Monolisa HBe Ag-Ab PLUS - Bio-Rad

Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS
2 plaka 192
96 HBe Ag - 96
72396
HBe Ab
HBe Antijenleri İle Anti-HBe Antikorlarini İmmünoenzimatik Yöntemle Algilama Kiti
883599 - 2014/01
İÇİNDEKİLER
1.TESTİN AMACI
2.KLİNİK ÖNEMİ
3.TEST PRENSİBİ
4.KİTİN İÇİNDEKİLER
5.GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN DONANIM
6.ÖNLEMLER
7.HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI
8.REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI
9.SAKLAMA - GEÇERLİLİK
10.NUMUNELER
11.ÇALIŞMA ŞARTLARI
12.HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ
13.REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ
14.PERFORMANSLAR
15.KAYNAKÇA
2 [TR]
1 - TESTİN AMACI
Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS insan serumu veya plazmasında mevcut hepatit B virüsü e
antijeninin (Ag HBe) ve/veya hepatit B virüsü e antijenine yönelik antikorların (Anti-HBe)
immünoenzimatik teknikle kalitatif olarak belirlenmesini sağlar.
2 - KLİNİK ÖNEMİ
HBe antijeninin varlığı genellikle aktif viral çoğalma şeklinde açığa çıkar ve deneğin
bulaşıcı olduğu anlamına gelir. HBe antijeni B tipi bir viral hepatitte erken ortaya çıkar ve
(bir aydan daha uzun süre) kalması hepatopatinin ağırlaşması riskini ifade eder. HBe
antijenine karşı antikorların ortaya çıkması viral çoğalmada düşüş olduğu gösterir ve
genellikle hastalığın ilerleyişi ile ilgili olumlu bir klinik tahmini temsil eder).
3 - TEST PRENSİBİ
a) HBe antijeninin algılanması
Ag HBe antijeninin algılanması iki zamanlı “sandviç” tipi immünoenzimatik bir tekniğe
dayanır; bu teknik bir insan Anti-HBe antikoru ve farklı epitopları tanıyan murin kaynaklı
(Acm1 ve Acm2) işaretlenmiş bir çift monoklonal Anti-HBe antikoru kullanır.
Solid faz, insan Anti-HBe antikorları ile duyarlılaştırılmış 8 polistiren kaptan oluşan 12
şeritten oluşmaktadır.
İki monoklonal antikor peroksidaz ile birleştirilmiştir.
Dozaj aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir:
1.Solid faza sabitlenen ilk insan Anti-HBe antikoru mevcut iken gerçekleştirilen numune ve
kontrol inkübasyonu.
2.Yıkama, ardından peroksidaz ile işaretlenmiş monoklonal antikor çifti ile çözünmez
kılınmış komplekslerin inkübasyona tabi tutulması.
3.Yıkama yoluyla, serbest kalan konjugatın elimine edilmesi, ardından substrat ilavesi ile
solid faza bağlı enzimatik faaliyetin develope edilmesi.
4.Developmanın durdurulması; ardından, 450/620 nm'de optik yoğunlukların okunması ve
sonuçların yorumlanması.
b) Anti-HBe antikorlarının algılanması
Anti-HBe antikorlarının algılanması için, kit Anti HBe için kullanılan solid fazın aynısını
kullanır. Test, nötrleştirme reaktifi olarak kullanılan plazma kökenli sınırlı miktardaki HBe
antijeni karşısında, çözünmez kılınmış antikor ile numunede mevcut antikor arasında
gerçekleşen kompetisyon prensibine dayanmaktadır. Developman daha sonra, peroksidaz
ile işaretlenmiş başka bir çift monoklonal antikor karışımı (Acm1 ve Acm2) yardımıyla
gerçekleştirilir.
Test aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir:
1. Solid faza sabitlenen ilk insan Anti-HBe antikoru ve nötrleştirme antijeni mevcut iken
gerçekleştirilen numune ve kontrol inkübasyonu.
2. Yıkama, ardından peroksidaz ile işaretlenmiş monoklonal antikor çifti ile çözünmez
kılınmış komplekslerin inkübasyona tabi tutulması.
3. Yıkama yoluyla, serbest kalan konjugatın elimine edilmesi, ardından substrat ilavesi ile
solid faza bağlı enzimatik faaliyetin develope edilmesi.
4. Developmanın durdurulması; ardından, 450/620 nm'de optik yoğunlukların okunması ve
sonuçların yorumlanması.
3 [TR]
4 - KİTİN İÇİNDEKİLER
Tüm reaktifler "in-vitro" teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir
Reaktifler 1 ila 12 bağımsız işlem şeklinde 2 x 96 ölçüm gerçekleştirmek için yeterli
miktarda verilmiştir:
• yani 96 Ag HBe ölçümü ve 96 Ac HBe ölçümü
• ya da eşzamanlı olarak 2 x 48 Ag HBe ölçümü ve 2 x 48 Anti-HBe ölçümü.
Etiketleme
Reaktiflerin Niteliği
Mikroplaka
Etkisiz hale getirilmiş, Ag HBs açısından pozitif
serumlardan elde edilen insan Anti-HBe antikorları ile
duyarlı kılınmış 8 kaptan oluşan 12 şerit
R2 Concentrated
Konsantre yikama solüsyonu (20X)
washing solution
NaCl pH 7,4 Tris Tamponu
(20X)
Koruyucu: ProClin™ 300 (%0,04)
R3 Negative control
Negatif Kontrol
(Ag HBe/Anti-HBe testleri için ortak) Anti-HIV1 ve anti-HIV
2 antikorları, HBs antijeni ve anti-HCV antikorları
açısından negatif insan serumu
Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid
R4 HBe Ab positive
Anti-HBe testi pozitif kontrolü
control
Anti-HBe antikorları içeren
ve potansiyel olarak AgHBs açısından pozitif, anti-HIV1
antikorları ve anti-HIV2 ve anti-HCV antikorları açısından
negatif, etkisiz hale getirilmiş insan serumu
Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid
R5 HBe Ag positive
Ag HBe testi pozitif kontrolü
control
Fibrinsiz insan plazması veya Ag HBe ve Ag HBs
açısından pozitif, anti-HIV1, anti-HIV2 antikorları ve antiHCV antikorları açısından negatif serum içeren, etkisiz
hale getirilmiş sentetik sulandırıcı
Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid
R6 Neutralizing HBe Ag Nötrleştirme antijeni
Fibrinsiz insan plazması veya Ag HBe ve Ag HBs
açısından pozitif, anti-HIV1, anti-HIV2 antikorları ve antiHCV antikorları açısından negatif serum içeren, etkisiz
hale getirilmiş sentetik sulandırıcı
Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid
R7a Concentrated anti
5X konsantre, Anti-HBe test konjugati
HBe conjugate
Peroksidaz ile bağlantılı 2 adet Anti-HBe monoklonal
murin antikoru (Acm1 ve Acm2)*
Koruyucu: ProClin™ 300 (%0,5)
R7b Concentrated Ag
5X konsantre, Ag HBe test konjugati
HBe conjugate
Peroksidaz ile bağlantılı 2 adet Anti-HBe monoklonal
murin antikoru (Acm1 ve Acm2)*
Koruyucu: ProClin™ 300 (%0,5)
R8 Substrate buffer
Peroksidaz substrat tamponu
% 0,015 H2O22 ve % 4 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren
sitrik asit ve sodyum asetat pH 4,0 solüsyonu
R9 Chromogen: TMB
Kromojen
solution (11X)
Tetrametil benzidin (TMB) içeren pembe renkli solüsyon
R10 Stopping solution
Durdurma solüsyonu
1 N sülfürik asit solüsyonu
Sulandirilmiş R2 için boş şişe
Sunum
72396
R1 Microplate
2 plaka
1 şişe
235 ml
1 şişe
8 ml
1 şişe
1,5 ml
1 şişe
1,5 ml
1 şişe
8 ml
1 şişe
3 ml
1 şişe
3 ml
1 şişe
60 ml
1 şişe
5 ml
1 şişe
28 ml
1 şişe
25 ml
4 [TR]
* acm1/acm2 oranları R7a ve R7b konjugatlarından her biri için farklıdır. Bu iki konjugatı birbirinin
yerine kullanmayın.
5 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER
• Damıtık veya tamamen demineralize su.
• Çamaşır suyu veya sodyum bikarbonat.
• Emici kâğıt.
• Tek kullanımlık eldivenler.
• Tek kullanımlık (12 x 75 mm) polistiren borular.
• 50 µl, 100 µl, 200 µl ve 1 ml'lik hacimler dağıtabilen ayarlanabilir veya sabit, otomatik
veya yarı otomatik pipetler
• 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1.000 ml dereceli deney tüpleri
• Vorteks tipi çalkalayıcı
• Kontamine atık konteyneri
• Mikroplakalar* için otomatik, yarı otomatik veya manüel yıkama sistemi
• 37°C ± 1 °C* termostatlı benmari veya kuru inkübatör
• 450 nm ve 620 nm* filtrelerle donatılmış, mikroplaka okuma cihazı
(*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek için
bize danışınız.
6 - ÖNLEMLER
Elde edilecek sonuçların kalitesi aşağıdaki laboratuar uygulamalarına tam olarak
uyulmasına bağlıdır:
• Aynı deney sırasında farklı partilere ait reaktifleri birbirine karıştırmayın.
NOT: Aynı deney boyunca hep aynı partiyi kullanmak kaydıyla, kitte teslim edilenlerden
farklı yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2), substrat
tamponu (mavi TMB buf. ibaresi ile tanıtılan, R8), kromojen (menekşe rengi TMB 11X.
ibaresi ile tanıtılan, R9) ve durdurma solüsyonu (kırmızı 1N ibaresi ile tanıtılan, R10)
partileri kullanmak mümkündür. Bu reaktifler şirketimizin diğer ürünleri ile birlikte
kullanılabilir. Ayrıca, belli bir deneyde bir tek karışımın kullanılması kaydıyla, yıkama
solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2) düzgün bir şekilde
yeniden oluşturulan farklı Bio-Rad reaktif kitlerine dahil edilmiş diğer iki yıkama
solüsyonundan biri ile (etiketin üzerindeki mavi bir 10X veya turuncu bir 10X ibaresi ile
tanıtılan, R2) karıştırılabilir. Ayrıntılı bilgi edinmek için teknik servislerimizle irtibat
kurunuz.
• Test ismi ve test özel tanıtım numarası her mikroplaka çerçevesinin üzerinde belirtilmiştir.
Bu özel tanıtım numarası her şeridin üzerinde de yer alır.
Monolisa™ HBe Ag-Ab PLUS: Özel Tanıtım Numarası = 56.
Bu tanıtım numarası her kullanımdan önce kontrol edilmelidir. Test numarası
bulunmayan veya yukarıda bahsi geçen test numarasından farklı olan hiçbir şerit,
kullanılmamalıdır.
• Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın.
• Kullanımdan önce, reaktiflerin ortam sıcaklığında (18-30°) dengelenmesi için, 30 dakika
ve sulandırılmış yıkama solüsyonu (R2) için bir saat bekleyin.
• Her türlü kontaminasyonu önleyerek, reaktifleri özenle tekrar oluşturun
• Konjugatların enzimatik faaliyetini bozabilecek reaktif buharlar (asitler, alkaliler, aldehitler)
veya tozlar mevcut iken test yapmayın.
• Damıtık su ile mükemmel bir şekilde yıkanmış cam aletler veya tercihen tek kullanımlık
donanım kullanın.
• Yıkama işleminin sonu ile reaktiflerin dağıtımı arasında geçen sürede mikroplakanın
kurumasına izin vermeyin.
• Her serum için yeni bir dağıtım konisi kullanın.
5 [TR]
• Kapların yıkanması, yapılan işlemler açısından önemli bir aşama teşkil eder: tavsiye
edilen yıkama döngüleri sayısına uyun ve tüm kapların tamamen doldurulup, ardından
tamamen boşaltılmasına özen gösterin. Kötü bir yıkama işlemi yanlış sonuçlar elde
edilmesine yol açar.
• Konjugatı ve developman solüsyonunu dağıtmak için asla aynı kabı kullanmayın.
• Pipetlerin doğruluğunu ve hassasiyetini ve kullanılan cihazların düzgün çalıştığını konrol
edin.
• İşlem protokolünü değiştirmeyin.
• Enzimatik developman solüsyonunu dağıtmadan önce kontrol edin. Bu solüsyon pembe
renkte olmalıdır. Solüsyonun rengi mavimsi ise, developman solüsyonu bozulmuştur ve
testte kullanılamaz.
7 - HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI
Çantadaki tüm reaktifler "in vitro" teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir.
• Reaktifler ve numuneleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin ve söz konusu
maddeleri kullandıktan sonra ellerinizi özenle yıkayın.
• "Ağzınızla pipetlemeyin".
• R3 reaktifinin (negatif kontrol) hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme,
Hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs), HIV virüslerine yönelik (HIV-1 ve HIV-2)
antikorlar ve Hepatit C (anti-HCV) virüsüne yönelik antikorlar açısından kontrol edilmiş ve
reaktif olmadığı belirlenmiştir.
• R1 reaktifinin (duyarlı kılınmış plaka) hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme
HIV virüslerine yönelik antikorlar (anti¬HIV-1 ve anti-HIV-2) ve hepatit C virüsüne (HCV)
yönelik antikorlar açısından kontrol edilmiş ve reaktif olmadığı belirlenmiştir. Bu malzeme
hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs) açısından reaktiftir. Muhtemelen fotokimyasal
olarak etkisiz hale getirilmiştir.
• R4 (Anti¬HBe testi pozitif kontrolü), R5 (Ag HBe testi pozitif kontrolü) et R6 (nötrleştirme
antijeni) reaktiflerinin hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme, HIV virüslerine
yönelik antikorlar (anti-HIV-1 et anti¬HIV-2) ve anti-HCV antikorları açısından kontrol
edilmiş ve reaktif olmadığı belirlenmiştir. R5 ve R6 reaktifleri hepatit B virüsü yüzey
antijeni (Ag HBs) açısından pozitiftir; R4 reaktifi hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs)
açısından potansiyel olarak pozitiftir. Bu reaktifler fotokimyasal olarak etkisiz hale
getirilmiştir.
• Hiçbir yöntem HIV, HBV, HCV virüslerinin veya diğer bulaşıcı ajanların bir ortamda
bulunmadığını kesin bir şekilde garanti edemediği için, insan kaynaklı reaktifleri ve hasta
numunelerini potansiyel olarak bulaşıcı malzeme addedin ve olağan önlemler ile kullanın.
• Numuneler ve insan kaynaklı reaktifler ile doğrudan temas eden malzemeyi ve ayrıca
yıkama solüsyonlarını kontamine ürünler addedin.
• Numunelerin veya bunları içeren solüsyonların sıçramasına engel olun.
• Kirlenen yüzeyler % 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile temizlenecektir. Bulaşan sıvı bir
asit ise, kirlenen yüzeyler önceden sodyum bikarbonat ile nötrleştirilecek, ardından
çamaşır suyu ile temizlenecek ve emici kâğıt ile kurutulacaktır. Temizleme işleminde
kullanılan malzeme kontamine atıklar için öngörülmüş özel bir konteynere atılmalıdır.
• İnsan kaynaklı numuneler ve reaktifler ve kontamine malzeme ve ürünler, bulaşıcı
özellikleri giderildikten sonra atılacaktır:
- Bu işlem, ya % 5 sodyum hipoklorit son konsantrasyonlu çamaşır suyuna (10 hacim
kontamine sıvı veya su için, 1 hacim çamaşır suyu) 30 dakika boyunca batırılarak,
- Ya da minimum 2 saat boyunca 121°C'de otoklavlama vasıtasıyla gerçekleştirilir.
Otoklavlama, HIV ve HBV virüslerini etkisiz hale getirmek için en iyi yöntemdir.
DİKKAT: SODYUM HİPOKLORİT İÇEREN SOLÜSYONLARI OTOKLAVIN İÇİNE
SOKMAYIN.
6 [TR]
• Solüsyonları veya yıkama atık sıvılarını veya biyolojik numuneler içeren herhangi bir
sıvıyı lavaboya atmadan önce, nötrleştirmeyi ve/veya otoklavlamayı unutmayın.
• Güvenlik verileri fişi talep üzerine verilmektedir.
• Kimyasal ürünler doğru laboratuar uygulamalarına göre kullanılmalı ve atılmalıdır.
• Substrat tamponunun, kromojenin ve durdurma solüsyonunun cilt ve mukozalar ile hiçbir
şekilde temas etmesine izin vermeyin (toksisite, tahriş veya yanık riski).
• Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma
yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım
talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası
www.bio-rad.com adresinde bulunabilir.
8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI
Not: Kullanımdan önce, reaktiflerin ortam sıcaklığında (18-30°C) dengelenmesini
sağlayın.
Mikroplaka (R1)
12 şerit içeren her taşıyıcı çerçeve kapalı alüminyum poşet içine konulmuştur. Poşeti
makas veya bıçak ile birleşme noktasının 0,5 ila 1 cm üzerinde kesin. Poşeti açın ve
çerçeveyi poşetten çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar poşetin içine yerleştirin. Poşeti
özenle kapatın ve yeniden +2-8°C sıcaklıkta muhafaza edin.
Konsantre yıkama solüsyonu (20X): R2
Solüsyonu damıtık su ile 20 kez sulandırın. Bu şekilde, kullanıma hazır yıkama solüsyonu
elde edilir. Bir şerit için 75 ml kullanıma hazır solüsyon gerekir. Homojenleştirin.
KONJUGATLAR
Anti -HBe Test Konjugatı (R7a)
Kullanılan şerit sayısına göre, R7a solüsyonunu önceden sulandırılmış olan R2
solüsyonunda 1/5 oranında sulandırın:
Kullanılan şerit sayısı
R7a solüsyon hacmi (ml) R2 ile sulandırılmış miktar
1
0,2
1
2
0,4
2
3
0,6
3
4
0,8
4
5
1
5
6
1,2
6
7
1,4
7
8
1,6
8
9
1,8
9
10
2
10
11
2,2
11
12
2,4
12
Homojenleştirin.
Konjugat sırasıyla, kullanıma hazır 80 µl sulandırılmış R2, ardından 20 µl 5X konjugat ilave
edilerek, önceden sulandırılmadan da kullanılabilir. Çalkalayın.
Ag HBe Test Konjugatı (R7b)
R7a konjugatı için kullanılan protokolün aynısını kullanın.
7 [TR]
Enzimatik developman solüsyonu (R8 + R9)
1/11 oranında sulandırmaya dikkat ederek, reaktif R9'u reaktif R8'e karıştırın (10 hacim R8
içinde, 1 hacim R9). Homojenleştirin.
1 ila 10 şerit için, 10 ml gerekli ve yeterlidir.
9 - SAKLAMA - SON KULLANMA TARİHİ
Kit +2-8°C sıcaklıkta saklanmalıdır. +2-8°C sıcaklıkta saklanan kitteki her unsur kutunun
üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir (özel bir uyarı bulunmadığı
takdirde).
R1: Vakumlu poşetin açılmasından sonra, +2-8°C sıcaklıkta muhafaza edilen ve özenle
kapatılan orijinal ambalajlarındaki şeritler 1 ay dayanabilir.
R2: Sulandırılmış yıkama solüsyonu +2-30°C sıcaklıkta 2 hafta saklanabilir. Konsantre
yıkama solüsyonu (R2) +2- 30°C sıcaklıkta muhafaza edilebilir.
R7a: Anti-HBe testinin sulandırılmış konjugatı ortam sıcaklığında (18-30°C) 8 saat
saklanabilir. Sulandırılmış konjugat ışık almayan bir yerde, ortam sıcaklığında (18-30°C)
saklanmalıdır.
R7b: Ag-HBe testinin sulandırılmış konjugatı ortam sıcaklığında (18-30°C) 8 saat
saklanabilir. Sulandırılmış konjugat ışık almayan bir yerde, ortam sıcaklığında (18-30°C)
saklanmalıdır.
R8 + R9: Yeniden oluşturulduktan sonra, karanlıkta saklanan reaktifler ortam sıcaklığında
(18-30°C) 6 saat boyunca kullanılabilir.
10 - NUMUNELER
Olağan uygulama yöntemleriyle bir kan numunesi alın.
Testler sulandırılmamış serum veya plazma numuneleri üzerinde yapılacaktır (numuneler
EDTA, heparin, sitrat gibi antikoagülanlar ile alınır).
Çok belirgin bir hemoliz test performanslarını etkileyebilir. Agrega içeren numuneler testten
önce santrifugasyon ile arıtılmalıdır. Süspansiyon halindeki partiküller veya fibrin
agregaları yanlış pozitif sonuçlar elde edilmesine yol açabilir.
Tarama 7 gün içinde yapılır ise, numuneler +2-8°C sıcaklıkta saklanacaktır veya -20°C
sıcaklıkta dondurulmuş olarak birkaç ay saklanabilecektir.
Örnekleri ısıtmak etmeyin.
Dondurma/Çözdürme işlemlerini tekrarlamaktan kaçının. 3 defadan fazla dondurulan ve
çözdürülen numuneler kullanılmamalıdır.
Eğer numuneler taşınacak ise, bunları etyolojik ajanların taşınması ile ilgili yürürlükteki
mevzuata uygun şekilde ambalajlayın ve tercihen dondurulmuş olarak taşıyın.
KONTAMİNE VEYA HİPERLİPEMİK VEYA HİPERHEMOLİZE TABİ TUTULMUŞ VEYA
HİPERPROTEİNLİ SERUMLAR KULLANMAYIN
NOT: 100 mg/l'ye kadar bilirubin içeren numunelerde ve ayrıca 36 gr/l'ye kadar triolein
içeren lipemik numunelerde ve 2,5 mg/ml'ye kadar hemoglobin içeren hemolizli
numunelerde hiçbir etkileşim ispatlanamamıştır. 45 mg/ml albumin ile aşırı yükleme
yapılmış negatif numunelerde, oranlarda hiperproteinemiyi takit eden bir azalma
gözlemlenmiştir.
11 - ÇALIŞMA ŞARTLARI
Ag HBe ve Anti-HBe testleri aynı plaka üzerinde yapılabilir. Bu durumda, size aşağıdakileri
tavsiye ediyoruz:
• Anti-HBe testi: Sütun 1 ila 6
• Ag HBe testi: Sütun 7 ila 12
Yıkama için, asgari hacim, yıkama ve hazne başına 0,55 ml'dir.
8 [TR]
a) Anti-HBe test protokolü
1. Yıkama solüsyonunu hazırlayın.
2. Taşıyıcı çerçeve ile gerekli sayıda şeridi koruyucu ambalajdan çıkarın. Kullanılmayan
şeritleri tekrar ambalajın içine yerleştirin ve ambalajı kapatın.
3. Kaplara art arda aşağıdaki malzemeleri dağıtın (önerilen plaka planı):
• A1, B1, C1:100 µl negatif kontrol (R3)
• D1:100 µl pozitif kontrol (R4)
• E1, F1, G1:100 µl bilinmeyen numune.
Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir.
Not: Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net
bir renk farkı görülebilir. 490 nm'de fotometrik ölçüm yapılarak kaplarda numune olup
olmadığı kontrol edilebilir (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
4. Her kaba hızlı bir şekilde 50 µl nötrleştirici antijen (R6) ilave edin. Homojenleştirin.
Üstünü yapışkan bir filmle örtün; 37°C ± 1°C sıcaklıkta 3 saat ± 10 dakika inkübe edin.
Not: Görsel olarak, nötrleştirici antijen R6'nın ilave edilmesinden sonra pembe bir renk
gözlemlenebilir. 490 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kaplarda nötrleştirici antijen
R6 bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
5. R7a konjugat solüsyonunu ilk inkübasyon sona ermeden önce hazırlayın.
6. Yapışkan filmi çıkarın; her kabın içeriğini çekerek atık konteynerine boşaltın, ardından
dört kez yıkayın.
7. Önceden sulandırılmış 100 µl R7a konjugat solüsyonunu hızlı bir şekilde her kaba
dağıtın (bkz. bölüm 8: REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI) veya, konjugat
önceden sulandırılmadan da kullanılabileceğinden, her kaba sırasıyla, 80µl
sulandırılmış R2, ardından 20µl R7a konjugatı ilave edin. Homojenleştirin.
Üstünü yapışkan bir filmle örtün ve 37°C ± 1 °C sıcaklıkta 30 dakika (minimum 25
dakika, maksimum 40 dakika) inkübe edin. Yapışkan filmi çıkarın; her kabın içeriğini
çekerek atık konteynerine boşaltın, ardından beş kez yıkayın.
Not: Görsel olarak, konjugat R7a'nın ilave edilmesinden sonra mor bir renk
gözlemlenebilir. 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kaplarda konjugat R7a
bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
8. Enzimatik developman solüsyonunu (R8 + R9) hazırlayın
9. Her kaba hızlı bir şekilde 80 µl developman solüsyonu ilave edin ve plakayı 30 dakika ±
5 dakika karanlıkta ve ortam sıcaklığında (+18-30°C) tutun.
Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu
aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir kap ile pembemsi renkteki
developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır (otomatik
kontrol için paragraf 13'e başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
10.Her kaba hızlı bir şekilde 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin.
Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel
olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif
numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale
gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için)
kaplardan kaybolur.
11.Okuma yapmadan önce 4 dak. bekleyin. Plakanın altını özenle silin ve reaksiyonun
sona ermesini müteakip 30 dakika içerisinde 450/620 nm'de optik yoğunluğu okuyun.
9 [TR]
b) Ag HBe test protokolü
1. Yıkama solüsyonunu hazırlayın.
2. Taşıyıcı çerçeve ile gerekli sayıda şeridi koruyucu ambalajdan çıkarın. Kullanılmayan
şeritleri tekrar ambalajın içine yerleştirin ve ambalajı kapatın.
3. Kaplara art arda aşağıdaki malzemeleri dağıtın (önerilen plaka planı):
• A1, B1, C1:100 µl negatif kontrol (R3)
• D1:100 µl pozitif kontrol (R5)
• E1, F1, G1:100 µl bilinmeyen numune
Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir.
Not: Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net
bir renk farkı görülebilir. 490 nm'de fotometrik ölçüm yapılarak kaplarda numune olup
olmadığı kontrol edilebilir (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
4. Üstünü yapışkan bir filmle örtün; 37°C ± 1°C sıcaklıkta 3 saat ± 10 dakika inkübe edin.
5. R7b konjugat solüsyonunu ilk inkübasyon sona ermeden önce hazırlayın.
6. Yapışkan filmi çıkarın; her kabın içeriğini çekerek atık konteynerine boşaltın, ardından
dört kez yıkayın.
7. Önceden sulandırılmış 100 µl R7b konjugat solüsyonunu hızlı bir şekilde her kaba
dağıtın (bkz. bölüm 8: REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI) veya konjugat
önceden sulandırılmadan da kullanılabileceğinden, her kaba sırasıyla, 80 µl
sulandırılmış R2, ardından 20 µl R7b konjugatı ilave edin. Homojenleştirin.
Üstünü yapışkan bir filmle örtün ve 37°C ± 1°C sıcaklıkta 30 dakika (minimum 25
dakika, maksimum 40 dakika) inkübe edin. Filmi çıkarın; her kabın içeriğini atık
konteynerine boşaltın, ardından beş kez yıkayın.
Not: Görsel olarak, konjugat R7b'nin ilave edilmesinden sonra turkuaz mavisi bir renk
gözlemlenebilir. 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kaplarda konjugat R7b
bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
8. Enzimatik developman solüsyonunu (R8 + R9) hazırlayın
9. Her kaba hızlı bir şekilde 80 µl developman solüsyonu ilave edin ve plakayı 30 dakika ±
5 dakika karanlıkta ve ortam sıcaklığında (+18 - 30°C) tutun.
Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu
aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir kap ile pembemsi renkteki
developman solüsyonunu içeren kap arasında önemli bir renk farkı vardır. (otomatik
kontrol için paragraf 13'e başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN
SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ).
10.Her kaba hızlı bir şekilde 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin.
Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel
olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif
numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale
gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için)
kaplardan kaybolur.
11.Okuma yapmadan önce 4 dak. bekleyin. Plakanın altını özenle silin ve reaksiyonun
sona ermesini müteakip 30 dakika içerisinde 450/620 nm'de optik yoğunluğu okuyun.
c) Aynı plaka üzerinde Anti-HBe ve Ag HBe test protokolü
Protokoller daha önce tanımlananlar ile tamamen aynıdır. Sadece plaka üzerindeki diziliş
düzeni farklıdır.
• Anti-HBe testi: Sütun 1 ila 6
• Ag HBe testi: Sütun 7 ila 12
10 [TR]
12 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN YORUMLANMASI
a) Anti-HBe testi
1. Negatif kontrollerin ortalama optik yoğunluğunu hesaplayın: R3 OPTİK
YOĞUNLUĞU
Örnek:
Negatif Kontrol R3
OPTİK YOĞUNLUK
1
1,607
2
1,410
3
1,552
Toplam =
4,569
Ortalama R3 Optik Yoğunluğu = 4,569 / 3 = 1,523
Optik Yoğunluk değeri ortalamadan %25 sapma gösterdiğinde, bir negatif kontrolün
değerini elimine etmek mümkündür.
Bu durumda, ortalamayı diğer iki değer üzerinden hesaplayın.
2. Eşik değerin hesaplanması
Her plaka için, eşik değer:
Eşik değer = VS = R3 OPTİK YOĞUNLUĞU x 0,4
Örnek:
R3 OPTİK YOĞUNLUĞU= 1,523
VS= 1,523 x 0,4 = 0,609
3. Anti-HBe testinin onaylanması
R3 OPTİK YOĞUNLUĞU > 0,900
R4 OPTİK YOĞUNLUĞU < 0,150
4.Oranların hesaplanması
Her numune için oranı hesaplayın:
Oran= Numune Optik Yoğunluk Değeri/VS
5. Sonuçların Yorumlanması
Oranı 0,9 değerine eşit veya bu değerin altında olan tüm numuneler pozitif kabul edilir
(oran ≤ 0,9).
Oranı 1,1 değerinin üzerinde olan tüm numuneler negatif kabul edilir (oran > 1,1). 0,9 ile
1,1 arasındaki oranlar için (0,9 < oran ≤ 1,1), daha sonra alınacak bir numunede tekrar anti
HBe araştırması yapılması tavsiye edilir.
Pozitif numunelerin çift olarak tekrar teste tabi tutulması tavsiye edilir. Testin
tekrarlanmasından sonra, 2 çiftten en az birinin değeri pozitif ise, numune pozitif addedilir.
b) Ag HBe testi
1.Negatif kontrollerin ortalama optik yoğunluğunu hesaplayın: R3 OPTİK YOĞUNLUĞU
Örnek:
Negatif Kontrol R3OPTİK YOĞUNLUK
1
0,023
2
0,022
3
0,026
Toplam =
0,071
Ortalama R3 OPTİK YOĞUNLUĞU= 0,071 / 3 = 0,024
OPTİK YOĞUNLUK değeri ortalamadan %25 sapma gösterdiğinde, bir negatif kontrolün
değerini elimine etmek mümkündür.
Bu durumda, ortalamayı diğer iki değer üzerinden hesaplayın.
11 [TR]
2. Eşik değerin hesaplanması
Her plaka için, eşik değer:
Eşik değer = VS = R3 OPTİK YOĞUNLUĞU + 0,025
Örnek:
R3 OPTİK YOĞUNLUĞU= 0,024
Adım= 0,025
VS= 0,024+ 0,025 = 0,049
3. Ag HBe testinin onaylanması
R3 OPTİK YOĞUNLUĞU < 0,060
R5 OPTİK YOĞUNLUĞU > 0,800
4. Oranların hesaplanması
Her numune için oranı hesaplayın:
Numune Opt. Yoğ.
Oran = -------------------------VS
5. Sonuçların Yorumlanması
Oranı 1 değerinin altında olan tüm numuneler negatif kabul edilir (oran < 1).
Oranı 1 değerine eşit veya bu değerin üstünde olan tüm numuneler pozitif kabul edilir
(oran ≥ 1). Pozitif numunelerin çift olarak tekrar teste tabi tutulması tavsiye edilir. Testin
tekrarlanmasından sonra, iki çiftten en az birinin değeri pozitif ise, numune pozitif addedilir.
13 - REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ
1 - Anti-HBe testi
Numune ve kontrol ilavesinin kontrol edilmesi
Kaplarda numune ve kontrol bulunup bulunmadığı 490 nm'de yapılacak fotometri ölçümü
ile kontrol edilebilir.
OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,050'nin üzerinde olmalıdır.
Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net bir renk
farkı gözlemlenebilir.
Nötrleştirme Ag ilavesinin (R6) kontrol edilmesi
Kaplarda R6 bulunup bulunmadığı, 490 nm'de yapılan bir okuma vasıtasıyla, OPTİK
YOĞUNLUK delta değerinin hesaplanması ile kontrol edilebilir.
OPTİK YOĞUNLUK Delta Değeri = (numune (veya kontrol) ve nötrleştirici antijen R6
mevcut iken 490 nm'de kabın OY değeri) – (sadece numune (veya kontrol) mevcut iken
490 nm'de kabın OY değeri).
OPTİK YOĞUNLUK farkı 0,150'nin üzerinde olmalıdır.
Görsel olarak, R6'nın ilave edilmesinden sonra pembe bir renk gözlemlenebilir.
Konjugat (R7a) ilavesinin kontrol edilmesi
Konjugat bulunup bulunmadığı 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir.
OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,070 ile 0,200 arasında olmalıdır (0,070 ≤ OY ≤ 0,200)
Görsel olarak, R7a'nın ilave edilmesinden sonra mor bir renk gözlemlenebilir.
Developman solüsyonu ilavesinin kontrol edilmesi (R8+R9)
Developman solüsyonu bulunup bulunmadığı, 490 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile
kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,100'ün üzerinde olmalıdır.
12 [TR]
Görsel olarak, developman solüsyonunun ilave edilmesinden sonra, pembe bir renk
gözlemlenebilir.
2 - HBe Ag testi
Numune ve kontrol ilavesinin kontrol edilmesi
Kaplarda numune ve kontrol bulunup bulunmadığı 490 nm'de yapılacak fotometri ölçümü
ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,050'nin üzerinde olmalıdır.
Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net bir renk
farkı gözlemlenebilir.
Konjugat (R7b) ilavesinin kontrol edilmesi
Konjugat bulunup bulunmadığı 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir.
OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,210'un üzerinde olmalıdır.
Görsel olarak, R7b'nin ilave edilmesinden sonra turkuaz mavisi bir renk gözlemlenebilir.
Developman solüsyonu ilavesinin kontrol edilmesi (R8+R9)
Developman solüsyonu bulunup bulunmadığı, 490 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile
kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,100'ün üzerinde olmalıdır.
Görsel olarak, developman solüsyonunun ilave edilmesinden sonra, pembe bir renk
gözlemlenebilir.
14 - PERFORMANSLAR
Aşağıda özetlenen Monolisa™ HBe Ag/Ab PLUS testinin sonuçları kan donörlerinden,
hastaneye yatırılmış hastalardan ve ticari panellerden alınan numuneleri kullanan iki
kuruluşta değerlendirmeye tabi tutulmuştur.
Ayrıca, analitik duyarlılık PEI standardı yardımıyla belirlenmiştir.
1 - HBe Ag
Özgüllük
200 kan donöründen oluşan bir popülasyonda incelenen özgüllük oranı, %100 [%98,51 %100], (GA %95) olarak bulunmuştur.
Özgüllük oranı ayrıca hastaneye yatırılmış hastalardan alınan numunelerde de incelenmiş
ve %100 [%99,28 – %100] GA % 95 (416/416) olarak bulunmuştur.
Hepatit B'ye bağlı olmayan farklı patoloji özelliklerine sahip 195 numune (viral ve bakteriyel
enfeksiyonlar, romatoid, otoantikor, veya anti-fare faktörleri açısından pozitif numuneler,
miyelom numuneleri, hamile kadınlardan alınan numuneler) teste tabi tutulmuştur.
Bu popülasyonun özgüllük oranı %99,49 idi [%97,18- %99,99] (GA %95), yani 194/195
numune negatif bulunmuştur.
1 miyelom numunesi diskordans göstermektedir.
Analitik Duyarlılık
PEI Standardı yardımıyla belirlenen duyarlılık limiti 0,64 UI/ml [0,49 – 0,84] (GA %95)
olarak bulunmuştur.
Klinik Duyarlılık
Duyarlılık, kronik hepatit hastalarından, ticari panellerden ve serokonversiyonlardan elde
edilen 203 numune üzerinde test edilmiştir. Bu numunelerin tamamı üzerindeki duyarlılık
%99,51 [%97,29 - %99,99] (GA %95) yani 202/203 numunedir.
Hassasiyet
Monolisa™ HBe Ag/Ab Plus (HBe Ag) testinin hassasiyeti 4 numune yardımıyla
belirlenmiştir: HBe Ag açısından 1 negatif, 1 zayıf pozitif, 1 orta pozitif, 1 güçlü pozitif.
13 [TR]
Test içi inceleme, her numunenin aynı test sırasında 30 kez teste tabi tutulması ile
gerçekleştirilmiştir. Testler arası inceleme, her numunenin çift olarak 20 gün boyunca
günde 2 teste tabi tutulması ile gerçekleştirilmiştir.
Sonuçlar şöyledir:
Tablo 1: Test içi
n = 30
Oranların
ortalaması
Standart sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
Numune 1
0,356
Numune 2
5,29
Numune 3
27,24
Numune 4
45,56
0,05
14,20
0,35
6,53
0,63
2,31
2,88
6,33
Numune 1
0,51
Numune 2
8,19
Numune 3
27,33
Numune 4
46,35
0,12
23,86
1,17
14,27
3,26
11,92
4,98
10,74
Tablo 2: Testler arası
n = 80
Oranların
ortalaması
Standart sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
2 - HBe Ac
Özgüllük
200 kan donöründen oluşan bir popülasyonda incelenen özgüllük oranı, %100 [%98,51 %100], (GA %95) olarak bulunmuştur.
Özgüllük oranı ayrıca hastaneye yatırılmış hastalardan alınan 206 numunede de
incelenmiş ve %98,54 [%95,80 – %99,70] GA %95 (203/206) olarak bulunmuştur.
Hepatit B'ye bağlı olmayan farklı patoloji özelliklerine sahip (viral ve bakteriyel
enfeksiyonlar, romatoid, otoantikor veya anti-fare faktörleri açısından pozitif numuneler,
miyelom numuneleri, hamile kadınlardan alınan numuneler) 198 numune teste tabi
tutulmuştur.
3 numune pozitif bulunmuştur (2 HCV numunesi ve 1 romatoid faktör numunesi).
Bu popülasyonun özgüllük oranı %98,48 idi [%95,64- %99,69] (GA %95), yani 195/198
numune negatif bulunmuştur.
Bu numuneler tekrar teste tabi tutulmuştur; romatoid faktör numunesi tekrar pozitif
bulunmuştur; 2 HCV numunesi tekrar, ya negatif ya da şüpheli bulunmuştur.
Klinik Duyarlılık
Duyarlılık, kronik hepatit hastalarından ve ticari panellerden elde edilen 220 numune
üzerinde test edilmiştir. Bu numunelerin duyarlılığı %98,64 [%96,07 - %99,72] (GA %95)
yani 217/220 numunedir.
Hassasiyet
Monolisa™ HBe Ag/Ab Plus (HBe Ac) testinin hassasiyeti HBe Ac açısından 1 negatif, 1
zayıf pozitif, 1 orta pozitif, 1 güçlü pozitif numune olmak üzere, 4 numune yardımıyla
belirlenmiştir.
Test içi inceleme, her numunenin aynı test sırasında 30 kez teste tabi tutulması ile
gerçekleştirilmiştir. Testler arası inceleme, her numunenin çift olarak 20 gün boyunca
günde 2 teste tabi tutulması ile gerçekleştirilmiştir.
Sonuçlar şöyledir:
14 [TR]
Tablo 1: Test içi
n = 30
Oranların
ortalaması
Standart sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
Numune 1
3,15
Numune 2
0,69
Numune 3
0,42
Numune 4
0,03
0,05
%1,7
0,04
%5,7
0,04
%10,5
0,00
%6,6
Numune 1
2,39
Numune 2
0,81
Numune 3
0,59
Numune 4
0,3
0,23
%9,6
0,077
%9,5
0,09
%14,5
0,01
%39,3
Tablo 2: Testler arası
n = 80
Oranların
ortalaması
Standart sapma
Varyasyon
Katsayısı (%)
15 - KAYNAKÇA
1 - MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985)
Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press.,
chap. 4: 47-76
2 - KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.;
SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987)
Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with
type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) 15-19
3 - BRECHOT C.; (1987)
Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l'hépatite B en 1987.
Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; 9-12
4 - THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C.,
(1986)
L'ADN du virus de l'hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison
avec l'antigène HBe et l'anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: 1219-1222
5 - LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983)
Signification des marqueurs sériques du virus de l'hépatite B. Biologiste et praticien;
56; 13-22
6 - ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.;
SKINHOJ P., (1980)
Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis
B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), 293-297
7 - TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M.
(1976)
Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of
hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); 102 - 105
15 [TR]
16 [TR]
17 [TR]
18 [TR]
19 [TR]
20 [TR]