 10 set halinde belirli bölgedeki farklı
noktalara uygulanan 1000 lazer darbesinden
ibaretti. Yedi yüz-4000 m/z eriminde yalnızca
ayrıştırım gücü > 300 olan en azından 1 pik ve
sinyal/gürültü oranı (S/N) >1 olan spektrumlar
(100
lazer
darbesinin)
birikecek
şekilde
MALDI-TOFMS ile OvariyumKanserBiyobelirteçleri
değerlendirme parametrelerini belirledik. Numune
3 replikat denemesinden en azından ikisinde toplam
1000 lazer darbesi alan replikatların dördünden
üçüne sahipse ilişkin veriler kabul edilmiştir. Dokuz
numune yinelenebilir spektrumu sağlayamamış ve
analizde gözardı edilmiştir.
C18-ZipTip pipetleriyle ekstraksiyon ve MS profili
Tanımlandığı gibi otomasyon protokolü içinde ters
fazlı C18 Zip Tipler kullanarak serum polipeptitlerini
zenginleştirdik (31). Kısaca işlemler için adapte
edilmiş CyBi™-Disk robotu kullandık. Beş
mikrolitrelik bölüntüler 5 µL % 2 TFA ile asidifiye
edildikten sonra robotun başlığına monte edilmiş daha
önce prosedüre alıştırılmış ZipTips pipetleri içinden
20 kez aspire edilmiş ve atılmış, ardından 10 µL %
0,1 TFA ile üç kez yıkanmıştır. Polipeptitler, 7 µL %
50 asetonitril, % 0,1 TFA ile 5 kez aspire edilip
atılarak yeni bir plağın içine ayrıştırılmıştır. Daha
sonra 3 µL ayrıştırılmış numuneyi (eluatı) 27 µL taze
hazırlanmış matris çözeltisiyle (2:1 etanol: asetonda
0,5 g/L CHCA) karıştırdık, hemen sonra 0,8 µL’lik 4
bölüntüyü bir 600 µm’lik AnchorChip™ hedef
plağına (Bruker Daltonics) damlatıp havada
kurumaya bıraktık. Analize özgü ve analizler arası
değişkenliği takip için kalite kontrol amacıyla
kullanılan insan serumundan ikişer numune ekstrakte
edilmiş ve olgu kontrol numuneleriyle birlikte
çalışılmıştır. Biraz modifiye edilmiş ortam ve
prosedürle bir Ultraflex II MALDI-TOF/TOF kütle
spektrometresi
kullanılarak
serum
kütle
spektrometrik profilleri elde ettik (sanal ortamda Ek
Dosya 1’e bkz). Numunelerin hepsi en azından
farklı günlerde üçer kez incelenmiştir. Numune 3
replikat denemesinden en azından ikisinde, toplam
1000 lazer darbesi alan replikatların dördünden
üçüne sahipse ilişkin veriler kabul edilmiştir.
Numunelerin tümü yinelenebilir spektrumlar
göstermiş, başlangıç materyali yetersiz olduğu için bir
numune çalışılamamıştır. Sanal ortamda Ek Dosya
2’de standart çalışma protokolünün ayrıntıları
verilmiştir.
VERİLERİN İŞLENMESİ VE SINIFLANDIRMASI
Kurum içinde geliştirilmiş aşamaların aynısı
kullanılarak her iki yöntemin ham MS profil
verilerini birlikte işledik (http://clrc.rhul.ac.uk/
projects/proteomic3,htm) (32). Kısaca replikat
numunelerden
gelen
spektrum
verilerinin
ortalamasını aldık ve verileri 5 kat azalttık (beş veri
noktasından biri hesaba katılmıştır). Daha sonra
sanal ortamda Ek Dosya 1’de açıklandığı gibi
düzgünleştirme,
başlangıçta
eliminasyon,
normalleştirme ve pik tanımlaması gibi işlemleri
uyguladık.
Pikleri
bulundukları
yerin
maksimumdaki şiddet derecesi olarak ölçtük ve sık
görülen pikleri bulmak için (pik grupları) 1500
ppm kütle penceresi kullanarak pikleri hizaya
dizdik. İşlemlerden sonra pikler 2 veri seti için 665
ve 431’lik pik grupları içinde kümeleştirilmişti.
Numunelerin % 10’undan fazlasında görünen pik
gruplarını analiz için kullandık. Sınıflandırma için
test ve kör-çalışma test setleri oluşturma amacıyla
iki seri halinde profilleri belirlenmiş numuneleri
kullandık. C18 manyetik boncuk profilinden alınan
eğitim seti 1. numune serisinin tümünü ve 2.
seriden rastgele alınan numuneleri (n = 205; 42
kanser, 63 iyi huylu tümör ve 100 sağlıklı numune)
içermekteydi. Kör-çalışmanın test seti (n = 127; 39
kanser, 22 iyi huylu tümör ve 66 sağlıklı numune) 2.
serinin geri kalan numunelerini içermekteydi. ZipTip
test seti de (n = 215) benzer bir dağılım göstermekte
olup 45 kanser, 64 iyi huylu tümör ve 106 sağlıklı
numuneyi içermekteydi. Her iki yöntem için de
kör-çalışmanın test seti özdeşti. Sınırda olguların
eğitim ve sınıflandırma açısından kötü huylu
tümörler olduğu düşünüldü. Kanser ve sağlıklı,
kanser ve iyi huylu tümörlerin ayrımı için 2 tip
ayırt edici öngörü modeli oluşturduk. Piklerin alt
kümelerine (genellikle az sayıda) ağırlıklı k-en
yakın komşu algoritması (kNN), sınır değer
kurallarının mantıklı kombinasyonları ve değişik
çekirdekli destek vektör makinesi (SVM) kullanan
farklı modeller uygulanmıştır. Numunelerin
etiketlerini 1000 kez tekrar tekrar randomize edip,
rastgele sırası değişmiş ve doğru etiketlenmiş
numuneler için P değerleri belirleyerek çapraz
validasyon testi uyguladık (Monte Carlo yöntemi).
Eğitim setinde en iyi performans gösteren modeller
daha sonra kör-çalışma test setinde (tümü ağırlıklı
kNN modeleri).validasyona tabi tutulmuştur.
Q-TOF MS/MS İLE PİK TANIMLAMASI
Numuneleri Q-TOF Premier kütle spektrometresiyle
(Waters) kullanılan ve farklı tipte hedef için hafif
modifikasyonlarla yukarıda tanımlanan MALDİ
numune hazırlama yöntemine benzer MALDI
modunda veya elektron püskürtmeli iyonizasyon
(ESI) modunda analiz ederek pikleri tanımladık. Bu
sonuncu olguda ESI analizinden önce numuneler
C18-bazlı ters fazlı HPLC ile fraksiyonlara
ayrılmıştır. Toplam 60’dan fazla olan fraksiyonlar
2’ye ayrılmış, her bir fraksiyondaki başlıca protein
bileşenlerinin tanımlanmasını kolaylaştırmak için bir
bölüntüsü tripsinle parçalanmıştır. Mümkün
olduğunda tanımlama için diğer parçalanmamış
fraksiyona ait bilgilendirici MS/MS dizin verileri
kullanılmıştır. Parçalanmış fraksiyondaki protein
tanımlamaları kullanılarak karşılaştırma için sınırlı
sayıda teorik peptit kitleleri seti oluşturulmuştur.
Deneysel fragman iyonlarla teorik parçalanma
ürünlerinin karşılaştırılmasıyla kütle hassasiyeti <
75
ppm
olan
peptit
setleri
yeniden
değerlendirilmiştir. Parçalanmamış fraksiyonlardan
MS/MS verilerinin elde edilemediği olgularda,
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
265
Şekil 1. Analizin yinelenebilirliğini gösteren kalite kontrol
serum numunelerinin düzenlenmiş spektrumları
(A) farklı günlerde incelenen 4 veya 5 seride 54 ekstraksiyon ve
kontamine edici replikatların düzenlenmiş 216 spektrumunu
gösteren C18 manyetik boncuk ekstraksiyon (UCL) yönteminin
sonuçları (B) üç ayrı
günün serilerinde incelenen 105
ekstraksiyon ve kontamine edici replikatların düzenlenmiş 418
spektrumunu gösteren C18 ZipTip ekstraksiyon (UoR) sonuçları
daha önce tanımlanmış fragmanlarla bilinen protein
yapısı bilgilerini karşılaştırdık.
Sonuçlar
Dynal
18
BONCUKLARI
VE
ZipTip
KSTRAKSİYONU KULLANILARAK UYGULANAN
MALDI-TOF PROFİL OLUŞTURMA YÖNTEMLERİNİN
KARŞILAŞTIRMASI
Sırasıyla C18-kaplı manyetik boncuklar ve C18
ZipTips ile ekstraksiyona dayanan yarı otomatik 2
serum peptit profili oluşturma yöntemi geliştirdik.
Test numuneleriyle birçok kez muamele edilip
işlenmiş bir kalite kontrol serum numunesi
kullanılarak robotik deneylere özgü ve deneyler
arası analiz performansı değerlendirilmiştir.. C18
manyetik boncukla ekstraksiyon yönteminde
CV’leri saptanan pik yoğunluklarının hepsi göz
önüne alındığında sırasıyla 1. ve 2. deneme
serilerinde analizler arası CV’ler %15,7 (%7,2) ve
%13,9 (%7,6) olmuştur. ZipTip yönteminin
analizler arası CV’leri %15,0 (%7,5) ve %13,7
(%8,3) idi. Şekil 1 her iki yöntemin ısı haritaları olarak
düzenlenmiş, 2 ekstraksiyon yöntemlerinde görülen
266
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
pik profillerinde hatırı sayılır örtüşmeyle yaklaşık 200
pik/spektrumu içeren kalite kontrol spektrumunu (m/z
700-10000;
S/N>3)
göstermektedir.
Pik
yoğunluğunda bazı farklılıkların kullanılan 2 reçine
tipinin farklı bağlama kapasitesini yansıtması olasıdır.
MS verilerini elde etme süreci sırasında bir
otomatik spektral kalite filtresi uygulanmış (bkz
“Gereçler ve Yöntemler”) ve her iki yöntem
numune eliminasyonu açısından iyi bir performans
göstermiştir. Sırasıyla manyetik boncuk ve Zip Tip
yöntemiyle 343 numunenin 334’ü ve 342 numunenin
342’sinde
filtreleme
kriterlerini
karşılayan
spektrumlar elde edilmiştir. Klinik numunelerin
spektral profillerinin karşılaştırması, 2 yöntemin
örtüşen ancak belirgin profillerinin mevcut olduğunu
ortaya çıkmıştır. (Şekil 2A–E). ZipTip yöntemi 12001700 m/z aralığında yüksek yoğunluklu pikler
oluşturma
eğilimindeydi.
Manyetik
boncuk
yöntemiyle tüm kütle spektroskopisi eriminde daha
homojen yoğunluklar elde edilmiştir. Klinik
numunelerle
kalite
kontrol
numunelerinin
profillerinin farklı olması kökenlerindeki ve
hazırlanmasında kullanılan farklı işleme koşullarını
yansıtmaktaydı. Tüm klinik numunelerin spektral
işlenmesi sırasıyla UCL ve Reading Üniversitesi
(UoR) veri setlerinde 665 ve 431 pik grubunun
sıralanmış olduğunu ortaya koymuştur. İleri analiz
için yalnızca numunelerin % 10’undan fazlası göz
önüne alınıp, çoğu kez düşük yoğunluklu pikler
atılarak piklerin sayısı manyetik boncuk veri seti
için 132’ye Zip Tip veri seti için 108’e
düşürülmüştür. Sanal ortamdaki Ek D’de 3. Dosya
elimine edilmiş piklerin listesini göstermektedir.
Eğitim setinden alınan sağlıklı numunelerin 1.
seriden geldiğini 2.seriden gelen sağlıklı
numunelerin ise aynı dağılım kalıbına ait olduğu
varsayımının doğruluğunu kontrol edip MannWhitney U-testi P değerlerini hesapladık,
Bonferroni düzeltili 0,01 üstü P değerleri (sanal
ortam Ek Dosya 3’de “stabil olmayan pikler” olarak
adlandırılan) elimine edilmiştir. Bu yaklaşımın
arkasındaki
motivasyon
sağlıklı
kontrol
numunelerine göre stabil olan piklerin listesini
oluşturmaktı. Sonuçta 2 veri setinden sırasıyla 36
ve 20 stabil olmayan pik çıkartılarak pik setleri 96
(manyetik boncuk)
ve
88’e (Zip Tip)
düşürülmüştür.
MS PİKLERİNİ KULLANARAK PERFORMANSIN
SINIFLANDIRMASI
SVM, ağırlıklı kNN ve basit sınır değer kuralları
gibi çeşitli öğrenme yöntemleri kullanarak eğitim
setinden çok sayıda model oluşturduk. Pik çiftleri
kullanımının en iyi performansları verdiğini, pik
sayısını artırmanın abartılı yakıştırma sonucu stabil
ve yinelenebilir sonuçlara yol açmadığını saptadık.
(bkz sanal ortam Ek Dosya 1). Pik yoğunluğa karşın
pik alanı kullanımı performansta kayda değer bir
MALDI-TOFMS ile OvariyumKanserBiyobelirteçleri
Şekil 2 UKOPS olgu kontrol numunelerinin MALDI-TOF MS profilleri.
(A), 228 pikin saptandığı C18 manyetik boncuk ekstraksiyonunun ortalama spektrumları. (B), 207 pikin saptandığı C18 Zip Tip
ekstraksiyonunun ortalama spektrumları. (C), Sınıflandırma ve FIGO evresiyle gruplandırılmış C18 manyetik boncukla ekstrakte edilmiş
numunelerin düzenlenmiş spektrumları. (D), Sınıflandırma ve FIGO evresiyle gruplandırılmış Zip Tip ile ekstrakte edilmiş numunelerin düzenlenmiş
spektrumları.. (E), İki farklı ekstraksiyon yöntemi kulalnarak aynı numunenin (numune no. 00100145) ikişer kez analizlerinden elde edilen
spektrumları
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
267
Table 2. Classification performances for discriminating healthy and malignant samples for the sets using 2 peak
weighted kNN models.a
Training set
kNN threshold/
total
Sensitivity,
%
Specificity,
%
Test set
Accuracy,
%
Peak m/z values
P for 1000
iterations
Sensitivity,
%
Specificity,
%
Accuracy,
%
UCL, malignant vs
healthy
1/3
90.5
75.5
80.0
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
76.9
40.9
63.9
74.4
45.5
63.9
51.3
40.9
47.5
66.7
31.8
54.1
76.9
36.4
62.3
87.1
+ 1078.6
710 + 1078.6
906.33 + 4093.4
4093.4 + 5913.2
4212.8 + 5913.2
4056.8 + 8752
1/2
85.7
81.6
82.9
3/8
81.0
83.7
82.9
4/10
78.6
86.7
84.3
3/6
76.2
89.8
85.7
4/8
69.0
94.9
59.0
45.5
54.1
1/7
100.0
50.0
63.4
3507.3
76.9
42.4
55.2
97.4
59.6
69.7
61.5
56.1
58.1
92.1
64.4
71.8
51.3
59.1
56.2
2/8
89.5
77.9
81.0
64.1
45.5
52.4
4/10
84.2
81.7
82.4
43.6
72.7
61.9
2/4
76.3
85.6
83.1
59.0
68.2
64.8
3/6
73.7
86.5
83.1
48.7
68.2
61.0
4/8
71.1
92.3
86.6
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
1/4
1/3
46.2
89.4
73.3
710
UoR, malignant vs
healthy
a
+ 6225.2
4787.4 + 3507.3
4787.4 + 3507.3
3448.5 + 3086.5
2023.1 + 3507.3
3086.5 + 3970.5
3086.5 + 2569
2023.1 + 7469.3
Cross-validation was performed by randomizing sample labels in 1000 iterations and calculating P values (Monte Carlo method) for the randomly permutated and correctly
labeled samples.
farklılık yaratmamıştır. Test edilen sınıflandırma
yöntemleri içinde çapraz validasyonda en iyi
performansı ağırlıklı kNN modelleri göstermiştir.
Değişik pik çiftlerinin 2 eğitim setinde sağlıklı ve
kanserli numunelerin ayrımında makul derecede iyi
bir performans gösterdiğini, doğruluk derecelerinin
manyetik boncuk seti için % 80-87,1 ve ZipTip seti
için % 63,45-86,6 olduğunu saptadık (Tablo 2).
Ancak bu modeller kör-çalışma testi setinde
validasyona tabi tutulduklarında daha düşük bir
performans sergilemişlerdir. En iyi performansla
sağlanan tanısal doğruluk dereceleri manyetik
boncuk veri setinde % 63,9, ZipTip veri setindeyse
% 73,3 idi. Sağlıklı ve kanserli numuneleri ayırt
eden 2 veri setinde kullanılan piklerin örtüşmemiş
olması kayda değer. Kanserli ve iyi huylu doku
numunelerini sınıflandırmada eğitim setlerinin
performansında doğruluk dereceleri UCL verilerinde
sırasıyla % 66,7-81,9 ve UoR verilerinde sırasıyla %
66,3-79,2 idi. (Tablo 3). Validasyon setinde bu
modeller ancak orta derecede iyi performans
göstermiş, en yüksek doğruluk dereceleri UCL ve
UoR veri setlerinde sırasıyla % 62,3 ve % 65,6
düzeyinde kalmıştır. İyi huylu ve kanserli olguların
268
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
ayrımı için kullanılmış az sayıda pikin aynı peptitler
(m/z 3509,6/3507,3, m/z 4056,8/4053,8 ve m/z
4093,4/4091,1) olması ihtimali mevcuttu İlaveten
her bir veri seti için kanser-sağlıklı ve kanser–iyi
huylu tümör sınıflandırmalarında birkaç pik sıklıkla
kullanılmıştır. Genellikle tanımlanan metodoojiler
kullanılarak yüksek verimlilikteki MALDI-TOF MS
profilleri içindeki verilerin over kanserine doğru tanı
koyamadığı açıkça belliydi.
PİKLERİN TANIMLANMASI
MS profillerinde gözlenen peptitleri over kanserinin
olası belirteçleri olarak tanımlamak önceki
çalışmamızdaki yöntemlerimizle karşılaştırmak (27,
33)için saptanan piklerin mümkün olduğu kadar
çoğunu tanımlamaya çalıştık. Kısaca 20’den az
sayıda proteinin proteolitik ürünlerini temsil eden
(gösterilmemiş veriler) 50’den fazla pik yüksek bir
güvenlilik derecesiyle tanımlanmıştır. Bu analizle
iyi ve kötü huylu tümör numunelerini ayırt etmek
için kullanılan en iyi modellerin piklerini, sağlıklıkanser sınıflandırmasında ise az sayıda piki
tanımlayabildik (Tablo 2 ve 3). M/z 906, 1021, 1079,
1265, 1547, 2771 ve 5913’deki piklerin tümü
MALDI-TOFMS ile OvariyumKanserBiyobelirteçleri
Table 3. Classification performances for discriminating benign and malignant samples for the training and
blinded test sets using 2 peak weighted kNN models.a
Training set
kNN threshold/
total
Sensitivity,
%
Specificity,
%
Test set
Accuracy,
%
Peak m/z values
P for 1000
iterations
Sensitivity,
%
Specificity,
%
Accuracy,
%
UCL, malignant vs
benign
1/5
100.0
44.4
66.7
2771.4
+ 2274.7
+ 2274.7
+ 4093.4
+ 1061.8
+ 9148.3
+ 9148.3
+ 3509.6
+ 5913.2
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
71.8
9.1
49.2
1/4
97.6
49.2
68.6
2771.4
2/7
92.9
66.7
77.1
906.33
66.7
13.6
47.5
59.0
31.8
2/5
90.5
71.4
79.0
1265
49.2
84.6
18.2
3/7
88.1
76.2
81.0
60.7
59.0
36.4
906.33
50.8
2/4
83.3
77.8
80.0
906.33
3/6
81.0
79.4
80.0
906.33
56.4
31.8
47.5
69.2
31.8
1/1
76.2
85.7
81.9
4056.8
55.7
74.4
40.9
62.3
1/3
100.0
46.0
66.3
1546.8
3/10
89.5
63.5
73.3
4053.8
+ 7469.3
+ 1021.3
1021.3 + 2106.1
4787.4 + 3507.3
2106.1 + 6909.6
4091.1 + 1021.3
2106.1 + 6909.6
1021.3 + 4396.3
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.005
<0.005
<0.01
56.4
50.0
54.1
76.9
40.9
63.9
2/5
86.8
69.8
76.2
2/6
84.2
73.0
77.2
66.7
45.5
59.0
59.0
68.2
3/7
76.3
81.0
79.2
62.3
30.8
68.2
5/10
68.4
84.1
78.2
44.3
48.7
63.6
5/10
68.4
84.1
78.2
54.1
25.6
72.7
42.6
4/8
68.4
84.1
78.2
61.5
72.7
65.6
UoR, malignant vs
benign
a
Cross-validation was performed by randomizing sample labels in 1000 iterations and calculating P values (Monte Carlo method) for the randomly permutated and correctly
labeled samples.
(işlenmiş ve dolu kitleler) ilk beşi MALDI-MS/MS
ile doğrudan tanımlanmış fibrinopeptidin değişik
fragmanları olmak üzere fibrinojen-alfa öncülünden
kaynaklanmıştır. Sanal ortamda Ek Dosya 3’e bkz)
Önceden fraksiyonlara ayırma ve ESI-MS/MS
analiziyle eşdeğer güvenlilikle m/z2771 ve 5913 pikleri
tanımlanmıştır. m/z 1547’deki pikin serin halkasında
fosforileşmiş bir fibrinopeptit A fragmanına tekabül
etmesi kayda değer m/z 2275’deki pik yine direkt
MALDI- MS/MS testiyle tanımlanmış bir inter-αtripsin inhibitörüdür.
Tartışma
Otomasyonlu MALDI-TOF MS profillemeyle
bağlantılı iki yüksek verimli polipeptit ekstraksiyon
yöntemini sağlıklı kontroller, over kanseri veya iyi
huylu over tümörü tanısı konmuş kadınlardan
benzer yöntemlerle toplanmış ve işlenmiş serum
numunelerine uyguladık. Başlıca amacımız over
kanserinin saptanması, iyi ve kötü huylu tümörlerin
ayırıcı
tanısı
için
varsayımsal
peptit
biyobelirteçlerini tanımlamaktı. Sonuçları tümöre
spesifik ekzoproteaz aktiviteleriyle oluşturulduğu
varsayılan diğer kanser tiplerinin serum peptit
belirteçlerini tanımlamak için benzer bir stratejinin
kullanılmış olduğu önceki çalışmalarla karşılaştırmayı
da istedik. (27,33). Hem Zip Tip hem de MS
profillemesiyle ilişkili
boncuk ekstraksiyon
yöntemi başarıyla otomatize edilmiştir., Bir kalite
kontrol numunesiyle test edildiğinde her iki yöntem
de yinelenebilir özellikte olup düşük numune
eliminasyon oranlarına sahipti. İki analizin
yinelenebilirliğinde (CV’ler yaklaşık % 15) birkaç
bol bulunan (ve sıklıkla stabil) pikten ziyade
spektrum içinde sinyal/gürültü oranları 3’den
yüksek eşleştirilmiş piklerin tümü göz önüne
alınmıştır Bu pikler MALDI bazlı serum profilleme
için bildirilenlerden daha yüksekti. Yöntemler
birbirleriyle iyice örtüşen ve öncekilerle uyumlu
spektral profiller oluşturmuş, MS/MS peptidazın
oluşumuna neden olduğu birçok özdeş serum
protein parçacığını tanımlamıştır. Özellikle m/z 1547
ve 5913’‘den başka tanımlanmış peptit pikinin
tümuyle kanser olgularını kontrollerden ayırt etmede
istatistiksel açıdan anlamlı oldukları bildirilmişti
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
269
(27). Profil oluşturma yöntemlerinin kanıtlanmış
yinelenebilirliğine ve numunelerin önceleri optimize
edilmiş protokolüne göre numunelerin benzer şekilde
işlenmiş olduğu gerçeğine rağmen (15,30)
validasyon setimizde kanserler ve iyi huylu
tümörlerin yüksek doğrulukla sınıflandırılması için
elde edilen pik yoğunluğu bilgileri kullanılamaz.
Özellikle aynı kişilerde belli bir zaman boyunca
izlendiğinde genel tanısal duyarlılık derecelerinin
yaklaşık % 80, özgüllük derecelerinin % 95’in
üstünde olduğu bildirilmiş olan kNN modellerinde
pik çiftlerinin performansı, serum CA-125’in altına
düşmüştür (4, 34). O halde over kanseri olgularında,
serumda tümöre spesifik peptidom kalıplarına
kanseri belirleme ve tanı koymada yararlı ayırt edici
özellik katan ekzoproteaz aktivitelerinin mevcut
olmadığı görünmektedir. Nedenleri belli olmamakla
birlikte ekzoproteaz aktiviteleri önceki çalışmalarda
kullanılan prostat, meme, mesane ve tiroit kanserine
karşın over kanseri ve alttiplerinin farklı moleküler
etiyolojisini temsil edebilir (27, 33). Bu farklılık
over kanseri hücrelerinde bu çeşit ekzoproteazların
mevcut olmadığını, tercihli inhibisyonlarını veya kan
dolaşımına hücrelerin salgılanması/ saçılmasındaki
azalmayı gösterebilir.
Buna karşın önceki çalışmalar MS ile
oluşturulan serum profilinin kanseri sağlıklı veya
iyi huylu tümörlerden doğrulukla ayırt etmek için
kullanılabildiğini
bildirmiştir
(35,36).
MS
profillerinde gözlemlenen farklılıklar numunelerin
işlenmesi ve seçimindeki hatalara bağlıydı (37, 38).
Numunelerin toplanması ve işlenmesine (39) ilişkin
standart çalışma prosedürleri uygulanmalıdır
Burada uygulanmış olan numune işleme
prosedürlerinin yanlılıktan kaçınmak için sıkıca
denetlenmiş olması MALDI-TOF MS profilleme
yöntemini kullanarak düşük kütleli serum
proteomunda over kanseri tanısal biyobelirteçlerinin
saptanamadığı
düşüncesini
desteklemektedir.
Tanımlanan yöntemler kullanılarak yüksek verimli
MALDI-TOF MS ile serum peptidomunun profilini
oluşturma over kanserinin saptanması ve tanısına
ilişkin bir miktar bilgi sağlamasına rağmen
tanımlanan belirteçler yalnız başlarına klinik
kullanım için uygun olmayacaktır.
Author Contributions: All authors confirmed they have contributed
to the intellectual content of this paper and have met the following 3
requirements: (a) significant contributions to the conception and design,
acquisition of data, or analysis and interpretation of data; (b)
drafting or revising the article for intellectual content; and (c) final
approval of the published article.
Authors’ Disclosures of Potential Conflicts of Interest: Upon
manuscript submission, all authors completed the Disclosures
ofPotential Conflict of Interest form. Potential conflicts of interest:
Employment or Leadership: None declared.
Consultant or Advisory Role: I. Jacobs, Becton Dickinson
Stock Ownership: None declared.
Honoraria: None declared.
270
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
Research Funding: D. Devetyarov, Veterinary Laboratories
Agency. This work was supported by the Medical Research
Council through grants G0301107 and G0401619. UKOPS was
supported by the Eve Appeal. Part of this work was undertaken at
UCLH/UCL, which received a proportion of funding from the
Department of Health’s National Institute for Health Research
(NIHR) Biomedical Research Centres funding scheme.
Expert Testimony: None declared.
Role of Sponsor: The funding organizations played no role in the
design of study, choice of enrolled patients, review and
interpretation of data, or preparation or approval of manuscript.
Kaynaklar
1. International Agency for Research on Cancer. GLOBOCAN 2002.
http://www-dep.iarc.fr (Accessed December 2009). The GLOBOCAN 2002
project shows cancer “incidence,” “mortality,” and “prevalence”
worldwide (2002 “estimates”).
2. Cancer
Research
UK.
Ovarian
cancer
survival
statistics.
http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/
types/ovary/survival/index.htm
(Accessed December 2009).
3. Brioschi PA, Irion O, Bischof P, Bader M, Forni M, Krauer F. Serum CA 125
in epithelial ovarian cancer: a longitudinal study. Br J Obstet Gynaecol
1987;94:196–201.
4. Bast RC Jr, Badgwell D, Lu Z, Marquez R, Rosen D, Liu J, et al. New tumor
markers: CA125 and beyond. Int J Gynecol Cancer 2005;15 Suppl 3:274–81.
5. Timmerman D, Testa AC, Bourne T, Ameye L, Jurkovic D, Van Holsbeke C, et
al. Simple ultrasound-based rules for the diagnosis of ovarian cancer.
Ultrasound Obstet Gynecol 2008;31:681–90.
6. Menon U, Gentry-Maharaj A, Hallett R, Ryan A, Burnell M, Sharma A, et al.
Sensitivity and specificity of multimodal and ultrasound screening for ovarian
cancer, and stage distribution of detected cancers: results of the prevalence
screen of the UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening
(UKCTOCS). Lancet Oncol 2009;10:327–40.
7. Wulfkuhle JD, Paweletz CP, Steeg PS, Petricoin EF 3rd, Liotta L. Proteomic
approaches to the diagnosis, treatment, and monitoring of cancer. Adv Exp
Med Biol 2003;532:59–68.
8. Ludwig JA, Weinstein JN. Biomarkers in cancer staging, prognosis and
treatment selection. Nat Rev Cancer 2005;5:845–56.
9. Chatterjee SK, Zetter BR. Cancer biomarkers: knowing the present and
predicting the future. Future Oncol 2005;1:37–50.
10. Kozak KR, Su F, Whitelegge JP, Faull K, Reddy S, Farias-Eisner R.
Characterization of serum biomarkers for detection of early stage ovarian
cancer. Proteomics 2005;5:4589–96.
11. Su F, Lang J, Kumar A, Ng C, Hsieh B, Suchard MA, et al. Validation of
candidate serum ovarian cancer biomarkers for early detection. Biomarker
Insights 2007;2:369–75.
12. Diamandis EP. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker
discovery tool: opportunities and potential limitations. Mol Cell Proteom
2004;3:367–78.
13. Coombes KR, Morris JS, Hu J, Edmonson SR, Baggerly KA. Serum
proteomics profiling: a young technology begins to mature. Nat Biotechnol
2005;23:291–2.
14. Karsan A, Eigl BJ, Flibotte S, Gelmon K, Switzer P, Hassell P, et al. Analytical
and preanalytical biases in serum proteomic pattern analysis for breast
cancer diagnosis. Clin Chem 2005;51: 1525–8.
15. Villanueva J, Philip J, Chaparro CA, Li Y, Toledo-Crow R, DeNoyer L, et al.
Correcting common errors in identifying cancer-specific serum peptide
signatures. J Proteome Res 2005;4:1060–72.
16. Banks RE, Stanley AJ, Cairns DA, Barrett JH,Clarke P, Thompson D, Selby PJ.
Influences of
blood sample processing on low-molecularweight proteome
identified by surface-enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry. Clin
Chem 2005;51:1637–49.
17. Baumann S, Ceglarek U, Fiedler GM, Lembcke J, Leichtle A, Thiery J.
Standardized approach to proteome profiling of human serum based on magnetic
bead separation and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometry. Clin Chem 2005;51:973–80.
18. Findeisen P, Sismanidis D, Riedl M, Costina V, Neumaier M. Preanalytical impact
of sample handling on proteome profiling experiments with matrix-assisted laser
desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry. Clin Chem 2005;51: 2409–
11.
19. Timms JF, Arslan-Low E, Gentry-Maharaj A, Luo Z, T’Jampens D, Podust
MALDI-TOFMS ile OvariyumKanserBiyobelirteçleri
VN, et al. Preanalytic influence of sample handling on SELDI-TOF serum
protein profiles. Clin Chem 2007;53:645–56.
20. Baggerly KA, Morris JS, Edmonson SR, Coombes KR. Signal in noise:
evaluating reported reproducibility of serum proteomic tests for ovarian
cancer. J Natl Cancer Inst 2005;97:307–9.
21. Diamandis EP. Serum proteomic profiling by matrix-assisted laser
desorption-ionization timeof-flight mass spectrometry for cancer diagnosis:
next steps. Cancer Res 2006;66:5540–1.
22. Hortin GL. The MALDI-TOF mass spectrometric view of the plasma
proteome and peptidome. Clin Chem 2006;52:1223–37.
23. Koomen JM, Li D, Xiao LC, Liu TC, Coombes KR, Abbruzzese J, Kobayashi R.
Direct tandem mass spectrometry reveals limitations in protein profiling
experiments for plasma biomarker discovery. J Proteome Res
2005;4:972–81.
24. Song J, Patel M, Rosenzweig CN, Chan-Li Y, Sokoll LJ, Fung ET, et al.
Quantification of fragments of human serum inter-alpha-trypsin inhibitor
heavy chain 4 by a surface-enhanced laser desorption/ionization-based
immunoassay. Clin Chem 2006;52:1045–53.
25. Lopez MF, Mikulskis A, Kuzdzal S, Golenko E, Petricoin EF 3rd, Liotta LA, et
al. A novel, high-throughput workflow for discovery and identification of
serum carrier protein-bound peptide biomarker candidates in ovarian
cancer samples. Clin Chem 2007;53:1067–74.
26. Villanueva J, Philip J, Entenberg D, Chaparro CA, Tanwar MK, Holland EC,
Tempst P. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated
sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem
2004;76:1560–70.
27. Villanueva J, Shaffer DR, Philip J, Chaparro CA, Erdjument-Bromage H, Olshen
AB, et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome
patterns. J Clin Invest 2006;116:271–84.
28. Menon U, Gentry-Maharaj A, Ryan A, Sharma A, Burnell M, Hallett R, et al.
Recruitment to multi-centre trials–lessons from UKCTOCS: descriptive study.
BMJ 2008;337:a2079.
29. Kurman RJ, Shih Ie M. Pathogenesis of ovarian cancer: lessons from
morphology and molecular biology and their clinical implications. Int J Gynecol Pathol 2008;27:151–60.
30. Villanueva J, Lawlor K, Toledo-Crow R, Tempst P. Automated serum peptide
profiling. Nature Protoc 2006;1:880–91.
31. Tiss A, Smith C, Camuzeaux S, Kabir M, Gayther S, Menon U, et al.
Serum peptide profiling using MALDI mass spectrometry: avoiding the
pitfalls of coated magnetic beads using well-established ZipTip technology.
Proteomics 2007;7 Suppl 1:77–89.
32. Gammerman A, Vovk V, Burford B, Nouretdinov I, Luo Z, Chervonenkis A, et
al. Serum proteomic abnormality predating screen detection of ovarian
cancer. Computer J 2009;52:326–33.
33. Villanueva J, Martorella AJ, Lawlor K, Philip J, Fleisher M, Robbins RJ,
Tempst P. Serum peptidome patterns that distinguish metastatic thyroid
carcinoma from cancer-free controls are unbiased by gender and age. Mol
Cell Proteom 2006;5:1840–52.
34. Bast RC Jr. Status of tumor markers in ovarian cancer screening. J Clin
Oncol 2003;21:200s– 205s.
35. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et
al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet
2002;359:572–7.
36. Semmes OJ, Feng Z, Adam BL, Banez LL, Bigbee WL, Campos D, et al.
Evaluation of serum protein profiling by surface-enhanced laser desorption/
ionization time-of-flight mass spectrometry for the detection of prostate
cancer: I. Assessment of platform reproducibility. Clin Chem 2005;51:102– 12.
37. Baggerly KA, Morris JS, Coombes KR. Reproducibility of SELDI-TOF protein
patterns in serum: comparing datasets from different experiments
Bioinformatics 2004;20:777–85.
38. McLerran D, Grizzle WE, Feng Z, Bigbee WL, Banez LL, Cazares LH, et
al. Analytical validation of serum proteomic profiling for diagnosis of
prostate cancer: sources of sample bias. Clin Chem 2008;54:44–52.
39. Tuck MK, Chan DW, Chia D, Godwin AK, Grizzle WE, Krueger KE, et al.
Standard operating procedures for serum and plasma collection: early detection research network consensus statement standard operating
procedure integration working group. J Proteome Res 2009;8:113–7.
Clinical Chemistry 56: 2 (2010)
271