enstrümental gıda analizleri ders notları

Transkript

1.
ENSTRÜMENTAL GIDA ANALİZLERİ
Yrd. Doç. Dr. Cemalettin BALTACI
Doç. Dr. Ali GÜNDOĞDU
2012
GENEL BİLGİLER
Bir gıda numunesinde kimyasal bir analizin sonuçlandırılması maddenin bir fiziksel
özelliğinin ölçülmesiyle olur. Ölçülen özellikler başlıca; kütle, basınç, yoğunluk, optik, özellikler,
radyasyon kapasitesi, potansiyel ve iletkenlik olarak belirlenebilir. Analitik kimya, maddelerin
kimyasal bileşimlerini ve bileşenlerin miktarlarının belirlenmesi için yöntem ve alet
geliştirilmesini amaçlar. Geniş anlamda bir kimyasal analiz cihazı, doğrudan doğruya
saptanamayan bir sinyali kişilerin anlayabileceği bir şekle dönüştürerek veren bir enstrümandır.
Yani bir cihaz, incelenen sistem ile kişi arasındaki iletişimi sağlayan bir aracıdır. Enstrümantal
analizin gelişmesi elektronik bilgisinin ilerlemesiyle paralellik gösterir; çünkü bir sinyalin
üretilmesi, yükseltilmesi ve görüntülenmesinin hızla gerçekleştirilmesi ancak elektronik
çevrimlerle mümkündür. Kimyasal sinyalleri elektrik sinyallerine çeviren çok sayıda transduserler
vardır; keza elde edilen elektrik sinyallerini yükselten amplifikatör çeşitleri de çok fazladır.
Modern analizci bir analiz cihazının en yüksek verimle kullanılabilmesi için ne derecede
elektronik bilgiye gereksinimi olduğu sorusu ile karşı karşıyadır. Görünen şudur ki analizcinin
elektronik devrelerin çalışması hakkında kalitatif düzeyde bir bilgiye sahip olması istenir.
1.1 Nitel (qualitative)(kalitatif) analiz;
karışımda neler olduğunu anlamak için yapılan
analizdir.
1.2 Nicel (quantitative)(kantitatif) analiz, bir karışım içerisindeki maddelerin miktarlarını
ölçmek için yapılan analizdir.
Genelde bu iki kavram, benzer kelimelerle ifade edildiği için kolaylıkla karıştırılabilir. Nitel
analizde, maddelerin niteliği yani ne kadar içerdiği bakılırken, nicel analizde, maddelerin niceliği
yani ne oldukları incelenir gibi bir mantık yürütmek sanırım bu karışıklığı engeller.
Nicel analiz yöntemleri olarak; gravimetrik, volumetrik, spektroskopik yöntemler (atomik soğurma,
Fluorometri, UV-VIS vs. ), kromatografik yöntemler, refraktometri ve ismini simdi sayamayacağım
birçokları söylenebilir. Nitel analiz yöntemleri olarak da, katyon ve anyon analizleri, TLC (hoş
aslında nicel analiz olarak sayılır ama nicelden çok nitel amaçlı kullanılır), kütle spektroskopisi
gösterilebilir. Bir de bu iki analiz türünün birlikte kullanıldığı yöntemler vardır ki en kralı bunlardır.
GC-MS (Gaz kromatografisi üstüne kütle spektroskopisi) karışımı önce ayırıp neyden ne kadar
olduğunu bulup sonradan da bu ayrılanların ne olduğunu anlamamız için kütle spektroskopisine
bakar ki oldukça kullanışlı bir analiz yoludur.
1.3 Kimyasal Analiz
a- Numune alma, b-Ayırma, c- Yöntem Seçimi, d- Ölçme, e-Değerlendirme
basamaklarından oluşur.
Analitik yöntemler klasik veya aletli yöntemler olarak sınıflandırılabilir.
Sayfa 2 / 94
1.4 Klasik (yaş) yöntemler
Gravimetrik, volumetrik analiz gibi yöntemleri içerir.
Kimyasal maddeler, terazi, kalibre edilmiş cam malzeme, ısıtıcı gibi basit laboratuvar
malzemelerinin kullanıldığı ve genelde analitin (tayin edilecek madde) daha fazla bulunduğu
numunelerin analizinin yapıldığı yöntemlerdir.
1.5 Aletli Analiz Yöntemleri
Genel laboratuvar cihazlarının yanı sıra, çeşitli analitik cihazların kullanıldığı
yöntemlerdir. Analitik cihazlar, maddenin, iletkenlik, elektrot potansiyeli, ışın absorpsiyonu veya
emisyonu, kütle yük oranı, floresans gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerini ölçer. Numuneyi
analiz etmek amacıyla bazı bileşenleri ayırmak için kullanılan kromatografik, elektrolitik,
elektroforetik yöntemler de aletli analiz yöntemlerindendir. Aletli yöntemler genellikle,
zamandan tasarruf etmek, birçok kimyasal ayırmalardan kaçınmak ve çoğu kez daha duyarlı ve
doğru sonuçlar elde etmek için kullanılır.
1.5.1 Enstrümental Analiz: Bir örnekteki herhangi bir bileşenin cinsi veya derişimiyle
orantılı sinyal üreten cihazlarla yapılan analize Enstrümental Analiz denir. Gıda analizlerinde
aletli analiz yöntemleri başlıca 5 grupta toplanır.

Spektroskopik Metotlar

Elektrokimyasal Metotlar

Kromotografik metotlar

Termal analiz metotları

Refraktometrik ve Polarimetrik metotlar
1.5.2 Enstrümantal Metotlar
1920’li yıllara kadar analizlerin kütle ve hacim özelliklerine göre yapılıyordu. Bu nedenle
gravimetrik ve volumetrik analizler "klasik yöntemler" olarak tarif edilir. Diğer yöntemlere ise
(spektroskopik,
elektroanalitik,
kromatografik
vb).
"enstrümantal
analiz
yöntemleri"
denilmektedir. Aşağıda analitik uygulamalarda kullanılan ve çok bilinen bazı sinyallerle bu sinyal
ölçümüne dayanan analitik metotlar verilmiştir.
Sayfa 3 / 94
Ölçülen Özellik
Aletli Analiz Yöntemi
Işın Absorpsiyonu
Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR,
Fotoakustik spektroskopisi
Işın Emisyonu
Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, )
Floresans, Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi
Işın Saçılması
Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi
Işın Kırılması
Refraktometri, interferometri
Işın Difraksiyonu
X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri
Işın rotasyonu
Polarimetri, dairesel dikroizm
Elektrik potansiyeli
Potansiyometri, Kronopotansiyometri
Elektrik yükü
Kulometri
Elektrik akımı
Amperometri, Polarografi
Elektriksel direnç
Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)
Kütle
Gravimetri
Kütle/yük
Kütle spektroskopisi
Tepkime Hızı
Kinetik yöntemler
Termal Özellikler
Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik, DSC
Radyoaktivite
Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri
Tablo 1.1 Bazı aletli analizlerin dayandığı yöntemler
Birbirine çok benzeyen maddelerin ayrılması için yukarıda verilen yöntemlerden başka
analitik ayırma yöntemleri de vardır. Kromatografi, destilasyon, ekstraksiyon, iyon değiştirme,
fraksiyonlu kristalizasyon, ve seçimli çökeltme işlemleri çeşitli ayırma ve saflaştırma
yöntemleridir.
Sayfa 4 / 94
Enstrümantal tekniklerin çoğu klasik yöntemler kadar hassas değildir. Karışımların
analizlerinde ise enstrümantal yöntemler daha başarılıdır. Enstrümantal veya klasik analizler için
doğruluk, uygunluk ve harcanan zaman gibi kıstaslara göre genel bir sınıflama yapılamaz. Hatta
kullanılan cihazlar yönünden bile, daha pahalı veya daha karmaşık, gibi bir ayırım bile doğru
olmaz; örneğin, gravimetrik bir analizde kullanılan modern bir terazi bazı enstrümantal analiz
cihazlarından daha karmaşık ve pahalı bir cihazdır.
1.5.3 Analiz Cihazları (Enstrümanlar)
Bir cihazın temel kısımları çoğunlukla dördü aşmaz. Şekilde şematik olarak görüldüğü
gibi bu kısımlar:
 Sinyal jeneratörleri
 Dedektörler (giriş dedektörleri)
 Sinyal prosesörleri (devreler ve elektrik aletleri)
 Veri okuma aletleri
1.5.3.1 Sinyal Jeneratörleri
Sinyal jeneratörleri örnekteki maddelere ait analitik sinyaller üretirler. Jeneratör örneğin
kendisi olabilir. Analitik bir terazinin sinyali tartılan örneğin kütlesidir; bir pH metre için ise
sinyal, çözeltideki hidrojen iyonlarının aktivitesidir. Diğer cihazların çoğunda sinyal jeneratörü
çok ayrıntılıdır. Örneğin, IR Spektrofotometrede sinyal jeneratörü, ışın kaynağı, monokromatör,
ışın chopperi (kesici), ayırıcı, örnek tutucu ve ışın aftenuatörü (zayıflatıcı) gibi kısımlardan
oluşur. Diğer bazı örnekler:
Fotometre: Tungsten lamba, cam filtre, örnek
Atomik Emisyon Spektrometre: Alev, mono-kromatör, kesici, örnek
Sayfa 5 / 94
Kulometre: DC kaynak, örnek
pH Metre: Örnek/cam elektrot
X-Işını Toz Difraktometre: X-ışını tüpü, örnek
Renk Komparatörü: Güneş ışını, örnek
1.5.3.2 Giriş Transduserleri veya Dedektörler
Transduser bir tip sinyali başka bir sinyal tipine çeviren bir alettir. Örneğin, ışığın ısısını
elektrik voltajına çeviren termokupl bir transduserdir; kadranlı bir barometredeki körükler basınç
sinyalini mekanik bir hareket sinyaline dönüştürürler. Enstrümental analiz cihazlarında
karşılaşılan transduserlerin pek çoğu analitik sinyalleri elektrik voltajı, akım, veya dirence
dönüştürürler; çünkü elektrik sinyalleri yükseltilebilir ve kaydedicide çizim veya yazım şeklinde
alınabilirler.
Fotosel: Elektrik akımı
Fotomultiplier tüp: Elektrik potansiyeli
Elektrotlar: Elektrik akımı
Cam-kalomel elektrolar: Elektrik potansiyeli
Fotoğraf filmi: Görüntü
Göz: Optik sinyal
1.5.3.3 Sinyal Prosesörleri
Sinyal prosesörü dönüştürülmüş sinyali, okuma aletine en uygun olacak şekilde değiştirir.
En fazla karşılaşılan değiştirme sinyalin kuvvetlendirilmesidir (amplifikasyon). Bunun için sinyal
1’den büyük bir sabitle çarpılır. İki kefeli bir analitik terazide kolun hareketi, bir gösterge ile
kuvvetlendirilmiş olarak iletilir. Bir fotoğraf filmi tarafından yapılan kuvvetlendirme çok daha
büyüktür; burada tek bir foton 1012 tane gümüş atomu üretir. Elektrik sinyalleri de keza 106 kat
veya daha fazla kuvvetlendirilebilirler.
Elektrik sinyallerinin kuvvetlendirilmesi yanında, zayıflatılmasına (attenuasyon) da
gereksinim olur; bu durumda sinyal, prosesörde 1 den küçük bir sabitle çarpılır, integre edilir,
ayrılır, eklenir veya çıkarılır. Bundan sonraki uygulamalarda sinyal önce alternatif akıma ve
sonra da doğru akıma çevrilerek bir standartla kıyaslama yapılabilir. Böylece akımdan voltaja
(veya tersine) bir geçiş sağlanmış olur.
Sayfa 6 / 94
1.5.3.4 Veri Okuma Sistemi
Veri okuma sisteminde, prosesörden yükseltilerek gelen sinyali kişinin okuyabile-ceği bir
sinyale dönüştüren bir transduser bulunur. Bunlar metreler, şerit kağıtlı kaydediciler,
osilaskoplar, işaretli cetveller, ve digital (rakamlı) göstergeler olabilir.
1.5.4 Analitik Metot Seçimi
Problemin tanımı:
İstenilen doğruluk ve hassasiyet nedir?
Elimizdeki örnek ne kadardır?
Analitin konsantrasyon aralığı nedir?
Örnekte girişime yol açacak bileşenler nelerdir?
Örnek matrisinin fiziksel ve kimyasal özellikleri nelerdir?
Kaç örnek analizlenecektir?
Analitik metot seçimi için sayısal kriterler:
Kullanılacak cihazların performansının metot için yeterli olup olmadığı doğrulanır.
Kullanılacak maddelerin (kimyasal, standartlar) kalitesi belirlenir. Validasyonu yapılacak metot
performans parametreleri metodun uygulama amacına ve kapsamına bağlı olarak belirlenir. Metot
validasyonuna başlamadan önce kullanılacak cihazın performansının test edilmesi ve
uygunluğunun saptanması da gerekir.
1.5.5.1 Metot Validasyonu
Metot validasyonu, bir analitik metodun ilgilenilen amaç için kabul edilebilirliğini
sağlama işlemidir. Metot problemlerini en aza indirmek için en iyi yol, geliştirme esnasında
uygun validasyon deneylerini gerçekleştirmektir. Metot validasyonu; metodun amaç için uygun
olduğunu kanıtlamayı içerir. İlaç analiz metotları için, Birleşik Devletler Farmakopisi (USP),
Uluslararası Harmonizasyon Konferansı (ICH), Gıda ve İlaç İdaresi (FDA)’nin verdiği talimatlar
böyle bir validasyonu gerçekleştirmek için bir çerçeve sunar. Ne tür bir çalışma yapılması
gerektiği konusunda genel bir uyum varsa da, nasıl yapılacağı konusunda büyük farklılıklar
bulunmaktadır. Analiz edilecek aktif maddeye, örnek matriksine ve bu analizleri yapacak gruba
bağlı olarak validasyon ihtiyaçları sürekli değişir.
1.5.5.2 Metot Validasyonunun Gerekli Olduğu Durumlar
 Herhangi bir metodun laboratuvarda ilk defa kullanılacağı zaman,
 Bir analiz için yeni metot geliştirildiğinde,
 Kullanılmakta olan metotta değişiklik yapıldığında,
 Valide bir metodun başka bir laboratuvarda kullanılacağı durumlarda,
Sayfa 7 / 94
 Yeni personel tarafından metodun ilk defa kullanılması durumunda,
 Yeni cihazlar devreye girdiğinde,
 Temel kimyasallarda önemli bir değişiklik yapıldığında (metot Modifiye edildiğinde),
 Uzun süredir kullanılmamış bir valide yöntemin yeniden kullanıma alınması
durumunda,
 Laboratuvarda yapılan ve sonuçları etkileyebileceği düşünülen değişiklikler olduğunda,
 İki metodun karşılaştırılması amacıyla ve
 Kalite kontrol testleri sonucunda metodun performansında zamanla bir değişme olduğu
anlaşıldığında metot validasyonu / verifikasyonu yapılır
1.5.5.3 Metot Validasyon Parametreleri
Metot geçerliliği, herhangi bir analitik metodun hedeflenen amaca göre kabul edilip
edilemeyeceğini
açıklayan
performans
kriterlerinin
istatistiksel
değerlendirilmesidir.
Enstrümental cihazlarla yapılan analizlerde, metot validasyonu belirli bir örnek veya örnek
matriksleri için geliştirilen metodun, geçerliliğinin ya da çalıştığının sağlamasının yapılmasıdır.
GLP ye uygun çalışan laboratuvarlar sadece geçerliliği onaylanan metotları uygularlar.
Geçerliliği kanıtlanmış metotlarla çalışmak laboratuvarda analiz süresince karşılaşılabilecek
problemlerin çoğunun ortadan kaldırılmasını sağlar. Bir çok metot performans kriterleri vardır:
gerçeğe yakınlık (accuracy), kesinlik (precision) doğrusallık (linearity), kalibrasyon, geri alım
(recovery), LOD (dedeksiyon limiti), LOQ (hesaplama limiti), hassasiyet (sensitivity), hedef
(scope), özgülük (specifity). Fakat çoğu araştırıcılar bu kriterlerden doğruluk, kesinlik
(repeatability, reproducubility, robustness), kalibrasyonun doğrusallığı değerlendirmelerine önem
vermektedirler. Bazen validasyon çalışmalarının sonucu uygulanan analiz prosedürünün
değiştirilmesini gerektirebilir, bunun için de metodu tekrar valide etmek gerekir. Metot
validasyonunun birçok seviyesi vardır. En düşük seviyeli olanı bir analizcinin bir tek
laboratuvarda örneklerini fortifiye etmesi gerekli verileri toplaması ve istatistiksel değerlendirme
yapmasıdır. En yüksek seviyeli olanı ise konsantrasyonu bilinmeyen analit içeren örneklerle
birçok laboratuvarın ortaklaşa çalışması ve verilerin toplanması ve değerlendirilmesidir. Metod
performance parametrelerini United States Pharmacopeia (USP), Inernational Conference on
Harmonisation (ICH) ve Food and Drug Administration (FDA) gibi uluslararası kuruluşlar bir
rehber yada kılavuz olarak açıklamışlardır.
 Doğruluk (Accuracy)
o Gerçeklik (Trueness) ve Sistematik Hata (Bias)

Kesinlik (Precision)
o Tekrarlanabilirlik (Repeatability)
Sayfa 8 / 94
o Tekrarüretilebilirlik (Reproducibility)

Tayin Limiti (LOD-Limit of detection)

Ölçüm Limiti (LOQ-Limit of quantitation)

Doğrusallık / Ölçüm Aralığı (Linearity / Reportable Range)

Lineer Aralık (Linear Range)

Sağlamlık (Robustness / Ruggedness)

Geri Kazanım Oranı (Recovery)

Spesifiklik (Specifity)

Selektivite / Seçicilik (Selectivity)

Hassasiyet / Duyarlılık (Sensitivity)

Stabilite

Ölçüm belirsizliği
1.6. Kalibrasyon
Tüm analitik metotlar kantitatif analiz amacıyla kullanıldıklarında kalibrasyona
gereksinim vardır. Kalibrasyon, bir enstrüman çıkışında ölçülen analitik sinyalin analitin
konsantrasyonuyla olan ilişkisinin doğru olarak saptanması amacıyla yapılan bir işlemdir.
Sinyalin (veya responsun) kalibrasyonu yapılmadan bir örnek için alınan verilerle konsantrasyon
bağıntısı elde edilemez. Bir kalibrasyon metodunun özgünlüğü kesinlik, doğruluk, bias,
hassasiyet, algılama sınırları, seçicilik ve uygulanabilir konsantrasyon aralığına bağlıdır. Bu kavramlar aşağıda kısaca açıklanmıştır.
1.6.1 Kesinlik (Precision)
Metodun tekrar üretilebilirliğinin (reproduciblility) bir ölçüsüdür; aynı şekilde elde edilen
sonuçlar birbirlerine ne kadar yakın değerlerdedir? Rastgele (random) hatalar standart sapmayla
izlenebilir; genellikle % relatif sapma değeriyle ifade edilir.
Sayfa 9 / 94
Analitik Metotların Kesinlik (Precision) Tanımları
1.6.2 Doğruluk (Accuracy)
Ölçülen değer gerçek değere ne kadar yakındır? Normal olarak % relatif hata (mutlak hata
olabilir) ile tanımlanır; Gerçek değer ile bulunan ortalama değerin farkının gerçek değere
bölümünün %’dir.
1.6.2.1 Bias
Bir ölçmenin sistematik hatasının göstergesidir; enstrümantal, personel ve metot
hatalarından kaynaklanır. Mutlak hata olarak ifade edilir. µ, tüm değerlerin ortalaması; xi, gerçek
değeri gösterir.
bias = µ - xi
1.6.3 Hassasiyet (Sensitivity)
Hassasiyet iki faktöre bağlıdır; kalibrasyon eğrisinin eğimi (eğimin dikliğiyle artar) ve
ölçümlerin birbirine yakınlığı. Metodun herhangi bir interferens olmadan gerçek olarak analiti
belirleme yeteneğidir. Örnek matrisinde bulunabilecek diğer bileşiklerin (componentlerin) olması
durumunda analiz edilen analit doğru ve spesifik olarak analiz edilebilmelidir. Diğer etkili
maddeler, katkı maddeleri, safsızlık veren maddeler ve parçalanma ürünleri ile karışabilmesinin
(interference) ölçümüdür. Böylece kromatogramdan alınan pikin sadece tek bir analite ait olduğu
(co-elutions olmadığı) teyit edilmiş olur. Özgülük için solvent, blank ve örnek matriksi blankleri
farklı deneme koşullarında (2 farklı analitik koşullarda, 2 farklı dedeksiyon tekniği ile test
edilmelidir.
Sayfa 10 / 94
S = mC + Sşahit
S = ölçülen sinyal, C = analitin konsantrasyonu, Sşahit = şahidin sinyali, m =
kalibrasyon eğrisinin eğimi, Si = analitik sinyal.
Kalibrasyon eğimi = m
Analitik hassasiyet = γ =
1.6.4 Seçicilik (Selectivity)
Uygulanan metodun örnek matrisindeki diğer maddelerden etkilenmemesini belirten bir
derecedir. S = analitik sinyal, Sşahit = şahidin sinyalini gösterdiğinde,
S = mACA + mBCB + mCCC + Sşahit
CA, CB, CC = A, B ve C konsantrasyonları; mA, mB, mC = A, B ve C maddelerinin
kalibrasyon eğrisi eğimindeki değerleridir.
kB,A =
kC,A =
kB,A = B için seçicilik faktörü (A’ya göre), kC,A = C için
seçicilik faktörü (A’ya göre) , S = mA (CA + kB,A CB + kC,A CC) + Sşahit
Seçicilik faktörleri 0 ile 1 arasındadır; girişimler gözlenen sinyali azaltırsa negatif olabilir.
1.6.5 Uygulanabilir Konsantrasyon Aralığı
Bir kalibrasyon eğrisi grafiği; cihaz responsu-konsantrasyon değişimi
Teorik olarak absorbansın konsantrasyonla orantılı olması gerektiği halde çoğu zaman
doğrusallıktan sapmalar olur. Bu nedenle kalibrasyon eğrilerine gereksinim vardır. Ayrıca,
analizin yapıldığı zaman en az bir standardın absorbansı tekrar ölçülerek atomik buhar elde
edilirken kontrol dışı kalan değişkenlerin neden olduğu hatalar saptanır. Böylece standardın
orijinal kalibrasyon eğrisinden gösterebileceği sapma, örnek için elde edilen sonuçların
düzeltilmesinde kullanılır.
Sayfa 11 / 94
1.6.6 Dinamik Aralık: Eğrinin doğrusal olan kısmının kullanılması tercih edilir; bu
bölümde analitik sinyal, analitin miktarıyla doğru orantılıdır. Dinamik aralığın üs-tündeki analit
konsantrasyonlarında respons değerinde yükselme görülmez.
1.6.7 Algılama Sınırı (Limit of Detection, LOD): Bir örnekte herhangi bir analitin,
background seviyesi üzerinde, belirlenebildiği en düşük konsantrasyondur. Değişik hesaplama
yöntemleri vardır.
a) Blank (kör) örnek (n≥20) okumalarının standart sapmasının (s) 3 ile çarpılması ile bulunur.
LOD= 3 x s (mg/kg).
formülü ile bulunur. k burada 3 Sşahit kör okuma(blank)
b)
c) LOD; 2:1 veya 3:1 lik signal/noise oranı genellikle enstrümental analiz için kabul edilir. LOD=
2 x 1.645xs = 3.29 x s
d) Bravenboer’in pratik çözümü; örnek matriksi ile yapılan kalibrasyon kurvesinin eğimi (B),
(y=a+bx, b=eğim) ve kurvenin relatif rezidual standart sapması (Sres) hesaplanır LOD, Cdet = 3 x
Sres/B
e) TLC olduğu gibi, görsel, enstrümental olmayan metotla da LOD belirlenir. Şöyle ki;
1.6.8 Kantitatif Ölçme Sınırı (Limit of Quantitative Measurement, LOQ): Bir örnekte
herhangi bir analitin, kabul edilebilir gerçeğe
yakınlık (accuracy) ve doğru tam (precise)
parametreleri ile belirtilen metot koşullarında belirlenebildiği en düşük konsantrasyondur.
Değişik hesaplama yöntemleri vardır.
a) Blank örneklerin (n≥20) SD sinin 10 ile çarpılması ile bulunur. LOQ, Cquan = 10*s (mg/kg).
b)
formülü ile bulunur. k burada 10 Sşahit kör okuma(blank)
c) Bravenboer’e göre LOQ, 2* Cdet = 6* Sres/B
e) TLC de u formül uygulanır: LOQ= LOD (ng/mg) / Q(tahmini geri alım, 0,70) =ng/mg
Piklerin ekli S/N oranını etkiler. Keskin pikler yüksek S/N oranı verir, bu da daha düşük LOD ve
LOQ ile sonuçlanır. LOQe <MRL ilişkisi her zaman olmalıdır. Analiz limiti MRL den fazla ise o
metotla çalışmanın anlamı yoktur.
1.6.9 Doğrusal Respons Sınırı (Limit of Linear Response, LOL): Bir entrümant
dedektörünün doygunluk noktasıdır; bu noktadan sonra sinyalde doğrusal bir respons üretemez.
1.7 Kalibrasyon Metotları
Sayfa 12 / 94
En çok uygulanan bazı kalibrasyon yöntemleri:
 Kalibrasyon eğrisi metodu
 Standart ilavesi metodu
 İç standart metodu
 Alan normalizasyonu metodu
1.7.1 Kalibrasyon Eğrisi Metodu
Kalibrasyon eğrilerinin doğrusal (lineer) olması, yani cihaz responsuyla hemen hemen
orantılı olması istenir. Kalibrasyon eğrisi kullanabilmek için analitin konsantrasyon aralığı
tahmin edilebilmeli, örneğin matriks koşulları değerlendirilmelidir. Örneğin matriks koşullarına
benzer koşullarda bir takım standart hazırlanır; standartlar, tahmin edilen konsantrasyon aralığını
kapsayacak seviyelerde olmalıdır. Analit içermeyen bir şahit hazırlanır. Standartlar ve şahit
analiz cihazında ölçülür ve elde edilen değerlerle bir kalibrasyon grafiği çizilir. Bir kalibrasyon
eğrisinin çizilebilmesi için, normal olarak, en az 3 standart ve bir şahit kullanılır. Örneğin (analit
konsantrasyonu bilinmiyor) ölçümü yapılır; alınan respons kalibrasyon eğrisinin dinamik aralığı
içindeyse, konsantrasyon hesaplanır.
Örnek 1
1.7.1.1 Ultraviyole ve Görünür Spektrofotometrede Co+2 Tayini
Analiz edilecek örneğe (bilinmeyen) uygun analiz koşulları saptandıktan sonra bir seri
standart çözelti kullanılarak kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Standartlar, örneğin konsantrasyonuna
yakın değerlerde olmalıdır. Kobalt iyonu (Co+2) miktarının tayini için spektrumda çalışma dalga
boyu saptanır; ~500 nm. Beş adet konsantrasyonu bilinen standart ve analit içermeyen bir şahit
çözelti hazırlanır ve 520 nm’deki absorbans değerleri okunur. AS değerlerine karşı
konsantrasyonu gösteren kalibrasyon grafiği çizilir.
Sayfa 13 / 94
Tablo 2 Co+2 Analizi verileri
Grafik bir doğru şeklindedir. Örneğin absorbans değeri okunur.
Ax = 0.447 (beş okumanın ortalaması)
Doğrunun eğimi (m), enstrüman responsunun konsantrasyonla ilişkisini; y eksenini kestiği değer
(b) ise, şahidin, veya enstrümanın analit bulunmadığı haldeki responsudur. Bu değerin her ölçme
sonucundan çıkarılması gerekir.
m = 0.0456
b = 0.0096
y=0,0456*x+0,0096
m ve b için standart sapma ne kadardır?
Sayfa 14 / 94
Transfer fonksiyonu için kalibrasyon hassasiyeti (m) nedir? m kalibrasyon eğrisinin
eğimidir. m = 0.0456
Analitik hassasiyet
her değer için
nedir? Bu değer konsantrasyonla değişir; dolayısıyla eğri üzerindeki
hesaplanır. Analitik hassasiyet = γ =
Algılama sınırı (limit of detection, LOD) nedir?
Kantitatif ölçme sınırı (limit of quantitative measurement, LOQ) nedir?
Örnekteki analit konsantrastonu (CX) ne kadardır?
Örneği ölçmenin standart sapması ne kadardır? (ölçme sayısı = 5))
Bu ölçme için %95 güvenilirlik sınırı ne kadardır?
 Örnek için 5 ölçme yapılmıştır.
 5 değer için %95 güvenilirlik sınırında, t = 2.78 (tablolardan)
Sayfa 15 / 94
CX = 9.3 ± 0.2 ppm, (95% güvenirlilikle)
1.7.2 Standart Katma Metodu
Standart katma yöntemi, çoğu zaman örneğin içeriğinin bilinmediği veya kompleks bir
karışım olduğu ve analit dışındaki diğer başka maddelerin (safsızlıklar) de sinyali etkilediği
durumlarda uygulanan bir kalibrasyon işlemidir. Böyle hallerde matriks, örnek içinde bulunan
analitten başka diğer her şeydir; responsu değiştiren bu tür etkilere ‘matriks etkisi’ denilir.
Örnekte bulunan safsızlıklar analitle etkileşerek cihaz responsunu değiştirirler veya kendi
başlarına özel cihaz responsları üretirler. Bu gibi durumlarda saf analit örneklere göre hazırlanan
bir kalibrasyon eğrisi yanlış sonuç verir.
Örneğin, aşağıdaki şekilde, kütle spektrometreyle yapılan, matriksin saf su ve yer altı suyu
olması hallerinde perklorat kalibrasyon eğrilerinin ne kadar farklı oldukları açıkça görülmektedir.
En ideal durum kalibrasyon standartlarının örnek matriksindeki hem analit hem de diğer
maddelerin konsantrasyonlarına yakın miktarlarda bileşen içermesidir; böylece, örnekteki diğer
maddelerin, ölçülen analit absorbansına etkisi en aza indirilmiş olur. Örneğin, renkli pek çok
metal iyonu komplekslerinin absorbansı ortamda sülfat veya fosfat iyonlarının varlığında azalır;
çünkü bu iyonlar metal iyonlarıyla renksiz kompleksler oluştururlar. Böyle bir durumda elde
edilen absorbans değeri gerçek değerinden düşük olur. Sülfat veya fosfatın matriks etkisi
standartlara, bu iyonlardan örnekte bulundukları miktara yakın miktarlarda ilavesiyle yenilir.
Perkloratın farklı matriksler için kalibrasyon eğrileri
Sayfa 16 / 94
Ancak, topraklar, mineraller, ve fabrika külleri gibi örneklerin analizinde, örneğe benzer
bileşimde standartların hazırlanması olanaksız veya çok zordur. Bu gibi durumlarda matriks
etkisini yok edebilmek için "standart ilavesi yöntemi" uygulanır.
Standart katma birkaç şekilde yapılabilir.
 Zaman kazanmak veya az miktarda örnekle çalışılması gerektiğinde standart ilavesi
örneğin sadece iki versiyonu ile yapılabilir. Örneklerde birine VS mL standart konulur, diğerine
konulmaz. Her iki balon da seyreltilerek sabit hacme tamamlanır. Bu yöntem voltametrik ve
potansiyometrik ölçmelerde çok kullanılır.
 Fotometrik ve spektrofotometrik çalışmalarda en çok uygulanan yöntem ise, aynı
miktardaki örneklere standart bir çözeltiden artan miktarlarda ilaveler yapılmasıdır. İlavelerden
sonra çözelti sabit bir hacme tamamlanır ve absorbansları saptanır.
1.7.2.1 İki Ölçmeyle Yapılan Hesaplama Yöntemi
Örnekten volumetrik bir balona bir miktar (VX) alınır ve gerekli maddeler (pH tampon,
kompleks yapıcı, v.s. gibi) ilave edilir, seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Buna (1)
diyelim. Diğer bir volumetrik balona aynı şekilde örnek ve gerekli maddeler konulur; ilave
olarak 5.00 ml analit standart çözelti ilave edildikten sonra seyreltilerek sabit hacme (VT)
tamamlanır. Buna (2) diyelim.
(1) ve (2)’nin sinyalleri ölçülür; A1 ve A2.
Sinyaller analit konsantrasyonuyla orantılıdır.
k orantı sabitini, CX örnekteki analit konsantrasyonunu gösterdiğine göre:
Bu iki eşitlikten örnekteki analit konsantrasyonu hesaplanır.
Sayfa 17 / 94
Örnek 2
Sodyum iyonu içeren gıda numunesi, atomik emisyon analizinde 4.27 mV sinyal
vermektedir. Bu örnekten 95.0 mL alınarak, 2.5 ppm Na+ çözeltisinden 5.00 mL ilave edilmiştir;
hazırlanan bu standardın sinyali ise 7.98 mV olarak ölçülmüştür. Gıdadaki sodyum iyonu
konsantrasyonu ne kadardır? [Na+] ? ppm. Sinyaller analit konsantrasyonuyla orantılıdır.
Hazırlanan standart (100 mL) karışımdaki Na+ konsantrasyonu, 95 mL gıdadaki ve ilave edilen 5
mL 2.5 ppm çözeltideki Na+ iyonları toplamına eşittir.
Atomik emisyon spektrumunda okunan sinyaller.
Gıda örneği için A1 : 4.27 mV Vx = 95 ml CS=2.5 ppm
100 mL standart için. A2: 7.98 mV VS= 5 ml
Sinyal ve konsantrasyonlar orantılı olduğundan, aşağıdaki eşitlikle gıdadaki Na+ konsantrasyonu
aşağıda verilen formülle hesaplanır.
= 0.151 ppm gıda numunesindeki Na+ miktar.
Cx=
1.7.2.2 Çok Sayıda Ölçmeyle Yapılan Hesaplama Yöntemi
Çok sayıda ölçmeyle yapılan standart ilavesi kalibrasyon metoduyla daha hassas sonuçlar
alınır
 Örnekten volumetrik bir balona bir miktar (VX) alınır ve gerekli maddeler (pH tampon,
kompleks yapıcı, v.s. gibi) ilave edilir, seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır.
 Diğer bir seri volumetrik balona aynı şekilde örnek ve gerekli maddeler konulur; ilave
olarak sırasıyla 5.00, 10.00, 15.00, 20.00, 25.00 ml analit standart çözelti ilave edildikten
sonra herbiri seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Standardın konsantrasyonu 8.7
ppm’dir.
 Hazırlanan beş standardın ölçümü yapılır; her biri kendine özgü sinyal değeri verir (Sİ).
 Sinyal değerleri, ilave edilen standardın hacimlerine karşı grafiğe alınır; grafik bir
doğrudur.
 Elde edilen grafiğin eğimi ve y eksenini kestiği noktadaki sinyal değeri saptanır; bu
değerler numunedeki analit miktarını hesaplamada kullanılır.
 Hazırlanan çözeltilerin her birindeki analit konsantrasyonu enstrümantal yöntemle ölçülür.
Sayfa 18 / 94
Şekil 1.1
Enstrümanın responsu (A) analit konsantrasyonuyla orantılı ise aşağıdaki eşitlik
yazılabilir.
VX=örneğin hacmi, = 25 mL olduğu varsayılsın
VS = standardın hacmi = değişken (5, 10, 15, 20 mL, gibi)
VT = balonun toplam hacmi = 50 mL
CS = standardın konsantrasyonu
CX = alınan örnek içindeki analitin hacmi (burada 25 mL)
k = orantı sabiti
A’nın VS’nin fonksiyonu olarak çizilen grafiği düz bir doğrudur.
Sayfa 19 / 94
Elde edilen grafik kullanılarak örnekteki analit konsantrasyonunun (CX) saptanması için
iki yol izlenebilir.
1.7.2.2.1 CX’in Tayini İçin Birinci Yol:
Doğrumun eğimi m, y eksenin kestiği nokta b ile gösterildiğinde,
A = m VS + b
Eğim,
Kesim noktası,
1.7.2.2.2 CX’in Tayini İçin İkinci Yol:
CX’in tayini için başka bir yol da izlenebilir.
Ölçme sonuçlarıyla çizilen doğru ekstrapole edilerek X eksenini kestiği nokta saptanır.
VS = 0 noktası
enstrüman responsudur.
Doğrunun X eksenini kestiği nokta
ilave edilen analit miktarı bilinir (içsel).
Veya bu noktada A = 0 olduğundan (enstrüman responsu yok)
örnekte analit
bulunmaz.
A = 0 olduğunda,
Sayfa 20 / 94
Örnek 3
5 ml numune çözeltisi alınarak sırasıyla 5ml artırılmak suretiyle 8.7 ppm standart ilave
edildi ve ölçümleri elde edildi. Çok sayıda ölçmeyle yapılan kalibrasyon işleminde bir örnek
için aşağıdaki verilerin elde edildiği varsayılsın. Örnekteki analit konsantrasyonu CX ne kadardır?
Yukarıdaki grafikten, m = 0.035 b = 0.2548 değerleri okunur.
CX’in hesaplamayla bulunması için daha önce verilen,
eşitliğinden
CX = örnekteki analit konsantrasyonu
CS = standarttaki analit konsantrasyonu
Eğim (m) ve kesişme noktası değerindeki (b) hata hesaplanabilir; böylece, elde edilen
sonucun ne kadar sağlıklı olduğu görülür.
SC = 12.7 x 0.0129 = 0.16 ppm
Bu ölçme için %95 güvenilirlik sınırı ne kadardır?
 Örnek için 5 ölçme yapılmıştır.
 5 değer için %95 güvenilirlik sınırında, t = 2.78 (tablolardan)
Sayfa 21 / 94
 CX = 12.7 ± 0.2 ppm, (95% güvenirlilikle)
Standart ilavesi yönteminde yukarıda görüldüğü gibi hesaplamayla değil grafikteki değerlerde
yapılan okumalar daha kolaydır. Bir doğru şeklinde elde edilen grafikteki doğru ekstrapole
edilerek x-eksenini kestiği, yani sinyalin sıfır olduğu nokta saptanır. Bu nokta, örnekteki
(bilinmeyen) analit miktarıyla aynı miktarda analit içeren Standard çözeltinin hacmini tanımlar.
1.7.3 İç Standart Metodu
Bir iç standart, bilinmeyen örneğe ilave edilen ve analitten farklı olan, miktarı bilinen bir
bileşiktir. İç standartlar çeşitli rastgele ve sistematik hataları dengeler.
 Bir iç standart, örnek, şahit ve kalibrasyon standartlarına aynı miktarda ilave edilen bir
maddedir.
 Standartlardan alınan ölçme sonuçları, ‘analit sinyali / iç standart sinyali’ değerleri
standartlardaki analit konsantrasyonlarına göre grafiğe alınır.
 Örnek için elde edilen ‘analit sinyali / iç standart sinyali’ oranından, kalibrasyon eğrisi
kullanılarak analitin konsantrasyonu bulunur.
Analit sinyalinin iç standart sinyaline oranı analitik parametre olarak kullanılır. Yöntemin
başarılı olabilmesi için iç standart sinyalinin örnekteki diğer maddelerin piklerinden uzakta (RS >
Sayfa 22 / 94
1.25), analit pikinin yakınında olması tercih edilir. Uygun bir iç standart kullanıldığında
relatif hata % 0.5-1 civarındadır.
Respons faktörü, RX/S: Bilinen miktarlarda analit ve standart içeren bir karışım
hazırlanır. Dedektör, genellikle, karışımdaki her bir madde için farklı responslar verir; böylece
analit için bir respons faktörü saptanır.
Hacim sabit olduğundan,
Sayfa 23 / 94
AX, AİS analit ve iç standart için responslar
mX, mİS enjekte edilen analit ve iç standardın kütleleri
CX, CİS enjekte edilen analit ve iç standardın konsantrasyonları
Örnek 4
İç standart yöntemi kromatografik analizlerde yaygın olarak uygulanan bir kalibrasyon
yöntemidir.
1.7.3.1 Tek Enjeksiyonla Hesaplama Yöntemi
Tek enjeksiyonla hesaplamada, örneğe bilinen miktarda bir iç standart ilave edilir. Analit
için saptanan respons faktörden örnekteki analit miktarı hesaplanır.
Standardın analizi için X maddesinden ve İS (iç standard) maddesinden, 1 ng enjekte
edilir, ölçüm yapılır; standart için elde edilen değerler:
Örneğin analizi için, örneğe 1.00 ppm iç standart ilave edilir ve ölçüm yapılır; elde edilen
değerlerden analit miktarı (CX) hesaplanır.
1.7.3.2 Kalibrasyon Eğrisiyle Hesaplama Yöntemi
İç standart miktarı sabit, analit miktarı değişken olan (farklı mX/mS değerlerinde) bir seri
standart hazırlanır, her birinin kromatogramları alınır. Standartların kromatogramlardan
hesaplanan AX/AS değerlerinin mX/mS değerlerine karşı grafiği çizilir; eğri, eğimi respons faktörü
olan bir doğrudur. Örnekteki analitin miktarının bulunması için, örneğe, bilinen miktarda iç
standart maddesi ilave edilir. Örnek + iç standart karışımının kromatogramından AX/AİS değeri
bulunur ve kalibrasyon eğrisinden analit konsantrasyonu (CX) hesaplanır.
Sayfa 24 / 94
Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi için, aşağıdaki tabloda görüldüğü gibi, dört standart
hazırlanmıştır;
Her standartta 5 00 mg/mL iç standart vardır.
AX/AİS değerleri CX/CİS değerlerine karşı grafiğe alınır.
Kalibrasyon eğrisi, eğimi respons faktörü olan bir doğrudur.
Örneğin analizi için örneğe bilinen miktarda iç standart (C İS) ilave edilir ve hazırlanan karışım
cihaza enjekte edilir.
AX/AİS değeri ölçülür.
Kalibrasyon verilerinden CX/CİS değeri tayin edilir ve CX hesaplanır.
1.7.4 Alan Normalizasyonu Metodu
Örnek enjeksiyonundaki düzensizliğin yarattığı hata alan normalizasyonu ile de
giderilebilir.
Bu
yöntemde
örnekteki
tüm
maddelerin
kolondan
çıkması
gerekir.
Kromatogramdaki tüm piklerin alanları hesaplanır ve her madde için bilinen detektör algılama
faktörü ile çarpılarak düzeltilir. Analitin konsantrasyonu, analit pikine ait alanın toplam pik
alanlarına bölünmesiyle hesaplanır.
Sayfa 25 / 94
Örnekte bulunan her bir analit için bir standart hazırlanır ve kromatogramı alınır, relatif dedektör
responsu hesaplanır.
 relatif respons = pik alanı /enjekte edilen miktar
Bir seri analit için relatif dedektör responslar normalize edilerek istenilen respons faktörlere
dönüştürülebilir; örneğin, her bir değer en büyük değere bölünür.
 respons faktörü = relatif respons /en büyük değer
Elde edilen alan değerleri (ham veriler), respons faktörlere bölünerek indirilmiş alanlar bulunur,
bu değerler miktarla orantılıdır (%kütle, %hacim, %ağırlık, … ).
 indirilmiş alan = alan /respons faktörü
Her bir bileşenin % değeri bulunur.
 ağırlık,% =
Örnek 5
Butil-alkoller karışımı bir örneğin kromatogramının alan normalizayon yöntemine göre
incelenmesi. Detektör hassasiyeti düzeltme faktörleri bilinen miktarlarda saf alkoller kullanılarak
ayrı deneylerde saptanmıştır.
RF (respons faktör) = normalize edilmemiş relatif respons/listedeki en büyük değer;
bunlar, enjekte edilen eşit miktarlardaki analitin, en büyük değer için 1’e normalize edilmesiyle
bulunan alanlardır.
Standartlar için elde edilen veriler
Örnekler için elde edilen veriler: Elde edilen alan değerleri (ham veri), respons faktörlere
bölünerek indirilmiş alanlar bulunur, bu değerler % ağırlıkla orantılıdır.
Sayfa 26 / 94
1.7.5 Elektrot Kalibrasyonu
1.7.5.1 Cam pH Elektrodun Kalibrasyonu
Bir pH ölçmesinde dikkat edilmesi gereken hususlar:
1. En az iki standart tampon seçilerek ölçülecek pH değerinin bu tamponların pH değerleri
arasında bulunması gerekir:
Örneğin pH değeri 5 dolayında ise, standartların pH’larının,
pH = 4 ve pH = 7 olması önerilir.
Örneğin pH değeri 3 dolayında ise, standartların pH’larının,
pH = 2 ve pH = 4 olması önerilir.
2. Cam elektrodun responsu daima voltj veya mV olarak kaydedilir.
1. algılama kısmı; hazne özel bir camdan yapılmıştır
2. az miktarda AgCl (bazen konur)
3. iç çözelti (pH için 0.1 M HCl)
4. iç çözelti (genellikle AgCl
elektrot veya kalomel
elektrot)
5. elektrot bedeni (iletken olmayan camveya plastik)
6. referans elektrot (genellikle AgCll elektrot veya
kalomel elektrot)
7. örnek çözeltisiyle bağlantı (genellikle seramik veya
kapiler asbest veya kuvartzfiber)
1.7.5.1 Cam Elektrodun Responsu (Algılaması)
Elektrot kalibre edilirken pH değeri değil, cam elektrodun voltaj değeri ölçülür. Yeni bir
elektrot, ortam koşullarında, 60 mV/pH dolayında bir respons verir.
pH = 7 – 4 arasında elektrot potansiyeli ≈+180 mV kadar yükselir.
pH = 7 – 10 arasında elektrot potansiyeli ≈+180 mV kadar düşer.
Sayfa 27 / 94
Elektrot yaşlandıkça kalibrasyon doğrunsun eğimi azalır, respons zamanı da uzar; yani,
elektrodun cevap vermesi yavaşlar. Reasponsun 60 mV’un önemli derecede altına düşmesi ve
respons zamanının da çok yavaşlaması durumunda elektrot kullanılamaz hale gelmiş demektir.
Cam elektrodun responsunun yavaşlaması kalibrasyon doğrusunun eğiminin düşmesiyle
de kendini gösterir. Yaşlanan elektrodda gözlenen bu durumun nedeni, zamanla elektrodun
organik ve inorganik iyonlarla kirlenmesidir. Organik iyonlar membranda adsorblanır, Na+ ve K+
gibi inorganik iyonlar ise jel tabakasına girerler.
1.7.5.2 pH Ölçmelerinde Hatalar
1.7.5.2.1 Yanlış kalibrasyon: Ölçülen pH değeri standartlardan daha doğru olamaz
(±0.01 pH). Kalibrasyonda kullanılacak tamponun hatalı hazırlanması veya hazır-lanmış
tamponun bekleme nedeniyle bileşiminin değişmesi (organik kısımlar bak-teriler tarafından
etkilenerek tamponun zamanla kirlenmesine neden olur) pH ölçümünde hatalı sonuçlara yol açar.
1.7.5.2.2 Sodyum (alkali) hatası: Yüksek pH değerlerinde elektrodun Na+ iyonlarını
algılamasından kaynaklanır; okunan pH değeri, gerçek değerden daha düşüktür. Herhangi bir cam
elektrot pH > 9 'da alkali metal iyonlarına karşı kısmen duyar olmaya başlar.
1.7.5.2.3 Asit hatası: Çok düşüş pH değerlerinde ortaya çıkar. pH < 0.5 ‘in altındaki
değerlerde cam elektrotlarla elde edilen sonuçlar gerçek değerlerden bir miktar yüksektir.
1.7.5.2.4 Sıcaklık değişikliğinin etkisi
pH metrede normal sıcaklık düzeltmesi sadece pH elektrodundan algılanan mV değerinde
yapılır, fakat çözeltideki sıcaklık değişiklikleri cihaz tarafından düzeltilemez. Çözeltide pH’ın
sıcaklıkla değişimini düzeltebilmek için, çalışılan çözeltiyle bir pH-sıcaklık kalibrasyonu yapılır;
deney sonuçları bu kalibrasyon değerlerine göre düzeltilir. Modern pH metrelerde, hazırlanan
pH-kalibrasyon değerleri cihazın programına girilerek düzeltmenin cihaz tarafından yapılması
sağlana-bilmektedir.
Aşağıdaki tabloda bir pH-sıcaklık düzeltme kalibrasyon değerleri verilmiştir.
Sayfa 28 / 94
(Temas potansiyelindeki değişiklikler ve elektrot neminin kaybolması da elektrotlarda
karşılaşılan diğer hata kaynaklarıdır.)
1.8. Enstrümental Analizde Çözeltiler
1.8.1 Konsantrasyon Birimleri ve Seyreltme
1.8.1.1 Derişim
Bir çözeltinin bilinen bir hacimdeki çözünen madde miktarı derişim (konsantrasyon)
olarak tanımlanır. Derişim yüzde derişim, molarite, normalite, ppt, ppb, ppm, µg/kg ve mg/kg
cinsinden ifade edilebilir. Bunlardan başka mol kesri, mol yüzdesi ve molalite gibi kavramlar da
kullanılabilir.
1.8.1.2 Yüzde Derişim
Bir çözeltinin konsantrasyonu yüzde olarak birkaç şekilde ifade edilir. Karışıklıkları
önlemek için yüzde konsantrasyon mutlaka açık olarak belirtilmelidir. Eğer bu bilgi olarak
verilmemiş ise çözeltinin türünden çıkarılmaya çalışılmalıdır. Bu ifadelerin belirtilmesinin ne
denli önemli olduğunu en iyi anlatacak örnek; ağırlıkça (m/m) % 50’lik NaOH çözeltisi, 1
litresinde 763 g NaOH içeriyor demektir. Bu da hacimde ağırlıkça yüzde (m/v) olarak % 76.3
demektir.
1.8.1.2.1 Ağırlıkça Yüzde (m/m)
Ağırlıkça yüz birim çözeltide bulunan çözünenin ağırlıkça kesridir. Genellikle ticari sulu
reaktifler için kullanılır. Örneğin Hidroklorik asit % 37’ lik (m/m) çözeltisi halinde satılır.
%(m/m) = çözünen maddenin ağırlığı(g)/[çözünen madde(g)+çözücünün ağırlığı(g)]x100
Örnek :
500 g %50’lik (m/m) NaOH çözeltisi nasıl hazırlanır.
% 50 = [X/(X+(500-X)]x100
X= 250 g çözünen
O halde bu çözeltinin hazırlanmasında 250 g NaOH alınır ve üzerine 250 ml saf su
eklenir.
1.8.1.2.2 Hacimce Yüzde (v/v)
Hacimce yüz birim çözeltide bulunan çözünenin hacimce kesridir. Saf bir sıvının başka
bir sıvı içinde seyreltilmesi ile hazırlanan çözeltiler için kullanılır. %(v/v) = çözünen maddenin
hacmi(v)/[çözünen madde(v)+çözücünün hacmi(v)]x100
Örnek :
150 mL % 28’lik (v/v) sulu etil alkol çözeltisi nasıl hazırlanır.
% 28= (X/150)x100
X= 42 ml
42 mL etil alkol alınır ve son hacim saf su ile mL’ ye tamamlanır.
Sayfa 29 / 94
1.8.1.2.3 Hacimde Ağırlıkça Yüzde (m/v)
Hacimce yüz birim çözeltide bulunan çözünenin ağırlıkça kesridir. Katı maddelerin
seyreltik sulu çözeltilerinin hazırlanmasında çözeltiler için kullanılır. Sulu reaktifler için
kullanılır.
%(m/v) =[çözünen maddenin ağırlıkça(g)/çözeltinin hacmi] x100
Örnek :
250 mL % 20’ lik NaCl çözeltisini hazırlamak için kaç g NaCl gerekir?
% 20 = (m/250)x100
m= 50 g
Bu durumda 50 g NaCl tartılarak suda çözülüp son hacmi saf su ile 250 mL ye
tamamlanır.
1.8.1.2.4 Molarite
Molarite, bir litre çözeltide çözünen maddenin mol sayısını gösterir. M harfi ile gösterilir.
M=n(mol)/V(L)
Örnek :
500 ml 0.1 M NaOH çözeltisi için kaç g NaOH tartılmalıdır.
MA(Molekül ağırlığı NaOH) = 40 g/mol
M=n/V
0.1 mol/L= n/0.5 (L)
n= 0.05 mol
N=m/MA 0.05 mol = m/40 (g/mol) m= 2 g
2 g NaOH tartılarak son hacim dikkatlice 500 mL’ ye tamamlanır.
1.8.1.2.4 Normalite
Çözeltinin 1 mL’sinde bulunan çözünen maddenin mili eşdeğer gram sayısıdır. Aynı ifade
Çözeltinin 1 L’ sinde bulunan çözünen maddenin eşdeğer gram sayısı olarak ifade edilir.
N=(m/eşdeğer gram sayısı)/V
Eşdeğer gram sayısı= Molekül ağırlığı/Tesir değerliliği
1.8.1.2.4.1 Tesir Değerliliği (TD):
Asitlerin ortama verdiği H+ iyonu sayısı, bazların ortama verdiği OH- sayısı, tuzların
ortama verdiği veya aldığı elektron sayısına tesir değerliliği denir.
Örneğin H2SO4 için bu değer 2’dir. Çünkü sülfürik asit 2 tane H+ iyonunu sulu çözeltisine
verebilir. NaOH, HNO3, HCL için bu değer 1’ dir. Fakat tesir değerliliği hesaplanırken, tesir
değerliliği bulunacak maddenin reaksiyona girdiği madde ile verdiği tepkimeye göre tesir
değerliliğinin değişebileceği unutulmamamladır. Bu nedenle son zamanlarda normalite kavramı
yerine maddenin reaksiyonu yazılarak stokiyometrik oran üzerinden hesaplama yapılmaktadır.
Molarite ve normalite arasında N= MxTD bağlantısı vardır.
1.8.1.2.5 ppt (binde bir), ppm (milyonda bir) ve ppb (milyarda bir Hesaplamalar
Eser miktarda çözeltilerin derişimlerini belirtmek amacıyla kullanılır.
Sayfa 30 / 94
ppt = (g çözüne / kg veya litre çözelti)
ppm = (mg çözüne / kg veya litre çözelti)
ppb = (µg çözüne / kg veya litre çözelti)
Not: Bazen ppt ifadesi part per thousand (binde bir) olarak kullanıldığı gibi bazende part
per trilion (trilyonda bir) olarak ifade edilebilir. Bu nedenle hangi ifade için kullanıldığına
dikkat edilmelidir.
Örnek:
Bir su örneğinin analizi sonucunda bulunan Na+ derişimi 200 ppm olarak bulunmuştur.
Sudaki sodyum kaynağının NaCl olarak düşünülmektedir. NaCl’ ün derişimini hesaplayınız.
Bu durumda çözeltinin litresinde 200 mg Na+ vardır.
N (mol) = m(g)/MA (g/mol) formülüden önce mol sayısı bulunur. nNa+ = (200x/103
)g)/23/mol)=8.70x(10-3) mol, V= 1 L olduğu için n=M
[Na] 8.70x (10-3) M
Sayfa 31 / 94
3. ENSTRÜMENTAL GIDA ANALİZLERİNDE ÖN HAZIRLIK
2.1 Gıdalarda Yapılan Enstrümental Analizler
Klasik kantitatif analiz metotları dediğimiz gravimetrik analizler bileşenin kütlesi,
titrimetrik analizde ise bileşenle reaksiyona giren standart bir numunenin hacmi tayin edilir. Ve
bu hacimden yararlanılarak analizi yapılmak istenen maddenin kütlesi bulunur. Eskiden analizler
sadece bu metotlarla yapılırdı. Ancak, 1930’lu yıllardan sonra analizler için cihaz kullanılmaya
başlanmıştır. 1950’li yıllardaysa cihazlarda ve kullanımlarında anormal bir artış göstermiştir. Bu
cihazları kullanarak yapılan analizlere de “enstrümental analizler” denmiştir. Enstrümental
analizlerin kullanılması, o tarihten günümüze kadar artarak devam etmiştir. Buna bakarak
enstrümental analizlerin bir gün gelecekte tamamen klasik metotların yerini alacağı fikrine
kapılmamak gerekir. Her enstrümental analizin temelinde genellikle klasik analiz işlemleri
(numune alma, tartma, ayırma, pH ayarlama, hacim ölçme vb.) yatar.
Klasik analizlerin sayısı belki biraz azalacak ama yine de devam edecektir.
2.1.1 Enstrümental analiz metotlarının klasik analiz metotlarına göre avantajları
şunlardır:
 Enstrümental analiz metotları, çok düşük konsantrasyonlarda bile iyi sonuç vermektedir.
Klasik analiz metotlarında bu kadar düşük konsantrasyonlar tayin edilemezler.
 Enstrümental analiz metotları, klasik metotlardan daha hızlıdır ve kısa sürede sonuçlar
alınabilir.
 Enstrümental amaçla kullanılan bir cihaza mikrobilgisayar bağlanarak, analiz sonuçları
otomatik olarak kaydedilebilir. Kısacası enstrümental analiz metotları otomasyona uygundur.
2.1.2.1 Enstrümental
analiz
metotlarının
klasik
analiz
metotlarına
göre
dezavantajları
 Enstrümental analizde kullanılan cihazlar laboratuvarda özel bir yer isteyen, pahalı ve bakıma
ihtiyaç gösteren cihazlardır.
 Enstrümental analizde elde edilen sinyallerin değerlendirilmesi iyi yetişmiş insan gücüne
ihtiyaç gösterirken klasik analizde ise buna gerek duyulmaz.
 Enstrümental metotların öğretilmesi ve öğrenilmesi güç iken klasik analizinki kolaydır.
 Enstrümental analizler, konsantrasyonları yüksek olan maddelerde uygulanamazken klasik
metotlar çok kolay uygulanır.
 Enstrümental metotlarda cihazlar kullanılmadan önce kalibre edilmek için standart maddelere
ihtiyaç duyulurken klasik analizlerde böyle bir işleme gerek yoktur.
Sayfa 32 / 94
 Enstrümental metotlar arada bir yapılacak analizler için uygun değildir. Zira bu analizlerde
kalibrasyon eğrisi oluşturmak hem pahalı hem de çok zaman alıcı bir işlemdir. Klasik analizde
kalibrasyon eğrisine ihtiyaç yoktur.
Zamanımızda klasik metotlarla yapılamayan pek çok analiz enstrümental analizle
yapılmaktadır ve nerdeyse, maddenin her fiziksel özelliği üzerine bir enstrümental analiz metodu
geliştirilmiştir. Örneğin, madde ışın enerjisini absorpluyorsa absorptimetri, floresans özelliği
gösteriyorsa spektroflorimetri, renkliyse kolorimetri, elektrik akımı geçiriyorsa kondüktometri vs.
metotları ortaya konmuştur. Bunlarla ilgili geniş bilgi Tablo 1.1’de verilmiştir. Tabloda fiziksel
özellik yerine sinyal kullanılmasının nedeni kullanılan cihazın kalitatif veya kantitatif olarak
belirtilmek istenen özelliği bir sinyal olarak vermesidir. Bu sinyaller bu konuda bilgili kişiler
tarafından incelenerek söz konusu madde hakkında yeterli bilgi elde edilir.
Günümüzde enstrümental analiz yöntemleri birçok alanda olduğu gibi gıda kontrolünde
ve gıda araştırmalarında çok önemli bir yer tutmaktadır. Her geçen gün yeni enstrümental analiz
yöntemleri uygulamaya katılmakta, eski yöntemler ise geliştirilmektedir. Teknolojik gelişime
paralel olarak cihazların duyarlılıkları ve seçicilikleri de artmaktadır. Bir analiz, proses veya
kalite kontrolü için yapılıyorsa, analiz sonucunun yapılan işe esas olan standardın şartlarını
karşılayıp karşılamadığına bakılır ve bu gibi durumlarda analizlerin çok süratli yapılması istenir.
Bu nedenle de enstrümental analiz metotları kullanılır ve otomasyona uygun metotlardır.
Enstrümental analiz metotları ile birçok gıda örneğinde hızlı bir şekilde otomatik olarak tayin
yapılabilmektedir. Bu da hem zamandan kazanıma hem de anında müdahaleye olanak sağlamakta
ve
gıda
kontrolünde
enstrümental
analiz
metotlarının
kullanılmasının
yaygınlaştırma
zorunluluğunu da ortaya koymaktadır. Enstrümental analizler metotları, örneği oluşturan
bileşenlerin verdiği sinyalleri değerlendirme prensibine bağlı olduğundan bu metotların
anlaşılması kolay değildir. İstek, sabır, bilgi ve tecrübe birikimi gerektirdiği asla
unutulmamalıdır.
Enstrümental gıda analiz metotları şu şekilde gruplandırılabilir:
 Spektroskopi
 Moleküler Spektroskopi
 Atomik Spektroskopi
 Polarimetri
 Refraktometri
 Kromatografi
 Sıvı Kromatografisi
 Gaz Kromatografisi
Sayfa 33 / 94
 Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC)
 Kağıt ve ince Tabaka Kromatografisi
 Potansiyometri
Gıda analizlerinde enstrümental analiz yöntemlerinden fotometrik analiz yöntemleri tercih
edilir. Çözeltilerin ışığı absorbe (soğurma) etme, ışığı geçirme veya kırma gibi özelliklerinin
ölçülmesi esasına dayanan yöntemlere fotometrik yöntemler denir.
Bu analiz yöntemlerinde şunlar yapılır:
 Analiz edilecek örnek çözelti haline getirildikten sonra üzerine belli bir kimyasal ilave
edilir.
 Böylece elde edilen sistemin ışığı absorbe etme, ışığı çevirme veya ışığı kırma
dereceleri ölçülür.
 Ölçüm değerleri aynı koşullarda hazırlanmış ve içerisine belli miktarda madde bulunan
bir standart seri ile karşılaştırılarak sonuca gidilir.
 Fotometrik analiz yöntemlerinin en büyük avantajı seri çalışmaya ve çok az madde
miktarlarının bile belirlenmesine imkân sağlamasıdır.
Başlıca fotometrik analiz yöntemleri şunlardır:

Spektrofotometri

Kolorimetri

Refraktometri

Türbidometri

Fluorometri
Bu enstrümental analiz metotlarından gıda analizlerinde en çok kullanılan spektroskopi,
refraktometri, polarimetri, kromatografi ve potansiyometri ile ilgili detaylı bilgiler ilgili
kısımlarda verilecektir.
Sayfa 34 / 94
Gıdalarda yapılan enstrümental analizlerden bazıları Tablo 2.1’de verilmiştir
Analiz
1.BESİN ETİKETİ ANALİZLERİ
Nişasta (kantitatif) tayini
Metod
Polarimetrik yöntem
C Vitamini analizi
Spektrofotometrik yöntem
2. GENEL ANALİZLER
Briks tayini (Kuru Madde)
Refraktometrik yöntem
Kırılma indisi
Suda çözünen madde tayini
Kırılma indisi tayini
Refraktometrik metot
pH tayini
Potansiyometrik yöntem
3. KATKI MADDELERİ VE KONTAMİNANT ANALİZLERİ
Aflatoksin (B1, B2, G1, G2) ,
HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi)
Okratoksin
yöntemi
Benzoat tayini
Boya tayini (kalitatif)
Kağıt Kromatografisi
Nitrit/nitrat tayini
4. YAĞ ANALİZLERİ
Yağ asitleri kompozisyonu
Gaz Kromatografisi
UV ışığında özgül soğurma
Kolestrol, steroller
Gaz Kromatografisi
Bazı hormonlar
Gaz Kromatografisi
5. SÜT VE SÜT ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ
Glikomakropeptid analizi (PAS analizi)
yöntemi
6. ET VE ET ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ
Hidroksiprolin miktarı
yöntemi
Nitrit/nitrat tayini
7. MEYVE-SEBZE VE ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ
Benzoik asit tayini
Briks tayini
Hidroksimetil furfural tayini
Laktik asit tayini
Meyve oranı
Spektrofotometrik ve mineral analiz
Sayfa 35 / 94
Tablo 2.1 devamı
Prolin tayini
Spektrofotometrik yöntemi
Salçada likopen tayini
Sirkede yapaylık tayini
Kolorimetrik yöntem
Suda çözünen madde miktarı
Boya maddeleri tayini (kalitatif)
Fenolik madde profili
yöntemi
8. TAHIL VE TAHIL ÜRÜNLERİ
Aflatoksin analizi
Nişasta tayini
Lipoksigenaz aktivitesi tayini
9. KURU BAKLAGİL ANALİZLERİ
Izoflavon miktarı
Lipoksigenaz aktivitesi tayini
HPLC (Yüksek performans sıvı kromatografisi) ile
analiz
yöntemi
10. ŞEKERLİ/ÇİKOLATALI ÜRÜNLER ANALİZLERİ
Diyastaz tayini
Kolorimetrik yöntem
Hidroksimetil furfural tayini
Nişasta miktarı
Şeker kompozisyonu analizi HPLC
yöntemi
11. ÇAY ANALİZLERİ
Antioksidan aktivitesi tayini
Fenolik madde profili
yöntemi
Kafein
yöntemi
Sayfa 36 / 94
2.2 Enstrümental analizlerde ön hazırlıklar
Yapılacak enstrümental analiz metoduna göre öncelikle ön hazırlıkların yapılması gerekir.
Bu analiz yöntemlerinde analiz edilecek örnek çözelti haline getirilmelidir. Bunun için örneklerin
analiz yöntemlerinde belirtildiği şekilde çözeltiler ve kimyasal maddeler hazırlanmalıdır. Daha
sonra bu örneğe ölçüm yapmadan önce ilave edilecek kimyasal maddeler analiz yönteminde
belirtilen şekilde hazırlanmalıdır. Analiz öncesi sistemin ışığı absorbe etme, ışığı çevirme veya
ışığı kırma dereceleri ölçümü için cihazlar kullanım talimatlarında belirtilen şekillerde
çalıştırılarak kullanıma hazır hale getirilmeleri gerekmektedir. Bunun için her cihaz için ayrı
işlemler yapılmaktadır. Bu konular ilgili faaliyetlerde ayrıntılı olarak anlatılacaktır. Ölçüm
değerlerinin aynı koşullarda ve içerisine belli miktarda madde bulunan bir standart seri ile
karşılaştırılması için analiz öncesi standart seri çözeltilerinin hazırlanması çözeltileri belirlenip,
çözelti hazırlama esasları uygulanarak hazırlanır. Bu standart seri çözeltilerden bazıları analiz
kitleri olarak hazır halde de bulunmaktadır. Bu kitler bulunuyorsa standart seri çözeltilerinin
hazırlanmasına gerek yoktur. Enstrümental gıda analiz yöntemlerinde analiz öncesi hazırlıklar
değişmekle birlikte genel olarak analiz föyü dikkatlice okunmalı ve aşağıdaki işlemler
yapılmalıdır.
 Analiz için gerekli kimyasal çözeltilerinin listesi çıkarılmalıdır.
 Listelenen çözeltiler usulüne uygun olarak teker teker hazırlanmalıdır.
 Standart seri çözeltileri hazırlanmalı ya da analiz kitleri tedarik edilmelidir.
 Örnek, analiz için, analiz föyünde belirtilen şekilde hazırlanmalıdır.
 Kulanım talimatlarına uygun olarak cihaz çalışmaya hazır hale getirilmelidir.
Sayfa 37 / 94
3. ALETLİ ANALİZLERİN SINIFLANDIRILMASI
Aletli analizleri başlıca üç grupta toplayabiliriz:
3.1 Optik Yöntemler
Optik yöntemleri dört ana başlık altında toplayabiliriz. Bütün optik yöntemlerde ışının
madde ile etkileşimi incelenir. Bu etkileşim sırasında soğuran veya yayılan ışının özellikleri veya
ışının uğradığı diğer değişiklikler ölçülür. Bu tür ölçüm yöntemlerine genel olarak spektroskopi
denir. Bu yöntemleri anlayabilmek için ışınla ilgili bilgileri bilmek gerekir.
3.1.1 Işın ve Özellikleri
Işın foton adı verilen enerji paketlerinden meydana gelmiş bir dalga hareketi olarak kabul
edilir. Bir başka deyişle ışın içinde enerji paketlerinin taşındığı bir dalga hareketidir. Dolayısıyla
bir enerjisi ve bir dalga boyu vardır. Fotonların enerjisi E=hγ =hc/λ = hcγ eşitliği ile ifade edilir.
Burada h Plank sabiti, γλ frekansı, c ışının boşluktaki hızını λ dalga boyunu. -γ ise dalga sayısını
belirtir. Enerji frekans ile doğru, dalga boyu ile ters orantılıdır. Işının spektrumu, bütün dalga
boyu sistemini ihtiva eder. Analizlerde, kullanılacak ışının dalga boyuna göre ölçülecek özellik
dolayısıyla kullanılacak yöntem farklıdır.
3.1.2 Işının Madde ile Etkileşimi
Bir madde üzerine gönderilen ışın, bu maddenin atom veya molekülleri ile etkileşime
girer. Etkileşim, maddenin ve gönderilen ışının özelliklerine göre farklı şekilde olur. Sonuç
olarak ışın ya maddeden geçerek ilerler ya da madde tarafından soğurulur, yansır veya saçılır.
3.1.3 Işının Soğurulması
Bir ışın; geçirgen bir katı, sıvı veya gaz içinden geçirilirse bazı dalga boylarının yok
olduğu görülür. Bu durum, ışın enerjisinin maddedeki atom veya moleküllere aktarılmasının bir
sonucudur. Bu olaya soğurma denir. Böylece kararlı durumda yani en düşük enerji düzeyinde
bulunan tanecikler bu şekilde kalmayı istemezler ve soğurdukları enerjiyi geri vererek yaklaşık
10-8 λ saniyede ilk durumlarına göre dönerler. Bu olayda çıkan enerji çoğunlukla ısı şeklinde
görülür. Enerjinin geri verilmesi bazı hallerde uyarılmış olan tanecikler kimyasal değişmeye
uğrayarak enerji soğururlar bazı hallerde de soğurulan enerji çoğunlukla daha uzun dalga
boyunda olmak üzere geri verilir. Bazı hallerde ise olaylar bir arada olur. Atom molekül veya
iyonların belli sayıda enerji düzeyleri vardır.
Işının soğurulması için maddenin kararlı düzeyi ile uyarılmış düzeyi arasındaki enerji
farkı, ışının enerjisine eşit olmalıdır. Bu sebeple soğurulan ışının özelliklerinin ölçülmesiyle
soğurucu madde hakkında bilgi edinir. Soğurma; atom veya moleküller tarafından olabilir.
Atomik soğurmada, bir ışık kaynağından analiz edilecek maddenin buhar fazındaki atomları
üzerinde belli dalga boyunda ışın gönderilir. Örneğin bir sodyum analizinde, örnek alevde
Sayfa 38 / 94
buharlaştırılır ve buhar içine belli dalga boyunca ışın gönderilirse 3s yörüngesindeki elektron 3p
yörüngesine geçtiğinden ışının soğurulduğu görülür. Soğurma miktarı ortamdaki sodyum
atomlarının derişimi ile orantılı olduğundan bu şekilde nicel tayin yapılabilir. Yalnız elektron
geçişleri sebebiyle değil molekül hareketleri sebebiyle de soğurma olabilir. Bilindiği gibi bir
molekülün enerjisi elektronik, dönme ve titreşim enerjilerinin toplamına eşittir.
E Toplam = E Elektronik + E Titreşim + E Dönme
Toplam enerji içindeki elektronik enerjinin payı diğerlerine oranla oldukça fazladır. Elektron
geçişi, dönme ve titreşimden başka çekirdek veya elektronların kuvvetli bir manyetik alanda
enerji düzeyleri değiştirilebilir ve radyo dalgaları düzeyinde ışının soğurulmasına sebep
olunabilir.
3.1.4 Işının Yayılması
Gaz halinde iken belli bir enerji ile uyarılmış olan atom veya moleküllerdeki elektronlar
bu halde kalmaz ve hemen ilk durumlarına döner. Bu dönüş sırasında belli bir ışın yayar. Yayılan
bu ışının enerjisi uyarılmış elektronun bulunduğu yörüngeç ile ilk yörüngeç arasındaki enerji
farkına eşittir. Yayılan ışının şiddeti ortamda bulunan atomların derişimine bağlı olduğundan bu
ışının özelliklerinin ölçülmesiyle nicel analizler yapılabilir. Gönderilen enerjinin şiddeti çok fazla
olursa içteki elektronlar daha yüksek enerji düzeylerine çıkar veya atomlardan tamamen
uzaklaşır. Elektronun uzaklaşmasıyla meydana gelen boşluk daha üst yörüngeçlerdeki
elektronlardan biri tarafından doldurulur ve iki yörüngeç arasındaki enerji farkı ışın olarak
dışarıya verilir. Yayılan bu ışın X- ışınıdır. Yüksek enerjiye sahip olan bu ışının dalga boyu
elemente ve elektronun hangi yörüngeçten geldiğine göre değişir
3.1.5 Işının Maddeden Geçmesi
Gözlemler, saydam bir ortamdan geçen ışının hızının boşluktakinden daha az olduğunu ve
ayrıca saydam ortamdaki atom, iyon veya moleküllerin derişimine bağlı olarak değiştiğini
göstermiştir. Bu gözlemler ışının madde ile etkileşimine girdiğini ancak gecen ışının frekansında
bir değişiklik olmadığından bu etkileşim sırasında bir enerji aktarımının olmadığını
göstermektedir.
Işının ortam ile etkileşimi kırılma indisi ile ölçülür ve Ni =C/ Vi Vi şeklinde ifade edilir.
Burada λ belli bir i frekansındaki ışının kırılma indeksini, Vi bu ışının saydam ortamdaki hızını,
C ise boşluktaki hızını belirtir. Bir ortamdan yoğunluğu farkı başka bir ortama geçerken ışının
yönünün değiştiği görülür. Buna ışının kırılması denir.
Sayfa 39 / 94
Şekil 3.1
Gelen ışın, kırılan ışın ve normal aynı düzlemde bulunur.Belirli ortamlar için geliş açısının
sinüsünün kırılma açısının sinüsüne oranı sabittir. Sin i / sin r = a Snell kanunu Işık yoğunluğu az
ortamdan, yoğunluğu fazla olan ortama girdiğinde hem daha fazla acıyla kırılır hem de hızı
azalır.
3.1.6 Lambert-Beer Yasası
Io şiddetinde, paralel bir ışın demeti b kalınlığında ve C derişiminde absorplayıcı bir
tabakadan geçirilirse, gelen ışının gücü veya şiddeti azalır. Bu yasa, ışımanın absorplanan
miktarı, çözeltinin derişimine ve izlediği yolun uzunluğuna bağlıdır. Eşitlik aşağıda verilmiştir.
Ölçülen absorbansla derişim arasındaki ilişkinin geçerli olması bazı koşullara bağlıdır. Bu
koşullar olmadığı takdirde Lambert-Beer yasasından sapmalar meydana gelir. Bu sapmaların en
büyük nedenlerinden birisi derişimdir. 0.01 M daha derişim çözeltilerde moleküller arası
etkileşim nedeniyle Lambert-Beer yasasından negatif yönde sapmalar meydana gelir. Bundan
başka çözelti ortamında ayrışma, polimer oluşturma, sıcaklık değişimi vs bu yasadan sapmalara
neden olur.
Şekil 3.2
Sayfa 40 / 94
3.1.6.1 Geçirgenlik (T)
Geçen ışın şiddetinin gelen ışın şiddetine oranıdır. Genellikle yüzde geçirgenlik olarak
ifade edilir.
3.1.6.2 Absorbans (A)
Gelen ışık şiddetinin
geçen ışın
şiddetine oranın logaritmasıdır. Absorbans ile
geçirgenlik ters orantılıdır.
3.1.2.3 Absorptivite (a)
Birim derişimde birim kalınlıktaki numunenin absorbansıdır.
A α b C yani A= a x b x C
Burada a orantı katsayısı olup, absorptivite’dir. Çözeltinin derişimi Molarite Çinsinden
verilmişse, absorptiviteye “molar absorptivite katsayısı” adı verilir. Bu durumda,
A= ε x b x C olur.
3.1.7 Işının Soğurulması Temeline Dayanan Aletli Analizler
Soğurma temeline dayanan aletli analizler kullanılan ışının dalga boyuna göre üç ana
grupta incelenir:
 Mor ötesi ve görünür ışınlarla yapılan soğurma analizleri
 Kızıl ötesi ışınlar ile yapılan soğurma analizleri
 Radyo dalgaları ile yapılan soğurma analizleri
Mor ötesi veya görünür bölge ışınları ile daha çok çözeltilerdeki örneklerin analizi yapılır.
İçi sıvı ile doldurulmuş bir kap içindeki bir ışın geçirilirse diğer tarafa geçen ışının gücünde bir
azalma olduğu görülür. Işının gücündeki azalma bir oranda maddenin yüzeyinden yarısına veya
madde içinde asılı parçacıklara çarpma sonucu saçılma da olabilir; ancak bu sebeplerle azalma
oldukça önemsizdir. Işının gücündeki azalmanın asıl sebebi ışının madde tarafından soğurulmuş
olmasıdır. Bir çözeltinin görünen bölgede hangi dalga boyundaki ışınları soğurduğu çözeltinin
rengine bağlıdır. Beyaz ışıktaki belli dalga boyundaki ışınlar soğurulursa veya bir başka deyişle
belli renkteki ışınlar soğurulursa görünen ışık beyaz değil farklı bir renkte olur. Mesela bir çözelti
sarı renkte ise dalga boyu 4550-4850 oA arasındaki ışınlar yani mavi ışınları soğurur. Aşağıdaki
çizelgede çeşitli renklerdeki çözeltilerin soğurdukları ışınlar ve bunların dalga boyları verilmiştir.
Sayfa 41 / 94
Soğurulan ışının ölçülmesine dayanan kimyasal analizlere genel olarak soğurma ölçümlü
denir. Renkölçümü(kolorimetri) sözcüğü ise yalnız görünür bölge ışınları ile yapılan soğurma
analizleri amaçlanır. Mor ötesi ve görünür bölge ışınları ile yapılan analizlerde derişimi bilinen
çözeltinin soğurduğu ışın ile bilinmeyen çözeltinin soğurduğu ışın miktarı karşılaştırılır.
karşılaştırma işlemi ya doğrudan göz ile yapılır ya da elektronik almaçlar kullanılır.
Çizelge 3.1: Çeşitli renkli çözeltiler ve bunların soğurdukları ışınlar
Soğurulan ışının ölçülmesine dayanan kimyasal analizlere genel olarak soğurma ölçümlü
denir. Renkölçümü(kolorimetri) sözcüğü ise yalnız görünür bölge ışınları ile yapılan soğurma
analizleri amaçlanır. Mor ötesi ve görünür bölge ışınları ile yapılan analizlerde derişimi bilinen
çözeltinin soğurduğu ışın ile bilinmeyen çözeltinin soğurduğu ışın miktarı karşılaştırılır.
Karşılaştırma işlemi ya doğrudan göz ile yapılır ya da elektronik almaçlar kullanılır.
 Görsel Renk Ölçümü
Görsel renkölçümünde derişimi bilinen çözeltinin rengi ile derişimi bilinmeyen çözeltinin rengini
göz karşılaştırır. Görsel renk ölçümü için değişik yöntemler uygulanabilir.
 Nessler Yöntemi
Bu yöntemde derişimi bilinen bir dizi çözelti hazırlanır ve bunlar aynı büyüklükteki tüplere
konur. Derişimi bilinmeyen çözelti bu tüplerden birine konur ve renk şiddetleri karşılaştırılır.
Rengi uyan tüpün derişimi bulunması istenen derişime eşit olur. A1 = a1 b1 c1 ve A2 = a2 b2 c2
eşitliklerinde A1 = A2 a1 =a2 b1=b2 c1= c2 olur. Bu amaçla kullanılan belli çap ve uzunluktaki
tüplere Nessler tüpü denilir. Bu yönteme de Nessler yöntemi denir.
Sayfa 42 / 94
3.1 Refraktometrinin İlkesi
'''Refraktometri''', her ortamın kırılma indisinin farklı olması prensibini kullanarak,
konsantrasyon ve madde miktarı gibi tayinleri yapmaya yarayan bir yöntemdir. Kırılma indisi her
maddeye özgü bir fiziksel özelliktir, bu sebeple kalitatif ve kantitatif analizlerde
kullanabileceğimiz bir metottur. Günümüzde organik bileşiklerin kantitatif analizinde NMR,
infrared spektroskopisi gibi yöntemler daha çok tercih edilmektedir. Saydam bir ortamdan gelen
bir ışının diğer bir saydam ortama geçerken doğrultusunu değiştirmesine ışığın kırılması denir.
Bir ortamın kırılma indisi, ışığın boşluktaki hızının bu ortama giren ışık demetinin düşey düzlem
ile meydana getirdiği havada ve bu ortamdaki açıların sinüslerinin oranı olarak ölçülür. Gelme
açısının sinüsünün kırılma açısının sinüsüne oranına “kırılma indisi” denir. Bir ortamın kırılma
indisine n, elektromanyetik ışımanın vakumdaki hızına c, elektromanyetik ışımanın bu ortamdaki
hızına da v dersek, şöyle bir bağıntı elde edilir:
n=c/v
Benzer maddelerin kırılma indisleri birbirine çok yakın olduğundan ( 1.25 -1.80 arası)
±0.001 duyarlılıkla ölçüm yapabilir.
Şekil 3.1
Işının bir ortama geliş açısına i, yansıma açısına da r dersek eğer, Snell Yasasına göre şöyle bir
bağıntı yazılabilir:
v1: Işının 1. ortamdaki hızı
v2: Işının 2. ortamdaki hızı
n1: 1. ortamın indisi
n2: 2. ortamın indisi
Işının geliş açısı, ışının hızı ve ortamın indisi ile orantılıdır. Işının geliş ve yansıma
açılarının bilinmesi halinde, iki ortamın kırılma indislerinin oranları da bulabilinir. Ya da bir
Sayfa 43 / 94
ortamın indisini biliniyorsa, diğer ortamın indisini de bu bağıntı sayesinde hesaplanabilinir.
Kırılma indisleri farklı olan bölgelerde ışının hareketi iki şekilde gerçekleşir:
 n2 > n1 koşulunda, α geliş açısı, β yansıma açısından daha büyük olacaktır. Geliş açısı
büyüdükçe, kırılma açısı da büyür. Buna rağmen geliş açısı, kırılma açısından her zaman daha
büyüktür.
 n1 > n2 koşulunda, yüksek yoğunluklu ortamdan düşük yoğunluklu ortama geçiş sırasında
yansıma açısı, geliş açısından daha büyüktür. Geliş açısı büyüdükçe, yansıma açısı da 90º‘ye
yaklaşır.
Işımanın 90º ’lik bir açı ile kırılmasını sağlayan geliş açısına kritik açı denir. Işının kritik
açıdan daha küçük bir değerle gelmesi halinde, yansıma sonucu aydınlık bölge oluşur. Eğer ışın
iki ortam arasındaki yüzeye kritik açıdan daha büyük bir açıyla gelirse, ışın kırılmaya değil,
yansımaya uğrar.
Yoğunluğu büyük ortama kritik açıyla gelen bir ışın, 90º’lik bir açı ile kırılır. Yoğunluğu
küçük ortama 90º’lik açı ile gelen bir ışın ise yoğunluğu büyük olan ortama kritik açı ile girer.
Snell yasasından yararlanarak şöyle bir bağıntı yazılabilir:
Refraktometre cihazının içerisinde prizmalar kullanılır. Gönderdiğimiz ışın örnekten geçip
prizmaya değişik açılarla gelir. Eğer;
 Geldiği açılar kritik açıdan küçükse, aydınlık bölge oluşur.
 Geldiği açılar kritik açıdan büyükse, karanlık bölge oluşur.
Karanlık ve aydınlık bölgenin sınırı kritik açıya karşılık gelir.
Şekil 3.2: Refraktometrede karanlık ve aydınlık bölgelerin oluşumu
Sayfa 44 / 94
Şekil 3.3: Refraktometrede karanlık ve aydınlık bölgelerin oluşumu
Bir maddenin kırılma indisi şunlara bağlıdır:
 Kullanılan ışımanın dalga boyuna
 Sıcaklığa
 Derişime
Bunun dışında sıkıştırılabilen maddelerin kırılma indisi, basınca bağlı olarak da değişir.
Dalga boyunun kırılma indisine etki etmesinden dolayı, kullanılan ışımanın dalga boyu da
belirtilmelidir. Ticari refraktometrelerde genellikle sodyumun atomunun yaydığı yaklaşık eşit
şiddetlerdeki, 589.0 ve 589.6 nm ‘deki hatları kullanılır. Bu hatlar sodyum D hatları olarak
adlandırılır.
3.2. Refraktometre ve Çeşitleri
Refraktometreler, katı (Abbe tip modellerde) veya sıvılarda katı madde miktarı, kırılma
indisi, şeker miktarı, refraktif indeks ve briks (Brix) aralıklarını ölçme amacıyla kullanılan
cihazlardır. Piyasada gıda, kimya, ilaç vb. alanlarda kullanılmaktadır. Özellikle de gıda alanında
şarap, meşrubat, reçel, bal, meyve suları, yemeklik yağlar gibi birçok üretim alanında
kullanılmaktadır. Örneğin, çözünebilir yağlar ve yemeklik yağların kırılma indisleri ölçülerek,
bunların saflık dereceleri ve acılık dereceleri tespit edilebilmektedir( Bir sıvı yağın acılaşma
derecesi artıkça kırılma indisi de artar).
Refraktometre çeşitleri şunlardır:
 Abbe refraktometreleri ( Dijital ve manuel)
 El refraktometreleri (Dürbün ve Dijital )
 Sıcaklık ayarlamalı dijital refraktometreler
 Daldırma Refraktometresi
3.2.1. Abbe Refraktometresi
Genellikle Abbe refraktometresi şu kısımlardan oluşur:
Sayfa 45 / 94
 Prizma haznesi
 Su giriş ve çıkış kısımları
 Termometre haznesi
 Oküler
 Vidalar (makro ve mikro vidalar)
Abbe refraktometresi ile ölçüm yapabilmek için aşağıdaki işlem basamakları takip edilir:
Önce cihaz gün ışığına yönlendirilir (ya da ışık kaynağına bağlanır). Cihazın aynasını sağa sola
çevirerek okülerden bakan göze ışığın en fazla gelmesi sağlanmalıdır.
 Prizmaların temiz olup olmadığı kontrol edilir. Temiz değilse alkolle ıslatılmış, yumuşak bir
bezle temizlenir ve kurulanır. Bunun için cihazın orta kısmındaki kilitleme düğmesi açılır ve
prizmalar birbirinden ayrılıp, temizlenip tekrar eski haline getirilir.
 Termometresi yerine takılır. Prizmaların etrafında sıcaklığı sabit olan su dolaştırmak suretiyle
sabit bir sıcaklık (20 ºC) elde edilir. (bazılarında termostat bulunmaktadır. Bu durumda termostat
20ºC’ a ayarlanır.)
 Saf su ile “0” ayarı yapılır. Bunun için;
 Önce birkaç dakika prizmaların etrafında su dolaştırılarak prizmaların sıcaklığı 20ºC’ye
getirilmesi sağlanır.
Resim 3.1: Abbe refraktometresi
 Sonra alttaki prizmaya birkaç damla saf su damlatılır.
 Alttaki prizmaya su damlatılınca üsteki prizma özel düğmesi ile suyu
sıçratmayacak şekilde yavaşça kapatılır. Kırılma indisinin 20ºC’de 1.3330 olup olmadığı kontrol
edilir. Değilse cihazın skalası yaklaşık 1.33 kırılma indisine ayarlanır.
 Ayarlamada önce, okülerden bakıldığında skalanın üzerinde ayrı olarak görülen görüş
alanındaki karanlık ve aydınlık alanların birbirinden net olarak ayrılmasını sağlamak, sonra da
karanlık ve aydınlık alanları eşitlemek gerekir.Bu işlem bunları birbirinden ayıran çizgiyi, çapraz
Sayfa 46 / 94
çizgilerin kesiştiği nokta ile çakıştırarak yapılır. Netleştirme işlemi cihazın sağ yanında bulunan
prizmaya kumanda eden küçük vida ile, çakıştırma ise örneğin konulduğu prizma ile birlikte
skalayı da hareket ettiren büyük vida ile yapılır. Gerekirse oküler sağa sola döndürülerek
göze göre ayarlanır.
 Saf su ile ayarlama yapılırken netleştirme işleminden sonra büyük vida ile sıcaklık 20ºC’de
iken skalanın üst bölümünde kırılma indisi rakamlarında 1.333 değerine ait taksimat çizgisi, skala
görüş alanının artasında skalaya dik kesen sabit çizgi ile üst üste getirilir. Böylece kuru madde
değeri de “0” (sıfır) gösterir.
 20ºC’nin dışındaki sıcaklıklarda yapılan ayarlamalarda sıcaklığa karşı gelen kırılma indisi ile
sabit çizgi çakıştığında % kuru madde sıfırdan farklı değer gösterebilir. Eğer örneğin kırılma
indisi okunacaksa; önemli olan belli sıcaklıkta saf suyun kırılma indisini ayarlamaktır. Eğer %
kuru madde miktarı okunacaksa saf su ile % 0 kuru maddeye ayarlamaktır.
 Bu durumda karanlık ve aydınlık sahayı ayıran net çizgi çapraz çizgilerin kesiştiği noktadan
geçiyorsa cihaz ayarlanmış demektir. Aksi halde skalanın ayarı değiştirilmeden aletin sağ
yanında ve en üstte bulunan üzeri kertikli kapak açılarak altındaki vida tornavida ile döndürülerek
çakıştırma yapılır. Böylece refraktometre ayarlanmış olur. Bu vida karanlık ve aydınlık sahaların
oranlarını değiştirdiği halde skalayı hareket ettirmez.
3.2.2 El Refraktometresi
Bahçede, tarlada veya işletmenin herhangi bir yerinde kullanılabilir. El refraktometresi
sıvı solüsyonların kırılma indislerini ölçen bir cihazdır. El tipi refraktometreler küçük hacimli,
hafif olması nedeniyle, meyve suyu, süt, salça, reçel gibi çeşitli gıda endüstrilerinde rahatlıkla
kullanılmaktadır.
 El Refraktometrelerinin Çeşit Ölçüm Aralığı Çözünürlük
0 - 18% 0.1 - 0.2% 0 - 32% 0.2% 0 - 80% 0.2% 45 - 82% 0.5% 0 - 90% 0.2%
Sayfa 47 / 94
Resim 3.2: El refraktometresi
3.2.2.1 Örnek Hazırlanması
Refraktometre ile berrak yani süspansiyon halinde katı parçacıklar içermeyen örnekler
incelenmelidir. Bulanık çözeltiler refraktometre deki aydınlık ve karanlık bölgeyi ayıran hattın
belirgin ve kesin olarak oluşmasını engeller ve analiz sonucu hatalı bulunur; bu nedenle örneğin
berrak olmasını sağlayacak şekilde hazırlanmasına dikkat edilmelidir.
3.2.2.2 Refraktometre ile Ölçümde İşlem Basamakları
 Uygun ve yeterli ışık kaynağı ile gerekli ışıklandırma sağlanır.
 Prizma kapağı açılır ve temiz olup olmadığı kontrol edilir. Gerekirse prizmasaf su ile
yıkanır ve yumuşak kâğıt mendille silinerek kurulanır.
 Temiz ve kuru prizma yüzeyine oda sıcaklığındaki örnekten 2–3 damla sıkılır. Örnek
prizma yüzeyine değdirilmeden yukarıdan damlatılır.
 Örnek konduktan sonra prizma kapağı kapatılır.
 Ayar vidaları ile aydınlık ve karanlık bölge netleştirilir.
 Karanlık ve aydınlık bölgenin kesiştiği noktadaki rakam okunur.
 Okuma yapıldıktan sonra prizma yüzeyi önce doğrudan sonra saf su ile silinir ve
kurulanır.

Özel ambalajını kaldırmadan prizma ve kapak arasına yumuşak kâğıt konur.
 Refraktometre kullanılmadan önce, ayarlı olup olmadığı kontrol edilmelidir.
 Prizmaya saf su damlatıldığında “0” okunuyorsa refraktometre ayarlıdır.
3.2.3 Daldırma Refraktometresi
Daldırma tipi refraktometreler,
cihazın bünyesinde bulunan su banyosu ile
çalışır.
Ölçüm yapabilmek için 3-5 ml örnek gereklidir. Bu tip cihazların okuma aralıkları 1.3250 1.3670 arasındadır. Cihazın okuma hassasiyeti ± 0. 000005 civarında olduğundan Abbe
refraktometrelerine göre daha hassas ölçüm yapılabilir. Bu cihazların temel özelliği; ölçme
yaparken alet prizmalarının ölçümü yapılacak sıvının içine daldırılması ve su içinden yansıyan
ışının kullanılmasıyla ölçümün yapılması şeklinde olur. Abbe refraktometresi ile daldırma
refraktometresi arasındaki
fark; daldırma tipinde
cihaz sudan gelen ışığı kullanır. Abbe
refraktometresinde ise cihaz havadan gelen ışığı kullanır.
3.2.4 Dijital Refraktometreler
Basit ölçüm yöntemiyle kullanım kolaylığı sağlayan, yüksek hassasiyetli, güvenilir
ölçümler için tasarlanmış refraktometrelerdir. Bu refraktometrelerde ölçüm sonuçlarının kolay
okunabilmesini sağlayan dijital okuma alanı bulunmaktadır.
Sayfa 48 / 94
Resim 3.3: Dijital refraktometre
3.3 Refraktometrik Analizler
Refraktometrik analizler nitel ve nicel olmak üzere iki amaçla yapılır.
3.3.1 Nitel Analizler
Her maddenin ışığı kırma özelliği farklı olduğundan kırılma indisleri de farklıdır. Bu
nedenle maddeler için kırılma indisleri ayırt edici bir özelliktir. Saflığından emin olunan bir
örneğin refraktometre de kırılma indisi ölçülerek okunan değer kırlma indislerine ait tablo ile
karşılaştırılır. Böylece bilinmeyen örneğin hangi madde olduğu tespit edilir. Ya da ne olduğu
bilinen bir maddenin, saf olup olmadığını belirlemek veya yabancı madde katılıp katılmadığını
belirlemek amacıyla kırılma indisinden faydalanılır. Örneğin, yemeklik yağların kırılma indisleri
ölçülerek, bunların saflık dereceleri ve acılık dereceleri tesbit edilebilmektedir( bir sıvı yağın
acılaşma derecesi artıkça kırılma indisi de artar). Maddenin yoğunluğu ile kırılma indisinin
arasındaki ilişkiden faydalanılarak molar kırılma değeri (R) bulunur. Molar kırılma değeri,
maddenin saflık derecesinin bir ölçüsüdür.
Tablo 3.1: Bazı maddelerin kırılma indisleri
Molar kırılma değerini bulmak için aşağıdaki eşitlikten faydalanılır.
Sayfa 49 / 94
R: Özgül (spesifik) kırılma değeri
n = Kırılma indisi
M = Örnek maddesinin molekül ağırlığı
d = Yoğunluk’tur.
Ölçülen kırılma indisi ve örnek yoğunluğu şüphe edilen bileşiğin molekül ağırlığı değeri ile
birlikte yukarıdaki eşitliğe konularak R değeri bulunur. Bulunan bu R değeri bilinen bileşiklerin
R' değerleri ile karşılaştırılır.
3.3.2 Nicel analizler
İkili karışımların tayininde en kolay ve çabuk yöntem; çözeltilerin kırılma indislerinden
faydalanmaktır. Düşük konsantrasyonlarda (seyreltik çözeltilerde), kırılma indisi ve derişim
arasında lineer bir bağıntı vardır. Bu bağıntıdan faydalanarak bir dizi % çözeltiler hazırlanarak
saf su ile refraktometrenin “0” ayarı yapıldıktan sonra bu çözeltilerin kırılma indisleri okunur.
Kırılma indisleri ordinata, çözelti % derişimleri ise apsise yerleştirilerek konsantrasyon-kırılma
indisi değeri grafiği çizilir. Numunenin % konsantrasyonu hesaplanır.
Şekil 3.2: Örnek% konsantrasyon-kırılma indisi grafiği
3.3.3 Refraktometrik Analizlerde Numunenin (Örnek) Hazırlanması
Refraktometrik metot genellikle sıvı gıdalar veya çözeltilerde kullanılmaktadır. Bu
nedenle numune, analizden önce homojen hale getirilir. Eğer çok kıvamlı ise belli oranlarda
seyreltme yapılır ve bu da hesaba katılır. Burada önemli olan numunenin okuma sıcaklığıdır. Bu
nedenle ölçüm yapılmadan önce numune sıcaklığı 20 ºC’de ayarlanmalıdır. Bu işlem genellikle
su banyosunda veya abbe refrakrometresi kullanılarak çözümlenir. Eğer bu sıcaklıkta okuma
yapılmamışsa gerekli düzeltme işlemleri yapılarak gerçek sonuç verilir.
Sayfa 50 / 94
3.3.4 Okuma Yapma ve Sıcaklık Düzeltmesi
Homojen hale getirilmiş ve sıcaklığı 20 ºC olan numuneden bir damla alınır.
Refraktometrenin okuma haznesine aktarılır ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde kapak
kapatılır ve okuma yapılır.
Okumalar 20 ºC’de yapılmalıdır. Eğer bu sıcaklık sağlanamazsa sıcaklık düzeltmesi
yapılır.
 Sıcaklık 20 ºC’den yukarıda ise her bir derece için ilgili çizelgede belirtilen miktar
ilave edilir,
 Sıcaklık 20 ºC’den aşağıda ise her bir derece için ilgili çizelgede belirtilen miktar eksik
alınır.
3.3.5 Refraktometre ile Hesaplama
Herhangi bir sulandırma yapılmamış örnekte, refraktometrede okunan değer, doğrudan
yüzde çözünür kuru madde oranını verir. Herhangi bir hesaplama yapmaya gerek yoktur.
Marmelat, örneğinde olduğu gibi zorunlu olmadıkça sulandırma işlemi uygulanmamalıdır.
Sulandırma yapıldığında aşağıdaki formül kullanılarak hesaplama yapılır.
B: Seyreltilmiş örnekte saptanan briks derecesi
V: Örneğin seyreltildiği hacim ( ml )
M: Örnek miktarı ( g )
Örnek problem: 50 g marmelat örneği 100 ml’lik ölçü balonuna aktarılarak hazırlanmış ve briks
değeri 16 olarak okunmuştur. Marmelattaki % suda çözünür kuru madde miktarını hesaplayınız.
Sayfa 51 / 94
3.4 Polarimetri
Optikçe aktiflik, kiral moleküller tarafından sergilenen fiziksel bir özellik olup düzlem
polarize olmuş ışığın polarizasyon düzlemini çevirme kabiliyetidir. Aynı bir molekülün
enantiyomerlerinden her biri düzlem polarize ışığın polarizasyon düzlemini eşit miktarda ama zıt
yönlü çevirirler. Enantiyomerlerinden eşit miktarda içeren bir karışım optikçe aktiflik göstermez
ve rasemik karışım olarak adlandırılır. Akiral moleküller de optikçe aktiflik göstermez.
Polarimetre, optikçe aktif bilenenlerin polarize ışık düzlemini ne kadar –sağa veya sola
çevirdiğini ölçmek için yararlanılan bir aygıttır. Kiral bir maddenin bir enantiyomerini içeren bir
çözelti içerisinden düzlem polarize olmuş bir ışık demeti geçirildiğinde ışığın, polarizasyon
düzlemini; açısı kadar sağa/sola çevirdiği gözlenir. Polarimetre öğelerinin şematik gösterilisi
Polarimetre cihazı parçalarının çalışma prensibi ve açıklaması aşağıdaki gibidir; Işık kaynağı:
Asimetrik karbon atomuna sahip maddeler aynı zamanda optikçe aktiftir. Optikçe aktiflik, bir
cismin polarize ışığı kendi düzleminden saptırma kabiliyetidir. Eğer bir karbonhidratta asimetrik
karbon atomu varsa, polarize ışık düzlemini sağa ya da sola çevirir. Sağa çevirirse (+), tersine
çevirirse (-) şeklinde gösterilir. D-Glukoz polarize ışığı sola çevirirse D(-)Glukoz şeklinde, sağa
çevirirse D(+)Glukoz şeklinde gösterilir. Bir şekerin (+) ve (-) formundan eşit oranda alıp
karıştırırsak, ışık ne sağa ne de sola çevrilir. Böyle karışımlara rasemik karışım denir.
Polarimetre, optik aktif maddelerin polarize ışığı saptırma özelliklerine dayanarak bu maddelerin
bir çözeltideki miktarlarını tayin etmeye yarar. Bu aletle aynı zamanda spesifik çevirme açısı
ölçülerek saf optik aktif maddelerin tanınması da mümkündür. Polarize ışık bir düzlem üzerinde
dalgalanan ışıktır. Adi ışık bazı maddelerden geçirilirse tek bir düzlem içinde çıkar. Bu düzleme
“polarize düzlem”, ışığa “polarize ışık” denir. Adi ışığı polarize ışık haline çevirmek için genel
olarak “kalsit” yani “kristal kalsiyum karbonat” kullanılır. İki kalsit kama şeklinde birbirine
kanada balması ile yapıştırılarak Nicoll prizması elde edilir. Böyle bir Nicoll prizmasından adi
ışık geçirilirse birbirine dikey iki düzlemde ışığı polarize eder.
Polarimetre molekül boyutlarının tayininde, konsantrasyon miktarının (derişikliğin)
tayininde ve gıda maddelerinin kontrollerinde kullanılır. Hassas polarimetrelerde polarizöranalizör arasına, polarizör küçük bir açı yapacak şekilde üçüncü bir kristal kutuplayıcı konur.
Böylece gözleme bölgesinde en karanlık durum aydınlanma ile mukayese edilerek daha kolay
incelenir. Elektronik kontrollü otomatik polarimetreler halihazırda en hassas ölçmeyi yapabilen
aletlerdir.
Sadece şeker için kullanılan polarimetrelere sakarimetre de denir. Titreşim düzleminin
dönmesini tayf analiziyle grafik halinde veren polarimetrelere de spektropolarimetre cihazları
denir. Polarimetre, maddelerin optikçe aktifliklerini ölçen cihazdır. Optikçe aktiflik, kutuplanmış,
Sayfa 52 / 94
(polarılmış) ışığın, kutuplanma düzlemini değiştirmek demektir. Kuvarts, şeker eriyiği ve bazı
yağlar optikçe aktiftir (organik maddelerin çoğu optikçe aktiftir). Bazı maddelere ait optikçe
aktiflik dış kuvvetlerin meydana getirdikleri gerilme ile değişmektedir. Cam selüloit, pleksi camı
gibi maddeler, gerilimler sebebiyle çift kırıcı hale gelir. Statik hesaplamalarda gerilime maruz
kalacak elemanların yukarıdaki maddelerden yapılmış küçük modelleri, jips tabakaları arasında
iki kutuplayıcı arasına konarak küçük kuvvetlerle gerdirilir. Gerilen bölgeler çift kırıcı durumuna
geçtiklerinden, modelin fotoğrafında gerilen bölgeler meydana çıkar görülür. Bu tekniğe, foto
esneklikle gerilim çözümleme denir.
3.4.1 Polarimetrenin Çalışma Prensibi
Işık kaynağından çıkan monokromatik ışık yani belirli bir dalga uzunluğuna sahip ışık
olmalıdır. Bu amaçla çoğunlukla D sodyum ışığı kullanılır. Monokromatik ışık süzgeçten
geçtikten sonra toplayıcı merceğe gelir. Bu mercekten çıkan ışınlar birbirine paraleldir.
3.4.1.1 Işık kaynağı: Bir bileşiğin polarize ışığın düzlemini çevirmesi, diğer öğeler
yanında ışığın dalga boyuna da bağlıdır. Bu nedenle sabit dalga uzunluğunda monokromatik bir
ışık kullanılması zorunludur. Her yerde kolaylıkla elde edilebilen monokromatik ışık, sodyumun
589 nm dalga uzunluğunda olan sarı ışığıdır. Polarizör: Işık kaynağından yayılan bayağı ışığı
polarize ışığa dönüştürür. Genelde turmalin mineralinden yapılmış özel prizmalar seklindedir.
Polarizör, ışık kaynağının hemen karsısında bulunur ve konumu sabittir.
3.4.1.2 Numune tüpü: Ölçülecek sıvı numunenin içine konulduğu silindir seklinde cam
bir tüptür. Her iki ucunda yine camdan yapılmış ve sıvı sızdırmayacak şekilde tıraşlanmış iki
Sayfa 53 / 94
pencere bulunur. Bu camlardan biri çıkarılarak tüpe numune konur ve hava kabarcığı kalmayacak
şekilde yerine yerleştirilir.
3.4.1.3 Analizör: Analizör, Polarizör gibi, bir nicol prizmasıdır. Ancak sabit olmayıp,
diskin merkezinde bulunur ve onunla birlikte döner. Çevresinde açı bölmeleri bulunan ve ekseni
çevresinde dönebilen bir sistemdir. İzomer polarize ışığı saat yönünde çevirirse, d veya + (dexter
= sag), saat yönünün tersine çevirirse l veya - (laevus = sol) olarak ifade edilir.
3.4.2 Polarimetrenin Ayarı
Polarimetre tüpüne distile su konur. Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilmelidir,
kalmışsa aşağı yukarı uygun hareketlerle çıkarılır. Tüp yerine konur. Dürbünden bakılır ve
dürbünün yan kısmındaki vida ile dürbünden görünen iki yarım dairenin renkleri eşit olacak
şekilde ayarlanır. Bu sırada dürbünün üst kısmındaki göstergede ibre sıfır noktasını göstermelidir.
Distile su ile sıfır ayarı yapıldıktan sonra polarimetre tüpüne numune konur ve dürbünden
görünen iki yarım dairenin renkleri eşitlenir. Göstergeye bakılarak okunur. Polarimetrelerde
genel prensip aynıdır. Tüp uzunlukları ve gösterge kısımlarındaki farklılıklarla birbirlerinden
ayrılırlar. Tüp uzunluğu 189.4 mm veya bunun yarısı olan 94.7 mm uzunluğunda olanlara
“sakkarimetre” de denir.
3.4.3 Spesifik Çevirme Açısı
100 ml’sinde 100 g optik aktif madde ihtiva eden bir solüsyonun 100 mm boyundaki bir
polarimetre tüpünde, 20 oC oda ısısında ve D sodyum ışığında okunan açı spesifik çevirme açısı
olarak bilinir. Bu sayı saf maddeler için sabittir. Glukoz için + 52.8’dir. Çevirme açısı
molükülün yapısına, sıcaklığa, ışığın dalga boyuna, ışık yolu üzerindeki molekül sayısına
(konsantrasyona) ve bazı durumlarda çözücüye bağlıdır.
Sayfa 54 / 94
Resim 3.4.1 : Değişik polarimetreler
[α]D20 = a x 100 / L x C
α : spesifik çevirme derecesi
a : okunan çevirme açısı
L : tüp uzunluğu (dm)
C : konsantrasyon (g/100 ml)
20: çözelti sıcaklığı
D : ışık kaynağının sodyum olduğunu (sodyum lambası) gösterir
3.4.4 Sütte Polarimetrik Laktoz Tayini
Süt teknolojisinde özellikle laktoz analizinde polarimetre kullanılır. Polarimetre cihazını
kullanmak suretiyle sütte laktoz analizi şu şekilde yapılmaktadır.
100 ml’lik balonjojeye 75 g süt numunesi tam olarak tartılır. Proteinleri çöktürmek için 2 ml
Karrez I ve 2 ml Karrez II çözeltilerinden ilave edilir. 1 ml laktik asit ilave edilip destile su ile
hacmi 100 ml’ye tamamlanır. İyice karıştırıldıktan sonra süzgeç kâğıdından süzülür. Süzüntü
tamamen berrak olmalıdır. Süzüntü 200 mm boyundaki polarimetre tüpüne konur. Sıcaklık 20 0C
olması gerekir. Polarimetrede çevirme açısı okunur.
Hesaplamada; saf laktozun ortalama 52,53o olan spesifik çevirme açısı kullanılır.
a= okunan çevirme açısı
Bulunan sonuç 100 g süt için hesaplanmalıdır. Protein çökmesiyle hacim değişmesinden ileri
gelen hatanın giderilmesi için sonuç tam yağlı sütte 0,94 ve yağsız sütte 0,97 ile çarpılır.
3.4.5 Unda Nişasta Tayini
%4 lük Amonyum Molibdat Çözeltisi: 4 gram Amonyum Molibdat tartılarak 100 ml saf suda
çözülür.
%1 lik HCl Çözeltisi : 3,1 ml %33 lük HCl 100 ml saf su ile seyreltilir.
Cihaz analize başlamadan yarım saat önce açılmalıdır. 5 gr numune tartılır. Üzerine %1 lik HCl
çözeltisinden 50 ml eklenir. Kaynayan suda 1-2 dak karıştırılarak tutulur ve 15 – 20 dak.
Bekletilir. Üzerine 25 ml saf su eklenerek çeşme altında soğutulur. Soğutulduktan sonra üzerine
10 ml Amonyum Molibdat çözeltisi eklenir, karıştırılır. 100 ml tamamlanana kadar saf su eklenir
Sayfa 55 / 94
karıştırılır. Süzgeç kağıdı ile süzülür. Süzüntü polarimetre tüpüne konularak ölçüm yapılır.
Hesaplama yapılır.
A = Spesifik çevirme derecesi
Buğday Nişastasında : 182,7
Yulaf Nişastasında : 181,3
Mısır Nişastasında : 184,6
Çavdar Nişastasında : 184
Arpa Nişastasında : 181,5
Pirinç Nişastasında : 185,5
Patates Nişastasında : 204,5 ‘ tir.
3.4.6 Sakarimetre
Sakarimetre doğrudan doğruya % şeker miktarını ölçmek için özel olarak yapılmış
cihazdır. Değişik ülkelerde farklı bölmeleri olanları kullanılmaktadır. Bunlardan en yaygın olanı
Almanya’da Wentzke sakarimetresidir.
1 Wentzke= 0,34657 Polarimetre derecesi
1 Polarimetre=2,8854 Wentzke derecesi
3.4.7 Polarimetre cihazının kullanımı:
Cihazda kullanılan tüplerin çok temiz olmasına dikkat edilir. Önceden herhangi bir kalıntı
bulunmaması gerekir. Cihazın “0″ ayarını yapmak için saf su kullanılır. Bunun için polarimetre
tüpü saf su ile doldurularak tüpün içinde herhangi bir hava kabarcığının olmamasına dikkat edilir.
Tüp cihazdaki yerine yerleştirilir. Üç defa okuması yapılıp ortalaması alındıktan sonra cihaz “0”
lanır. Cihazın “0″ noktası belirlendikten sonra analizi yapılacak çözelti polarimetre tüpüne konur.
Hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir.
Üç defa okuması yapıldıktan sonra okumaların
ortalaması alınır. Hesaplamalarda yapılacak analizlerle ilgili metotta verilen formüller kullanılır.
Örneğin Beyaz şekerin polarizasyon değerinin bulunmasında analiz metoduna göre yapılan işlem
sonucunda cihazdan okunan çevirme açısı 2,889 ile çarpılarak beyaz şekerin polarizasyon değeri
bulunmuş olur. Sonuç Türk Gıda Kodeksi Beyaz Şeker tebliğine uygun olup olmadığına bakılır.
Sayfa 56 / 94
4. UV GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTROSKOPİSİNİN UYGULAMALARI
Bir örnekteki atom, molekül veya iyonlardaki elektronların bir enerji düzeyinden diğerine
geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın, ölçülmesi ve
yorumlanmasına spektroskopi denir. Atom, molekül veya iyonun elektromanyetik ışıma ile
etkileşimi sonucu dönme, titreşim ve elektronik enerji seviyelerinde değişiklikler spektroskopinin
temelini oluşturur. Işın veya elektromanyetik dalga uzayda çok büyük hızla hareket eden bir
enerjidir. Diğer enerjilerde olduğu gibi bu enerjinin de çeşitli şekilleri vardır. En çok bilinenleri
ışık, ısı, radyo dalgaları ve X–ışınlarıdır. Bu enerjilerden gözle görülebileni sadece ışıktır.
Elektromanyetik spektrumda gözle algılanan elektromanyetik radyasyon ışık adını alır. Işının
uzaydaki hareketi dalgalar halinde olur. Seste uzayda dalgalar halinde yayıldığı halde ışından
farklıdır. Işın boşlukta enerjisinden bir şey kaybetmeden büyük hızla yayıldığı halde, ses
yayılamaz. Örneğin, havası boşaltışmış fanustaki zilin sesi duyulmaz. Işığın manyetik ve
elektriksel iki bileşeni (alanı) bulunur. Bu iki bileşen sinüzoidal
özellikte olup, yayılma yönüne ve birbirine dik konumdadır.
Şekil 4.1: X yönünde yol alan elektromanyetik dalganın elektriksel ve manyetik bileşenleri,
dalga boyu (
)
Işının tanecik ve dalga olmak üzere iki özelliği bulunmaktadır. Elektromanyetik ışın, dalga boyu,
frekans, hız ve genlik gibi parametreleri içeren sinüs dalga modeli ile açıklanabilir.
Sayfa 57 / 94
4.1 Dalga boyu ( ) Bir ışının dalga hareketinin ard arda gelen iki maksimumu veya
minimumları arasındaki doğrusal uzaklıktır ve
ile gösterilir. Dalga boyu metre, santimetre,
milimetre, mikrometre, nanometre, angstron gibi çeşitli birimlerle verilebilir.
1 cm = 10 mm = 104 µm =107 nm = 108 Å
4.2 Frekans (ʋ):Bir ışının saniyedeki periyot sayısı olup birimi s-1 veya buna eşdeğer
Hertz (Hz) dir. Frekans, dalga boyu ve ışının yayılma hızı arasında,
ʋ= v bağıntısı vardır.
Bir ışının frekansı içinden geçtiği ortama bağlı değildir. Sadece kendini meydana getiren kaynağa
bağlıdır. Kaynağın sıcaklığı yükseldikçe ışının frekansı da yükselir.
Şekil 4.2 Tayfın dalga boylarına göre dizilen bileşenleri şunlardır:
4.3 Işının havadaki hızı, her çeşit ışının vakumdaki hızı aynıdır ve c ile gösterilir.
Dolayısıyla yukarıdaki eşitlik, c =
ʋ =3.1010 cm/s şeklinde yazılabilir.
Bir ışın saydam
ortamlardan (maddelerden) geçer ve hızında azalma olur. Bu azalma ortamın kırma indisiyle
ilgilidir ve ortamda ışının hızı ne kadar azalırsa kırma indisi o kadar büyür. Örneğin, ışının
vakumdaki hızı c, ortamdaki hızı c1, ise, kırma indisi (n1): Çözelti içindeki madde miktarını
çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri,
bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin
konsantrasyonu da ölçülebilir. Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler
kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar
ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.
Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi
veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometre düzeneği, başlıca ışık
kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline
çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür.
Sayfa 58 / 94
Şekil 4.3: Basit bir spektrofotometrenin bölümleri
1. Işık kaynağı
2. Mercek
3. Prizma
4. Işık tayfı/kırınım ağı
5. Silit (kırılan ışığın geçtiği aralık)
6. Örnek kabı
7. Detektör (algılayıcı)
8. Gösterge
Ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrede ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki
demete bölmek, ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık
bölücüleri, giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren
maddeden yapılmış örnek kaplarına (küvet) konularak ışık yoluna yerleştirilir.
4.3 UV Işın Kaynakları: UV-görünür bölgede D2, W, H2, Xe, Civa buhar lambası gibi
sürekli ışık kaynakları kullanılır. Tungsten flaman lambası, görünür ve yakın IR bölgede (3203000 nm) ışık yayar. Tungsten lambasının içinde bir miktar iyot veya brom buharı bulunursa
lambanın ömrü artar ve bu lamba tungsten- halojen lambası olarak adlandırılır. Ulraviyole
bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu
lambalar 180-380 nm arasında ışık yayar. Daha pahalı ve daha uzun ömürlü olan D2 lambasının
yaydığı ışığın şiddeti H2 lambasına göre çok daha fazladır.
Xe ark lambası, UV-görünür bölgenin tümünde (150-700 nm) kullanılabilecek şiddetli ve sürekli
ışık kaynağıdır.
Civa buhar lambası, her iki bölgede ışıma yapabilen bir ışık kaynağıdır; sürekli spektruma ek
olarak kesikli hatlar da içerir.
Sayfa 59 / 94
4.5 Dalga Boyu Seçicileri (monokromatörler): Işık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek
bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini
gerçekleştiren düzeneklerdir.
Monokromatör, filtreli fotometrelerde ışık filtresidir; spektrofotometrelerde ise ışık prizmasıdır.
Örnek
üzerine
gönderilen
ışığın
daha
monokromatik
olmasını
sağlamak
için
bazı
spektrofotometrelerde çift monokromatör kullanılır.
4.6 Işık Filtreleri: Camdan yapılmış ve uygun boyalarla boyanmış filtrelerdir. Portatif
olup kullanıcı istediği zaman uygun dalga boyundaki filtreyi cihaza takar. Filtrelerin üzerinde
geçirdikleri dalga boyu yazılıdır. Filtrenin rengi, ölçüm yapılacak çözeltinin rengine göre seçilir;
örneğin, mavi ışığı tutan (sarı) bir maddenin ölçümünde sadece mavi ışığı geçiren filtre kullanılır.
4.7 Işık Prizmaları: Cam veya kuartz olabilir. Özellikle düşük UV ışınları iyi
geçirmediğinden cam prizma görünür bölge için uygundur. Kuartz prizmalar ise hem UV
ışınlarını iyi geçirir, hem de görünür ışık ve IR’e yakın bölgelerde çalışmaya elverişlidir. Kuartz
prizmalar pahalı spektrofotometrelerde bulunur.
4.8 Spektrofotometrelerde Dedektör: Maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını
anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir.
UV-görünür bölgede kullanılabilen üç tür dedektör vardır.
 Fotovoltaik Dedektör: Işık Se veya Si gibi bir yarıiletken tarafından absorplandığında
iletkenlik bandına geçen elektronlar nedeniyle bu yarıiletkenle temasta olan bir metal filmi (Ag)
arasında bir gerilim farkı oluşur. Fotoiletken dedektörlerde ise PbS, CdSe, ve CdS gibi
yarıiletkenler tarafından ışık absorplandığında iletkenlik bandına çıkan elektronlar ışık şiddeti ile
orantılı bir elektrik akımı oluşturur.
 Fototüp: Alkali metal oksit filmlerden yapılan fotokatodlar üzerine düşen fotonlar bu
yüzeyden elektronlar koparır ve elektronlar bir anotta toplanarak elektrik akımına çevrilir.
 Fotoçoğaltıcı Tüp: Fotokatod yüzeyinden foton çarpması ile fırlatılan elektronlar
dinot denilen yüzeylere doğru elektriksel alanda hızlandırılır ve dinoda çarpan her elektron dinot
yüzeyinden 3-5 elektron daha koparır. Böylece sayıları giderek artan elektronlar sonunda bir
anotta toplanarak elektrik akımına çevrilir. Bu dedektörlerin duyarlı oldukları λ aralığı da
farklıdır. Daha hızlı bir dedektör olan fotodiyot dizisi ile birçok λ’da aynı zamanda ve çok hızlı
bir biçimde ölçüm yapılabilir.
Tek ışık yollu spektrofotometrelerde, bileşenlerin tümü aynı ışık yoluna yerleştirilmiştir.
Bu aletin başlıca üç ayar düğmesi vardır: Bunlardan biri, alette kullanılan optik ağ veya prizmayı
mekanik olarak döndürmeyi sağlayan düğmedir. İkinci düğme, ışık yolunu tamamen kapatarak
galvanometre “sıfır” geçirgenlik ayarını yapmak içindir. Üçüncü düğme, ışığın geçtiği aralığın
Sayfa 60 / 94
enini değiştirir. Ölçümün yapılacağı dalga boyu birinci düğme ile ayarlandıktan sonra ışık yolu
kapatılarak ikinci düğme ile “sıfır” ayarı yapılır. Daha sonra üçüncü düğme ile ışığın geçtiği
aralığın eni değiştirilerek ve örnek kabında sadece çözücü kullanılarak galvanometre 100
değerine getirilir. Sıfır ve 100 ayarları her dalga boyunda yeniden yapılmalıdır.
Resim 4.1 : Spektrofotometre Cihazı
Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, monokromatörden çıkan ışık, eşit şiddette iki
demete bölünerek biri örneğe diğeri sadece çözücünün bulunduğu kaba gönderilir. İkiye ayrılan
ışık, iki ayrı dedektörle algılanır ve dedektörlerde oluşan sinyallerin oranı ölçülür. Böylece
örnekteki geçirgenlik değeri sürekli olarak çözücününki ile karşılaştırılmış olur. Burada iki
dedektörün tam uyumlu olması, yani eşit şiddetteki ışık ile aynı sinyali oluşturması gerekir.
Çift ışık yollu spektrofotometrelerde, tek dedektör kullanılarak da ölçüm yapmak
mümkündür. Örnekten ve çözücüden geçen ışık demetleri dedektör üzerine art arda gelir ve
alternatif türden sinyal oluşturur. Işık şiddetleri eşit ise dedektörde herhangi bir sinyal oluşmaz;
örnek bölmesinden gelen ışığın şiddeti absorpsiyon nedeniyle azaldığı zaman dedektöre gelen
sinyal alternatif sinyal olarak algılanır. Çift ışık yollu spektrofotometrelerin bir başka türü çift
dalga boylu spektrofotometrelerdir. Çift dalga boylu spektrofotometrelerde iki farklı
monokromatör vardır; iki farklı dalga boyundaki ışık, dönen bir ışık bölücü yardımıyla örnekle
art arda etkileştirilir.
Bulanık çözeltilerde dalga boylarından biri çözeltideki maddenin absorplayacağı, diğeri
ise absorplamayacağı değerlere ayarlanır. Bulanıklıktan dolayı her iki dalga boyunda aynı
miktarda ışık kaybı olacağından iki dalga boyunda yapılan ölçümlerin farkı, sadece örneğin
absorbansı ile ilişkilidir.
4.9 Kalibrasyon Grafiği: Spektrofotometre ile bir maddenin nicel analizinin yapılacağı
dalga boyunu kararlaştırmak için, örneğin absorpsiyon spektrumunu bilmek gerekir. Bunun için,
Sayfa 61 / 94
maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür.
Çözücünün ve çözeltide bulunan başka türlerin ışığı absorplamadığı, Lambert- Beer eşitliğine
uyulduğu ve nicel analizin en duyarlı bir biçimde yapılabileceği dalga boyu değeri saptandıktan
sonra analizi yapılacak maddeyi içeren ve derişimleri bilinen bir dizi standart çözelti ile bu dalga
boyundaki absorbans (A) değerleri ölçülür. A değerleri, standart çözeltilerin bilinen derişimlerine
karşı grafiğe geçirilir. Standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı A değerlerini grafiğe
geçirmek suretiyle elde edilen doğruya kalibrasyon doğrusu denir. Nicel analiz, kalibrasyon
doğrusunun doğrusal olduğu bölgede yapılır. Derişimi bilinmeyen örneğin A değeri ölçülür ve
kalibrasyon doğrusunda bu değere karşılık gelen derişim saptanır. Molar absorpsiyon katsayısının
değerinin bilindiği durumlarda, Lambert-Beer eşitliğinin analizde doğrudan kullanılması da
mümkündür.
Absorbans (A)=ε * c * l
4.10 Küvetler: Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu örnek kapları (küvet), yuvarlak
bir tüp veya dört köşe olabilir. Soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır.
Soft camlar asidik çözeltiler, borosilikat camlar kuvvetli alkali çözeltiler için uygundur. Corex
gibi bazı camlar 340 nm’de kullanılabilse de kısa UV dalgalar için uygun değildir.
Kuartz
Plastik
küvetler
küvetler
hem
özel
UV
üretilmiş
hem
ise
görünür
200-700
dalga
nm
boyları
arasında
için
rahatlıkla
uygundur.
kullanılabilir.
Küvetlerin temizliği:
-Küvetler kullanıldıktan hemen sonra bol çeşme suyu ve ardından distile sudan geçirilmelidir.
-Aşırı kirlenen veya koyu renkli reaktiflerin okunduğu küvetler yumuşak deterjanlı su, çeşme
suyu
ve
distile
su
ile
yıkanmalıdır.
Kesinlikle
fırça
kullanmamalıdır.
-Deterjanla temizlenemeyen küvetler, %20’lik nitrik asitte bir gece bekletildikten sonra, distile
sudan geçirilip kullanılır.
-Küvet temizliğinde bikromat solüsyonu kullanılmamalıdır. %10’luk NaOH kullanılabilir; ancak
küvetler bu çözeltide uzun süre kalmamalıdır.
Spektrofotometrik ölçümlerde kör, standart ve numune olmak üzere üç tüp hazırlanır. Kör,
cihazın optik ayarlarının (sıfır ve 100 ayarı) yapılması amacıyla kullanılan çözeltidir. Kör
çözeltisi olarak distile su veya reaktifin kendisi kullanılır. Bazı ölçümlerde numune körü de
kullanılabilir. Distile su körü, en sık kullanılan kördür; okuma küvetine Distile su konularak
hazırlanır. Daima absorbans değerinin sıfırlanması için kullanılır.
Reaktif körü, deneyde kullanılan reaktif ile hazırlanan kördür. Deneyde birden fazla reaktif varsa
birden fazla reaktif körü de olabilir. Bazen absorbans değerinin sıfırlanması için, bazen de distile
Sayfa 62 / 94
su körüne karşı numune gibi kullanılır. Numune körü, deneyde kullanılan reaktif/numune oranına
uygun olarak distile su veya serum fizyolojik ile numune karıştırılarak hazırlanır. Daima distile
su veya reaktif körüyle sıfırlanmış cihazda numune gibi okutulur.
Şekil 4.4 : Çeşitli Spektrofotometrik Küvetler
Numune gibi okutulan reaktif veya numune körü değerleri numune değerinden çıkarılır.
Standart, aranan maddenin bilinen konsantrasyondaki çözeltisidir. Numune, içindeki madde
miktarını tayin etmek istediğimiz çözeltidir. Fotometrik ölçümler, esas olarak iki tipte yapılır.
Bunlar, end point ve kinetik okumadır. End point okumada fotometrik okuma, reaksiyon
tamamlandıktan sonra yapılır. Bunun için reaksiyon karışımı belli bir süre ve belli bir sıcaklıkta
inkübe edilir. Reaksiyon tamamlanıp ürünlerin oluşumu ve dolayısıyla renk oluşumu
tamamlandıktan sonra okuma yapılır.
Kinetik okumada birim zamandaki absorbans değişimi ölçülür. Genellikle enzimlerin
katalitik aktivitelerinin tayininde kullanılır. Hesaplama için deney ortamındaki kromojen
maddenin molar absorpsiyon katsayısının bilinmesi gerekir. Analiz tüpüne reaktif ve numune
konup belirtilen sıcaklıkta inkübasyona bırakılır. Deney metodunda belirtilen bir süre sonra ilk
absorbans değerleri okunur. Daha sonra birer dakika aralarla 2, 3 defa daha absorbans değerleri
okunur ve birbirini takip eden her iki okumanın farkı alınır (ΔA). Daha sonra bu dakikalık
absorbans farkları toplanıp okuma aralığı sayısına bölünerek dakikadaki ortalama absorbans
değişimi (ΔA/dakika) bulunur. Dakikadaki ortalama absorbans değişimi (ΔA/dakika), deneyde
ölçülen maddenin miktarı reaksiyon sırasında artıyorsa (+), azalıyorsa (-) bir sayıdır;
hesaplamada mutlak değer alınır. Eğer reaktifte deney şartlarında numune olmaksızın bir
absorbans değişimi oluyorsa bunun tespit edilip numune için bulunan değerden çıkarılması
gerekir. Ayrıca ΔA değerlerinin birbirinden çok farklı olması reaksiyonun lineer olmadığını
gösterir. Kinetik okumada sonuçlar, ΔA/dakika değerleri bir faktörle çarpılarak bulunur.
Sayfa 63 / 94
IU/L
(μmol/dak/L)
olarak
enzim
aktivitesi
hesaplamasında
kullanılan
faktör
(F):
F = Total volüm x 106 / ε x ışık yolu x numune volümü Total volüm → ml cinsinden deney
tüpündeki toplam sıvı miktarı106 → sonucu μmol/dak/L = IU/L’ye çevirme katsayısı ε →
L/mol/cm cinsinden molar absorpsiyon katsayısı (ekstinsiyon katsayısı) Işık yolu → cm
cinsinden okuma küvetinin çapı Numune volümü → ml cinsinden reaksiyona katılan numune
hacmi
Tercih edilen spektrofotometrik ölçüm cihazının özellikleri: -filtreli fotometre değil,
spektrofotometre
olmalı.
-Okuma
aralığı
340-700
nm
aralığını
kapsamalıdır.
-Cihazın küvet okuma kısmı ısıtıcılı olmalıdır.
okuma
-Optik
için
gerek
duyduğu
asgari
reaksiyon
hacmi
küçük
olmalıdır.
-Cihaz gerekli program bilgilerini hafızasında tutabilmelidir.
-Şebeke elektrik akımındaki dalgalanmaların zararlı etkilerinden korunmak için bir regülatörü
olmalıdır.
-Çift ışık yollu cihaz olmalıdır.
-Dijital göstergeli ve 0 100 ayarlarını otomatik yapmalıdır.
-Hafıza sistemi açık olmalıdır; test parametreleri kullanıcı tarafından değiştirilebilmelidir.
-Bikromatik (çift dalga boylu) okuma yapabilmelidir.
-Dalga boyu geçişleri kesintisiz olmalıdır; her bir nm dalga boyuna ayarlanabilmelidir.
-Cihaz, non-lineer testleri çalışıp hesaplayabilmelidir.
4.11 Spektrofotometrelerin Kalibrasyonu: Bir miktar potasyum bikromat (K2Cr2O7),
100oC’de bir saat süre ile kurutulur. Kurutulmuş potasyum bikromattan çok hassas olarak 0,005 g
tartılır ve 1 L’lik balon jojede 0,005 M sülfürik asit çözeltisinde son hacim 1 L olacak şekilde
çözülür. Bu çözeltinin absorbansı, 15-25 oC aralığında 1 cm’lik küvette 350 nm dalga boyunda
okunur.
Reaktif
körü
olarak
0,005
M
sülfürik
asit
çözeltisi
kullanılır.
-Bu şartlarda ölçülen absorbans değeri 0,536±0,005 olmalıdır.
4.12 Otomatik Spektrofotometre: Bu tip spektrofotometreler oto analizördür. Oto
analizör, numune ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştırır, belirli süre ve ısıda inkübe eder,
gerekli sürelerde optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz sonucunu hesaplanmış olarak
kullanıcıya sunar.
4.13 Türbidimetri ve Nefelometri: Bulanıklığın ölçümü esasına dayanan yöntemlerdir.
Türbidimetride, çözeltiye gelen ışık şiddetinde çözeltideki partiküllerin neden olduğu saçılmadan
dolayı ortaya çıkan ışık kaybı ölçülür. Bunun için, absorpsiyonun olmadığı dalga boyundaki ışık
ve fotometreler veya kolorimetreler kullanılır. Türbidometri, genellikle numunedeki protein
Sayfa 64 / 94
yapısındaki maddelerin ölçümünde kullanılır. Değişik yöntemlerde proteinler denatüre edilerek
çözünürlükleri ortadan kaldırılır; bulanıklık oluşturulur ve bu ölçülür. Antikorların kullanıldığı
deneylere immünotürbidimetri adı verilir.
Nefelometride, çözeltideki partiküllerce geliş eksenine göre 90o açıyla yerleştirilmiş olan
fotosele doğru saptırılan ışınlar ölçülür. Çeşitli açılarda saçılan ışınları ölçen farklı tip
nefelometreler vardır; spektrofotometreler nefelometri için kullanılamaz.
4.14 Spektrofotometrik Analizler
4.14.1 Nitel analizler: Geniş uygulama alanları, yüksek duyarlılık, seçimlilik ve
tekrarlanabilirliğin iyi olması, uygulanabilirlik ve hızlılığın iyi olması gibi nedenlerle tercih
edilirler. Nitel analizlerde, gıdalardaki saf maddelerin yapılarının saptanmasında, fonksiyonel
grubun
4.14.2 Nicel analizler: Nicel analizde Lambert –Beer kanunundan yararlanılır. Bu kanuna
göre, absorbans konsantrasyonla doğru orantılıdır. Tayin tek standartla, kalibrasyon eğrisi ile ve
standart katma metodu ile yapılabilir. Bunun için analiz edilecek maddenin absorblayacağı ışığın
dalga boyu belirlenir ( bu genellikle maddenin maksimum absorbans gösterdiği dalga boyudur).
Belirlenen
dalga
boyunda
hazırlanan
standart
çözeltilerin
absorbansları
ölçülür
ve
konsantrasyona karşı kalibrasyon grafiği çizilir. Kalibrasyon grafiğinde standart çözeltilerin
absorbası grafik denkleminde y değeri yerine, konsantrasyonu x değeri yerine konularak çizilir.
Sonra bilinmeyenin (örneğin) absorbansı okunarak grafikten absorbansının kalibrasyon eğrisini
kestiği yerden x eksenin dikme indirilerek te aynı şekilde bilinmeyenin konsantrasyonu tayin
edilir.
4.15
Meyve Sularında Spektrofotometre ile Askorbik Asit (C Vitamini) Tayini
4.15.1 Uygulama Alanı Ve Amacı:
Meyve sularında Askorbik asit miktarının tespit etmektir.
4.15.2 Prensip:
Askorbik
asit,
oksidasyon-redüksiyon
boyasını
(2,6-dikloroindofenol
boyasını)
renksizliğe indirger. Reaksiyon sonunda, indirgenmemiş boyanın fazlası asidik çözeltide gül
pembesi-mor bir renk gösterir. Askorbik asit, otooksidasyonunun engellenmesi ve reaksiyonda
uygun asitliğin sağlanması için fosforik asit+asetik asit veya fosforik asit+asetik asit+sülfirik asit
veya okzalik asit çözeltisi varlığında boya ile reaksiyona sokulur. Boyanın fazlasından oluşan
renk spektrofotometrede 518 nm’de okunur.
4.15.3 Kısaltma Ve Tanımlar:
4.15.4 Reaktifler:
Sayfa 65 / 94
 Stabilizan Çözelti: 4 g Oksalik asit 1 litre soda çözülür. (% 0.4)
 Stok Askorbik Asit Çözeltisi: 100 mg Askorbik asit 100 ml % 0.4 lük Oksalik asitte
çözülür (% 0.1).
 Çalışma Çözeltisi olarak Askorbik Asit Çözeltisi: Stok Askorbik asit çözeltisinden
100 ml lik balonjojelere 1, 2, 3, 4, 5 er ml konur. Üzerlerine stabilizan olarak % 0.4’lük Oksalik
asit çözeltisi ilave edilerek hacim 100 ml’ye tamamlanır. Böylece 1–5
mg/100 ml
konsantrasyonda çalışma çözeltileri hazırlanmış olunur.
 Boya Çözeltisi: 12 mg 2,6-dikloroindofenol Na tuzu 1 litre saf suda çözülür.
4.15.5 Cihaz Ve Malzemeler:

Spektrofotometre

Analitik terazi
4.15.6 İşlem:
4.15.6.1 Standart Kurvenin Çizilmesi için Hazırlıklar: Bir tüpe % 0.4’lük Oksalik 1
ml çözeltisi ve 9 ml saf su konur (Şahit 1 çözeltisi). Diğer 5 adet tüpe sırasıyla standart 1, 2, 3,
4, 5 mg/100 ml çözeltilerinden 1 ml
ve 9 ml boya çözeltisi konur bu şekilde kalibrasyon
çözeltileri hazırlanır.
4.15.6.2 Örnek Çözeltilerinin Hazırlanması: 10 ml meyve suyu 90 ml stabilizan
çözeltiyle karıştırılır ve filtre kâğıdından süzülür. Böylece örnek 10 misli seyreltilmiş ve C
Vitamini asit ortamda korunmuş olur. Bir tüpe örnek çözeltisinden 1 ml alınır, üzerine 9 ml su
konur (Şahit Örnek çözeltisi) Diğer tüpe 1 ml örnek çözeltisi alınır, üzerine 9 ml boya çözeltisi
konur. (Örnek çözeltisi)
4.15.6.3
Numunenin Okunması : Cihaza elektrik verilerek cihazın kalibrasyonu ve
ısınması için 15 dakika beklenir. Dalga boyu 518 nm’ye ayarlanır. Mode tuşu ile Absorbans
seçilir. Şahit 1 çözeltisi küvete doldurulur, küvet cihaza yerleştirilir ve absorbans sıfırlanır (0.000
A). Standart 1 çözeltisi küvete doldurulur, küvet cihaza yerleştirilir ve standart 1 çözeltisinin
absorbansı okunarak kaydedilir (A STD 1). Benzer şekilde sırasıyla şahit 1, 2, 3, 4 ve 5
çözeltileriyle absorbans sıfırlanarak standart 1, 2, 3, 4 ve 5 çözeltilerinin absorbans değerleri
okunur ve kaydedilir (A STD 1, A STD 2, A STD 3, A STD 4, A STD 5). Şahit Örnek
çözeltisinden küvete doldurulur, küvet cihaza yerleştirilir ve absorbans değeri okunup kaydedilir
(A Örnek) .Örneğe ait absorbans değerine (A Örnek) karşılık gelen konsantrasyon standart
kurveden okunur. Örnek 10 misli seyreltilmiş olduğundan bulunan konsantrasyon 10 ile çarpılır.
Sonuç, meyve suyunda mg/100 ml Askorbik asit olarak verilir.
Sayfa 66 / 94
4.15.6.4 Standart Kurvenin Çizimi: A STD 1, A STD 2, A STD 3, A STD 4, A STD 5
değerleri ve C Vitamini konsantrasyonları (1, 2, 3, 4 ve 5 mg/100ml) bir milimetrik kâğıda
geçirilerek kalibrasyon eğrisi elde edilir. Buradan
y=ax + b denklemi elde edilir. Ayrıca en
küçük kareler yöntemi kullanmak suretiyle a, b, r ve R2 değerleri elde edilir.
4.15.7 Sonuçların Gösterilmesi:
A=Absorbans
b= y=ax + b denkleminde b sabiti
a= y=ax + b denkleminde eğim sabiti
5. Alev Fotometrisi
5.1 Giriş
Alev Fotometrisi, Atomik Emisyon Spoktrometri’nin içinde yer alan en basit yöntemdir. Bu
yöntemde, alev etkisiyle uyarılmış atomların temel hale dönerken yapmış oldukları emisyon
dikkate alınır. Bu yöntemle alkali ve toprak alkali metallerin (Li, Na, K, Mg, Ca, Sr, Ba gibi )
kantitatif (nicel) analizi yapılabilmektedir.
Alev fotometresinde alev, çözelti içindeki maddenin buharlaştırılması, maddenin atom veya
basit moleküllere ayrıştırılması ve atom veya moleküllerin uyarılması gibi işlevleri yerine getirir.
Her element atomlarının uyarılması gibi işlevleri yerine getirir. Her element atomlarının uyarılma
sıcaklığı gerekenden az ise uyarılma olayı olmaz yani elektronların bir üst yörüngelere geçmesi
sağlanamaz. Eğer sıcaklık gerekenden fazla ise bu kez elektronun bir üst yörüngeye geçmesi
değil atomdan tamamen uzaklaşması olur. Bir başka değişle atomun uyarılması değil iyonlaşması
olur. Atomdan uzaklaşan elektron tekrar eski yörüngesine gelemeyeceği için ışın yayılması da
söz konusu değildir.
Sayfa 67 / 94
Şekil 5.1. Atomdaki dış yörünge elektronunun temel halden yüksek enerjili uyarılmış hale
geçişi
Analiz yapılacak örnek, çözelti halinde özel bir kaba konur ve buradan yüksek sıcaklıktaki
bir bek alevi üzerine püskürtülür. Bu sıcaklıkta çözücü buharlaşır ve geriye tuzlar kalır. Bu tuzlar
da bu kadar yüksek sıcaklıkta parçalanır ve atomlarına ayrılır. Bu iş için kullanılan bek, analizi
yapılacak maddenin uyarılma sıcaklığına bağlı olarak çeşitli yakıtlar (hava gazı, propan, bütan,
hidrojen ve asetilen gibi) kullanılabilir; ayrıca bu yakıtların yanması için hava veya oksijene
ihtiyaç vardır. Bu yöntemde elde edilen sıcaklık 1200 oC civarında olduğundan bu sıcaklıkta
ancak alkali ve toprak alkali metallerin uyarılması sağlanabilir. Dolayısıyla uyarılmaları için çok
daha yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyulan geçiş metalleri bu yöntemle tayin edilemez. Bu amaçla
yine emisyon modunda çalışan ve günümüzde en gelişmiş cihaz olarak ICP-AES (İndüktif
eşleşmiş plazma – atomik emisyon spektrometresi) kullanılmaktadır.
Şekil 5.2. Basit bir Alev Fotometresinin temel kısımları
Atomik emisyonda alevin sıcaklığı aynı elementin atomik absorbsiyon spektroskopisi için
kullanılan alevin sıcaklığından daha yüksek olmalıdır. Alev üzerine küçük damlacıklar halinde
püskürtülen çözelti yakıt ve oksijen veya hava etkisiyle yakılır. Burada alev sıcaklığı 1200 oC’nin
Sayfa 68 / 94
üzerine çıkar. Bu sıcaklıkta çözücü buharlaşır ve içinde bulunan tuzlar atomlarına ayrışır. Bu
kadar yüksek sıcaklığa getirilerek uyarılan atomlar ışın yayar. Bu ışınlar bir merceğe ve oradan
da diyaframa ve monokromatöre gelir. Monokromatördeki filtre analizi yapılacak elemente göre
değişir. Bu filtreden geçen ışınlar bir detektöre gelir ve burada gelen ışınlar elektrik enerjisine
dönüştürülür. Son olarak da bir galvanometre yardımıyla akım okunarak kaydedilir.
5.1.1 Kullanılan Alevin Özellikleri
Alevdeki indirgen gazlar ve serbest radikaller, metal iyonlarını nötr iyonlar haline çevirir.
Alev, temel durumunda olan elektronları uyarıp daha yüksek orbitallere geçmesi için gerekli olan
enerjiyi sağlar. Uyarılmış atomlar kararsız olduklarından stabil duruma (temel hale) geçerlerken
karakteristik bir dalga boyunda ışıma yapar. (Bu ışığın dalga boyu her elementten elemente göre
değişmektedir, yani her element kendine özgü bir dalga boyunda ışık yayar). İşte bu dönüş
sırasında ortaya çıkan ışıma miktarı alev fotometresi ile ölçülür.
5.1.2 Alev Fotometresinin Diğer Cihazlardan Ayıran Özellikleri
Numunedeki parametrelerin ölçülmesindeki temel kavram ışığın absorbe edilmesi değil,
numuneden gelen ışımanın ölçülmesidir. Bu yöntem ile sadece saf metal konsantrasyonları tespit
edilebilmektedir.
5.1.3 Alev Fotometresinde Karşılaşılabilecek Problemler
Alev ısısı sabit olmalıdır. Numunenin alev içine püskürtülmesi özel olarak kontrol edilmesi
gerekmektedir. Aleve çok fazla sıvı numune giderse bu, alevin ısısının düşmesine neden olabilir.
Bu sorunun giderilmesi için alev fotometresinin her kullanımdan sonra düzenli temizlenmesi
gerekmektedir. Na ve K iyonları ile kirlenmiş su, cam kaplar, standart çözelti yanlış okumalara
neden olacaktır. Siyanür gibi radikaller metal iyonlarına benzer bir ışıma yapar. Bu da yanlış
okumalara neden olmaktadır. Zamanla serum proteinleri atomlaştırıcının iç yüzeyini kaplar ve
alevle birlikte yandığında yanlış pozitif sonuçlar verir.
5. 2. Analiz Yöntemleri
5.2.1. Direkt Okuma Yöntemi
Bazı eski modellerde sodyum ve potasyum standart çözeltileri atomlaştırıldıktan sonra
direkt olarak aleve verilir. Daha sonra aynı şekilde numune çözeltileri seyreltilmiş olarak
uygulanır. Bu yöntemin bazı sakıncaları vardır. Hava ve gaz basıncındaki hafif oynamalar cihazın
okumasında dengesizlik yapabilir. Aynı seyreltmeler için ayrı okumalar gerekebilir. Ayrıca
potasyuma ait sinyal numunesi sodyum içeriğine bağlı olarak şiddetlenebilir. Bu olay karşılıklı
Sayfa 69 / 94
uyarılma şöyle gerçekleşebilir: Uyarılan bir sodyum atomu enerjisini potasyum atomuna transfer
edebilir. Buna bağlı olarak daha çok potasyum atomu uyarılır ve ışık emisyonu artar. İdeal olarak
standartlardaki sodyum ve potasyum konsantrasyonları bilinmeyen numunedekine yakın
olmalıdır.
5.2.2. Standart Ekleme Yöntemi
Standart ekleme yönteminde, eşit hacimli kaplara örnekten eşit miktarlarda konur.
Bunlardan birisine hiçbir şey eklenmez ve saf su ile son hacme tamamlanır (Blank ya da kör
çözelti). Diğerlerine analizi yapılacak elementin standart çözeltilerinden bilinen miktarlarda
ekleme yapılarak son hacme saf su ile tamamlanır. Örneğin tayin edilmek istenen element Na
olsun ve bunun derişimine Cx diyelim, Eklenen Na miktarına karşılık emisyon şiddeti grafiğe
geçirilir. Standartsız örnekteki sodyumun emisyon şiddeti 30 birimdir. 5 ppm Na eklendiği zaman
(Cx+5) emisyon şiddeti 33 birime yükselmiştir. Bu durumda 5 ppm’lik Na, 3 birimlik bir artış
sağlamıştır. Böylece doğrunun X ekseninin kestiği yer bilinmeyen örneğin derişimini (Cx) verir.
Bu yöntemin en önemli avantajlarından biri, örnekte bulunması beklenmeyen bir maddenin
girişimini ortadan kaldırmasıdır. Çünkü analite karşı girişim hem örnekteki analite karşı hem de
eklenen standarda karşı olacaktır. Kalibrasyon grafiğinde ise girişim sadece örnekteki analite
yansımaktadır. Bu da karmaşık numunelerde sonuçların güvenilirliğini etkilemektedir.
Şekil 5.3. Standart ekleme grafiği
5.2.3. İndirekt Okuma Yöntemi (İç Standart )
Bu yöntemde tüm standart, kör ve numunelere eşit konsantrasyonlarda lityum veya sezyum
eklenir. Lityum yüksek emisyon şiddeti gösterir, normalde biyolojik sıvılarda mevcut değildir ve
farklı dalga boyunda emisyon yapar. Alev fotometresi incelenen elementin emisyonu ile referans
Sayfa 70 / 94
lityum elementinin emisyonunu kıyaslamaktadır. Bu şekilde emisyon oranlarının ölçülmesi
atomlaştırma hızlarını, alev stabilizesini ve çözelti viskozitesine bağlı farklılıkları kompanse eder.
Bu şartlarda lityum standart değil referans elementi olarak fonksiyon görmektedir. Lityum
seyreltme çözeltisinde potasyum ve sodyumun değişik konsantrasyonlarda standart çözeltileri
hazırlanarak kalibrasyon eğrileri çizilir ve yanıtın doğrusallığı kontrol edilir. Lityumun bir başka
fonksiyonu, karşılıklı uyarılma olayının etkilerini minimuma indirerek bir tür radyasyon tamponu
görevini yapar. Sodyum ve potasyuma göre lityum konsantrasyonu yüksek ayarlanmaktadır ve
böylece sodyum atomlarının konsantrasyonu potasyum atomlarını etkilememekte, sodyuma ait
radyasyonu absorblamaktadır.
5.3. Alev Fotometresiyle Sodyum Tayini
5.3.1. Metodun Özeti – Uygulanabilirliği ve Tayin Sınırı
Sodyum doğal sularda fazla miktarda bulunur. Ayrıca tuzlu sular, iyon değiştirme prosesi
ile yumuşatılmış sular ve endüstriyel atık sularda da fazla miktarda sodyum vardır. Sodyum
oranının yüksek olması toprağın geçirgenliğinde rol oynar. Yüksek basınçlı buhar kazanlarında
kullanılan besleme suyundaki sodyumun miktarı 2–3 mg/L limit konsantrasyonu olarak önerilir.
Bu metotta numune gaz alevine gönderilir ve sodyum atomları tekrarlanabilir şartlar altında
uyarılır. Uyarılan sodyum atomlarının temel hale dönerlerken yaydıkları ışın, filtreler veya
prizmalar gibi istenilen dalga boyundaki ışını ayırıcı düzeneklerle diğer atomların yaydıkları
ışınlardan ayrılır. Işık şiddeti fototüp potansiyometresi veya diğer uygun devrelerle ölçülür. 589
nm dalga boyunda emisyon şiddeti, sodyumun konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. Numune ve
standart çözeltilerinin 589 nm dalga boyunda emisyon şiddetleri ölçülerek kalibrasyon eğrisi
çizilir. Bu eğriden numunenin sodyum konsantrasyonu tayin edilir.
Bu metotla yaklaşık 100 μg/L veya daha düşük miktardaki sodyum, AAS’de alev emisyon
modunda 589 nm dalga boyunda tayin edilebilir.
5.3.2. Numunelerin Korunması
Alkali numuneler veya az miktarda sodyum ihtiva eden numuneler, cam şişelere etki ederek
camın bileşiminde bulunan sodyum iyonunu alarak kirlenebilirler. Kirlenmeyi önlemek için
numuneler polietilen şişelerde saklanmalıdır.
5.3.3. Girişimler ve Giderilmeleri
Numunenin içerisinde aleve engel olabilecek partikül halindeki materyaller, 0.45 μm’lik
membran filtre kağıdından süzülerek giderilmelidir. Aşağıdaki uygulamalarla girişim problemi
minimuma indirilebilir:
a) İşlemin pratikçe en düşük sodyum aralığında yapılması,
Sayfa 71 / 94
b) Standard ilave tekniğinin kullanılması,
c) Numune içerisinde bulunan girişim yapan safsızlıkların belirli miktarlarının, kalibrasyon
standartlarına ilavesi,
d) Genel girişim yapan maddelerin belirli konsantrasyonlarını ifade eden bir seri standart
eğrinin hazırlanması,
e) Tek bir önemli girişim olan numunelerde deneysel olarak tayin edilmiş düzeltmeler
yapılması,
f) Girişim yapan iyonların giderilmesi,
g) Numunedeki alevi engelleyici materyallerin, orta gözenekli fitre kağıdından süzülerek
uzaklaştırılması,
h) Dahili standart tekniğinin uygulanması. K/Na > 5/1, Ca/Na >10/1, Mg/Na>100 ise
kalsiyum, potasyum ve magnezyum dahili standart metodunda girişim yapar. Bunun için
önce kalsiyum, potasyum iyonlarının miktarı tayin edilmeli ve gerekirse girişim yapan
iyonların yaklaşık konsantrasyonları sodyum standartları içerisine ilave edilmelidir.
i) Yüksek miktardaki klorür, sülfat ve bikarbonat alevde yayılmaya sebep olarak girişim
yapabilir. İyonlaşma ve anyon girişimini azaltmak için yayılma tamponu eklenmesi,
j) Bütün cam kapların (1+15) HNO3 ile çalkalanarak sonra saf su ile yıkanması.
5.3.4. Standartların Hazırlanması
Stok Sodyum Çözeltisi: 140 oC’de kurutulmuş 2.542 g NaCI bir miktar saf suda çözülerek
1000 mL’ye tamamlanır (1.0 mL = 1.0 mg Na, 1000 ppm)
Ara Standard Sodyum Çözeltisi: 10 mL stok sodyum çözeltisinden alınır, 100 mL’ye saf
su ile tamamlanır. (1.0 mL = 0.1 mg Na, 100 ppm)
İç Standart Çözeltisi (Li): Kurutulmuş LiCl’den 0.611 g tartılır, saf suda çözülür ve hacmi
1000 mL’ye tamamlanır. Böylece 100 ppm’lik Li çözeltisi hazırlanmış olur.
Sodyum tayini 3 farklı yolla yapılabilir: Standart kalibrasyon grafiği yöntemi, standart
ekleme yöntemi ve iç standardı yöntemi. Eğer tayini yapılacak numunede matriks girişimi yoksa
ya da analit iyonlarının tayinini etkileyecek bir ortam yoksa, kolaylığı bakımından standart
kalibrasyon grafiği yöntemi en uygunudur. Ancak analitin tayinini bozabilecek matriks varlığı
durumunda diğer iki yöntem seçilir.
Standart kalibrasyon grafiği yönteminde; yukarıda hazırlanan 100 ppm’lik Na ara
standardından C1V1 = C2V2 formülünden uygun oranlarda seyreltilerek 10, 20, 30, 40 ve 50
ppm’lik 10’ar mL çalışma standartları hazırlanır.
Sayfa 72 / 94
Standart ekleme yönteminde; 1’den 6’ya kadar numaralandırılmış cam tüplere 5’er mL
numune konur. 1. tüp hariç diğer 5 tüpe 100 ppm’lik ara standarttan sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve 5 mL
ilave edilir ve bütün tüplerin son hacimleri saf su 10 mL’ye tamamlanır.
İç standardı yönteminde numuneye, analitle benzer kimyasal özelliklere sahip fakat
numunede hiç bulunmayan başka bir metal iyonu ilave edilir. Alkali iyonların tayininde
genellikle Li ilave edilir. Li doğal sularda pek bulunmaz. İç standardı yönteminde; 6 tane tüp
alınır ve hepsine 100 ppm’lik Li çözeltisinden 5’er mL konur. Daha sonra ilk 5 tüpe 100 ppm’lik
Na ara çözeltisinden sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve 5 mL ilave edilir. 6. tüpe ise numune çözeltisinden 5
mL ilave edilir ve bütün tüpler 10 mL’ye saf su ile tamamlanır.
5.3.5. Numune Hazırlanması
Numunedeki aleve girişim yapan partiküller, orta gözenekli filtre kâğıdından süzülerek
uzaklaştırılır.
5.3.6. İşlem
1) Standart çözeltiler ve 50 mL veya 50 mL’ye seyreltilmiş numune alınır.
2) Sıfırlama çözeltisi gönderilerek alet sıfıra ve en derişik standart çözeltisi gönderilerek de
emisyon şiddeti 100’e ayarlanır. Bundan sonra en derişik standart çözeltisi 50 ppm’den
başlayarak 10 ppm’e kadar bütün standart çözeltilerinin ve hemen arkasından numunenin
emisyon şiddeti ölçülür. Her standart çözeltisinin emisyon şiddetinin ölçülmesinden sonra
alet sıfırlama çözeltisiyle sıfıra ayarlanmalıdır. Ölçmeler tamamlandıktan sonra,
kalibrasyon çözeltilerinden 1 veya 2 tanesinin emisyon şiddeti tekrar ölçülmeli ve ilk ölçme
ile farklılık varsa işlem tekrarlanmalıdır. İç standardı yönteminde, tüplere ayrıca Li çözeltisi
ilave edildiğinden tüpler ayrıca Li içerikleri için de cihazda ölçülür.
3) Standart kalibrasyon grafiği yönteminde her bir kalibrasyon çözeltisinin emisyon şiddeti
dikey eksene ve bu değeri karşılayan sodyum konsantrasyonu mg/L olarak yatay eksene
işaretlenerek bir kalibrasyon eğrisi çizilir. Standart eklemede, yatay eksene eklenen
standartların son konsantrasyonları, dikey eksene de okunan emisyon şiddeti değerleri
yazılır. İç standardı yönteminde ise, yatay eksene Na standartlarının konsantrasyonları,
dikey eksene de standart Na emisyon şiddetlerinin Li emisyon şiddetlerine oranları yazılır.
5.3.7. Hesaplama
Standart kalibrasyon grafiği yönteminde, numunenin bir litresindeki sodyum miktarı mg
olarak kalibrasyon eğrisinden doğrudan tayin edilir. Orijinal numune seyreltilmiş ise, sonuç
seyreltme faktörüyle çarpılarak verilmelidir.
Sayfa 73 / 94
Standart ekleme yöntemi için Şekil 5.4’deki gibi bir grafik çizilir. Burada yatay eksendeki
eklenen standartların son konsantrasyonları, C1V1 = C2V2 formülüyle hesaplanarak işaretlenir.
Örneğin birinci tüpe herhangi bir standarttan ilave edilmediği için x’in 0 (sıfır) olduğu nokta
işaretlenir. Ancak bu 1. tüpte numune olduğundan y eksenine bu sıfır noktası için bir emisyon
şiddeti değeri işaretlenir. 2. tüpe 100 ppm’lik ara standarttan 1 mL ilave edilip hacmi 10 mL’ye
tamamlanmıştı. Buna göre eklenen standardın son konsantrasyonu, 100.1 mL = C2.10 mL
formülünden C2 = 10 ppm olarak hesaplanır. Bu şekilde diğerlerini de hesap edersek x ekseninde
10, 20, 30, 40 ve 50 ppm olarak eklenen standartların son konsantrasyon değerleri hesaplanmış
olur. Grafikte x’i negatif bölgede kesen değer 2 kat seyrelmiş numunenin konsantrasyonudur.
Bulunan değer seyreltme katsayısıyla çarpılarak sonuç hesaplanır. Ya da grafiğin denklemi
bulunur. Numune konsantrasyonu y’nin sıfır olduğu nokta olduğundan, bu denklemde y’değerine
sıfır verilir ve x bulunur (Şekil 5.4). Numune çözeltisi 2 kat seyreltildiği için sonuç 2 ile çarpılır.
Şekil 5.4. Standart ekleme grafiği
İç standardı yönteminde de Şekil 5’deki gibi bir grafik çizilir. Yatay eksene standart
konsantrasyonları, dikey eksene de analit absorbansının iç standardı absorbansına oranları yazılır.
Sayfa 74 / 94
Şekil 5.5. İç standardı grafiği
5.4. Alev Fotometresiyle Potasyum Analizi
5.4.1. Metodun Özeti – Uygulanabilirliği ve Tayin Sınırı
Alev emisyon analizi, elementlerin belli sıcaklıklarda uyarılması prensibine dayanır. Bu
metotta numune gaz alevine gönderilir ve potasyum atomları tekrarlanabilir şartlar altında
uyarılır. Uyarılan potasyum atomlarının temel hale dönerlerken yaydıkları ışın, fitreler veya
prizmalar gibi istenilen dalga boyundaki ışını ayırıcı düzeneklerle diğer atomların yaydıkları
ışınlardan ayrılır. Işık şiddeti fototüp potansiyometresi veya diğer uygun devrelerde ölçülür.
Emisyon şiddeti, potasyum konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. Numune ve standart
çözeltilerinin emisyon şiddetleri ölçülerek kalibrasyon eğrisi çizilir. Bu eğriden numunenin
potasyum konsantrasyonu tayin edilir.
Bu metodla yaklaşık 100 μg/L veya daha düşük miktardaki potasyum AAS’de alev
emisyon modunda 766,5 nm dalga boyunda tayin edilebilir.
5.4.2. Numunelerin Korunması
Kontaminasyonu önlemek amacı ile numuneler polietilen şişelerde korunabilir. Numune
alındıktan 72 saat içinde analizine başlanmayacak ise (1+1)’lik HNO3 çözeltisi ile pH değeri 2–
3’e ayarlanarak daha uzun süre korunabilir.
5.4.3. Girişimler ve Giderilmeleri
Numunede bulunan alevde girişim yapan partikül halindeki materyal 0,45 μm’lik membran
filtre kağıdından süzülerek giderilmelidir. Bütün cam malzemeler (1+15)’lik HNO3 ile çalkalanıp
saf su ile yıkanmalıdır.
Sayfa 75 / 94
Na/K > 5/1, Ca/K > 10/1, Mg/K > 100 ise sodyum, kalsiyum ve magnezyum dahili standart
metodunda girişim yapar. Bunun için önce kalsiyum ve sodyum iyonlarının miktarı tayin edilmeli
ve gerekirse girişim yapan iyonların yaklaşık konsantrasyonları potasyum standartlarına ilave
edilmelidir.
5.4.4. Standartların Hazırlanması
Stok Potasyum Çözeltisi: 110 oC’de kurutulmuş 1,907 g KCl bir miktar saf suda çözülür
ve 1000 mL’ye saf su ile tamamlanır. 1 mL = 1,0 mg K (1000 ppm)
Ara Standard Potasyum Çözeltisi: 10 mL stok potasyum çözeltisi saf suyla 100 mL’ye
seyreltilir. 1.0 mL = 0,1 mg K (100 ppm)
Standard Potasyum Çözeltisi: 100 ppm’lik çözeltiden 5 mL alınıp, 50 mL’ye saf su ile
tamamlanır. Bu çözelti 10 ppm’dir.
10 ppm.lik standart potasyum çözeltisinden aşağıdaki
hacimlerde çekilerek 100 mL’lik balonlarda 2, 4, 6, 8, 10 ppm’lik çalışma standartları hazırlanır.
5.4.5. Numune Hazırlanması
Numunede bulunan alevi etkileyen askıdaki materyaller, orta gözenekli filtre kâğıdından
süzülerek uzaklaştırılır.
5.4.6. Hesaplama
Standart çözeltilerinden hazırlanan kalibrasyon eğrisinden hesaplanır. Orijinal numune
seyreltilmiş ise sonuç seyreltme faktörü ile çarpılarak verilmelidir.
6. KROMATOGRAFİK YÖNTEMLER
Kromatografi ilk defa 1906 yılında bir Rus botanikçisi olan Tswett tarafından bitkilerin
renk verici maddelerin ayrılmasında kullanıldı. Tswett renkli maddelerin ayrı bantlarını elde
ettiği için metodunu «kromatografi» olarak isimlendirdi. Metotlar renksiz maddelere tatbik
edildiği zaman bu yanlış bir isim oldu, fakat o kadar kat'i bir şekilde yerleşmişti ki, yerini başka
bir isme bırakamadı. 1931 yılında Kuhn ve Lederer, Tswett'in tekniğini karotenlerin ve
ksantofillerin preparatif ölçüde ayrılması için başarı ile kullandı. Gaz-likid partisyon
kromatografisi ilk defa olarak James ve Martin tarafından 1952 yılında uçucu yağ asitleri
karışımlarının analizlerinde ve ayrılmasında kullanıldı. Kromatografi, bir karışımı bileşenlerine
ayırma yöntemidir. Bu yöntemle bir karışımdaki eser miktardaki bileşenler bile ayrılabilir.
Kromatografi farklı türde moleküllerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir fazda değişik
hızlarla hareket etmeleri temeline dayanır. İki veya daha fazla bileşenden meydana gelen bir
karışım, içi gözenekli bir katı ile doldurulmuş bir kolona boşaltılır ve bir sıvı ile kolon sürekli
Sayfa 76 / 94
yıkanırsa, karışımdaki bileşenlerin farklı hızlarla aşağıya doğru indiği görülür. Bu tür ayırma
işlemine kromatografik ayırma, bu yönteme de kromatografi denir. Bütün kromatografik
yöntemlerde durgun ve hareketli olmak üzere iki faz bulunur. Hareketli faz genellikle bileşeni
ortamdan ayıran itici güçtür. Durgun faz ise bileşenler kendi hızları ile hareket ederken
yavaşlatıcı güç olarak etki eder. Kromatografi kolonuna konan örnek, önce bir süre durgun fazda
kalır. Daha sonra hareketli faza geçer ve kolondan aşağıya doğru ilerlemeye başlar. Eğer farklı
türde iki molekül, örneğin; parafin ve aromatik bileşik, böyle bir kolona konursa hareketli fazda
geçirdikleri sürelerin farklı olduğu görülür. Bir başka deyişle durgun faz ve hareketli fazda
geçirdikleri sürelerin oranları her iki molekül için farklıdır. Hareketli fazda daha az süre kalan
bileşen diğerlerinden daha yavaş hareket eder. Böylece bileşenler birbirinden ayrılır.
Kromatografik ayırmalarda hareketli faz, sıvı veya gaz; durgun faz ise katı veya sıvı olabilir.
Buna göre itici güç sıvı veya gazın akma hızı, yavaşlatıcı güç ise katı yüzeyinde tutunma veya iki
akışkanın birbirine dağılmasıdır.
Kromatografik yöntemler birçok şekillerde gruplandırılabilir.
6.1 Kromatografi ‘nin Sınıflandırılması
 Ayrılma Mekanizmalarına Göre
 Uygulama Biçimine Göre
 Faz Tiplerine Göre
6.1.1 Ayrılma Mekanizmalarına Göre
 Adsorpsiyon kromatografisi
 Partisyon kromatografisi
 İyon değiştirme kromatografisi
 Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi
 İyon çifti kromatografisi
 Afinite kromatografisi
6.1.2 Uygulama Biçimine Göre
 Düzlemsel kromatografi
Kağıt kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi (TLC)
 Kolon kromatografisi
Gaz kromatografisi (GC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
6.1.3 Faz Tiplerine Göre
Sayfa 77 / 94
 Sıvı kromatografisi
Sıvı-Katı kromatografisi
Sıvı-Sıvı kromatografisi
 Gaz kromatografisi
Gaz-Katı kromatografisi
Gaz-Sıvı kromatografisi
6.2 Gaz Kromatografisi
Kromatografik yöntemler içinde en önemlisi gaz kromatografisidir. Burada hareketli faz
gaz; durgun faz ise sıvı veya katıdır. Gaz-katı kromatografileri tutunma olayına dayanır. Ayırma
gücü iyi olmadığı için pek fazla kullanılmazlar. Gaz-sıvı kromatografileri’nde ise yüzeyi geniş
gözenekli katı maddeye özel bir sıvı emdirilir. Bu sıvı, katı maddenin gözenekleri dâhil bütün
yüzeyine dağılır ve bir durgun faz gibi davranır. Hareketli olan gaz fazı bu fazın içinden
kolaylıkla geçer. Bu kromatografide etkin olan olay dağılmadır. Analizi yapılacak örnek içindeki
maddeler bu iki faz arasında dağılırlar.
Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat
inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin
doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulması ile 0.2-0.5 mm iç
çapında ve 10-100 m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle
kapiler kolonların verimliliği ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir.
Kullanılan cihazlarda, kolondan önce örnek maddesinin buharlaştırılması için ısıtılan bir
bölme veya katı örneklerin gaz halindeki ürünlere dönüştürülmesi için bir piroliz bölmesi vardır.
Kolon, sıcaklığı ayarlanabilen veya programlanabilen bir fırına yerleştirilir.
Sıvı örnekler, bir enjektör yardımıyla cihazın giriş kısmına verilir. Kolon çıkışına
yerleştirilen uygun bir dedektörle izlenen sinyal, gerektiğinde uygun bir dedektörle integre edilir.
Yöntemde en yaygın olarak kullanılan dedektör türü, ısısal gaz iletkenliği ilkesinden
yararlanılarak geliştirilen ısısal iletkenlik dedektörüdür. Seçici olmayan, yani her tür örneğe
uygulanabilen bu dedektörler, özellikle kapiler kolonların kullanılmaya başlamasından sonra
yerlerini daha duyarlı dedektörlere bırakmışlardır. Bu tür dedektörlerden birisi olan elektron
yakalama dedektöründe kolondan çıkan gazlar beta ışımasına maruz bırakılır. Beta tanecikleri ile
yani yüksek enerjili elektronlarla çarpışan moleküller iyonlaşırlar ve bir elektron akımı
oluştururlar. Isısal iletkenlik dedektörüne oranla 100 kat daha duyarlı olan elektron yakalama
dedektörleri, doymuş hidrokarbonlara karşı duyarlı değildirler. Alev iyonlaşma dedektörü adıyla
bilinen bir başka tür dedektörde ise kolondan çıkan gazlar, hidrojen- oksijen gazları ile karıştırılır
ve yakılır. Oluşan pozitif yüklü iyonlar daha negatif bir elektroda doğru çekilerek elektrik akımı
Sayfa 78 / 94
oluştururlar. Alev iyonlaşma dedektörü de seçimli bir dedektör olup N2, O2, CO2 gibi alevde
iyonlaşmayan moleküllere karşı duyarlı değildir. Bu dedektörle hemen hemen aynı ilkeye
dayanarak çalışan ve özellikle kükürt ve fosfor atomları içeren moleküllere karşı duyarlı olan alev
fotometresi dedektöründe, kükürtün 394 nm’de, fosforun ise 526 nm’de yaydığı ışıma ölçülür.
Tetraalkilli kurşun ve kalay bileşikleri gibi çoğu organometalik bileşikler uçucudurlar ve GC’ de
kolayca ayrılırlar. Diğer organometalik türler, örneğin di- ve trialkilkurşun, di- ve trialkilkalay
gibi iyonik organometallerin GC kolonundan ayrılabilmesi için bunları türevlendirme yöntemi ile
uçucu türlerine dönüştürmek gerekir.
Şekil 6.1 Gaz Kromatografisi Genel şekli
En çok kullanılan türevlendirme teknikleri, hidrür oluşturma ve alkilasyondur. Hidrür
oluşturma tekniği, yalnızca As, Sb, Bi, Sn, Pb, Se, Te ve Ge gibi hidrür oluşturan elementlere
uygulanır. Alkilleme genellikle, di ve trialkilkurşun, mono-, di- ve trialkilkalay gibi iyonik
organometalik türlere uygulanır. Bütün bu türevlendime teknikleri, orjinal metal-karbon
bağlarının bütünlüğünü değiştirmeksizin, yalnızca bileşiklerin uçuculuğunu değiştirir. Son
zamanlarda GC için uçucu metalik hidrürlerin elde edilmesinde, yeni kolon üzeri türevlendirme
tekniği rapor edilmiştir. Bu yöntem, NaBH4 değiştiren fraksiyon içeren GC dolgulu kolonlarında
veya gaz kromatografının enjeksiyon bölmesinin içine yerleştirilmiş, NaBH4 içeren mini bir
reaktör içinde, organik ve inorganik metallerin hidrür türevlerinin oluşumunu kapsar.
Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza
taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı
ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu
maddesi üzerine tutturulmuş uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını
alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir. Gaz kromatografisi yönteminde
Sayfa 79 / 94
ayrıca 0.2-0.5 mm iç çapında, 10-50 m boyunda kapiler kolonlar da kullanılabilir. Bu tür
kolonlarda verimlilik, dolgulu kolonlara göre daha iyidir.
Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır.
Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir.
Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına
yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir.
Gaz kromatografisi yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma
sürelerinin birbirinden farklı olmasından yararlanarak nitel analiz yapılabilir. Ancak, birçok
bileşen için tek bir kolonla birbirine yakın alıkonulma süreleri elde edilebileceğinden, sonuçların
güvenilir olması için birkaç değişik kolon kullanmakta yarar vardır. Bir maddenin alıkonulma
süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı gaz akış hızında sabit bir değerdir. Bu
sebeple de, bir iç standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağıl
olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir yoldur.
Gaz kromatografisi yönteminde nicel analiz ise kromatogramdaki piklerin altlarında kalan
alanların hesaplanması ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır. Örneğin, enjekte ettiğimiz
bir karışımda başlangıçta eşit miktarlarda A ve B bileşenlerinin olduğunu varsaydığımız bir
durumda, kromatogramda bu bileşenlere ait piklerin altında kalan alanlar da birbirine eşit
olacaktır. Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde
edilirken, kolondan geç çıkan bileşenlere ait pikler ise geniş ve yayvan olarak elde edilmektedir.
Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması yöntemi
uygulanır. Başlangıçta kolon sıcaklığı düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.
6.2.1 Gaz kromatografisinin Kullanım Alanları
 Çevre, Kimya, Su-Gıda, Tekstil, Polimer Laboratuarları
 Aroma, Koku, Parfüm Sanayi
 Endüstriyel kimyasal-Solvent Sanayi
 Adli Tıp, Polis Kriminal Laboratuarları
 İlaç Sanayi
 Petrol Sanayi
 Araştırma Laboratuarları
 Yağ Sanayi
 Ambalaj Sanayi
6.2.2 Gaz kromatografisinin uygulamaları
 Su, Gıda,Toprak ve Havada; PAH,PCBs,
Uçucu ve yarı uçucu,
Fenol , Aldehit
analizleri
Sayfa 80 / 94
 Su, Gıda,Toprakta Pestisit ve Herbisit analizleri, Hidrokarbon, Sülfür analizleri
 Sıvı ve Katı Yağlarda Yağ Asitleri Kompozisyonu
 Yağlarda Sterol ve Wax tayini
 Alkol ve Saflık analizleri
 Narkotik-Alkoloid madde analizleri (amfetamiler, anestezikler, antihistaminler,
babitüratlar....)
 Alkollü içeceklerde Yüksek Alkoller
 Nikotin analizi
 Kanda organik asit analizleri
 Balda Naftalin analizi
 İçme sularında THM ve Koku analizi
 Biberon memelerinde Nitrosaminler
 Mısır şurubunda Asetaldehit analizi
 Rafineri gaz analizleri
6.2.3 Gaz Kromatografisi Cihazının Ana Kısımları
Gaz Kromatografi Cihazı Kromatografik sistem şematik olarak şekilde görülmektedir.
 Taşıyıcı gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım,
 Numune enjekte etme kısmı, (enjeksiyon bloğu)
 Fırın (Isıtma kısmı, kolon fırını)
 Detektör kısmı,
 Kaydetme kısmı.(İntegratör-Kaydedici-Bilgisayar)
6.2.3.1 Taşıyıcı gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım,
Gaz kromatografisinde kullanılan gazların saflığı %99.999 oranında olmalıdır. Kullanılan
gazlar inert olmalı ve çalışma esnasında analizi yapılan maddelerle reaksiyon vermemelidir.
Bunun için He ve N2 gazları taşıyıcı gaz olarak kullanılır. ECD (elektron yakalama dedektörü)
gibi yüksek hassasiyete sahip olan dedektörlerde taşıyıcı gazın saf olması çok önemlidir. Aksi
taktirde temel hatta (base-line) gürültü pikleri çıkar. Alev iyonlaşma dedektörü (FID) daha az
hassastır. Fakat FID kullanılan H2, hava ve N2 nin gerektiği kadar saf olmaması durumunda temel
hatta gürültü meydana gelir.
Taşıyıcı gazın içindeki su miktarı da çok önemlidir. Gaz içinde bulunan su kolonun
bozulmasına neden olur. Gaz içindeki suyun kolona ulaşmasını engellemek için gaz hatlarına
filtreler takılır. Bu filtreler aynı zamanda tuzak olarak da adlandırılır.
Sayfa 81 / 94
Şekil 6.1 Çeşitli Gaz Kromatografisi Gaz Filtreleri
Gaz filtreleri
dördüncü
oksijen, karbon, su
filtreleri şeklinde sisteme takılır. Bazen sisteme
filtre şeklinde oksijen göstergesi filtreside takılabilir. Bu filtrelerin çeşitli tipleri
vardır.
6.2.3.2 Numune enjekte etme kısmı, (enjeksiyon bloğu)
Numunelerin buhar fazında kolona aktarabilmek için örnek odasına aktarılmasında çeşitli
yöntemler vardır.
 Şırınga Enjeksiyonu (Sıvı örneklerin direk analizi)
–
Manual injeksiyon
–
Autosampler injeksiyon
 Valve Enjeksiyonu
–
(Gaz Örneklerin direk analizi)
Gas Örnekleme valfi
 Harici Örnekleme Sistemleri
–
Purge and Trap (Sıvı ve katı örneklerde uçucuların analizi)
–
Headspace (Sıvı ve katı örneklerde uçucuların analizi)
–
Thermal Desorption (Gaz örneklerden uçucuların analizi )
Örneğin gaz haline dönüştürülmesi için enjeksiyon bloğunun örnekteki bileşenlerin
kaynama noktalarının en yüksek olandan 50 0C kadar yüksek olması gerekir.
6.2.3.3 Çeşitli Enjeksiyon Bloğu Tipleri
 Purge packed
( Dolgulu kolonlar için )
 Split / Splitless
( Kapiler Kolonlar için )
 Cool on-column ( Kapiler Kolonlar için )
 PTV ( Programable Temparature Vaporization-Kapiler Kolonlar için )
 VI ( Volatile Interface-Kapiler Kolonlar için )
 CIS ( Cooled Injection System-Kapiler Kolonlar için )
Sayfa 82 / 94
Şekil 6.2 Siplit/Siplitless enjeksiyon bloğu şekli
Enjeksiyon manuel olarak 10 µL’ lik enjektörle birlikte cihaza yapılabilir. Enjeksiyon
bloğu üzerinde bulunan silikon kauçuktan yapılmış “septum” adı verilen parçadan enjeksiyon
yapılır. Septum numunenin verilmesi esnasında enjektör tarafından delindiğinden bir süre sonra
gaz kaçırmaya başlar. Bu nedenle belli sayıda enjeksiyondan sonra değişmesi gerekir.
6.2.3.3.1 Split/Splitless (Kapiler Kolonlar için) inlet: enjeksiyon bloklarında cihaz
programından ayarlanmak suretiyle örnek enjeksiyon sisteminde iki eşit olmayan hacme ayrılır.
Çok az kısmı kolana giderken büyük kısmı dışarı atılır. Bölünme oranı, kolondan geçen ve dışarı
atılan taşıyıcı gaz ölçülerek “ ayırıcı valf “ yardımıyla yapılır. Genelde bu oran 1/10 – 1/100
oranında değişir. Bu şekilde enjeksiyon işlemi siplit olarak tanımlanır. Siplitless enjeksiyon
işleminde ise örnek bölünmeden direkt olarak kolana verilir.
6.2.3.3.2 Cool on-column (Kapiler Kolonlar için )İnlet : Bu sistemde örnek direkt
olarak kolana verilir.
Sayfa 83 / 94
Şekil 6.3 Cool on-column ( Kapiler Kolonlar için )
Bu esnada hem kolon hemde fırın soğuk olmalıdır yada sıcaklıkları solventin kaynama
noktasının altında olmalıdır. Çünki örnek hemen buharlaşmadığından örnek ayrımı ve değişimi
problemleri minimize edilmiş olur. Eğer doğru yapılırsa ön soğuk kolon enjeksiyonu güzel
sonuçlar verir.
6.2.3.3.3 Purge packed (Dolgulu kolonlar için) İnlet: Bu tip inletlerde yüksek seviyede
ayrım gerektirmediği zamanlarda paket kolonlarda kullanılır. Geniş borsilikat kolanlar kullanılır.
Bu kolonlarda akış 10 ml/dk kadar çıkarılabilir.
Sayfa 84 / 94
Şekil 6.3 Purge packed (Dolgulu kolonlar için) inlet
6.2.3.3.4 PTV (Programable Temparature Vaporization-(Kapiler Kolonlar için)
İnlet:
Sıcaklık programlanabilir buharlaşma
inletlerde
farklı modları vardır. Siplit modu
siplitless modu gibi. Hem manuel hemde otomatik olarak kullanılabilir. Bu inletin özelliği
sıcaklık programı oluşturulabilmesidir. Bu şekilde çözücü kaynama noktasına yakın veya daha
düşük sıcaklıkta tutulan Kapiler kolona seyreltik örneklerin verilmesini mümkün kılar.
Şekil 6.4 PTV (Programable Temparature Vaporization-Kapiler Kolonlar İçin İnlet
6.2.3.3.5 CIS ( Cooled Injection System-Kapiler Kolonlar için )İnlet: Split/splitless
enjeksiyon bloklarına benzer. Ancak programlanabilir sıcaklık kontrollü bir inlettir. Hem
ısıtabilir hemde soğutma özelliği vardır. Sıvı azot, karbondioksit ve peltier element soğutma gibi
soğutucular kullanılır.
Sayfa 85 / 94
Şekil 6.5 CIS ( Cooled Injection System-Kapiler Kolonlar için )
6.2.3.3.6 VI ( Volatile Interface-Kapiler Kolonlar için )İnlet: Uçucu gaz örneklerinin
analiz edilmesinde kullanılan enjeksiyon bloğudur. Head space, purge ve trap ve bazı hava
toksik maddelerlerin analiz edildiği cihaza bağlanabilir. Siplit, splitless ve direkt modla
çalışabilir.
Şekil 6.6 VI ( Volatile Interface-Kapiler Kolonlar için )
6.2.3.4 Gaz Kromatografisi (GC) kolonları
Modern GC metodunda çok ince bir tüp gibi kolonlar kullanılır ve bunlar açık tüpsü
kolonlar diye adlandırılır. Bu tip kolonlar çok dar çaplı (100 – 750 µm) camdan, erimiş silika,
tesirsiz metal (örnek; nikel) yada Silicasteel®’ den yapılır. Bu tüpler çeşitli boylarda olabilir (2 –
60 m yada daha fazla). Kolonların etrafı kaynama noktası yüksek bir sıvıyla kaplanır. Bu da sabit
faza yardımcı olur. Unutulmaması gereken çok önemli bir hususta kolon sıcaklığındaki değişimin
hiçbir zaman sabit fazdaki sıvının katıya dönüşmesine izin verecek kadar düşmemesi gerektiğidir.
Sabit faz genellikle bir organosiloksan polimeridir. Dolayısıyla birçok metil grubu fonksiyonel
gruplara karışır ve sabit faza çeşitli tipteki bileşikleri ayırma özelliği sağlar.
İç çapları 320 µm yada daha az olan kolonlar da en uygun akış oranı dakikada 2 mL yada
daha azdır. Bu kolonlar direkt olarak kütle spektroskopisinin içine sokulur. Geniş çaplı kolonlar
(530 µm ve 750 µm) 2 mL/dk’ dan daha yüksek akış oranına sahiptir ve iki cisim arasındaki ortak
yüzey aracı bulundurmalılar. Gözenekli tabakalı açık tüplü (PLOT) kolonların polimerik
materyalli fiberleri vardır. Al2O3 yada duvarlarında moleküler elek bağları vardır. Bunlar özel
Sayfa 86 / 94
karışımları ayırmak için kullanılır. Örneğin; moleküler elekli PLOT kolonların kullanımı sürekli
aynı kolon gazların (O2, N2, CO, H2O gibi) ayrıştırılmasında kullanılır.
Sarmalanmış kolonlar 3 mm ve 6 mm’ lik iç çapa sahiptirler. Bazen 12 mm kadar geniş
olabilirler. Uzunluğu 1 m ile 3 m arasında değişir. Bazen 15 m’ ye kadar çıkabilir. Katı bir
desteğin üzerine tüplüklü kolonların dış yapısında kullanılan sabit faz kaynama noktası yüksek
sıvılarla katı destek (örnek; diatomaceos earth) kaplanır. Toplam ağırlığın % 1 – 10’ u genellikle
likit kısımdan oluşur. Daha sonra bu katı madde kolonun içine paketlenir ve kolonun sabit fazı
başlar.
Açık tüplü kolonlar ve destek kaplı açık tüplü (SCOT) kolonlar birbirine benzer. SCOT
kolonlar sabit fazın “whiskers” halindeyken destek geçici olarak kolonların dış yüzeyinden
çekilir. Kolonun ortası açılır. Uygun kolon performansı, taşıyıcı gazın akış oranına, kolonun
çapına ve sabit fazın tabakasının kalınlığına bağlıdır. Kromatografik kolonun randımanı yüksek
ekivalent teorik tabakası (HETP) terimleriyle adlandırılır. Bu da kolon uzunluğunca sabit fazla
hareketli faz arasında analitlerin parçalanması, ayrılmasındaki eşitliğin başarılması demektir.
Şekil 6.7 Gaz Kromatografi Kolonları
6.2.3.5 Gaz Kromatografisi (GC) Kolon Fırını
Sayfa 87 / 94
Gaz kromatografisinde kolonlar fırın içinde bulunurlar ve bu fırınlar çok hassas şekilde
sıcaklık ayarlamaları programlanabilir ve kontrol edilebilir. Örneğin kolon içinden geçmesi
tamamen sıcaklıkla alakalıdır. Yüksek sıcaklıkta
analitler çok daha hızlı hareket ederler.
Analitlerin kolon içinde hızlı hareket etmesinde ayrım iyi olmaz. Genelde kolon sıcaklığı analiz
uzunluğu ve analitlerin ayrılma durumuna göre seçilir. Bütün analiz boyunca Sıçaklığın sabit
tutulası izotermal olarak adlandırılır. Analiz esnasında sıcaklık zamana bağlı olarak artırılır. Bu
rampa olarak da tanımlanır. Son sıcaklığa kadar olan kısım sıcaklık programı olarak adlandırılır.
Şekil 6.8 Kolon fırını
Sayfa 88 / 94
Şekil 6.9 Kolon Fırını Programı
6.2.3.6 Gaz Kromatografisi (GC) Dedektörleri
Bir gaz kromatografisi dedektörü kromatografik işlem uygulanan bir karışımdaki bileşenleri
süratle ve hassasiyetle algılayabilen bir aygıttır; sisteme uzamsal ve zamansal boyutlarda
yerleştirilebilir. Herhangi bir anda, taşıyıcı gazdaki madde konsantrasyonu sadece binde birkaç
seviyesindedir ve dedektör bunun çok altındaki değerleri algılayabilecek kapasitede olmalıdır.
Ayrıca bir pikin dedektörü geçtiği süre 1 sn veya daha kısa bir zaman aralığı olduğundan,
dedektör kısa bir periyot içinde tüm algılama gücünü gösterebilmelidir. Dedektörün doğrusal ve
muntazam algılamalar yapabilmesi ve uzun süre kararlılığını koruyabilmesi istenir.
İlk kullanılan dedektörler arasında gaz yoğunluğu terazisi, katarometre, alev temokupl dedektörü,
x-ışını dedektörü ve emissivite dedektörü sayılabilir.
Gaz kromatografisi tekniklerindeki
gelişmeler son on yılda artık kararlı hale gelmiş gibidir; bu durum GC dedektörleri için de söz
konusudur. Son yıllarda çok az sayıda yeni ticari gaz dedektörü üretilmiştir. Yirmi yıl öncesinde
olduğu gibi hala çok popüler olan ve tüm gaz kromatografik çalışmaların, yaklaşık %95’inde
kullanılabilen dört dedektör tipi vardır; termal iletkenlik (TCD), alev iyonizasyon (FID), nitrojen
fosfor (NPD), ve elektron yakalama (ECD) Algılanması istenen komponentlere bağlı olarak
geliştirilmiş çok çeşitli gaz kromatografisi dedektörü vardır. Kullanım alanı yaygın olan bazı
dedektörler, uygulama alanları ve hassasiyetleri aşağıdaki tabloda verilmiştir.
Tablo 6.1 Tipik bazı Gaz Kromatografi Dedektörleri ve Algılama Limitleri
Gaz kromatografisi dedektörerin çoğu, GC kolonundan gelen akımdaki bileşenle-rin
iyonlaştırılmasında farklı iyonizasyon metotlarının kullanıldığı iyon dedektörleridir; bir kapasitör
Sayfa 89 / 94
veya vakum tüpüne benzerler. Bir iyonizasyon dedektörü, içinde, önemli derecede iyonizasyon
potansiyeli ürete-bilen bir gaz bulunan sızdırmaz bir ‘iyon odacığı’dır. Bu amaçla argon, kripton,
neon, ksenon, helyum gibi gazlar kullanılabilir. Tipik olarak odacık metalden yapı-lır; negatif
potansiyel taşır (katot) ve topraklanmıştır. Anot gergin bir tel, bir çubuk veya bir disk olabilir.
Odacığın bir tarafında veya son kısmında bir pencere vardır; pencere ışını (alfa, beta, gama ve Xışınları) ölçebilecek derecede şeffaf olmalı ve ışının odacığın iç tarafına nüfuz etmesine olanak
vermelidir. Elektrotlar bir güç kaynağına bağlandığında ve odacığa ışın verildiğinde,
iyonizasyonla oluşan orta-lama akım veya puls sayısı ve/veya bunların genliği, ışının miktarını
gösterir. İlk üretilen GC iyonizasyon dedektörlerinin (1950 yılları) hassasiyetleri, katharometre
veya alev termokupl dedektörler seviyesindeydi (~10-6 g/ml).
6.2.3.6.1 Termal İletkenlik Dedektörü, TCD
Kullanım alanı geniş olan bu yöntemde, gaz akımındaki ısısal iletkenliğin değiş-mesi
algılanır; bu amaçla kullanılan cihaza bazan "katharometre" denir. Cihazın hassas elementi
elektrikle ısıtılan bir kaynaktır; kaynağın sıcaklığı, sabit elektrik gücünde, etrafındaki gazın ısıl
iletkenliği ile değişir. Element ince bir Pt tungsten tel veya yarı iletken bir termistördür. Tel veya
termistörün direnci gazın ısıl iletken-liğinin bir ölçüsüdür; telin sıcaklık katsayısı pozitif,
termistörünki negatiftir. TCD’lerde genellikle çift dedektör kullanılır; biri taşıyıcı gazı (referans),
diğeri taşı-yıcı gaz ve örnek karışımının ısıl iletkenliğini izler. Bunlar örnek injeksiyon odacığının önündeki gaz akımı içine ve kolon çıkışına konarak taşıyıcı gazın ısıl iletkenliği yok edilir;
akış hızı, basınç ve elektrik gücündeki değişiklerin etkisi de en aza indirilir. Dedektörlerin
dirençleri, bir Wheatstone köprüsünün iki kolu üzerinde birleştirilerek kıyaslanır.
Hidrojen ve helyumun ısıl iletkenlikleri, pek çok organik maddeye göre 6-10 kat daha fazladır.
Bu nedenle çok az miktarlardaki organik maddeler bile kolon akışındaki ısıl iletkenliği önemli
derecede düşürür. Azot ve karbon dioksitin iletkenlikleri organik maddelerinkine yakındır; bu
nedenle taşıyıcı gaz azot veya karbon dioksit ise ısıl iletkenlik yöntemi hassasiyetini kaybeder.
Isıl iletkenlik dedektörleri basit, kaba ve ucuzdur. Bunlar diğer bazı dedektörler kadar hassas
değildir.
Sayfa 90 / 94
Şekil 6.10 Termal İletkenlik Dedektörü Şematik Görünümü
6.2.3.6.2 Alev İyonizasyon Dedektörü (FID)
Pek çok organik bileşik bir hidrojen/hava alevinde piroliz edildiğinde, bazı ara ürünler
verirler; bu reaksiyonlar alevden elektrik taşınmasına yol açarlar. Şekilde görülen bir sistemle
iyonlar toplanarak oluşturuldukları iyon akımı ölçülebilir. Bir alevin elektrik direnci çok
yüksektir (1012 ohm gibi) ve meydana gelen akım da önemsizdir; bu akım ancak bir elektrometre
ile ölçülebilir.
Karbon bileşiklerinin alevdeki iyon sayısı (kabaca) alevde indirgenen karbon a tomlarının sayısı
ile orantılıdır; Karbonil, alkol, ve amin gibi fonksiyonel gruplar çok az iyonlaşırlar veya hiç iyon
vermezler. Hidrojen alev dedektörleri çok kullanılan, çok hassas dedektörlerdir. Isıl iletkenlik
dedektörlerine kıyasla daha karmaşık ve daha pahalıdır. Bunların doğrusal algı-lama aralığı daha
geniştir.
Şekil 6.11 Alev iyonizasyon Dedektörü Şematik Görünümü
Sayfa 91 / 94
6.2.3.6.3 Nitrojen-Fosfor Dedektörü (NPD)
Nitrojen-fosfor dedektörü (bazen termiyonik dedektör de denir), alev iyonizasyon
dedektörüne benzeyen, fakat tamamen farklı prensiplere göre çalışan çok hassas özel seçici bir
dedektördür; 10-12 g/ml fosfor ve 10-11 g/ml nitrojeni ölçebilir. Bir fosfor atomuna karşı, bir
azot atomundan 10 kat, bir karbon atomundan da 104 –106 kat daha fazla respons verir. Bu
özellikler NPD’yi özellikle fosforlu pestisidlerin tanımlanması ve tayin edilmesinde çok önemli
kılar.
Bir NPD yapı olarak alev iyonizasyon dedektörüne benzer; farklılık, hidrojen jetine yakın
bir mesafede yerleştirilmiş, içinde ısıtıcı bir sarım olan bir ribüdyum veya sezyum klorür
taneciktir; taneciğin bulunduğu yerde, H2 ve taşıyıcı gaz N2 karışır.
Dedektör hem nitrojen ve hem de fosforun algılanması için kullanıldığında hidrojen akımı en
düşük düzeyde tutulmalıdır; bu durumda jette gaz yanmaz. Dedektörün sadece fosforu
algılanması istendiğinde daha fala hidrojen verilir ve karışım jette yanar. Isıtılan alkali tanecik,
termiyonik emisyonla elektronlar emitler (yayar), bunlar anotta toplanır ve elektrot sisteminde
arka plan akımını yaratırlar.
Nitrojen veya fosfor içeren bir örnekle çalışıldığında kısmen yanmış nitrojen ve fosforlu
maddeler taneciğin yüzeyinde adsorblanır. Adsorblanmış madde yüzeyin iş-fonksiyonu düşürür,
bunun sonucu olarak elektron emisyonu artar ve anotta toplanan akım yükselir.
Şekil 6.12 Azot Fosfor Dedektörü Şematik Görünümü
6.2.3.6.4 Elektron-Yakalama İyonizasyon Dedektörü (ECD)
Elektron-yakalama dedektörleri, X-ışınları ölçümüne benzer şekilde çalışırlar. Dedektörde
düşük enerjili β ışını ile elektronlar ve iyonlar üretilir. İlk kullanılan kaynak bir gümüş sarım
Sayfa 92 / 94
içinde absorblatılmış trityumdu; ancak bu maddenin yük-sek sıcaklıklarda kararsız olması
nedeniyle çok daha kararlı olan 63Ni kaynak kullanılmaya başlanmıştır.
Kolondan çıkan akım, bir beta-vericiden geçirilir. Vericiden gelen bir elektron, taşıyıcı gazı
(çoğunlukla azot) iyonlaştırır ve bir elektron çıkarır. Ortamda organik madde yoksa bu
iyonizasyon sonunda sabit bir akım görülür. Organik madde bulunması durumunda ise
elektronlar madde tarafından yakalanacağından akım düşer; Akım kaybı ölçülür ve sinyal
meydana gelir.
Elektron-yakalama dedektörü, FID kadar hassas bir dedektördür; fakat dinamik aralığı sınırlıdır.
Daha çok halojenli bileşiklerin analizlerinde kullanılır. Peroksidler, kinonlar, ve nitro grupları
gibi elektronegatif fonksiyonel gruplara karşı çok hassastır. Aminler, alkoller, ve hidrokarbonlara
karşı hassasiyetleri düşüktür. Bu dedektörler en çok klorlu tarım ilaçlarının analizlerinde
kullanılır.
Resim 6.13 Elektron-Yakalama Dedektörü Şematik Görünümü
6.2.3.6.5 Kütle Spektrometre (MS) Dedektörler
Sayfa 93 / 94
Kütle spektrometre dedektörler, tüm gaz kromatografisi dedektörleri arasında en güçlü
olanlarıdır. Bir GC/MS sisteminde ayırma boyunca, kütle spektrometresi sürekli olarak kütleleri
tarar. Örnek kromatografi kolonundan çıktığında bir transfer hattından geçerek kütle
spektrometrenin girişine gelir; burada bir elektron-darbe (impact) iyon kaynağı tarafından
iyonlaştırılır ve fragmanlara ayrılır. Bu işlem sırasında örnek enerjili elektronlarla bombardıman
edilir ve elektrostatik kuvvetler molekülün elektron kaybederek iyonlaşmasını sağlar.
Bombardımanın ilerletilmesi iyonların fragmanlara dönüşmesine neden olur. Kütle analizörüne
giren iyonlar burada m/z (kütle-yük oranı) değerlerine göre sıralanırlar. İyonların çoğu tek değerlidir. istemde, kromatogram alıkonma zamanlarını belirler, kütle analizörü de pikler-den,
karışımda ne tür moleküllerin bulunduğunu saptar. Kullanımı en yaygın olan kütle analizörü, gaz
anyon ve katyonların elektrik ve magnetik alan vasıtasıyla uzun süre tutulmasını sağlayan
kuadrupol iyon-kapanı analizördür.
İyon kapanı analizöründe üç elektrot bulunur. Merkez elektrot halka; üst ve taban elektrotlar
yarım küre şeklindedir. İyonizasyon ve kütle analizi aynı yerde gerçekleşir. Ayrılan iyonlar bir
iyon dedektörüyle ölçülür; kullanımı en yaygın olan dedektör, sürekli dinod tip bir iyon
dedektörü olan elektron multiplierlerdir.
Şekil 6.15 GC-MS Dedektörü Şematik Görünümü
Sayfa 94 / 94

enstrümental gıda analizleri ders notları

Transkript

Benzer belgeler

Çizgi kusurlu fotonik kristal dalga kılavuzlarında saçıcıların

Eroğlu - Kıbrıs Postası

Bayim Olur Musun?

Otobüs Rayiç Bedelleri - izmir yüksek teknoloji enstitüsü

IŞIK

Facebook paylaşım detaylarını kişiselleştirme