PowerPoint Sunusu

1
Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi
ECZ 344
Prof.Dr. Dilek AK
04.04.2014 /5. DERS
BİYOLOJİK SIVILAR
2
İDRAR

İdrarın % 95 i sudur.

% 5 i, şekerler, amino asitler, kreatinin, üre ve diğer
metabolizma ürünleridir.

İdrarın fiziksel ve kimyasal bileşimi oldukça
değişkendir, diyetin türü ve bileşimi ve endojen
metabolitlerin miktarı ile değişir. Ayrıca kilo, duygu
durumu metabolizma hızı vb de bağlıdır.

Taze idrar berraktır, ancak bekleyen idrarda, idrar
yollarından gelen mukus varlığı veya lipitlerin
bozulmasına bağlı olarak bulutumsu, bulanık bir
görünüm veya topaklı çökelti oluşur.
3
İDRAR

Elde edilmesi kolay olduğu için ilaç analizinde en
yaygın kullanılan biyolojik örneklerden biridir.

Numune alma sırasında, kadınlar için mens dönemi,
erkekler için sperm bulaşması konularında dikkatli olmak
gerekir.

Farmakokinetik çalışmalarda detaylı talimatlara göre 24
saatlik idrar temiz kaplara toplanır.

Bakteriyel degredasyon ve dondurarak bekletme gibi
durumlarda koruyucu maddelerin eklenmesi gerekebilir.

İdrar stabilitesini sağlamak için numune alma ve analiz
arasındaki zamanı kısa tutmak en iyi çözümdür.
4
İDRAR

İdrar, plazma veya serumdan farklı olarak protein ve
lipid içermez.

Organik bir çözücüyle doğrudan ekstre edilebilir.

Bileşim olarak geniş bir çeşitliliğe sahiptir; gün
boyunca açık renkli olmasına rağmen gece
sonunda sabah ilk idrar koyu amber renklidir.

İdrarda bulunan bileşikler normalde suda çözünür
özelliktedir. İlaçların çoğu yağda çözünür ve uygun
bir çözücü ile idrardan doğrudan ekstre edilebilir.
5
İdrar

En büyük güçlüklerden biri sabit zaman aralıklarında
üretilebilen idrarın hacmidir.

Analitik testlerin çoğunda sabit bir numune hacmi ile analiz
yapmak yaygın bir uygulamadır.

Üriner atılma ile belirli aralıklarla ilgili maddenin bir miktarı atılır
ve derişim yerine derişimle hacmin çarpımından bulunan
miktarı değerlendilir.

Burada problem 2 misli olur.

İdrar hacmi fazla ise numune seyreltiktir ve yöntem saptama
sınırı yakınlarında işleyebilir ve düşük derişimlerde
kanıtlanamayan hatalar hacim için ayarlamalarda misli olarak
artacaktır.

İdrar ile atılım miktarının değerlendirilmesinde büyük bağıl
hatalar büyük mutlak hataya dönüşür.
6
İdrar

Bu yüzden tek bir hastadan toplanan idrarların bir
serisinde, bireysel idrar numuneleri farklı hatalara
maruz kalacaktır ve toplam ilaç atılmasında önemli
ölçüde belirsizlik olacaktır.

Toplam ilaç atılımının sonuçları değerlendirilirken bu
faktörü göz önüne almak gerekir.
7
İdrar

Örneğin bir yarışın ardından rasgele seçilen ve test
numuneleri alınmış olan atletlerin idrarlarındaki özellikle
kafeinin anormal miktarlarına karşılık gelen tayinlerinde
benzer problemler ortaya çıkar.

Sporcuların idrarında kafein için bir derişim sınırı vardır;
ancak atlet özellikle ter vb su kaybına maruz kaldığı
zaman idrar çok derişik olabilir ve kafeinin normal
düzeyi kolayca yasaklı düzeye dönüşür.

Spor otoriteleri problemin bilimsel olmayan görünüşü ve
yorumlanmasını değerlendirirken dikkatli olmalıdır.

Diğer taraftan idrar numunesinin içeriği hatalı
negatiflere neden olabilir.
8
İdrar

İdrar geniş bir pH aralığına sahiptir. İçeriği diyete
veya ilaç kullanımına bağlıdır.

Örneğin antiasitler absorbe olursa idrarı alkali
yapabilir; kuvvetli asit idrar daha az görülür.

İdrar için normal pH aralığı 5.5-7.0 dir.

Atılan ilacın davranışı bu durumda pH ya bağlıdır.
Amfetamin gibi zayıf bazik ilaçlar asit idrarda, zayıf
asidik ilaçlar ise alkali idrarda daha fazla atılırlar.
9
İdrar

Bekletilen idrar karbondioksitini yavaşca kaybeder
ve daha alkali olur bu da inorganik fosfatların
çökmesine yol açar.

pH değişikliğine ilave olarak bu durum analitin
bozunmasına da yol açabilir.

Analit bu fosfatlarla da çökebilir ve analiz için
kaybedilir.

Bu yüzden bekletilmiş idrar taze idrardan farklı bir
bileşime sahip olacaktır. Analitik yöntem ve bu
matrikste ilacın stabilitesinin sağlanması her iki tipin
özellikleri için değerlendirilmelidir.
10
İdrar

Kantitatif çalışmalarda kullanıldığı zaman idrar ile
ilgili önemli diğer bir konu numune alma yöntemi ve
alınan numune miktarıdır.

Acaba hasta mesanesini tamamen boşaltmış mıdır,
böylece belli bir zaman periyodunda ilaç ya da
metabolitinin tamamı idrara geçen miktar olarak
hesaplanabilir mi?

Hastadan bir numune sağlaması istendiğinde
minimum düzeyde idrar verebilir ve bu orta bir
numune yerine ilk yakalanmış düzey olabilir ve
numune bütünü temsil etmeyebilir.
11
Numune Hazırlama

Bir çok ilaç idrar ile konjugatları halinde atılır. Bu
nedenle analizden önce dekonjugasyon işlemi için
asit hidroliz veya beta glukuronidaz enzimi ile hidroliz
edilir.

İlacın kanda kaybolması, idrarda ortaya çıkmasına
neden olur.

Genellikle seyreltme ve tamponlama işlemi
uygulanır. İçeriğinde katı varsa santrifüj veya süzme
işlemi uygulanır.
12
İdrarın Asit Hidrolizi

5 ml idrar üzerine iç standart ve 500 µL derişik
hidroklorik asit eklenir ve karıştırılır.

Otoklav: 121 oC de20 dk tutulur

Su banyosu: (kaynayan su ortamı) 20 dk tutulur.

Isıtıcı blok: 90 oC de 30 dk tutulur.

Soğutulduktan sonra 10 dk 670 g de santrifüj edilir,
pellet atılır.

1 ml 7.4 M NH4OH eklenir ve karıştırılır. Numune pH sı
6.0 ± 0.5 değerine fosforik asit ile ayarlanır.
13

İdrarın enzimatik hidrolizi

5 ml idrara 2 ml ß-glukuronidaz çözeltisi eklenir.

ß-glukuronidaz çözeltisi pH 5.0 olan 1.0 M asetat
tamponu içerisinde hazırlanır.

65 oC de 3 saat hidroliz edilir ve soğutulur.

670 g de 10 dk santrifüj edilir ve pellet atılır.

Numune pH sı 6.0 ± 0.5 değerine 700 µL 1.0 M NaOH
ile ayarlanır.
14
SÜT

Süt ilaçların analizi için çok alışılmış bir sıvı değildir, ancak
anneden bebeğe bu yolla ilaçların geçip geçmediğini
belirlemek için nadiren ilgilenilir.

Çoğunlukla idrar veya serum için uygulanan mevcut yöntemler
fazla güçlükle karşılaşmadan anne sütüne de uygulanabilir.

Temel problem sütte bulunan yağlardır. Ergin insan meme
sütünde yaklaşık % 4,5 yağ bulunur.

Fillokuinon için önerilen bir yöntemde, HPLC analizinden önce
numunedeki yağları hidroliz etmek için lipaz enzimi kullanılmıştır.

Alternatif olarak plazma numuneleri için yukarıda önerilen
yağdan arındırma basamakları yeterli olabilir, insan sütünde
fenoksikam analizi için yağlar 0,5 mL sütün pH 3-4 e
tamponlanıp 10 mL n-hekzanla yıkanmasıyla uzaklaştırılmıştır.
15
BEYİN OMURİLİK SIVISI

Beyin omurilik sıvısı, ilaçların ve doğal biyolojik
ajanların plazma veya serumda tayin edilenlere
göre, etki yerine daha yakın olduğu düşünülen diğer
bir biyolojik sıvıdır.

Bu sıvıda genellikle ağrı kesici (pain-killing) aktiviteli
ilaçların analizine yönelik uygulamalar bulunur.
Analiz numunelerinin kolayca elde edilememesine
karşın, numune mevcut ise plazma veya serum için
geliştirilmiş olan yöntemler kolayca uygulanabilir.

Bu tip modifiye olmayan tayinler beta endorfinler ve
diğer peptidler ve yanısıra enkefalin, morfin ve
nimodipin için bildirilmiştir.
16
SAFRA

Safra, ilaçların analizinde çok sık kullanılmayan kompleks ve
değişken bir sıvıdır. Analiz numunesi sağlanması kolay değildir.
Ayrıca araştırılan proses ile girişim yapabilecek, safra
uzaklaştıran herhangi bir sistem analizde zorluklara neden
olabilir.

Özellikle konjugasyon enzimleri ile ilgili araştırmaların yapıldığı in
vivo karaciğer perfüzyon çalışmalarında, safra, analiz numunesi
olarak kullanılır.

Diğer sıvılar için geliştirilmiş uygun yöntemler safra için kolayca
uygulanamaz.

Örneğin kan, idrar, vitrös humör ve BOS da morfin için ticari RIA
kitleri kullanılarak doğrudan analiz yapılabilir, ancak safra
analizlerinde numunenin bazik yapılması ve
diklorometan:propanol ile ekstre edilmesi gerekir ve kalıntı
serumda çözüldükten sonra analiz yapılır.
17
TÜKRÜK/SALYA

Salya, renksiz, saydam veya yarı saydam, düşük
viskoziteli bir sıvıdır.

İlaç analizi için cazip olmasının nedeni,


girişim yapan maddelerden bağıl olarak uzak olması,

organik çözücülerle kolayca ekstre edilmesi ve

kanda proteine bağlı olmayan ilaç düzeyini
yansıtmasıdır.
Steroidler gibi iyonize olmayan ilaçlar , plazmadan
salyaya kolayca geçebilir ve bu yol ilaç izlemenin
noninvaziv bir yöntemini temsil eder.
18


Salya, ağız boşluğunda başlıca üç salgı bezi
tarafından salgılanır:

(1) Parotid gland: Ağız boşluğu tavanında bulunur, kan
plazmasından kaynak alan salyanın salgılanmasından
sorumludur (Seröz sıvı)

(2) Sublingual gland: Ağız boşluğunun yan taraflarında
bulunur, hem seröz sıvı hemde musin salgılar.

(3) Submandibular gland: Bademciklerin altında
bulunur, hem seröz sıvı hem musin salgılar.
Musin salyaya yapışkan özellik kazandırır.
19
TÜKRÜK/SALYA

Normal kişiler 24 saatte 2 litre salya üretebilir.

Yemekler arasında 15 mL/saat altında ya da üzerinde devamlı
akış sağlar.

Uyarılmamış salyanın pH değeri
Uyarıldığında max pH 8.0 olur.

Uygun zaman sürecinde uygun bir numunenin toplanması güç
bir işlemdir, ancak parafilm gibi bir inert materyal çiğneyerek
veya sitrik asit kullanarak glandların uyarılması ile daha büyük
numuneler kolayca elde edilebilir.

Schramm ve arkadaşları ağız içine yerleştirilen poliüretan bağlı
selüloz yarı geçirgen membranlarda hapsedilmiş sukroz
granülleri içeren bir cihazı ultrafiltre salya toplamak için
kullanmış ve değerlendirmişlerdir. Bu dâhice cihaz sıvının
toplanması ve işlenmesi ile ilgili bazı problemleri ortadan
kaldırmıştır. Uyarılmış salyanın kendi pH değeri ile daha uyumlu
olduğu da bildirilmiştir (pH 7.0 ile 7.8 arası).
5.6-7.0
aralığındadır.
20
Salya, Kan, Plazma ve Serum bileşimlerinin
karşılaştırılması
Salya
Kan
Plazma
Serum
Su
99.5%
-
90-95%
90-95%
Özgül ağırlık
1.002-1.008
1.05-1.06
1.025-1.029
1.024-1.028
pH
5.17-6.77
7.36
7.32
7.32
Toplam
protein
262 mg/100ml
-
6550 mg/100
ml
-
Toplam lipit
2.8 mg/100 ml
-
500 mg/100 ml
-
Fibrinojen
-
-
330 mg/100 ml
-
Kolestrol
<1 mg/100ml
-
-
200 mg/100ml
Klorür
102.8 mg/100
ml
300 mg/100ml
350 mg/100ml
350 mg/100ml
Hemoglobin
0
15 g/100 ml
-
-
21
Salya

Salyadaki ilaçların tayini için analitik yöntem geliştiren
araştırmacılar plazma veya serum gibi diğer sıvılar için
mevcut
yöntemlerin
salyadaki
analizlere
uygulanmasında önemli güçlüklerle karşılaşmamışlardır.
Bu durum terapötik ilaç izleme ve adli uygulamalarda
önemli kolaylık sağlar.

Karşılaşılan küçük problemler ise salyada bulunan
mukoit proteinlere ilaçların (örn. fenitoin) adsorpsiyonu
ve ilaçların uyarıcı materyal tarafından seyrek de olsa
adsorbe edilmesidir.

Salyada ilaçların analizi ile ilgili temel problem teknolojik
bir problem değildir. Ancak böyle analizlerin
sonuçlarının uygunluğu belirlenmelidir.
22
Salya

Kandan salyaya ilacın transferinin pasif difüzyon ile
olduğu kabul edilirse, salya ve kan derişimleri
arasındaki ilişki teorik olarak ifade edilebilir.

Araştırmacılar
beklenen
düzeylerin
analitik
kapasiteleri içerisinde olup olmadığına karar
verebilirler ve salya içerisindeki analitik değerler elde
edilirse kandaki derişimleri belirlemek için uygun
ekstrapolasyonlar yapabilirler.

Henderson- Hasselbach eşitliğini uygulayarak zayıf
bir asidin salya ve plazmadaki ilaç derişimleri oranı
şöyle ifade edilebilir:
23
Salya
Plazma ve salyadaki zayıf asit ilaçlar için derişim oranı
Oran=
1 + 10𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎 𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎
1 + 10𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎 𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎
𝑥
𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛
𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛
Plazma ve salyadaki zayıf bazik ilaçlar için derişim oranı
1+ 10(𝑝𝐾𝑎−𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎 𝑝𝐻)
Oran =
1+ 10(𝑝𝐾𝑎−𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎 𝑝𝐻)
𝑥
𝑝𝑙𝑎𝑧𝑚𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛
𝑠𝑎𝑙𝑦𝑎𝑑𝑎 𝑏𝑎ğ𝑙ı 𝑜𝑙𝑚𝑎𝑦𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖𝑦𝑜𝑛
Salyadaki ilaç derişimi salyanın pH sına ve uyarılma derecesine
bağlıdır.
24
Salya

Plazma pHsı 7.4 olduğunda ve asit ve baz
ilaçların
salya/plazma
oranları
hesaplandığında
salyada
protein
bağlanmasının minimum olduğu gösterilmiştir.

Salyanın pH’sı dağılım üzerine dramatik etkiye
sahip olabilir. Düşük pH larda ve
plazma
proteinlerine %99 bağlanan asidik ilaçlar için
salyadaki derişim plazmadakinin 0.0004 katı
olabilir.

Bu yüzden anlamlı bir yorum için
toplandığında pH’sını ölçmek önemlidir.
salya
25
BLİSTER SIVISI

Blister sıvısı (yeni bir ayakkabının ayakta içi sulu kese
oluşturması, yanık sırasında oluşan kese, sürtünme
nedeniyle el ve ayakta tahriş, kimyasal maruziyeti
gibi) hafif iltihaplı reaksiyonlarda salınan ve
interstisyal sıvıya benzer olan bir sıvıdır ve protein ve
lipid içerir.

İbuprofenin
kullanılmıştır.
farmokokinetiğinin
çalışılmasında
26
SİNOVİAL SIVI

Eklem kıkırdakları arasında bulunan sıvıdır.

Antiinflamatuar ilaçların sinovial sıvıda analizi için
HPLC ile yapılan analizler plazma için kullanılanlar ile
aynıdır.

Eklem romatizmalı hastaların sinovial sıvı ve
plazmasında flurbiprofenin enantiyomerlerinin analizi
için benzer yöntemler kullanılır; sinovial sıvının
sınırlaması sadece numunenin küçük miktarıdır.

Diklofenak
tayininde
plazma
için
kullanılan
ekstraksiyon yöntemi sinovial sıvı için de aynı şekilde
kullanılmıştır.
27
AKÖZ HUMOR

Kornea ile lens arasını dolduran
sıvıdır.

İmipenemin bu sıvıdaki HPLC
yöntemi ile analizi, plazmadaki
tayini için kullanılan yöntem ile
aynıdır.
28
İlginiz için teşekkür ederim.