Clostridium botulinum

Clostridium botulinum 1
Nezihe TUNAİL
Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü
01. Genel Bilgiler
02. Morfolojik, Kültürel Özellikleri ve Doğal Olarak Bulundukları Yerler
03. Diğer Önemli Özellikleri
03.01. Proteolitik Aktivite
03.02. Enterotoksinleri
03.03. Isıya Direnci
04. Hastalığın Belirtileri ve Aracı Olan Gıdalar
05. Clostridium botulinum ve Toksinlerinin Belirlenmesi
01. Genel Bilgiler
Bacillaceae familyasında bulunan Clostridium cinsinin bir üyesi olan C. botulinum
nörotoksini bilinen en öldürücü doğal bileşiklere örnek oluşturmaktadır.
'un
02. Morfolojik, Kültürel Özellikleri ve Doğal Olarak Bulundukları Yerler
C. botulinum sporlu, anaerob, hareketli, Gram pozitif özellikte çubuk şeklinde bir bakteridir.
Oval veya silindirik formlu sporlar hücrede terminal veya subterminal pozisyonda bulunurlar ve
çoğunlukla vejetatif hücrenin spor bulunan bölgesinin şişmesine (raket formu) neden olurlar.
İmmunolojik yöntemlerle birbirinden ayrılabilen 8 ayrı toksin (A, B, C1, C2, D, E, F, G)
oluşturan 8 ayrı tipi bulunmaktadır. Son olarak Arjantin topraklarından izole edilen G tipi bugün
C. argentinense olarak anılmaktadır. İnsanlarda görülen botulizme A, B, E, F tipleri neden
olurken, C ve D tipleri hayvanlarda botulizm etmeni olarak belirlenmiştir. G tipinin botulizme
neden olduğuna ilişkin veriler bulunmamaktadır.
Mezofilik bir mikroorganizmadır ancak tiplere göre sıcaklık istekleri değişir. Tip A ve B
optimum 37 oC de gelişir. Bunlar için minimum gelişme sıcaklığı 10-12.5 oC, maksimum
gelişme sıcaklığı da 47.5-50 oC arasındadır. E tipi optimum olarak 30 oC de gelişmektedir.
Minimum gelişme sıcaklığı ortalama olarak A ve B tipleri için belirlenen sıcaklıkların 10 oC
altındadır, maksimum gelişme sıcaklığı ise, A ve B tiplerinin isteğinden 5 oC daha düşüktür. F
tipi psikrotrof olup çok düşük derecelerde bile uzun sürede toksin oluşturabilmektedir. C.
botulinum optimum olarak pH 6.0-7.5 arasında gelişir. pH 4.5' un altında gelişmeleri engellenir.
Sporlarının çimlenmesi için minimum sıcaklık ve pH istekleri bakterinin gelişebilmesi için
gerekli minimum değerlerden biraz daha yüksektir. Sporların çimlenebilmesi için en düşük
derece 15 oC ve en düşük pH 5.0-5.1 olarak belirlenmiştir. Genel olarak pH' nın spor çimlenmesi
ve gelişme için optimum oluşu toksin oluşumunu da stimule eder. Toksin oluşumunda minimum
su aktivitesi değeri; A ve B için As= 0.94, E tipi için de As= 0.97' dir. Sıcaklığa dirençleri; A ve
B tipleri için D121 oC = 0.2 dakika F tipi için D121 oC = 0.17 dakika olarak belirlenmiştir. %
10 oranında tuz ve % 60 oranında sakkaroz ortamlarında C. botulinum toksin oluşturmaz. Tuzun
daha düşük konsantrasyonları (% 3.0-3.5), eğer beraberinde koruyucu teknolojik bir işlem
1
Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, 2000. Genişletilmiş 2. Baskı; Ankara Üniversitesi
Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü yayını. Sim Matbaası, Ankara 522 s 03. Bölüm, 03. kısım
1
(tütsüleme, ısıl işlem uygulaması) varsa toksin oluşumunu engeller. Gıdalara katılan nitratlar da
gelişmeyi ve toksin oluşumunu, O/R potansiyelini yükselterek ve hidroksilamin (NH2OH)
oluşturarak engeller.
Clostridium botulinum suşlarının doğal habitatları toprak ve deniz tabanları ile kıyı sularıdır.
Göllerin sedimentlerinde, balıkların sindirim kanallarında, bahçede yetiştirilen sebzelerde
bulunurlar. Bunlardan özellikle E tipi kıyı sularında ve balıklarda görülür. Topraktan her tarafa
dağılımı söz konusudur.
03. Diğer Önemli Özellikleri
03.01. Proteolitik Aktivite
Fermentasyon yapan C. botulinum türleri, sakkarolitik ve proteolitik özelliklerine göre de
sınıflandırılmıştır. İçlerinde A tipi toksin yapanlar, B ve F tipi toksin yapanların bir kısmı
proteolitik bulunmuştur. Proteolitik aktivite göstermeyen grupta; E tipinin tüm suşları ile B ve F
tipi toksin yapanların proteolitik olmayanları yer almaktadır. C ve D tipi C. botulinum suşları da
proteolitik değildir, her iki tip de ortak metabolik sisteme sahip olduğundan ayrı bir grupta
toplanmıştır. Proteolitik suşlardaki endojen proteazlar veya refakatçi flora olarak bulunan
proteolitik suşların proteazları C. botulinum toksininin aktivitesini artırmada rol oynar.
03.02. Enterotoksinleri
Toksinler sıcaklığa dayanıksız, suda çözünebilen, asitlere dirençli yüksek moleküllü
proteinlerdir. İçlerinde A tipi toksinin toksisitesinin B tipi toksinden daha yüksek olduğu
belirlenmiştir. Nörotoksik proteinin 150 MDa büyüklükte tek bir polipeptid zincirden oluştuğu
saptanmıştır. Bu polipeptid yapı; proteolitik olan A, B, F tiplerinde endojen proteazlar
aracılığıyla, proteolitik olmayan B, E, F tiplerinde ise ekzojen proteazlar yardımıyla iki zincire
parçalanır ve buna bağlı olarak toksisite artar. Toksinin 35 ng-10 mg arasındaki dozunun bir
insanı öldürmeye yeterli olduğu düşünülmektedir. Toksin, organizmanın logaritmik gelişme
evresinde sentezlenmekte ve hücre içinde birikmekte, logaritmik gelişme döneminin sonunda
büyük olasılıkla liziz sonucu ortama geçmektedir. Toksinin hücre dışına çıkışında başka bir
mekanizmanın var olup olmadığı bilinmemektedir. Gıda ile alınan toksin ince barsağa ulaştıktan
sonra burada absorbe olur ve lenf sistemi yolu ile kana karışır. Ardından sinir sistemine ulaşan
toksin burada belirli noktalara bağlanarak sinirlerin komuta ettiği kaslara komutların
gönderilmesini engellemekte ve kasların paraliz (felç) olmasına neden olmaktadır. Toksinin etki
mekanizmasına ilişkin tam açıklanamamış bazı bilgiler mevcuttur. Nörotoksik etkili proteinin,
sinir düğüm ve kavşaklarında uyarı mesajlarının iletilmesini bloke ettiği, bunun sonucu olarak da
sinir uçlarında asetilkolinin serbest hale geçmesinin engellendiği bilinmektedir. Anlaşılamayan
kısım ise bu sonuca götüren blokajın nasıl olduğudur. Kesin olan, toksinin etkisinin
nöromuskular blokaj şeklinde ortaya çıktığıdır.
03.03. Isıya Direnci
C. botulinum toksinleri ısıya duyarlıdır. Kaynama derecesinde birkaç saniyede tahrip olurlar. 80
o
C de 6 dakikada, 72 oC de 12 dakikada tamamen inaktif hale geçerler. Bu durum özellikle tekrar
ısıtılarak yenen konserve ve diğer yiyeceklerde toksin rizikosunu azaltmaktadır.
2
04. Hastalığın Belirtileri ve Aracı Olan Gıdalar
Toksinli gıdanın tüketilmesinden yaklaşık 12-36 saat sonra intoksikasyon; bulantı, kusma, ağrılı
ve kramplı mide ve barsak rahatsızlığı şeklinde ortaya çıkar. Çift görme, dil ve boyun kaslarında
felç ve en son olarak da solunum felci görülür. İntoksikasyonun ortaya çıkması gıdaya bağlı
olarak 4 saatten 4 güne kadar değişebilir. Karın bölgesindeki ağrı ve kramplar hastalığın
apandisit veya barsak düğümlenmesiyle, bazen de ağızda ve boğazda görülen kuruma, yanma,
kızarma belirtileri faranjitle karıştırılabilir. Toksin ağız yolu ile alındığında minimal toksik dozun
0.1-1.0 mg olduğu düşünülmekle beraber toksinin daha geniş sınırlarda (35 ng-10 mg) ölüme
neden olabileceği de ileri sürülmektedir.
Toksinin taşınmasında aracı olan gıdalar arasında evde yapılan sebze konserveleri başta gelir.
Yeterli ısıl işlem görmemiş (ticari sterilizasyon sıcaklığına ulaşamamış) ve asitliği fazla olmayan
sebze konservelerinin yanında yine evlerde; tuz-sirke karışımına yatırılarak ve baharatla
çeşnilendirilerek hazırlanan sebzeler, çiğ jambon, tütsülenmiş veya fermentasyon yolu ile
lezzetlendirilmiş balıklar, buharla az pişirilen balıklar, salamura et ürünleri, ciğer ezmesi vb
yiyecekler botulizme aracı olan gıdalardır. Özellikle uzak doğu ve İskandinav ülkelerinde aracı
gıdalar olarak balık önemli görülmektedir. Sebze konserveleri (yeşil fasulye, bezelye, bakla,
mercimek, nohut, ıspanak, kuşkonmaz) sık sık zehirlenmeye neden olur. Çeşitli salata sosları,
özellikle domates, biber gibi sebzelerden hazırlananlar, C. botulinum toksinlerinin taşınmasında
önemli paya sahiptir.
Hasta zehirlendikten sonra kurtulması için polivalan antitoksin ile toksinin nötralizasyonu
gerekmektedir. Nefes alma zorluğu baş gösterdiğinde de yapay solunum uygulanmalıdır.
05. Clostridium botulinum ve Toksinlerinin Belirlenmesi
Clostridium botulinum' un gıda içerisinde kültürel yöntemle varlığının gösterilmesi veya
sayılması intoksikasyonun seyri dikkate alındığında çok fazla anlam taşımamaktadır. Gıdalarda
toksinin belirlenmesinde kullanılan geleneksel analiz yöntemi farelerle yürütülen letal doz
testidir. Bu yöntem günümüzde hala en geçerli yöntem olarak kullanılır. Farelere farklı
antitoksinler verilerek gıdadaki enterotoksin tipi nötralizasyon sonuçları ile ortaya konulabilir. C.
botulinum nörotoksinlerinin belirlenmesi için birçok immunolojik yöntem geliştirilmiştir. Ancak
geliştirilen immunolojik analiz yöntemlerinde belirlenen immunolojik aktivitedir. Toksinin
biyolojik aktivitesini ortaya koyabilecek yöntemlerin de geliştirilmesi gerekmektedir.
Bugün için Sandwich ELISA, floresan antikor teknikleri veya RPLA testleri henüz fare
denemelerinin yerine geçebilmiş değildir. Örneğin RPLA testinin, toksini değil, toksin
komponentlerinden birini belirlemeye yönelik olduğu belirtilmiştir. Floresan antikor tekniği
bakterinin E tipi toksini için kullanılmaktadır. Ancak gıdalarda henüz bu yolla toksin saptamak
mümkün olamamaktadır. Monoklonal antikor tekniğinin gelişmesi ile gelecekte immunolojik
toksin belirleme yöntemlerinin hayvan denemelerinin yerine geçeceği düşünülmektedir. PCR ve
gen sondalarının da henüz başarılı kullanımları görülmemektedir.
Clostridium botulinum' un spor varlığının ballarda gösterilmesi tüm gıdalar içerisinde üstünde en
fazla durulan konudur. Süt emmekte olan bebeklerde spontan olarak ortaya çıkan bebek
botulizmlerine C. botulinum sporları neden olur. Sporların jerminasyonu ile barsakta gelişen C.
botulinum vejetatif hücreleri, toksin oluşturarak bebek botulizmlerini yaratır. Bu şekildeki
vakaların ABD, Japonya ve İngiltere' de ortaya çıktığı belirtilmektedir. Ballar da A ve B tipi
3
toksin yapan C. botulinum sporlarını içerdiklerinde aynı tehlikeli sonucu yaratabilmektedir. İşte
böyle gıdalarda C. botulinum varlığının veya sayısının belirlenmesi yerine gıda içerisinde veya
örneğin broth kültüründe toksinin geliştirilmesi ve gıda ekstraklarının deney farelerine verilerek,
toksin oluşumunun ispatlanması yoluna gidilmektedir. Bu yolla balda C. botulinum veya spor
varlığı belirlenmektedir.
Balda C. botulinum varlığının gösterilmesi için 45 oC ye ısıtılan ve homojen hale getirilen bal 1:1
oranıyla steril destile suyla karıştırılarak (Örneğin 25 g bal : 25 ml steril su) bir dializ tüpünde,
+4 oC de 24 saat süreyle suya karşı usulüne uygun olarak dializ edilir. Dializ tüpündeki bal+su
karışımı, içinde önceden sterilize edilmiş çok az miktarda Cooked Meat Medium (CMM)
bulunan bir erlene boşaltılır (5 g CMM az bir su içinde sterilize edilir). Dializ tüpü Triptone
Peptone Glucose Yeast Extract (TPGY) Broth ile yıkanarak erlene alınır (2 x 60 ml; 1 kat
konsantre TPGY kullanılır). Hacim aynı broth ile 300 ml' ye tamamlanarak 80 oC de 25 dakika
su banyosunda ısıtılır ve 4 gün süreyle inkübe edilir. Gelişmeden sonra broth santrifüjlenerek
süpernatantta toksinin varlığı deney hayvanları kullanılarak gösterilir.
C. botulinum' un izolasyonu ve identifikasyonu amaçlandığında ise bakteri tehlikeli olduğundan
toksoidlerle korunmak gerekir. C. botulinum içerdiği düşünülen gıdanın 1:1 oranıyla absolü alkol
içerisinde oda sıcaklığında bir saat tutulması, refakatçi floranın ve C. botulinum vejetatif
suşlarının öldürülmesi için gereklidir. Bu karışımdan öze ile Egg Yolk Agar (EYA) veya Liver
Veal Egg Yolk Agar (LVEYA) plaklarına sürülür, plaklar 35 oC de 48 saat inkübasyona bırakılır.
Bu besiyerleri üzerinde C. botulinum beyaz-sarı, yassı, homojen olmayan tipik koloniler
oluşturur. Kolonilerin etrafında sedefli parlaklık gösteren presipitasyon zonları eğik ışıkta
bakıldıklarında daha belirgin olarak görülürler. Diğer Clostridium türleri de aynı tarzda koloni
verebileceklerinden, en az 3-5 koloni CMM' a (A, B tipi için) ve TPGY Broth' a (E tipi için)
aşılanır. Birinci besiyeri 35 oC de, ikinci besiyeri 26 oC de 5' er gün inkübasyona bırakılır.
Gelişen kültürlerde biyokimyasal testler yürütülür.
Zenginleştirme gerekiyorsa; işlenmemiş ve az işlenmiş gıdalar için Differential Reinforced
Clostridial Broth (DRCB) veya Modified Peptone Colloid Broth (MPCB) kullanılır. Çok fazla
işlem görmüş gıdaları ise taze hazırlanmış Pork Pea Infusion Broth (PPIB) veya Beef Infusion
Broth (BIB) besiyerlerinde 37 oC de 72 saat zenginleştirmek gerekmektedir. Gelişmenin
görüldüğü tüplerden seyreltiler yapılarak Sülfite Polymyxin Sulfadiasine Agar (SPSA) plaklarına
ekim yapılır ve 32 oC de 48-72 saat inkübasyona bırakılır. Plakta gelişen siyah kolonilerden 3-5
adet seçilerek biyokimyasal testler gerçekleştirilir.
4