proteinlerin nicel olarak tayini(bradford yöntemi)

PROTEİNLERİN NİCEL OLARAK TAYİNİ
Doğal kaynaklardaki protein miktarlarını hesaplayabilmek için pek çok yol vardır. Yöntemlerin bu derece çokluğuna karşın,
genelde herhangi bir örnekteki protein miktarını en iyi saptayan ve tam istediğimiz sonucu veren bir yol yoktur. Ancak protein
miktarını en iyi şekilde saptayabilmek için proteinin ve örnekteki diğer bileşiklerin yapısına , deneyin hassasiyetine göre metod
seçilmelidir.
Tahmin edileceği üzere, moleküller bakteri kolonileri ya da hücreler gibi mikroskop altında sayılamaz. Proteinler gibi moleküllerin
miktarının ölçülebilmesi için, ortamda bulunan molekül konsantrasyonu ile doğru orantılı olan ve ölçülebilir bir parametre
kullanılmalıdır. En sıklıkla kullanılan parametre ise ışık absorbsiyonudur. Beer kanununa göre eğer çözünen bir madde belirli bir
dalga boyunda ışık absorbluyorsa, bu absorbsiyon o maddenin çözeltideki miktarı ile doğru orantılıdır. Spektrofotometre cihazı
yardımı ile bu absorbsiyon ölçülebilir. Ancak genellikle incelenen madde kendi başına analiz yapılmasına yeterli olacak miktarda
absorbsiyon yapamaz. İşte bu durumda incelenecek maddeye bağlanabilecek renkli bileşenler bağlanır ve ölçüm yapılır.
Fakat tek başına absorbsiyon değerlerini bilmek bize miktar hakkında pek bilgi vermez. İstenen proteinin miktarını tayin
edebilmek için absorbansları karşılaştırabileceğimiz bir standarta ihtiyaç duyulur. Örneğin X proteini 0.5 absorbans veriyorsa
miktarını bulabilmek için aynı koşullarda, konsantrasyonunu bildiğimiz ve yine 0.5 absorbans veren bir diğer proteine ihtiyaç
duyarız. İşte bu örneğin miktarını bildiğimizden dolayı X proteininin miktarınında 0.5 absorbans değerinde aynı olduğunu kabul
edebiliriz. Ancak genellikle elimizde değişen konsantrasyonlarda protein içeren çözeltiler olacaktır. Aynı yaklaşımı uygulamak için
bir referans aralığı gereklidir. İşte bu sebeple bir proteinin konsantrasyonu belirli aralıklarla artan çözeltisi hazırlanır (standart)
ve absorbsiyonlarına bakılarak bir standart grafik çizilir. Standart grafik, içerisindeki madde derişimi bilinen saf proteini içeren
çözeltinin absorbans değerlerine göre hazırlanan ve sonrasında derişimi bilinmeyen protein çözeltisinin verdiği absorbans
değerlerinin bu standart eğri üzerinde yerine konulması ile bilinmeyen derişim değerinin bulunduğu grafiktir. Fakat bu her
zaman olası değildir. Çünkü, protein saf olarak elde edilmeyebilir. Bu durumlarda ticari olarak satılan saf proteinler standart
olarak kullanılır. En yaygın kullanılan protein standartı sığır serum albuminidir (BSA).
Bir çözeltideki total protein miktarının belirlenmesi, ayırma ve saflaştırma işlemlerinin seçiminde ve belli aşamalardaki protein
veriminin ve saflığının kontrolünde önemli bir yer tutar. Özellikle elektroforetik ve kromotografik ayırmalarda deneylerin
optimizasyonu için miktar tayinine gereksinim duyulmaktadır. Ayrıca çalışılan bir enzimin spesifik aktivitesi ve saflaştırma
derecesinin belirlenmesinde de total protein miktarının bilinmesi şarttır.
Doğal kaynaklardaki protein miktarını saptama yöntemleri:
a) Biüret Yöntemi
Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Reaksiyonun temeli
belirteçteki bakır iyonlarının (Cu+2) peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540-560 nm’de maksimum absorbsiyon
gösteren renkli bir kompleksin oluşumuna dayanır. Cu+2 iyonlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit çeşitlerinin
ölçümler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.
b) Lowry Yöntemi
Lowry yöntemi alkali koşullarda meydana gelen iki farklı reaksiyona dayalıdır. Hassasiyet aralığı 5 - 100 µg/ml’dir. Bunlardan
birincisi amid bağları ile bakır arasında meydana gelir ve indirgenmiş bakır oluşumu ile sonuçlanan Biüret reaksiyonudur. İkincisi
ise Folin-Ciocalteu ayıracının (fosfomolibden ve fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek
indirgenmesidir. İndirgenmiş ayıraç mavi renktedir ve 500-700 nm arasında absorbans verir ancak çoğu zaman tercih edilen
değer 660 nm’dir. Bu iki reaksiyonu bir arada gerçekleşmesi Biüret reaksiyonu hassasiyetini 100 kat artırır. Lowry yöntemi pH
hassasiyeti gösterir, ortam pH’sı 10-10.5 olmalıdır. Yöntem pek çok farklı tamponun içeriğinde yer alan Tris, EDTA ve potasyum
bileşikleri ile enterferans yaratabilir, bu durumda yanıltıcı absorbans değerlerinin ortaya çıkmasına neden olur. Yöntem triptofan
ve tirozin içeriği fazla olan proteinlerin
miktar tayini için avantajlıdır zira ayıraç bu amino asitlere daha yüksek hassasiyet
gösterir.
www.hasanunal.net
c)Warburg-Christian Yöntemi :
Diyaliz ya da fraksinasyon yoluyla protein olmayan maddelerin uzaklaştırılmasından
sonra 260-280 nm’de UV. absorbsiyon analizleri yapılır. Proteinlerin triptofon ve tirozin
reziduları 275-280 nm’de UV. absorbansını arttırır. Çünkü beraber durumdaki bu iki amino
asitin saf bir protein çözeltisindeki derişimleri birçok proteinde genellikle sabittir. 260/280 nm
yönteminde duyarlılık 0,05-210 mg/ml dır. ml.'deki mg protein = A280 - A260 dır.
(1.55 x A280 )- (0.76 x A260) = mg protein/ ml.
d)Bradford (Coomassie Blue) Yöntemi :
Oldukça duyarlı olan bu yöntem (5-100 µg/ml); organik boyaların, proteinlerin asidik
ve bazik grupları ile etkileşerek, renk oluşturmasını esas alır. Mavi rengin oluşmasında
proteinin amino asit bileşimi (özellikle arjinin gibi bazik amino asitler ve aromatik
amino asitler) önemlidir.Yöntemde temel alınan olgu, boya normal şartlarda 465 nm’de maksimum absorbans verirken, protein
ile bağlandığı zaman 595 nm dalga boyunda maksimum absorbans vermesidir.
Anlatılan metotların yanısıra protein tayini yapılırken, koşullar uygun olduğu taktirde, Smith yöntemi, Kjeldahl analizi, bulanıklık
ölçümleri (turbidimetri), özgül aktivitenini ölçülmesi, kırılma indeksinin ölçülmesi (refraktometri) ve saflaştırılıp kurutulmuş
örneklerin doğrudan tartılması yöntemlerinden de faydalanılabilir.
Bradford Yöntemi ile Protein Miktarının Tayini
Bradford yöntemi Coomasie brillant blue (parlak mavisi) G-250 boyasının farklı konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak,
değişik renk şiddetinde mavi renkli çözeltiler ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir. Mavi rengin oluşmasında proteinin
aminoasit bileşimi önemlidir. Boyanın özellikle arjinin gibi bazik amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma
eğiliminde olduğu gösterilmiştir.. Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi vardır. Yöntemde boyaya bağlanmış
protein 595 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir.
Chemical Structure of Coommassie Brilliant Blue G-250
www.hasanunal.net
Konsantrasyon (µg/ml)
Bradford Testi İçin Standart Eğrinin Hazırlanması
Araç ve Gereçler
•
1 mg/ml standart bovine serum albumin (% 0.9 NaCl içinde),
•
% 0.9 NaCl
•
Distile Su
•
Bradford çözeltisi;
25 mg Coomasie brillant blue G-250, 12.5 ml %95 etanolde çözündürülüp, 25 ml %85 fosforik asit (H3PO4) eklenir. Bu
boya çözeltisi 250 ml’ye tamamlanır. Kullanılacağı zaman 5 kere sulandırılır. Whatman no.1filtreden geçirilir ve bir cam
şişede, oda sıcaklığında saklanır. Kullanılmadan kalan Bradford stok çözeltisi ortalama 1 yıl 4oC’de saklanabilir.
•
Test Tüpü
•
Pipet (1 ve 5 ml. lik pipet)
•
Kolorimetre tüpler
İzlenecek Yol
Bileşikler
Tüp No
1
2
3
1 mg/ml BSA (µl)
00
20
40
60
D-H2O (µl)
100
80
60
40
%0,9 NaCl (ml)
5.9
5,9
5,9
5,9
1
1
Bradford çözeltisi (ml)
Toplam Hacim ml
7.0
7.0
4
5
6
80
7
8
100
50
20
00
50
70
5,9
5,9
5,9
5,9
1
1
1
7.0
7.0
7.0
30
1
1
1
7.0
7.0
7.0
1) Kör tüpü (1 no.lu tüp) ve Örnek tüpleri (7 ve 8 no.lu tüpler) hariç bütün tüplere tabloda verilen miktarlarda (µl) BSA
(Standart Serum Albumin) ilave edin.
2) 7 ve 8 no.lu tüplere, farklı konsantrasyonlarda ancak bizim derişimlerini bilmediğiniz protein örneğinden 20-100 µl arası
ekleyin. Eğer 100 µl’den az örnek kullandıysanız son hacmi su ile 100µl’ye tamamlayın.
3) Bütün tüplere tabloda verilen miktarlarda d-H2O (distile su) ekleyin
4) Bütün tüplere 5.9 ml NaCl ekleyerek hacimleri 6 ml’ye tamamlayın
5) Bütün tüplere 1’er ml Bradford çözeltisi ilave edin.
www.hasanunal.net
6) Oluşan rengin sabitlenmesi için 10 dakika bekleyin.
7) 595 nm ye ayarlı spektrofotometrede 1 numaralı kör tüpüne karşı 2,3,4,5,6, 7. ve 8. tüplerin
absorbanslarını okuyun ve kaydedin.
8) 2,3,4,5 ve 6. Tüpler için okuduğunuz absorbans değerlerini ordinatta (y ekseni),bu
tüplerdeki BSA derişimlerini absiste (x eksenine) göstererek Standart grafiği çizin.
9) Bu standart grafiği kullanarak derişimini bilmediğiniz 7 ve 8 no.lu tüpteki örneklerinizin protein derişimini bulun ve kaydedin.
protein miktarlarına göre renk göstergesi (en sağdaki tüp kör tüpüdür)
DENEY SONUÇLARINIZI AŞAĞIDAKİ TABLOYA YAZINIZ
Tüp no
Kör 1
Std 2
Std 3
Std 4
Std 5
Absorbans
595 nm
Protein Miktarı
(µg/ml)
www.hasanunal.net
Std 6
Örnek1
Örnek2