ICG Tabanlı FDT`nin in vivo Etkisinin Araştırılması Ayşenur Kiriş

TIPTEKNO‘14
25 – 27 Eylül 2014
Perissia Hotel & Convention Center
KAPADOKYA
TIP TEKNOLOJİLERİ ULUSAL KONGRESİ
Fotoelektrik Sinyaller
3. Gün 27 Eylül 2014 Cumartesi (10.45-11.30)
ICG Tabanlõ FDT’nin in vivo Etkisinin Araştõrõlmasõ
In vivo investigation of ICG Mediated PDT Effects
Ayşenur KİRİŞ1, Tuğba KİRİŞ1, Saadet AKBULUT1,Haşim Özgür
TABAKOĞLU1, Zuhal GÜCİN2, Mahmut MÜSLÜMANOĞLU3
1 Biyomedikal
Mühendislik Enstitüsü
Fatih Üniversitesi
!
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
2 Tõbbi
!
Patoloji Anabilim Dalõ
Bezmialem Vakõf †niversitesi Tõp FakŸltesi Hastanesi
[email protected]
3Genel
Cerrahi Anabilim Dalõ
3Bezmialem Vakõf †niversitesi Tõp FakŸltesi Hastanesi
!!
[email protected]
252
TIPTEKNO‘14
25 – 27 Eylül 2014
Perissia Hotel & Convention Center
KAPADOKYA
TIP TEKNOLOJİLERİ ULUSAL KONGRESİ
Fotoelektrik Sinyaller
3. Gün 27 Eylül 2014 Cumartesi (10.45-11.30)
!
Özetçe
İndosiyanin yeşili (ICG), klinikte kalp debisi, karaciğer
fonksiyonu değerlendirilmesi, retina ve koroidal damarlarõn
gšrŸntŸlemesinde kullanõlmakta ayrõca fotodinamik terapide
fotosensitizan ajan olarak deneysel çalõşmalarda tercih
edilmektedir [9,10].
Fotodinamik Terapi (FDT) tümör hücrelerine seçici olarak
sitotoksik etki uygulayan, klinik olarak onaylanmõş, minimal
girişimsel bir tedavi yšntemidir. Bu çalõşmada indosiyanin
yeşili (ICG) tabanlõ FDT’nin meme kanserine karşõ etkisi in
vivo olarak araştõrõlmõştõr. MCF-7 meme kanser hŸcreleri
nude farelere ekilmiş, tŸmšrler 4-5 mm boyutlarõna
eriştiğinde FDT uygulamasõ 24 saat ara ile 4 kere yapõlmõştõr.
Sonuçlar patolojik inceleme yöntemlerden
hematoksilen&eozin ile boyanarak analiz edilmiştir. Elde
edilen sonuçlara gšre, FDT uygulamasõ sonrasõnda %50
oranõnda kŸçŸlme elde edilmiş ve patolojik analizlerde nekroz
dokularõ görülmüştür.
!
!
Bu çalõşmanõn amacõ, gŸnŸmŸzde meme kanseri tedavisi için
klinikte sõklõkla tercih edilen tedavilere alternatif olarak
FDTÕnin indosiyanin yeşili (ICG) tabanlõ olarak in-vivo meme
kanser tŸmšrŸne etkisinin araştõrõlmasõdõr.
2. Materyal ve Metot
2.1. Hücre Kültürü
MCF-7 insan meme kanser hŸcreleri Prof. Dr. Bedia
‚akmakoğluÕnun hediyesidir. HŸcreler %5 karbondioksid
içeren ve 37oC ortamda RPMI 1640 içinde kŸltŸre edildi.
RPMI 1640 %10 ve %20Õlik fetal dana serumu içermektedir.
Bunun dõşõnda 2 µM L-glutamin, 100 µg/ml streptomisin ve
100 u/ml penisilin katõlmõştõr. Hiperisin %0.1'lik
dimethylsulfoxide (DMSO) içinde çšzŸndŸ ve kullanõmdan
hemen šnce kŸltŸr ortamõnda (1-50 µM) dilŸe edildi. HŸcre
sayõmõ 0.01 ml hŸcre sŸspansiyona 0.01 ml tripan mavisi
eklenerek otomatik hŸcre sayõm cihazõnda yapõlmõştõr
(Invitrogen Cell Counting).
Abstract
Photodynamic Therapy (PDT) is selectively cyctotoxic for
tumor cells, minimal invasive and clinical approved
therapeutic procedure. Aim of this study is investigation of
ICG mediated PDT effects on breast cancer formed animal
model. MCF-7 breast cancer cells inoculated to nude mice.
When tumors size arrived 4-5 mm, PDT application applied 4
times with 24 hours intervals. Results evaluated with
hematoxylin&eosin (H&E) staining which is one of the
common pathological examination method. According to
results, after PDT treatment, %50 reduction obtained in tumor
size and tissue necrosis was observed.
!
‚alõşma Boğaziçi †niversitesi Etik Kurulu tarafõndan
2013-01-29 tarihi başvuru olarak kabul edilmiştir ve
onaylanmõştõr.
1. Giriş
2.2. İnokülasyon
Meme kanseri, kadõnlarõnda en yaygõn gšrŸlen ve en çok
šlŸme neden olan kanser tipidir [1-2]. WHO 2014 verilerine
gšre, 235,035 kişiye meme kanseri tanõsõ konmasõ ve 40.430
kişinin meme kanserinden hayatõnõ kaybetmesi beklenmektir
[3]. Meme kanseri, sŸt Ÿreten ya da sŸt taşõyan kanallardaki
hŸcrelerden kšken alarak bu hŸcrelerin kontrolsŸz bŸyŸmesi
ile meydana gelmektedir. Meme kanserlerinin onda birinde
genetik bir bozukluk tespit edilmektedir. Tedavisi stratejisi
olarak cerrahi yšntem, radyoterapi, kemoterapi ve hormon
tedavisi klinikte sõklõkla uygulanan yšntemlerdir [2,4,5].
İnokšlasyondan šnce hayvanlara hormon takviyesi yapõlmõştõr.
1*10^7 MCF-7 hŸcresi flank bšlgesine intraperitonal olarak
enjekte edilmiştir. HŸcreler 100 ul PBS içerisinde
çšzŸlmŸştŸr. Enjeksiyon yapõlan hayvanlar 3 haftalõktõr.
2.3. FDT Uygulamasõ
TŸmšr çapõ 4-5 mmÕye ulaşan hayvanlarda tedaviye
başlanmõştõr. 5 mg/kg ICG intraperitonal olarak uygulanmõştõr.
Tedaviye alõnan hayvanlar ICG enjeksiyonun ardõndan tedavi
tamamlanana kadar karanlõk ortamda tutulmuşlardõr.
Tedavilerden sonra kaliper ile tŸmšr çapõ šlçŸlmŸştŸr.
!
!
FDT yan etkileri minimize edilmiş, minimal girişimsel,
nispeten dŸşŸk maliyetli bir tedaviyšntemidir [6]. FDA
tarafõndan onaylanmõş olan FDT, minimal girişimsel bir
yšntemdir. FDT, azaltõlmõş yan etkileri ve tekrarlanabilir bir
tedavi olmasõ yšnŸyle geleneksel yšntemlere ŸstŸnlŸk gšsterir.
FDT uygulamalarõnõn başarõsõ fotosensitizer tipine ve
konsantrasyonuna, õşõk kaynağõ ve dozuna ve oksijen
konsantrasyonuna bağlõdõr [7].
‚alõşmada 2 tedavi grubu oluşturulmuştur. 1.gruba ICG
enjeksiyondan hemen sonra õşõk uygulamasõ yapõlmõştõr. 2.
gruba ICG enjeksiyonundan 30 dakika sonra õşõk uygulamasõ
yapõlmõştõr. TŸm gruplarda tedavi 24 saat ara ile 4 gŸn tekrarlõ
olarak uygulanmõştõr.
!
!
‚alõşmada 808 nm, CW mod diyot lazer kullanõlmõştõr.
Uygulanan gŸç 250 mW, uygulama sŸresi 20 dakikadõr.
Nude fareler timŸs bezi eksik olmasõ ya da zarar gšrmesi
sonucu doğuştan immŸn sistemi eksik tŸrlerdir. İmmŸn
tepkilerini, sahip olduklarõ çok az sayõda T lenfositleri
sayesinde sağlarlar. KŸrk eksiklği nedeiyle çõplak (nude)
fareler olarak adlandõrõlõrlar. Bu sayede bir çok tŸmšr tŸrŸ
sõnõrlõ bir red cevabõ ile nude farelerde yetiştirilebilir [8].
Yetiştirilen tŸmšrler tedavilerinin ardõndan çeşitli tekniklerle
analiz edilebilmektedir. Patoloji yšntemlerden en yaygõn olanõ
hematoksilen&eozin (H&E) boyamadõr. Temel prensibi, mavimor renk veren hematoksilen ile, pembemsi kõrmõzõ renk veren
eozinÕin hŸcreleri boyamasõdõr. Hematoksilen alkali pHÕda
boyar maddedir ve nŸkleus ile kalsiyum çškŸntŸlerini boyar.
Eozin, sitoplazma, protein birikimi ve amiloid gibi yapõlarõ
boyar [9].
2.4. Patoloji Analizi
4. FDT uygulamasõndan 48 saat sonra tŸmšr dokularõ
çõkartõlmõş ve patolojik analize alõnmõştõr. Dokulara
hematoksilen&eozin boyama yapõlmõştõr.
!
253
TIPTEKNO‘14
25 – 27 Eylül 2014
Perissia Hotel & Convention Center
KAPADOKYA
TIP TEKNOLOJİLERİ ULUSAL KONGRESİ
Fotoelektrik Sinyaller
3. Gün 27 Eylül 2014 Cumartesi (10.45-11.30)
3. Sonuçlar
2 farklõ grupta, toplam 4 hayvana uygulanan Fotodinamik
terapinin her bir uygulama sonunda tŸmšr boyutlarõna etkisi
šlçŸlmŸş ve değişimler xx istatistik yšntemlerine gšre analiz
edilmiştir. Değişim istatistiği grafikte gšsterilmiştir (Şekil1-2).
%
Şekil 3. 1.hayvana ait H&E boyama gšrŸntŸsŸ (x400)
1. hayvandan alõnan numunenin patolojik incelemesinde solda
belirgin a tipi tŸmšr dokusu, sağda nekroz dokusu
gšrŸlmektedir (Şekil 3).
!
!
!
Şekil 1. FDT Uygularõnõn 1. Grubun TŸmšr boyutlarõna etkisi
Birinci gruptaki hayvanlara ICG enjeksiyonun ardõndan
hayvanlara 250 mW gŸçle 20 dakika lazer uygulamasõ
yapõlmõştõr. 1. hayvanda tŸmšr çapõnda %50Õye yakõn oranda
kŸçŸlme kaydedilmiştir. 2.hayvanda tŸmšr çapõnda %50Õden
fazla kŸçŸlme gšrŸlmŸştŸr (Şekil 1).
Şekil 4. 2.hayvana ait H&E boyama gšrŸntŸleri (a.x100,
b.x200)
2. hayvandan alõnan numunenin patolojik incelemesinde sağda
iyi sõnõrlõ malign tŸmšr gšrŸlmŸştŸr. Soldaki fotoğrafta iyi
sõnõrlõ tŸmšr dokusu içinde nekroz gšrŸlmektedir (Şekil 4).
%
!
Şekil 2. FDT Uygularõnõn 2. Grubun TŸmšr boyutlarõna etkisi
İkinci gruptaki hayvanlara ICG enjeksiyonundan 30 dakika
sonra 250 mW gŸçle 20 dakika lazer uygulamasõ yapõlmõştõr.
TŸmšr çapõnda 3. hayvanda %50Õden daha fazla kŸçŸlme elde
edilirken, 4. hayvanda %50Õye yakõn kŸçŸlme elde edilmiştir
(Şekil 2).
Şekil 5.3.hayvana ait H&E boyama gšrŸntŸsŸ (x400)
3. hayvandan alõnan numunenin patolojik incelemesinde
belirgin a tipi gšsteren sõnõrlõ alanda tŸbŸler yapõ oluşturan,
geniş kõsõmda solid tŸmšr dokusu gšrŸlmŸştŸr (Şekil 5).
254
TIPTEKNO‘14
25 – 27 Eylül 2014
Perissia Hotel & Convention Center
KAPADOKYA
TIP TEKNOLOJİLERİ ULUSAL KONGRESİ
Fotoelektrik Sinyaller
3. Gün 27 Eylül 2014 Cumartesi (10.45-11.30)
Teşekkür
Bu çalõşma, TŸbitak 1002 kodlu 113S420 proje numarasõ ile
desteklenmiştir.
5. Kaynakça
1.
J.Ferlay, et al., Cancer Incidence, Mortality, and
Prevalence Worldwide. IARC Cancer Base No. 5,
version 2.0. IARC Press, Lyon, 2002 (2004).
2.
Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the
worldwide incidence of 25 major cancers in 1990.
International Journal of Cancer 1999; 80: 827Ñ41.
4. hayvandan alõnan numunenin patolojik analizinde iyi sõnõrlõ
malign tŸmšr dokusu gšrŸlmektedir. Periferde nekroz dokularõ
gšrŸlmektedir (Şekil 6).
3.
Theakston F. World health statistics 2008. In: Breast
cancer: mortality and screening. France: WHO
Press; 2008.
4. Tartõşma
4.
FDT malignant tŸmšrlerde, tŸmšr boyutunu etkili olarak
azaltan bir tedavi yšntemidir. Fotodinamik terapi geleneksel
yšntemlere kõyasla çeşitli avantaja sahip bir yšntemdir.
Bunlar; minimal girişimsel olmasõ, tekrar edilebilir olmasõ ve
seçici olarak bir bšlgeye uygulanabilmesidir.
Montazerabadi A.ve ark., The effects of combined
treatment with ionizing radiation and indocyanine
green-mediated photodynamic therapy on breast
cancer cells, Journal of Photochemistry and
Photobiology B: Biology 109, 42Ð49, (2012).
5.
Bu çalõşmada, hayvanlarõn tŸmšr boyutlarõ izlenmiş ve tedavi
sonucu patolojik analiz kullanõlarak tŸmšr yapõlarõ
incelenmiştir.
Instõtute, N. C., Radiation Therapy and you. A guide
to self-help during cancer treatment,USA: National
Institutes of Health, 2007.
6.
Saville, M.W., Lietzau, J., Pluda, J.M., Wilson,
W.H., Humphrey, R.W., Feigel, E. and et al.,
Treatment of HIV-associated Kaposi's sarcoma with
paclitaxel, The Lancet, 346(8966): 26Ð8, 1995.
7.
Mamoona A.M., Gamal A.M. and et al., In vitro
efficiency and mechanistic role of indocyanine green
as photodynamic therapy agent for human
melanoma, Photodiagnosis and Photodynamic
Therapy, 6:105-116, 2009.
8.
Sorensen R, Iani V, Moan J. Kinetics of
photobleaching of protoporphyrin IX in the skin of
nude mice exposed to different fluence rates of red
light. Photochem Photobiol 1998;68(6):835Ñ40.
9.
AFIP
Laboratory
Methods
in
Histotechnology.Armed Forses Institute of
Pathology. American Registry of Pathology, March
1992.
10.
El-Daly SM, Gamal-Eldeen AM, Abo-Zeid MAM,
Borai İH, Wafay HA, Abdel-Ghaffar ARB
Photodynamic Therapeutic Activity of Indocyanine
Green Entrapped in Polymeric Nanoparticles.
Photodiagnostic and Photodynamic Therapy
2012;13-26
11.
A. M. Mamoon, A. M. Gamal-Eldeen, M. E. Ruppel,
R. J. Smith, T. Tsang, and L. M. Miller, "In vitro
efficiency and mechanistic role of indocyanine green
as photodynamic therapy agent for human
melanoma,"Photodiagnosis PhotodynTher, vol. 6,
pp. 105-16, Jun 2009.
Şekil 6. 4.hayvana ait H&E boyama görüntüsü(x100)
Intraperitonal olarak 5mg/kg ICG verildikten sonra 0 ve 30.
dakikalarda yapõlan FDT uygulamalarõndan sonra tŸmšr
çaplarõna ait kŸçŸlmeler Şekil 1 ve Şekil 2Õde verilmiştir.
Tedavi tamamlandõktan sonra çõkartõlan tŸmšrlerin patolojik
analizlerine ait gšrŸntŸler Şekil 3, 4, 5 ve 6Õda verilmiştir.
‚alõşma sonucu yapõlan patolojik analize gšre 4 hayvanda da
malign tŸmšr geliştirilmiştir.
ICG verildikten 0 dakika sonra yapõlan uygulamada elde
edilen sonuçlarla, 30 dakika sonra yapõlan uygulamalar
arasõnda anlamlõ bir fark yoktur. Her iki uygulamada da
hayvanlarõn tŸmšr boyutlarõ ortalama %50 oranõnda
kŸçŸlmŸştür.
ICG enjeksiyonun hemen ardõndan FDT uygulamasõna alõnan
1. hayvanõn patolojik analizinde bŸyŸk bir nekroz dokusu
görülmüştŸr. 2. hayvanõn patolojik incelemesinde iyi sõnõrlõ
tŸmšr dokusu gšrŸlŸştür.
ICG enjeksiyondan 30 dakika sonrasõnda başlatõlan FDT
uygulamasõndan ardõndan 3. hayvandan alõnan tŸmšr
dokusunun patolojik analizinde belirgin a tipi iyi sõnõrlõtŸmšr
görülmüştŸr. 4. hayvandan alõnan tŸmšrdokusunun analizinde
periferdeki nekroz dokularõ görülmüştŸr. Nekroz dokularõ
tedavinin kõsmen başarõlõ olduğunu gšstermektedir.
‚alõşmamõzõn šn sonuçlarõna gšre Fotodinamik Terapi 250
mW lazer uygulamasõ ile 5mmÕlik meme kanser modellerinde
kõsmen başarõlõ olmuştur. Parametrelere ait optimizasyon
çalõşmasõ yapõlmaya devam etmektedir.
255