İşlenmiş Eşyaların Etkinlik Stabilite ve Salınım Testleri Antibacterial

İşlenmiş Eşyaların Etkinlik Stabilite
ve Salınım Testleri
How To Design EfficacyTest for
Treated Articles
Doç.Dr. Alper Tunga Akarsubaşı
İTÜ Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
İşlenmiş Eşyayı Anlamak!
• Bir malzeme kendisine zararlı olan
organizmaları kontrol etmek niyetiyle,
biyosidal aktif bir madde ile işlenirse, işlenen
eşya biyosidal ürün olarak kabul edilmez
(dahili etki)
• Bununla birlikte o eşyayı işlemek için
kullanılan aktif madde biyosidal bir ürün
olarak izin gerektirir.
• Ahsap, deri, ve bir çok su bazlı boya gibi
eşyalar bu gruba girer.
• Eğer biyosidal aktif maddenin işlenmiş eşyanın
dışındaki zararlı organizmaları kontrol etmesi
amaçlanmışsa (harici etki)
• Etkinlik testi yapılarak, izin alması gereken
primer bir biyosidal ürün olarak kabul edilir.
• Tekstil ürünleri, plastik malzemeler, taş, yer
kaplama vb.; bu tür işlenmiş eşyalar için örnek
verilebilir.
•
Ref: Regulation (EU) No. 528/2012 of the European Parliament and Council Concerning the Making Available on the Market
and Use of Biocidal Products,
• Tanımlamak neden önemli?
• Avrupa topluluğunda dahi bu tanımın üreticiler
tarafından net olarak algılanamayarak dahili ve
harici etki kavramları oturtulamadığından
özellikle işlenmiş eşyalarda biyosidal ürün
yönetmeliğine uygunluk konusunda belirsizlik
yaşanmaktadır.
• OECD Tanımı:
• Plastik, tekstil veya diğer şekillendirilmiş
materyallerin:
– Kimyasal veya fiziksel yapılarının korunmaları
– Estetik bozunmaların önlenmesi
– Mikrobiyal enfeksiyon riskini minimize etmesi
Amacıyla ön işleme tabi tutulmasına verilen addır.
Örnek: PVC, fungicide ile işlenmiş
PVC yi mikrofungi’den koruyarak
elastikiyetini kaybetmesini önler.
• NEDEN?
– Materyalin korunmasını artırmak için değer eklemek
– Kendini korumasının yanında; yakın çevre veya kontak
halinde biyolojik etki sunması
Örnek: Bulaşık Süngeri
Gıda zehirlenmesinde rolü olan bir bakteriye karşı
antimikrobiyal ajanla işlenmesi
Temel amaç yüzeyleri dezenfekte etmek değil
Ama sünger bu zararlı organizma için rezervuar
olmayacak.
İddia (Claim) Etiket Bilgisi
• ÜRETİCİ:
– İşlenmiş ürün için üreticinin iddiası nedir?
– Ne tip bir reklam yapılmaktadır?
• KULLANICI:
– Son kullanıcı tarafından beklenen servis/fonksiyon
nedir? Ve Biyosidin buradaki yeri nedir?
– Biyosidin kullanımdaki temel amacı nedir?
İddia (Claim) Etiket Bilgisi
• Bilinçli olmak çok önemli
• Örnek1: Duş Perdesi (fungicidal)
– Temel amaç: estetik ve ürünün elastisitesi için
– Fakat insanda fungal büyüme riskini azaltır denirse:
Biyosidal işlenmiş ürüne girer
• Örnek2: Hijyenik/antimikrobiyal kaplamalar
– Antimikrobiyal boya:
• Kutuda koruyucu;
• Aynı zamanda harici (antimikrobiyal) etki olabilir.
Ürün Tipleri
• A-(Porous) Gözenekli Absorban Malzemeler
1.
2.
3.
4.
Doğal, Sentetik ve Karışık dokuma tekstil
Doğal, Sentetik ve Karışık dokusuz tekstil
Kağıt, Tahta Deri vb Doğal polimerler
Gözenekli olmayan malzemelerin absorban hale
getirilmesi (polyethylene sünger, halı vb)
B- (NonPorous) Gözenekli olmayan malzemeler
1. Metal yüzeyler
2. Cam ve seramik
3. Sert /Yarı sert ve esnek polimerler
4. Gözenekli olan ürünün modifikasyonu
C – (Coatings) Kaplamalar, filmler
1. Üretim Sırasında
2. Üretim sonrasında (biofilmler)
3. Geçici antimikrobiyal etki
Ürün İddiaları/Etiket Bilgisi
(Claims)
• Biyosidal Aktivite
– Test mikroorganizmasında geri dönüşümsüz
azalma sağlanması (öldürme)
•
•
•
•
•
•
Bakterisidal
Fungusidal
Sporisidal
Virusidal
Protistisidal
Algisidal
• Biostatik Etki
– Test mikroorganizmasında azalma veya yavaş
büyüme veya seçici etki yaratma
• Bakteriostatik
• Fungistatik
• Algistatik
• Örnek:
• Koku yapmayan tekstil ürünü
(yavaşlatıcı ve/veya seçici etki)
İşlenmiş Eşya Örnekleri
Test Nasıl Olmalıdır?
• İddiayı destekleyen mikroorganizmalarla kontrollü
koşullar altında tekrarlanabilir test
• Mümkünse saha testi
• Mutlaka kontrol kullanılması (treated vs untreated)
• Yaşlandırmanın simulasyonu (UV, fiziksel
yıprandırma, rüzgar tüneli, nem kontrolü vb)
• Fiziksel/Kimyasal/Biyolojik bozunma
– Estetik bozunma, kütle/güç/elastisite kayıbı
– pH, viskozite, renk, hydro-philicity-phobicity,EC
– Mikroorganizma sayısında artış
Test Metodolojisi
• Malzeme çok çeşitli
• Kullanım şartları çok farklı
– Tek tip test yaklaşımı mümkün değil
• Hiyerarşik Yaklaşım (Faz Stratejisi)
1.Faz: İddianın temelinin kanıtlanması
2.Faz: İddianın simulasyonu
3.Faz:Faydanın saha deneyleri ile kanıtlanması
FAZLARIN AÇIKLANMASI
Faz1: Temel iddianın İspatı
(Proof of Principle)
• Aktif maddenin ilgili ortamda; bahsi geçen
mikroorganizmalarla test edilmesi
(Hali hazırda yapmakta olduğumuz testler)
• Örnek:
– Fungusit film boya malzemesinde, materyali koruma
amaçlı: EN 15457
– Bakterisit film boya malzemesinde hijyenik etki
amaçlı: ISO 22196
Faz 2: İddianın Simulasyonu
(Simulation of Claims)
• Kullanım koşullarına uygun ortamda biyosidal
etkinliğin gösterilmesi
• Yaşlanma koşullarının göz önünde tutulması
– Yıkama
– UV
– İklimsel, Kimyasal ve Fiziksel yıpranma koşulları
Faz 2: İddianın Simulasyonu
• Test Dizaynı: önemli her zaman standart yok
• Hangi çevre koşullarında yaşlanma
benzetmesi yapılmalı?
• Gerçek kullanım koşullarının senaryosu nedir?
• Beklenen etki süresi nedir?
– Dış cephe / İç cephe boyasımı?
– Elektrik düğmesi = ıslak ortam?
– Tekstil = kaç yıkama?
– Hastane Tekstili = otoklavlanabiliyormu veya ne
tip sterilizasyon?
Faz 3: Faydanın saha deneyleri ile kanıtlanması
(Demonstration of Benefit)
Sadece Hijyenik Kaplamalar
• Saha Denemeleri
• Modelleme
Kritik Test Parametreleri (OECD Toplantı Raporu
Kritik Test Parametreleri (OECD Toplantı
Raporu
Gözenekli Malzemeler (Tekstil) Metod Örneği:
Gözenekli Olmayan Malzemeler için Metod Örneği:
Gözenekli Olmayan Malzemeler için Metod Örneği:
Kaplama Yüzey Malzemeler için Metod Örneği:
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Test organizmaları minimum inhibe edici konsantrasyon (MIC) test protokolüne göre taze
hazırlanır. Bir bakteri kolonisi 10 ml triptikaz soya sıvı besi yerinde 20 saat, 37 °C’de
inkübe edilir. Ertesi gün santrifüj edilmiş ve OD’si 620 nm’de 0.1 olacak şekilde PBS
içinde tekrar süspanse edilir. % 20’lik sabun bulamacı deiyonize su içerisinde hazırlanır
ve final konsantrasyonu %5-%0.0024 aralığında olacak şekilde 96 kuyulu mikroplakalara ½
oranında seyreltilerek eklenir. Test organizmaları kuyulara hemen eklenmiş ve 24 saat,
37 °C’de inkübe edilir, Ertesi gün sonuçlar mikroplaka okuyucularda OD ölçülerek kayıt
edilir. Deneylerde negatif kontrol olarak bakteri yerine fosfat tampon çözeltisi (PBS)
eklenen, pozitif kontrol olarak bakteri eklenen ama dezenfektan bulamacı eklenmeyen
inkübasyonlar kullanılır.
Test organizmaları:
Staphylococcus aureus ATCC # 6538
E. coli ATCC # 10536
Pseudomonas aeruginosa ATCC # 15442
Enterococcus hirae ATCC # 10541
Short Interval Kill Test (SIKT)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Test organizmaları standart kısa zamanlı biyolojik etkinlik test (SIKT) protokolüne
göre taze
hazırlanır. Bir bakteri kolonisi 10 ml triptikaz soya sıvı besi yerinde 20 saat, 37
°C’de
inkübe edilir. Ertesi gün santrifüj edilmiş ve OD’si 620 nm’de 0.1 olacak şekilde
fosfat
tampon çözeltisi (PBS) içinde tekrar süspanse edilir. Bir test tüpüne 8 gram %7.5’luk
ürün test solüsyonu, 1 ml bakteri süspansiyonu ve 1 ml BSA (0.3 g/L) eklenmiş ve
yavaş bir
şekilde karıştırılır. 1 dk’lık temas süresi sonunda karışım Dey-Engley sıvı besi yeri
ile
nötralize edilip, Letheen sıvı besi yeri ile 10-2-10-5 seyreltmeler hazırlanır.
Başlangıç
bakteri sayısını tespit etmek için aynı işlemler 8 ml deiyonize suya uygulanır.
Yaşayan
bakteri sayısı triptikaz soya katı besi yerine yapılan ekimlerle belirlenir.
Test organizmaları:
Staphylococcus aureus ATCC # 6538
ISO 22196
Plastics — Measurement of
antibacterial activity on plastics surfaces
•
•
•
•
Yüzey baz alınarak gerçekleştirilen bir prosedür.
S. aereus ve E. coli mikroorganizmalarının testini içeriyor.
Numune boyutları 50 mm × 50 mm olmalıdır.
Test organizmalarını içeren test inokulumu petri içine
yerleştirilir ve antibakteriyel ve kontrol numune üzerine
uygulanıp ve üzeri film ile kapatılır. 24 saat sonunda
antibakteriyel özelliği nötralize edici solüsyon (10mL) ile
mikroorganizmalar geri kazanılır. Plate sayım methodunu
uygulamak için, Besiyerlerine dökme plak yöntemi
kullanılarak ekimi gerçekleştirilir. Kontrol ve test
numunesinde geri kazanılan koloni sayılarının farkları
antibakteriyel özelliğin belirlenmesinde kullanılır.
BS EN ISO 20743
Textiles-Determination of
antibacterial activity of antibacterial finished
products
• Standart method 0,40 g kumaş kullanmayı
gerektirmektedir. Methodun önerdiği
mikroorganizmalar Staphylococcus aureus ATCC 6538
ve Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 dır.
• Test organizmalarını içeren ve 1 x105 CFU/ml to 3 x105
CFU/ml ‘e ayarlanmış test inokulumu sıvı besiyeri ve
numunelerle inkübasyona bırakılır. 6lı tekrarlar şekilde
uygulanır (6 kontrol, 6 test numunesi). 24 saat sonunda
nötralize edici solüsyon (20mL) ile muamele edilir.
Plate sayım methodunu uygulamak için, Besiyerlerine
dökme plak yöntemi kullanılarak ekimi gerçekleştirilir.
Kontrol ve test numunesinde geri kazanılan koloni
sayılarının farkları antibakteriyel özelliğin
belirlenmesinde kullanılır.
BS EN 14476 Chemical disinfectants and antiseptics-Virucidal
quantitative suspension test for chemical disinfectants and
antiseptics used in human medicine
• (1)Virüs Solüsyonu, 2)Ürün Test solüsyonu
• Test edilecek Virüsün infekte edebileceği bir hücre hattı kültürü uygun
koşullarda çoğaltılır. Virüsle muamele edilip bir virüs solüsyonu hazırlanır.
• Disinfectan ya da antiseptic idda edilen oranda hazrlanır bu ürün test
solüsyonumuzdur(%80 konsantrasyonda kullanılmalıdır.)
•
• Test Solüsyonu (8ml) ve virüs solüsyonu (1 ml) karıştırlır ve seçilen uygun
sıcaklıkta ve kontak süresi kadar su banyosunda muamele edilir işlem
sonunda bu karışımdan 0,5 ml alınır ve 4,5ml MEM (Minimum Essential
Medium Eagle) + %2 FCS (foetal calf serum) eklenir.
• Sitotoksik etkiden kaçınmak için yukarıda açıklanan karışım, sefadex
içinden geçirilir böylece sitotoksik etki elemine edilir.
• Daha sonra bu karışım tekrar uygun hücre kültürüne eklenir.
• Eğer hücreler virüs infekte oluyorsa disenfektan başarısız demektir.
Compilation of Survey Data for OECD Countries For Project on
Harmonizing Efficacy Test Methods - Treated Articles
HANGİ TEST?
•
•
•
•
Tek doğru yok
Amerikan ASTM
Japon JIS
ISO EN / TSE standartlarında da bulunmaktadır.
• Sonuç olarak işlenmiş eşyanın (treated articles)
biyosidal testleri mümkün olduğunca bağlı olduğu
standarta uygun olarak yapılmalı ve stabilite testinde
şüpheye düşüldüğü an analitik metodun yanı sıra
antimikrobiyal testin tekrarlanması ile sağlaması
yapılmalıdır.
Sonuç
• İşlenmiş Eşya iki grupta değerlendirilir:
– Eşyayı biyolojik bozunmadan koruyan biyosit
– Eşyaya yeni bir fonksiyon ekleyen biyosit
• İddia bilimsel data ile desteklenmeli
• Test metodları iddia ile uyumlu olmalı
– Gerekirse gerçek koşullarda test
• İşlenmiş eşya bir fayda sağlamalı
ÖNERİLER
• Geniş bir ürün yelpazesini kapsayan işlenmiş
ürünlerin, antimikrobiyal etkinlik testleri
• FAZ1:
– Avrupa topluluğu kapsamında çoğu tanımlı ürün için
spesifik ISO EN test başlıkları altında tanımlanmıştır
• FAZ2 :
– Uluslar arası kabul görmüş Test metodu varsa
– Yoksa, en az bir konferansta sunulmuş bildiriye dayalı
test metodu (topluluk önerisi)
• Faz1 e dayalı süreli izin verip gerekli diğer fazların
talep edilmesi
Referanslar
•
•
•
•
•
•
•
İşlenmiş Eşyalarla ilgili sık sorulan sorular ve cevaplar:
chemicalwatch.com/downloads/CA-Dec12-Doc.5.1.pdf
OECD ninbu konudaki kapsamlı ve diğer çalışmalara baz oluşturan ortak
toplantı raporu ENV/JM/MONO(2007)4
İsveç Kimya Ajansı PM2_12_Biocide_treated_articles
İsveç Kimya Ajansı PM10-12-Biocide-treated-articles
İsviçre Halk Sağlığı Kurumu 090130_Biozide+Produktarten_e
PAN Almanya biocide-treated_consumer_products
EU ECHA 11_bshd_bernsel_treated_articles_en
TEŞEKKÜRLER
Faz2 Örnek
•
•
•
•
•
Klozet Kapağı
İddia: enfeksiyoz yayılımı engeller,
Salmonella, Norovirus gibi
LAB Test dizayn edildiğinde:
Yaklaşık 2-5 yıllık servis süresini simule edecek
yıkama döngüleri
• Ortalama insan kontak zamanı (2-5 dk)
• Genelde kuru ve nemli döngüler
• Ortalama ortam sıcaklığı (22 °C ± 2 °C )