Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3

METABOLİK ENZİM VE TRANSPORTER GENLERİNİN
EKSPRESYON ANALİZİ İLE METABOLİK YOLLARIN
AYDINLATILMASI
Prof.Dr. Ö.İrfan KÜFREVİOĞLU
Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü
Biyokimya Anabilim Dalı Erzurum/TURKEY
GEN
Moleküler anlamda gen, fonksiyonel bir ürün; rRNA (ribozomal RNA),
tRNA (transfer RNA) ve polipeptit zincirini kodlayan DNA dizisi olarak
tanımlanabilir. Protein genleri, hücreler tarafından yapılan proteinlerin
çeşitlerini tayin ederek etkilerini gösterirler.
GEN EKSPRESYONU
DNA’da mevcut olan genetik bilginin ifade edilmesi yani
bilginin kullanılması olayıdır.
Replikasyon
Normal hücrelerde genetik bilginin akışı şu şekilde olur;
Gen
mRNA
Transkripsiyon
Protein
Translasyon
Hayvan genomları, 15.000 (Drosophila) ve
23.000 (insan, fare) arasında gen ihtiva ederler;
bu genlerin büyük kısmı düzenleyici proseslerde
gerekli olan proteinleri kodlarlar. Bu genlerin
büyük çoğunluğunun sekanslarının
bulunması,
temelini teşkil eden
biyolojik regülasyonun
kompleks genetik ve protein etkileşmelerini
araştırma imkanlarına neden olmuştur. Birçok
bileşen ihtiva eden düzenleyici metabolik ağın
anlaşılması için, her bir komponentin ekspresyon
zamanının
ayrıntılı
bir şekilde
önemli bir avantaj sağlar.
bilinmesi
Gen ekspresyonu; Northern analizi, Rnaz koruma ölçümleri, gen
arrayleri, RNA in situ hibridizasyonu ile protein seviyesinde
yapılan Western Blot ve immunohistokimya gibi metotları içeren
çok geniş bir spektrumda incelenebilir.
RNA in situ hibridizasyonu vasıtasıyla gen ekspresyon analizine dayanarak, binlerce
genin
uygun zaman periyodunda ekspresyon örneklerinin belirlenmesi için etkili
teknolojilere gerek vardır. Değişik dokularda gen ekspresyon örneklerinin tayini ve
gösterilmesine izin veren tamamen otomatik olarak düzenlenmiş böyle bir sistem,
Göttingen
Max-Planck
Enstütüsünde
geliştirilmiştir.
Ayrıca
RNA in
situ
hibridizasyonu vasıtasıyla elde edilen gen ekspresyon verilerinin otomotik mikroskopik
taranması için bilgisayar programı oluşturulmuştur.
Bu çalışmada, bazı merkezi metabolik yol enzim genlerinin (TCA devri,
glikoliz yolu, bazı lipid ve amino asit metabolizmaları vb.) cDNA’larının
üretimi tarafımızdan gerçekleştirilmiştir. Antisens mRNA sentezi ve in situ
hibridizasyon
işlemleri,
Prof.
Dr.
Gregor
Eichele
gözetiminde
Göttingen Max-Planck Enstitüsünde burslu bölümümüz elemanları
Dr. Murat ÇANKAYA ve Dr. Harun BUDAK tarafından yapılmıştır.
Glutamat metabolizması genleri için,
12,5, 14,5, 15,5 günlük fare embriyoları
ile P56 yetişkin beyninde, diğer genler
için 14,5 günlük fare embriyosunda in situ
hibridizasyon yöntemi ile gen ekspresyon
örnekleri çıkarılarak
http://www.genepaint.org/
ve http://www.metscout.mpg.de/ web
sitesine konulmuştur (toplam 750 gen). Bu
çalışmaların diğer teknolojilerle
kombinasyonu sonucu, beyin ve diğer
dokuların gelişimi ve fonksiyonlarının
temelini oluşturan genetik ve biyokimyasal
ağın anlaşılmasına ışık tutulacaktır.
In Situ Hibridizasyon Yöntemiyle Gen
Ekspresyon Analizi
Geffers, L.
İlk önce çalışılacak olan enzim genlerinin taraması yapıldı.
Çalışılacak genler belirlendikten sonra bu genler için
20 bazlık spesifik primerler hazırlandı.
Daha sonra mRNA’lardan revers transkriptaz enzimi
vasıtasıyla elde edilen komplementer DNA (cDNA)
kütüphanesi kullanılarak PCR ile istenilen gene spesifik
yaklaşık 1000 bazlık cDNA probu sentezlendi.
Çoğaltılan bu cDNA probundan ilgili genin mRNA’sına
komplementer olan bir antisens mRNA sentezlendi.
Sentezlenen antisens mRNA, bir robot kullanılarak lam
üzerine serilmiş fare embriyosu veya yetişkin fare beyni
üzerinden geçirildi. Lam üzerindeki fare mRNA’sıyla, sentetik
antisens mRNA probu hibridize edildi ve daha sonra boyama
tekniğiyle genin nerelerde ekspresyona uğradığı belirlendi.
PRİMER DİZAYNI
İlgili gen için
sekans bilgisi ve
yer bilgisi tam
olarak bulundu.
Genin spesifik
probunu elde
etmek için gen
sekansında en iyi
bölge seçildi.
Genin spesifik
primerinin
seçimi için
primer 3
bilgisayar
programı
kullanıldı.
Genin spesifik
probu üzerinde
son kontrol
yapıldı.
Dizayn edilen
primerlerden;
left primerin
ucuna T7, right
primerin ucuna
SP6
promotorları
takılarak sipariş
edildi.
«www.ncbi.nlm.nih.gov» internet sayfası açıldı.
1 .«All Databases»
kutucuğu tıklanır.
2. «Nucleotide» seçeneği
seçilir.
3. Arama bölgesine aranacak
genin adı «Atp9a» girilir.
4. «Search»
tıklanır.
Buradan ilgili
genimizi
çalışmak
istediğimiz
organizma
tıklanır.
Aranılan
genle ilgili
tüm
organizma
ların listesi
Yalnızca ilgili genimizin
listelendiği sayfa
İlgili genimizin linkine tıklayarak spesifik
özelliklerinin ve nükleotid sekansının
bulunduğu sayfaya gideriz
İlgili gene ait çeşitli spesifik bilgileri içeren veri tabanı
İlgili gene ait çeşitli spesifik bilgilerin bulunduğu internet sayfası üst bölüm
İlgili genin nükleotid sekansının
tamamı seçilerek blastlama
yapmak üzere yeniden
«www.ncbi.nlm.nih.gov» internet
sayfasına gidilir.
İlgili gene ait çeşitli spesifik bilgilerin bulunduğu internet sayfası alt bölüm
1. «www.ncbi.nlm.nih.gov» sayfasının
altında bulunan «BLAST» linki tıklanır.
2. «nucleotide blast» linki tıklanarak blastlama
sayfasına gidilir.
1. Tüm nükleotid dizisi blastlanmak üzere yapıştırılır.
2. «Mouse genomic + transcript» seçeneği işaretlenir.
3. «BLAST» linki tıklanarak genin homoloji sayfasına gidilir.
Seçilen Bölge: Primer ve Prob dizaynı için
kullanılacak gen bölgesi
Query Cover: blastlanan sekansının diğer
genlerle ile homolojisinin yüzde değeri
Sekans sayfasına gidilerek primer dizaynı yapılacak bölge seçilerek kopyalanır ve daha
sonra primer dizaynı yapmak amacıyla «http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/» internet
sayfasına gidilir.
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ internet sayfasında iken;
1.Daha önce seçilerek kopyalanan sekans yapıştırılır.
2.İlgili genin adı yazılır.
3.Çoğaltılacak ürünümüzün baz çifti aralığı ayarlanır.
4.Dizayn etmekte olduğumuz primerlerin baz sayısı aralığı,
Tm sıcaklıkları ve % GC oranları girilir.
5.Yukarıdaki işlemlerden program tarafından önerilen primer
listesine ulaşmak için «Pick Primers» linki tıklanır.
Program tarafından
önerilen amaca uygun
olan left primer
(cacatttcttcctggggtgt) ve
right primer
(cctatcagcttgcgtgtgaa)
sırasıyla kopyalanarak
daha önce yapıldığı gibi
blastlama yapılır.
Programın verdiği bölge
ile oynanarak en uygun
primer, blastlama ile
belirlenir.
% 100
örtüşme
gösteren
bölge
Left ve Right primer
arasında kalan ve
antisens mRNA probu
olarak hazırlanacak
bölge BLAST
edildiğinde sadece
Atp9a geni ile %100
olarak örtüşüyor ise
teorik olarak
probumuz hazır
demektir.
Atp9a (ATPase, class II, type 9A) Geni İçin Seçilen
Primerler
T7-Forward (Left) primer (43 baz):
5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGG ACATGACGGACAGCATCCCG-3’
SP6-Revers (Right) primer (41 baz):
5’-GCGATTTAGGTGACACTATAG TTTCTGCCAGTGTAGAGAAC-3’
PCR Protokolü
• cDNA kütüphanesi
: 1,0 µL
• dNTP (10mM)
: 0,5 µL
• Enhancer
: 5,0 µL
• Pri.T7-F(10 pmol/µL)
: 1,0 µL
• Pri.Sp6-R (10 pmol/µL) : 1,0 µL
PCR Programı
LİD 105oC WAITAUTO
1. PAUSE PRESS ENTER
2. T = 94oC de 2 dakika
3. PAUSE PRESS ENTER
4. T = 94oC de 20 saniye
5. T = 57oC de 20 saniye
• PCR tamponu (10x)
: 2,5 µL
6. T = 72oC de 1 dakika
• H2O
: 14,0 µL
7. GOTO 4 REP 35
• Taq Poli. (5U/ µL)
: 0,2 µL
8. T = 72oC de 9 dakika
9. HOLD 4oC ENTER
PCR Sonucunun Agaroz Jel Elektroforezi
İle Görüntülenmesi
In vitro Transkripsiyon
(Antisens mRNA Üretimi)
SP6 RNA polimeraz
1µl
RNAsin
1µl
Dig RNA labeling mix, 10x
2µl
Tampon 10x
2µl
DNA Templeyti
2µl
DEPC- su
12µl
37oC’de 4-5 saat inkübasyon
DNase I (10U/µl)
0,1µL
0,3 M MgCl2
0,08µL
H 20
0,82µL
370C’ de 15 dakika inkübasyon yapılarak DNA’nın sindirilmesini sağlandı.
In situ Hibridizasyon (ISH)
• Fare embriyoları veya fare beyni özel ortamına gömüldü.
• Mikrotom cihazıyla 20 mikronluk kesitler alındı ve slaytlar robota yerleştirildi.
Geffers, L.
Frozen kesitler için fiksasyon ve dehidrasyon yapıldı.
Fiksasyon Basamağı;
•%4’lük PFA ile 15-25 dakika inkübasyon
•%0,9’luk NaCl ile 2 dakika inkübasyon
•%0,9’luk NaCl ile 2 dakika inkübasyon
Dehidrasyon Basamağı;
1.1xPBS ile 2 dakika inkübasyon
2.%0,9’luk NaCl ile 2 dakika inkübasyon
3. %30’luk Etanol ile 2 dakika inkübasyon
4.%50’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon
5.%70’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon
6.%80’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon
7.%95’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon
8.%100’lük Etanol ile 2 dakika inkübasyon
9.%100’lük Etanol ile 2 dakika inkübasyon
10.30ºC’lik fırında 3 dakika inkübasyon.
Daha sonra slaytlar IHC için -80ºC’de muhafaza edilir.
Geffers, L.
Prehibridizasyon, Hibridizasyon, Yıkama ve NBT/BCIP kullanarak renk reaksiyonu
uygulandı.
Robotik ISH
Geffers, L.
Slaytlar lamelle kaplanarak saklandı, mikroskop altında incelendi ve skan edilerek
internet ortamına aktarıldı. (www.genepaint.org ).
Geffers, L.
ISH’ın Prensibi
DIG: Digoxigenin (Hapten)
AP: Alkaline Phosphatase
DIG labelled probe
mRNA
anti-DIG AP
purple
precipitate
BCIP + NBT
Geffers, L.
Atp9a Geni İçin Ekspresyon Sonuçları
www.genepaint.org
Glutamat dehidrogenaz 1’in ekspresyon örnekleri
(Glud1)
www.genepaint.org
14,5 GÜNLÜK FARE EMBRİYOSU ÜZERİNDE ELDE EDİLEN IN SITU
HİBRİDİZASYON SONUÇLARI
• Atp9a (ATPaz 9A, class II): Beyin, dış sinir sistemi, merkezi sinir sistemi.
• Atp10a (ATPaz 10A, class V): Ekspresyon olmadı.
Atp9a
Atp10a
www.genepaint.org
Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics
Enerji metabolizmasındaki bazı
enzimler bir stereotipik
ekspresyon örnekleri
gösterdiler.
Idh3a (izositrat dehidrogenaz):
İsositrat+ NADP+ -----> alpha-Ketoglutarat + NADPH+H+ + CO2
(mitochondrial matrix)
Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics
KIRMIZI : KUVVETLİ EKSPRESYON
SARI : ORTA EKSPRESYON
BEYAZ :ZAYIF EKSPRESYON
MAVİ : EKSPRESYON YOK
Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics
KIRMIZI : KUVVETLİ EKSPRESYON
SARI : ORTA EKSPRESYON
BEYAZ :ZAYIF EKSPRESYON
Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics
MAVİ : EKSPRESYON YOK
Fare genomu içinde bulunan çalışılan lipid ve amino asit
enzim genleri http://www.genome.ad.jp web sayfasından bakılarak
belirlenmiştir. Web sayfası açıldıktan sonra “KEGG PATHWAY”
butonuna basıldı. http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html web
sayfası açıldı. Bu sayfadan ilgili metabolik yol seçildi. Database’de
bulunan bütün organizmalara ait ortak pathway göründü. Daha sonra
“Pathway menü”den “Mus musculus (mouse)” seçildi, “Go” tuşuna
basıldı. Fareye ait genler yeşil kutucuklar içinde ekranda görüldü. Proje
kapsamına alınan metabolik yollar aşağıdaki şekilde verilmiştir.
GLUTAMAT METABOLİZMASI
N-Acetyl-D-glucosamine
Nagk
-Glucosamine
6-phosphate
Gfpt1
N-Acetyl-Dglucosamine 6phosphate
Gnpnat1
Ppat
5-Phosphoribosylamine
Nadsyn1
NAD+
Gmps
GMP
L-Glutaminyl-tRNA
(Gln)
Qars
Cad
Glutamine
Oxalo
acetate
Malate
Carbamoylphosphate
Citrate
Cps1
Glul
Gls1
Fumarate
NH3
Gls2
Succinate
2- oxoglutarate
Gclc
Gclm
Glud1
1-pyrroline-5carboxylate
Aldh4a1
L-glutamate
Gamma-L-Glutamyl-L-cysteine
Aldh5a1
Gpt1
Gpt2
Got1
Got2
Gss
Glutathione (GSH)
Gsr
Gad1
succinate-semialdehyde
Abat
Gad2
Glutathione disulfide
(GSSH)
4-Aminobutanoate
Ears
Eprs
L-Glutamyl-tRNA
(Glu)
GLUTAMAT METABOLİZMASININ BÜTÜN GENLERİ İÇİN 12,5, 14,5, 15,5
GÜNLÜK FARE EMBRİYONİK DÖNEMLERİ VE POSTNATAL FARE BEYNİNDE
(P56) EKSPRESYON YORUMLARI KARŞILAŞTIRMASI
ENZİM ADI VE
GEN SİMGESİ
E12.5
E14.5
E15.5
P56
Glutamat piruvat
transaminaz 1,
soluble (Gpt1)
Ekspresyon olmadı.
Zayıf olarak yaygın
ve genel olarak tüm
dokularda
ekspresyon
olmuştur.
Zayıf olarak yaygın
ve genel olarak tüm
dokularda
ekspresyon
olmuştur.
Zayıf ve yaygın bir
ekspresyonla
beraber kortekste,
serebellumda
ekspresyon olduğu
görüldü.
Glutamat piruvat
transaminaz
(alanin
aminotransferaz)
2 (Gpt2)
Arka beyin
boşluklarının
yüzeyinde ve spinal
kord da ekspresyon
oldu.
Beyin boşluklarında
ekspresyon
olmuştur.
Beyin boşluklarında
ekspresyon
olmuştur.
Zayıf ve yaygın bir
ekspresyonla
beraber kortekste,
serebellumda
ekspresyon görüldü.
Glutamat
dehidrogenaz 1
(Glud1)
Karaciğerde çok
kuvvetli ve belirgin
olarak diğer
dokularda da zayıf
olarak ekspresyon
olduğu görüldü.
Kaslar, karaciğer,
böbrekde çok daha
belirgin olmak
üzere tüm
dokularda
ekspresyon
olmuştur
Kaslar, karaciğer,
böbrekde çok daha
belirgin olmak
üzere tüm
dokularda
ekspresyon
olmuştur
Talamus,
hipotalamus ve
serebellum başta
olmak üzere
kuvvetli ve yaygın
bir ekspresyon
olduğu belirlendi
ENZİM ADI VE
GEN SİMGESİ
Glutamat
okzaloasetat
transaminaz 1,
soluble (Got1)
Glutamat
okzaloasetat
transaminaz 2,
mitokondrial
(Got2)
E12.5
Karaciğer, akciğer,
dorsal kök bezleri,
böbrek, timusda
ekspresyon oldu.
Karaciğer, dorsal
kök bezleri başta
olmak üzere yaygın
bir ekspresyon
olduğu görüldü.
E14.5
Yaygın ve genel
olarak tüm
dokularda
ekspresyon
olmuştur.
Yaygın ve genel
olarak tüm
dokularda
ekspresyon oldu.
E15.5
P56
Yaygın ve genel
olarak tüm
dokularda
ekspresyon
olmuştur.
Olfaktori soğancığı,
talamus,
hipotalamus ve
serebellum başta
olmak üzere
kuvvetli ve yaygın
bir ekspresyon
olduğu belirlendi.
Yaygın ve genel
olarak tüm
dokularda
ekspresyon oldu.
Olfaktori soğancığı,
talamus,
hipotalamus ve
serebellum başta
olmak üzere
kuvvetli ve yaygın
bir ekspresyon
olduğu belirlendi.
Noradrenalin Biyosentezi
Noradrenaline
3 boyutlu olarak bu olaylar nasıl meydana gelir?
Beyinde noradrenerjik projeksion şebekesi
locus coeruleus
rodent beyin
sinir fiberi
Solute Carrier Transporters (Slc)
Exchanger
Pasif
transporter
Coupled
transporters
nucleus
vesicular
transporter
mitokondrial
transporter
Slc’ler inter ve intraselüler transporta aracılık ederler.
BASAMAK 1:
Fenilalanin karaciğerde tirozine çevrilir.
Fenilalanin hidroksilaz
BASAMAK 2:
Slc3a2
Tirozin
karaciğerden göç
eder,
ve choroid pleksus
veya kan-beyin
bariyeri vasıtasıyla
beyine girer.
choroid
plexus
Slc7a5
liver
Slc16a10
uniporter
Karaciğer: Slc ve bir
enzim arasındaki
birlikteliğe bir örnek
heterodimerik
antiporter
BASAMAK 3:
Tirozin locus coeruleus’a girer, fakat
transporteri bilinmemektedir.
Muhtemelen orphan Slc10a4’dür.
locus
coeruleus
Slc10a4
BASAMAK 4:
Tirozin L-Dopa’ya dönüşür.
locus
coeruleus
Tirozin
hidroksilaz
BASAMAK 5:
L-Dopa dopamine Dönüştürülür.
locus
coeruleus
Dopa
dekarboksilaz
BASAMAK 6:
Dopamin noradrenaline dönüştürülür.
Noradrenaline
locus
coeruleus
Dopamine beta
hydroxylase
BASAMAK 7:
Noradrenerjik bir durum çıkarsa,
veziküler noradrenalin
transporter Slc18a2, sinapslara
yerleşir.
locus
coeruleus
Slc18a2
Noradarenalin ve ön maddelerinin sentezi ve transportu,
üç boyutlu olarak organize edilmektedir. Solut taşıyıcı
transporterler ve ilgili enzimler koekspresyona
uğramaktadır. Küçük moleküllerin hareketini böylece üç
boyutlu olarak takip edebiliriz. Çünkü onların transport
yerleri ve ilgili enzimlerin ekspresyon haritalarına
sahibiz. Böylece solut taşıyıcı transporterler ve enzimlerin
ekspresyon örnekleri, metabolik pathway’lerin 3 boyutlu
yerlerini haritalandırmak için kullanılabilir.
KOLESTEROL SENTEZİ METABOLİZMASI
Kolesterol ve onun biyosentetik yolağı ara ürünleri ve türevleri membran biogenezi,
transmembran
reseptör
sinyalizasyonu,
steroid
aktivasyonu ve hedgehog (Hh) proteinlerinin
birçok gelişimsel proses için gereklidir.
biogenezi,
nükleer
reseptör
posttranslasyonel modifikasyonu gibi
Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015
Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015
Bu çalışmada, ilk kez bütün bir organizma için, asetil-CoA’dan başlayıp kolesterol ile
biten kolesterol biyosentezinde (CBS) gerekli olan tüm genlerin 3D ekspresyon
profilleri- modelleri belirlendi.
Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015
Expression of CBEs in the developing forebrain
Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015
Expression of CBEs in the developing eye.
Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015
Expression domains of Hmgcr and Shh in the E13.5 mouse embryo
The ventricular zone of the hypothalamicarea (A), the mesencephalic area (B), and the vibrissae follicles (C)
Bu çalışma aynı zamanda CBS ve Shh ekspresyon bölgelerinin uzaysal-mekansal
ilişkisini de açıklamaktadır (CBS’nin düzenleyici enzimi olan Hmgcr seçilmiştir).
Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015
* Kolesterol biyosentezi (CBS) için gerekli olan tüm genlerin 3D ekspresyon
profilleri fare fetüsünden alınan seri kesitlerde in situ hibridizasyon yöntemiyle
modelleri belirlendi. Annotasyon görüntü verileri METscout ve GenePaint
veritabanlarına aktarıldı.
*Bu yeni bilgiler kolesterol biyosentezi enzimlerinin (CBE) neden fetusun içinde
belirli bölgelerinde spesifik ekspresyona uğradığını anlamamıza yardımcı olacaktır.
Örnek olarak, embriyonik gelişimde önemli fonksiyonu olan sonic Hh (Shh)
proteinleri ile kolesterol biyosentezi enzimlerinin ekspresyon profillerinin
paralellik göstermesi ve birbiriyle ilişkili olması gibi.
*Nöron aksonlarının oluşması ve sinapsların şekillenmesi gibi proseslerde hücre
proliferasyonunun ve proliferasyonun gerçekleştiği yerlerdeki membranın
yüzeyinin arttığı bölgelerde güçlü CBE ekspresyonu gözlemlendi.
TEŞEKKÜR
Bu çalışmalar;
• Avrupa Birliği Çerçeve Programı,
• TÜBİTAK
• Kalkınma Bakanlığı
tarafından desteklenmiştir.
Dinlediğiniz için teşekkürler!..