Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3

Transkript

LC-MS/MS İLE KOLŞİSİN ÖLÇÜM
YÖNTEMİNİN VALİDASYONU
Uzm.Dr .Tevfik HONCA
SUNUM PLANI
•
•
•
•
•
•
GİRİŞ ve AMAÇ
GENEL BİLGİLER
GEREÇ ve YÖNTEM
BULGULAR
TARTIŞMA
SONUÇ ve ÖNERİLER
GİRİŞ
•
Kolşisin, Lily familyasından
Colchicum Autumnale (Acı
Çiğdem) ve Zambakgillerden
Gloriosa superba bitkilerinin bir
alkaloid derivesidir.
•
Çiçekler morumsu pembe renkli
olup, altı lobludur.
•
Bitkideki alkaloidlerin çoğu amid
yapılı ve çok zayıf bazik karakterli
ve nötraldir.
•
Kolşisinin azotu halka dışındadır ve
bir asetamid şeklinde teşkil etmiştir.
•
Burada tropolon bir keton grubu
taşıyan 7 üyeli ve doymamış bir
halkadır. 4 metoksil grubunun 3’ü
benzen, 1’i tropolon halkasına
bağlanmıştır.
•
Kolşisin benzen ve tropolon halkası
taşır ve bu iki halka arasında 53
derecelik bir bükülme vardır. Bu eğim
molekülün tübülinle bağ
oluşturabilmesi için gereklidir.
•
Bu bağ mikrotübülinlerin oluşmasını
engeller ve alkoloidin antimitotik
aktivitesinden sorumludur.
•
Kolşisin mitotik ipliklerin oluşumunu
engelleyerek, metafaz safhasında
mitozu bloke eder.
GENEL BİLGİLER
• Kolşisin trisiklik, yağda
çözünen bir alkaloid olup ana
aktivasyonu etkisi; mikrotübül
polimerizasyonunun
inhibisyonudur.
• Mikrotübüller hücre iskeletini
oluşturan ana protein
filamanlarıdır ve pek çok
aktivitenin düzenlenmesinden
sorumludurlar.
• Mikrotübüller sitoplazma
boyunca uzanan uzun rijit
polimerlerdir
•
Her mikrotübül yüksek labilite ve
değişik antimitotik yapılara sensitif, α
ve β tübülün heterodimerlerinden
oluşmaktadır.
•
Her kolşisin molekülü bir tübülin
molekülüne bağlanır ve polimer
oluşumunu önlemeye çalışır.
•
Mikrotübül oluşumu durur, mitotik uç
hasarlanır ve hücre bölünmesi devam
edemez.
•
Hücre iskeletinin oluşumunun
hasarlanmasıyla, kolşisinin intrasellüler
vezikül motilitesini, sitokinler ve
kemokinler gibi endojen mediatörlerin
de salınımı önlenebilmektedir.
•
Kolşisin yıllar boyunca gut,
psödogut ve ailevi Akdeniz ateşi
(AAA) tedavisinde kullanılmıştır.
•
Bitkinin farmakolojik komponenti
1820 yılında izole edilmiştir ve
1883 yılında saf formu
oluşturulmuştur ve kolşisin adı
verilmiştir.
•
2009 yılında US Food and Drug
Administration (FDA) tarafından
ilacın onaylanmasıyla güvenilir
şekilde uygulanmaya başlamıştır.
•
Kolşisinin sağlıklı gönüllülerde 15 gün
boyunca günlük verilen oral 1mg dozuyla,
plazma seviyeleri 5 gün içerisinde stabil
düzeylere ulaşmaktadır ve 0,7- 1,4 ng/mL
düzeyine gelmektedir.
•
Kolşisin etkileri plazmadan ziyade
lökositlerdeki konsantrasyonuyla ilişkili
olmasına rağmen kolşisin terapisi altındaki
hastalarda plazma ölçüm yöntemleri, düşük
intestinal absorbsiyon, yüksek riskli toksisite
ve tedaviye zayıf yanıt durumlarında yararlı
olmaktadır.
•
Doz bağımlı kolşisin etkileri akut kolşisin
zehirlenmesinden kaynaklanmaktadır ve
yüksek bir mortalite oranına sahiptir.
Terapotik İndeks
•
0.5mg/kg’dan daha düşük olarak
enjekte edilen dozlar gastrointestinal
semptomlara ve pıhtılaşma faktör
eksikliklerine yol açmaktadır.
•
0.5-0.8mg/kg doz oranları kemik iliği
yetmezliğine sebep olabilir ve %10
düzeylerinde mortaliteye yol açabilir.
•
0.8 mg/kg üzerinde bir enjeksiyon
ölüme yol açabilir.
•
Terapötik dozlar 0.015’ten 0.030
mg/kg’a uzanabilir.
•
Terapötik indeksi dardır.
Kolşisin ölçümünde kullanılan
yöntemler
• Ultra-high performance liquid
chromatography (Uhplc)
• (GC/MS)
• Turbulent flow LC-MS/MS
• Charcoal adsorption assay for
measurement of colchicine
GEREÇ ve YÖNTEM
•
Hastalardan analiz için gerekli olan
kan örnekleri 8-12 saat açlığı takiben
sabah 9:00-11:00 saatleri arasında
alındı.
•
Kan örnekleri EDTA içeren mor
kapaklı tam kan tüplerine alındıktan
sonra 4 °C’de 4000 rpm’de 10 dakika
santrifüj edildi.
•
Daha sonra plazma örnekleri ayrılıp
eppendorf tüplerine alınarak çalışma
gününe kadar -80 °C’de saklandı.
•
Bu örnekler çalışma gününe kadar gün
ışığından korundu.
Kullanılan Kimyasal Maddeler

Kolşisin (saflık> %99.5)
Sigma (A.B.D.)

Izopropil alkol
Merck (Almanya)

Diklormetan
Merck (Almanya)

Metanol (HPLC grade)
Merck (Almanya)

Asetonitril (HPLC grade)
Merck (Almanya)

Trikloroasetik asit (TCA)
Merck (Almanya)

Etilasetat
Merck (Almanya)

Amonyum Asetat
Merck (Almanya)

Formik Asit
Merck (Almanya)

Tegafur (saflık> %99.5)
DRG Ins. (Almanya)
Kullanılan Cihazlar Ve Malzemeler
•
Ultra Hızlı Sıvı Kromatografisi (UFLC)
Sıralı Kütle Spektrometresi (MS/MS)
Cihazı Ve Ekipmanlari
–
–
–
–
–
–
–
–
Otomatik örnekleme sistemi: Shimadzu
Prominence SIL-20AC HT, Shimadzu
Technologies, Japan.
Paralel Tipte Çiftli Pompa: Shimadzu Prominence,
LC-20AD Shimadzu Prominence, Shimadzu
Technologies, Japan.
Degasser: Shimadzu Prominence, DGU-20A5,
Shimadzu Technologies, Japan.
Kolon Fırını: Shimadzu Prominence, CTO-10 AS
VP, Shimadzu 1200, Shimadzu Technologies,
Japan.
Mikroişlemci: AB SCIEX for LC.
Yazıcı: Xerox Phaser 3140.
Sıralı Kütle Spektrometresi: Applied Biosystems
Sciex API 3200 QTrap mass spectrometer (Applied
Biosystems Sciex, Ontario, Canada)
Iyonizasyon Modu: Elektrospray İyonizasyon (ESI)
Kullanılan Cihazlar Ve Malzemeler
• Analitik Kolon
– C18 hidrokarbon zincirine bağlı silika içeren, partikül büyüklüğü 5 µm
olan 4.6 x 150 mm boyutlarındaki ODS-3 ters faz kolon (ACE C18
kolon 5 µm, 150 mm×4.6 mm i.d).
• Guard Kolon:
– Phemomenex ODS-3, C18 5 µm koruyucu kolon
• Ultrasonik karıştırıcı (Branson 3200, Almanya)
• Vorteks (Heidolph, Almanya)
• Santrifüjler
– Soğutmalı santrifüj (Eppendorf 5420, Almanya)
– Normal santrifüj (Labofuge 200, Thermo Scientific, İngiltere)
• Milli-Q su arıtma cihazı (Elga, Almanya)
• Millex-HV örnek süzme filtresi (sellüloz asetat 0.2 ve 0.45 µm)
Yöntem
• Sulu Mobil Faz Çözeltisi 1
– 1 gr amonyum asetat (CH3COONH4) tartılarak,
500 ml distile su ile karıştırılıp manyetik karıştırıcı
sayesinde çözüldü. Daha sonra 1 ml % 0.1’lik
formik asit ile çözelti 1000 ml ye tamamlandı.
• Mobil Faz 2:
– 1 lt Metanol +1 ml % 0.1 Formik Asit
IS Tegafur
• Kolşisin protonlandığında m/z
400.3→358.1 ve m/z
400.3→310.2 iki iyona
dönüştüğünden bileşiği
tanımlamak için bu değerler
kullanıldı.
• Tegafuru tanımlamak için ise
m/z 200.8→130.9 değerleri
kullanıldı.
• Burada IS olarak tegafur
seçilmiştir.
Metod Değerler
•
Kütle spektrometrisi parametrelerini
optimize etmek için, analit (kolşisin) ve
internal standardın (tegafur) bir karışımla
cihaza verilmesi sağlandı.
•
Optimizasyon parametreleri; curtain gaz,
gaz 1 ve gaz 2 (nitrogen) sırasıyla; 15, 50
ve 30 birim, bekleme süresi; 200 ms;
kaynağın sıcaklığı 550 0C; IonSpray
voltage 4000 V. Declustering potential
colchicine için 79 V ve tegafur için 45 V
olarak uygulandı. Collision energy kolşisin
molekülleri için 31 eV (m/z 400.3→358.1)
ve 40 eV (m/z 400.3→310.2) ve Tegafur
için 9 eV olarak uygulandı.
•
Bu optimizasyon değerleri defalarca
yapılan işlemlerden sonra ortaya kondu ve
diğer ölçümlerde standart olarak uygulandı.
XIC of +MRM (3 pairs): 200.800/130.900 Da ID: tegafur from Sample 18 (colc (6.25 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoo...
Max. 355.7 cps.
790
750
700
BULGULAR
650
600
550
I n t e n s it y , c p s
500
450
400
1166
350
300
250
200
100
50
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Time, min
XIC of +MRM (3 pairs): 200.800/130.900 Da ID: tegafur from Sample 18 (colc (6.25 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoo...
Max. 238.9 cps.
1155
239
230
220
210
200
190
180
170
160
150
0
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Time, min
XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 18 (colc (6.25 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoothe...
Max. 435.0 cps.
3106
435
420
400
380
360
340
320
300
280
• LC-MS/MS Kolşisin
metodu ile yapılan
kolşisin ölçümü 6.25
ng/mL’lik standart
çözeltisinden elde
edilen
kromatogramlar..
150
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Time, min
3.0
3.5
4.0
Doğruluk (Accuracy)
• Bir yöntemin doğruluğu elde
edilen değerin gerçek değere
veya referans kabul edilmiş
olan değere yakınlığının
ölçüsüdür.
• Kolşisin konsantrasyon
düzeylerine göre yöntemin
doğruluğunun
değerlendirilmesi tablo 1de
verildi.
Tablo 1 Kolşisin konsantrasyonlarına göre yöntemin doğruluğunun değerlendirilmesi .
Güniçi Tekrarlanabilirlik
GÜN İÇİ TEKRARLANABİLİRLİK
• Hazırlanan standart çözeltiler 20
ayrı eppendorf tüplerine
aliquotlandı.
• Çalışma günü bir aliquot çıkarıldı
ve aynı gün içerisinde 20 kez ard
arda ölçüldü.
• Elde edilen sonuçlara göre
ortalama, standart sapma (SD) ve
varyasyon katsayısı (%CV)
değerleri hesaplandı veTablo 2 de
verildi.
KOLŞISIN METODU
Kolşisin (12.5 ng/mL) Tegafur 10 ng/mL)
Ölçüm No
alanlarının oranları
1. enjeksiyon
2. enjeksiyon
3. enjeksiyon
4. enjeksiyon
5. enjeksiyon
6. enjeksiyon
7. enjeksiyon
8. enjeksiyon
9. enjeksiyon
10. enjeksiyon
11. enjeksiyon
12. enjeksiyon
13. enjeksiyon
14. enjeksiyon
15. enjeksiyon
16. enjeksiyon
17. enjeksiyon
18. enjeksiyon
19. enjeksiyon
20. enjeksiyon
Ortalama
SD
%CV
3,70
3,17
3,01
3,49
3,29
3,36
3,19
3,37
3,38
3,22
3,70
3,17
3,01
3,49
3,29
3,36
3,19
3,37
3,38
3,22
3,32
0,19
5,72
Tablo 2.Kolşisin metodu için gün içi tekrarlanabilirlik çalışması
Günler Arası Tekrarlanabilirlik
• Hazırlanan standart çözeltiler 20
ayrı eppendorf tüplerine
aliquotlandı.
• Her çalışma günü +4 oC’den
çıkarılarak, 20 gün boyunca
ölçüldü.
• Sonuçlara göre ortalama,
standart sapma (SD) ve
varyasyon katsayısı (%CV)
değerleri hesaplandı ve
Tablo 3’de verildi.
GÜNLER ARASI TEKRARLANABİLİRLİK
Ölçüm No
1. gün
2. gün
3. gün
4. gün
5. gün
6. gün
7. gün
8. gün
9. gün
10. gün
11. gün
12. gün
13. gün
14. gün
15. gün
16. gün
17. gün
18. gün
19. gün
20. gün
Ortalama
SD
% CV
KOLŞISIN METODU
Kolşisin (12.5 ng/mL) Tegafur 10 ng/mL)
alanlarının oranları
3.70
3.28
2.49
3.50
3.62
2.57
3.40
3.09
2.71
2.94
3.19
3.37
3.22
2.75
2.89
2.79
3.51
3.49
3.00
2.79
3,12
0,38
12,1
Tablo 3.Kolşisin metodu için günlerarası tekrarlanabilirlik çalışması
Linearite
• Farklı konsantrasyonlarda
hazırlanan standart çözeltiler ile
yapılan linearite çalışmalarında,
kolşisin standart
konsantrasyonları ile elde
edilen ölçüm sonuçlarının 50
ng/mL’ye kadar lineer olduğu
saptandı.
• Linearite çalışması sonucunda,
pik alanları ile
konsantrasyonlarının oldukça
uyumlu olduğu gözlendi.
Geri kazanım
•
•
Çalışmamızda kolşisin ölçümünün
yapılacağı plazma ile bu plazmaya,
değişik konsantrasyonlarda kolşisin
standartları eklenerek elde edilen
örnekler ile 3’er defa ölçümler
sonucunda geri kazanım oranları
tespit edildi.
Buna göre; 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50
ng/mL bu konsantrasyonlarda
verimlilik sırasıyla 0.96, 0.98, 0.96,
0.96, 0.97 şeklinde bulundu. Bu
sayısal verilerin ışığında en yüksek
geri kazanımın %98 ile 25 ng/mL
konsantrasyonda olduğu gözlendi.
GERİ KAZANIM
Eklenen
Konsantrasyon
(ng/mL)
50
50
50
25
25
25
12,5
12,5
12,5
6,25
6,25
6,25
3,12
3,12
3,12
Ölçülen
Kazanılan
48,7
47,6
49,1
23,7
24,6
23,9
12,3
11,8
12,03
6,2
6,1
6,08
3,08
2,94
2,98
0,97
0,95
0,98
0,95
0,98
0,96
0,98
0,94
0,96
0,99
0,98
0,97
0,99
0,94
0,96
Verim%
0,97
0,96
0,96
0,98
0,96
Tayin Limiti (Limit of Detection: LOD)
•
LOD için sinyal gürültü oranı (S/N: signal to noise) 3'ün üzerinde
olmalıdır.
•
Denediğimiz en düşük konsantrasyon olan 0.01 ng/mL konsantrasyonunda
S/N oranı 9.5 olarak bulunmuştur.
•
Bu nedenle yöntemimize ait LOD konsantrasyonu 0.01 ng/mL olarak
kararlaştırıldı (Şekil 1).
•
Kromatogramda yumusatma (smoothing) yapıldığında S/N oranı artmakta
yani kromatogram kalitesi de yükselmektedir.
•
Örneğin LOD için kromatogram yumuşatması yapıldığında S/N oranı 26.7
olmaktadır (Şekil 2).
XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 41 (colc (0.01 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray)
Max. 100.0 cps.
3.46
100
95
90
S/N = 9.5
85
80
Peak Int.(Subt.)=9.5e+1
75
70
Ymax=1.0e+1 cps Ymin=0.0e+0 cps
S/N = 9.5
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
!- Noise -!
10
5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Time, min
Şekil 1. LOD değerinin bulunması için
elde edilen kromatogram
XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 41 (colc (0.01 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoothed...
Max. 45.3 cps.
3.46
45
44
42
S/N = 26.7
40
38
36
34
32
Ymax=1.7e+0 cps Ymin=1.4e-10 cps
30
28
26
24
22
20
18
16
14
!- Noise -!
12
10
8
6
4
2
0
! - Noise - !
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Time, min
Şekil 2. Yumuşatılmış LOD değerinin bulunması için elde edilen kromatogram
4.0
Ölçüm Limiti (Limit of Quantitaion: LOQ)
•
LOQ için, sinyal gürültü oranı (S/N: signal to noise) 10‘ un üzerinde
olmalıdır.
•
S/N oranı 0.01 ng/mL kolşisin konsantrasyonu için 9.5 olarak
bulunduğundan bir üst konsantrasyona bakıldı.
•
0.05 ng/mL konsantrasyondaki kolşisinin S/N oranı ise 16.5 olarak bulundu
(Şekil 22).
•
Dolayısıyla LOQ değeri, 0.05 ng/mL kolşisin konsanstrasyonu olarak
belirlendi.
•
Kromatogram yumuşatıldıktan sonra S/N oranı 53.7 olmuştur (Şekil 23).
XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 37 (colc (0.05 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray)
Max. 170.0 cps.
170
160
S/N = 16.5
150
140
130
3.49
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
-!Noise!-
10
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
S/N = 16.5
4.0
Time, min
Şekil 22. LOQ değerinin bulunması için elde edilen kromatogram
XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 37 (colc (0.05 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray),
Smoothe... cps Ymin=0.0e+0 cps
Ymax=1.0e+1
3.47
110
105
100
S/N = 53.7
95
90
85
80
Ymax=2.0e+0 cps Ymin=7.4e-4 cps
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
-!Noise!-
10
5
0
! - Noise - !
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Time, min
Şekil 23. Kromatogramda yumuşatılmış LOQ hesaplanması
4.0
Max. 110.0 cps.
• Bu hesaplamalar sonrasında yöntemin tekrarlanabilirliğin kabul
edilebilir olup olmadığının belirlenmesinde, NCCLS EP5
protokolünde belirtilen kriterlerden yararlanıldı.
• Günde tek çalışma ile yapılan hesaplamalarda, NCCLS EP15
protokolünde gösterilen çalışma iş akışı ve formüller kullanıldı.
• LOD VE LOQ hesaplamaları esnasında NCCLS EP15 protokolünde
gösterilen çalışma iş akışı ve formüller kullanıldı.
• Doğruluğun hesaplanması esnasında ise NCCLS EP 9 ve EP15
protokolünde gösterilen çalışma iş akışı ve formüller kullanıldı.
• Sonuç olarak, plazma kolşisin ölçümünde laboratuvarımızda
kullanacağımız yeni geliştirdiğimiz LC-MS/MS metodu ile daha
kısa zamanda analiz imkânı tanıması, mobil faz hazırlama kolaylığı,
maliyet düşüklüğü, daha iyi kromatogramların ve daha doğru
sonuçların elde edilmesinin sağlanması gibi nedenlerden tercih
sebebi olacağı düşünülmektedir.
• Laboratuvarımızda kurduğumuz LC-MS/MS yöntemi ile kolşisin
ölçümü, Türkiye’deki ilk kolşisin ölçümü olma özelliği de
taşımaktadır.
• Yapılacak daha ileri çalışmalar ile daha standardize LC-MS/MS
yöntemleri için bir ön çalışma niteliği de taşımaktadır.
Teşekkürler…

Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3

Transkript

Benzer belgeler

Tilmivet

65BG ve 95BG motorların yakıt enjeksiyon pompası avans

NEXERA - Ant Teknik

61ıntramuskuler(ım)e..

Ailesel Akdeniz Ateşi (AAA)