Slayt 1 - Bamcag

Mikolojik Tanı
Dr Dilek Yeşim Metin
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova-İzmir
Candida infeksiyonları
Yüzeyel (mukoza ve deri) infeksiyon
Fırsatçı, sistemik infeksiyon
Candida infeksiyonları
200 fazla tür,
İnfeksiyonların en sık etkenleri
C albicans
C parapsilosis
C tropicalis
C glabrata
C krusei
Candida infeksiyonları mikrobiyolojik tanı
•Örnekte Candida varlığını göstermek
•Tür düzeyinde belirleyebilmek
•Olanak varsa duyarlılık testlerini yapmak
•En kısa sürede!
Yüzeyel Candida infeksiyonları
Tanı kolay, yorum zor!
İnfeksiyon bölgesi sıklıkla gözle görülebilir, örnek alınabilir
Mukoza ve deri, flora yönünden zengin
Normal flora
Kolonizasyon
İnfeksiyon
Sistemik Candida İnfeksiyonları
Tanı zor!
Mikrobiyolojik tanı tek başına yeterli değil!
Klinik
Radyolojik
Histopatolojik
Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler
Yüzeyel örnekler
Deri, kıl, tırnak kazıntı, deri ve mukoza
sürüntüleri
Sistemik infeksiyon örnekleri
Kan
Steril bölgelerden
alınan örnekler
Solunum yolu örnekleri
tanıda
İdrar
ÖNEMLİDİR !
BOS
Steril boşluk sıvıları
Doku biyopsileri
Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler
Antifungal tedavi öncesi alınmalıdır!
Anaerobik transport besiyerleri
kullanılmamalı!
Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler
Örnek miktarı;
Mantar kültürü > bakteri kültürü
Üreme şansını artırır !!!
Mikrobiyolojik tanı
a. Direkt mikroskobik inceleme
b. Kültür
c. Tanımlama
c. Kültür dışı yöntemler
d. Duyarlılık testleri
Direkt Mikroskobik İnceleme
• Direkt örnek bakısı
• KOH preperatı ile örnek değerlendirme
• Kalkoflor beyazı ile floresan mikroskobik
değerlendirme
• Gram boyası
Kültür
Altın standart
Cins ve tür düzeyinde tanımlama
Türe özgü olası direnci belirleme
Antifungal duyarlılık testi
İdentifikasyon
Germ tüp: Candida albicans – albicans dışı Candida’lar
İdentifikasyon
Dalmou yöntemi: Mısır unu tween 80 agar besiyerinde
mikromorfolojik tanı
İdentifikasyon
Kromojenik besiyerinde (CHROMagar Candida, France) farklı koloni
renkleri
İdentifikasyon
Ticari kitler ile: KH asimilasyonları
•RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic Systems, Norcross, Ga)
•Fongiscreen test (Sanofi Diagnostics Pasteur, France)
•Automated Rapid Yeast Identification Panel (Dade Microscan, USA)
•API 20C AUX (bioMerieux-Vitek, Hazelwood, Mo.)
•API Candida (bioMerieux, France)
•Auxacolor (Sanofi Diagnostics Pasteur, France)
•Uni-Yeast-Tek kit (Remel Laboratories, Lenexa, Kan.)
•Kitch et al.,1996; Heelan et al., 1998; Wadlin et al., 1999
•Quindos et al., 1993; Hoppe and Frey, 1999
•Land et al., 1991; St-Germain and Beauchesne, 1991
İdentifikasyon
Ticari kitler ile: Otomatize biyokimyasal sistemler
ID32C stripleri (bioMerieux)
Vitek Yeast Biochemical Card system (bioMerieux Vitek, Inc.,
Hazelwood, Mo.), Vitek 2 ID-YST card system (bioMerieux Vitek, Inc.)
Quantum II (Abbott Laboratories, USA)
Biolog YT MicroPlate system (Biolog, USA)
İdentifikasyon
Moleküler tanımlama: Daha hızlı ve daha spesifik
tanımlama
Genellikle PCR temelli
İdentifikasyon
Kültürde ya da histopatolojik kesitlerde hibridizasyon temelli testler
Peptide Nucleic Acid Fluorescent in-situ hybridization (PNA FISH): Kan
kültüründe üreme sinyali olan örneklerde, Candida albicans’ı saptamaya yönelik
Duyarlılık ve özgüllük %100
Rigby et al., 2002)
İdentifikasyon
MALDI-TOF MS
Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür
Duyarlılık istenilen düzeyde değil
Uygun örnek alınmasındaki zorluklar
Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür
Duyarlılık istenilen düzeyde değil
Örnekteki mantar miktarı azlığı
Duyarlılık istenilen düzeyde değil
Üreme olan örneklerde değerlendirme
Kontaminasyon
KARAR ?
Kolonizasyon
İnfeksiyon
Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür
•Etkenin üretilmesi ve tanımlanması zaman alıcı
•Deneyim gerektiriyor
Kültürde üreme : 2-4 gün
Kültürden tanımlama: 2-3 gün
4-7 gün
Kültür
•Enfeksiyon odağına ait belirtiler yoksa
•Enfeksiyon odaklarına kolay ulaşılamıyorsa
Sistemik mikoz şüpheli hastada
ilk incelenecek örnek
“KAN KÜLTÜRÜ”
“KAN KÜLTÜRÜ”
Lizis santrifügasyon yöntemi “altın standart”
Otomatize kan kültür sistemleri
Bactec (BD Diagnostic system, Sparks, Md.)
BacT/Alert (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France)
Otomatize sistemlerin performansı, lizis santrifügasyon ile uyumlu
Kandidemili olgularda duyarlılığı %50
Current Drug Targets, 2006; 7: 513-22
Solunum yolu örnekleri
Kontaminasyon? / Kolonizasyon? > İnfeksiyon
Orofaringeyal kolonizasyon nedeniyle balgam uygun örnek değil!
Üst solunum yolu sürüntü örnekleri ile birlikte değerlendirilmeli
Tür düzeyinde tanımlanmalı
Solunum yolu örnekleri
Kültür
Kontaminasyon
?
Kolonizasyon
?
KANDİDÜRİ
Üriner
sistem
infeksiyonu?
Dissemine
infeksiyon
?
Kültür
İdrar
•YB, organ nakilli, bağışık sistemi baskılı hastalarda tür düzeyinde tanımlanmalı
•Kandideminin belirtisi (!)
•Renal kandidoz: İdrar kültürü (-)
Edwards JE. International conference for the development of a concensus on the
management and prevention of severe candidal infections. Clin Infect Dis 1997;25:43-49
Kolonizasyon-İnfeksiyon
• Piyüri, koloni sayısı anlamlı değil!
• >10.000 cfu/ml
sürülmüş
ÜS infeksiyonunda anlamlı olduğu ileri
kesinlik kazanmamış !
– Uzun süreli sondası olan hastalarda (=kolonizasyon)
– Risk faktörlerinin ortadan kaldırılması ile kandidüri düzelebilir
Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol. 1978
Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol. 1978
Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection-diagnosis and management. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science, 1997:78-93; 131-48
Edwards JE. International conference for the devolepment of concensus on themanagement and prevention of severe candidal infections. ClinInfect Dis 1997; 25: 43-59
Kolonizasyon-İnfeksiyon
• Kantitatif sonuçlar; tür identifikasyonu ile anlamlı!
– C. albicans, gebeler
İYE ile ilişkili bulunmamış!
– C. glabrata, idrarda saptanması
– C. tropicalis, 103-105 cfu/ml
İYE lehine
İYE ile ilişkili olabilir
Ahearn DG, Janach JR, Roth EJ. Speciation and densities of yeasts in human urine specimens.
Sabouraudia 1966: 5; 110-119.
Hazen KC, Stei J, Darracott C, Breathnach A, May J, Howell SA. Isolation of cholesterol-dependent
Candida glabrata from clinical specimens. Diagn Microbiol Infect. 2005: 52; 35-37.
Kültür
İdrar
Katater yoksa
Orta idrar
Üreme varsa, kültür tekrar alınır
Katater varsa
Perianal-vaginal kültür
Katater değiştirilir
Kontaminasyon
olasılığı
Kültür
İdrar
Kültürde sürekli üreme var
İnvazif kandidoz ?
•nötropeni?
•nedeni bilinmeyen ateş?
•geniş etki alanlı antibiyotik?
•santral venöz kateter?
•hiperalimentasyon?
•ameliyat (özel. karın)?
•Candida kolonizasyonu (yara, periton
KAN KÜLTÜRÜ
•Steril örnek alımındaki kısıtlamalar
(özellikle pansitopenik hastalarda)
•Var olan kültür yöntemlerinin zaman alışı
•Etken mantar izolasyonundaki başarı oranının çok yüksek olmayışı
•Üreyen etkeni değerlendirmede sorunlar
Kültür dışı yöntemler
“Moleküler Tanı”
Moleküler yöntemler
• Çok sayıda çalışma var!
– Nükleik asid hibridizasyon
– DNA dizi analizi
– PNA FISH
– PCR …..
Moleküler yöntemler
• Kullanılan örnek
– Doku, kan, serum, plazma, BAL
• Örnek miktarı (200 µl-10 ml)
• Farklı metodoloji
– Nükleik asid ekstraksiyonu
– Farklı primer ve probların kullanılması
Onay almış standart test yöntemi yok!
Arendrup MC, Fisher BT, Zaoutis TE. Invasive fungai infections in the paediatric and neonatal population: diagnostics and
management issues. CMI. 2009: 15; 613-624.
Xavier MO, Oliveria FM, Severo LC. Laboratory diagnosis of pulmonary mycose. J Bras Pneumol. 2009: 35; 907-919
• Test duyarlılığı:
Kandidemi
%100
İnvazif kandidoz şüphesi
%95
• İspatlanmış/yüksek olasılıklı invazif kandidozda
PCR pozitifliği:
%85 (78-91)
Kan kültür pozitifliği
%38 (29-46)
39/26
Moleküler yöntemler
PCR temelli yöntemlerde
“Kan” uygun örnek değil
•Etken kanda az miktarda
-örnek miktarı artırılabilir
•inhibitör etki fazla
-internal kontroller çalışmaya dahil edilebilir
•Farklı örnekler kullanılabilir (BAL, doku biyopsisi)
-örnek alma sorunlu
Moleküler yöntemler
PCR temelli yöntemlerde
Tek örnek yerine, ardışık 2 veya daha fazla örnek
Diğer tanı yöntemleri ile birlikte
Cuenca-Estrella M, Bassetti M, Lass-Flörl C et al. Detection and investigation invasive mold disease J Antimicrob Chemother 2011; 66: 15-24.
“İn vitro Duyarlılık Testleri”
İdeal bir duyarlılık testi
• İn vitro-in vivo uyum göstermeli
• Sağaltım sonuçlarını öngörebilmeli
• Yeni ilaçların terapötik potansiyellerini saptayabilmeli
• Laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği
• yüksek olmalı
• Hızlı sonuç verebilen, kolay uygulanabilir ve ucuz olmalı
CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) Kılavuzları
2009 M44A2, M44S3
2008 M27A3, M27S3
2004 M44A
2003 M44P
2002 M27A2
1997 M27A
1995 M27T
1992 M27P
1982
CLSI-AFDT
Alt komitesi
The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing”
Antifungal Susceptibility Testing
(EUCAST-AFST)
“The European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases” (ESCMID)
Mayalar için sıvı mikrodilüsyon testi
•EUCAST definitive document EDef 7.1: method for the determination of broth
dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts.2008.
CLSI M27 A3
EUCAST-E-DEF 7.1
Uygulama alanı
Candida ve Cryptococcus
Candida
İnokülum
0.5x103-2.5x103 CFU/ml
0.5x105-2.5x105 CFU/ml
İnokülum
standardizasyonu
Spektrofotometrik
Hemositometrik
Besiyeri
RPMI 1640
RPMI % 2 glukoz
Buffer
MOPS, pH 7.0±0.1
MOPS, pH 7.0±0.1
Mikrodilüsyon plağı
U tabanlı
Düz tabanlı
Değerlendirme
Görsel
Spektrofotometrik
Isı
350C
350C
İnkübasyon süresi
24-48 saat
(C. neoformans72 saat)
24 saat
Sınır değer
AmB için üreme olmayan
kuyucuk, azoller,
ekinokandinler için ~% 50
inhibisyon
AmB için ~% 90 inhibisyon,
azoller, ekinokandinler için
~% 50
•Etest (bioMérieux)
•ATB Fungus 3 (bioMérieux)
•Vitek 2 yeast susceptibility test
(bioMérieux)
•Sensititre YeastOne colorimetric plate
(Trek Diagnostic Systems)
Candida direnç sınır değerleri (CLSI)
Antifungal ilaç
S
S-DD
I
R
Flukonazol
8
16-32
-
 64
İtrakonazol
 0,125
0,25-0,5
-
1
Vorikonazol
1
2
-
4
Kaspofungin
2
-
-
>2
Anidulafungin
2
-
-
>2
Mikafungin
2
-
-
>2
Flukonazol
≥ 19
15-18
≤ 14
Vorikonazol
≥ 17
14-16
≤ 13
M27A2
M27A3-M27S3
M44A
Türe özgü direnç profilleri
Flukonazol
(24 h)
İtrakonazol
(48 h)
Vorikonazol
(48 h)
Posakonazol
(48 h)
C. albicans
>4
>0.5
>2
>2
C. tropicalis
>4
>0.5
>2
>2
C. krusei
R
>0.5
>2
>2
C. glabrata
>32
>0.5
>2
>2
C. parapsilosis
>4
>0.5
>2
>2
Kaspofungin
(24 h)
Anidulafungin
(24 h)
Mikafungin
(24 h)
C. albicans
>0.5
>0.5
>0.5
C. tropicalis
>0.5
>0.5
>0.5
C. krusei
>0.5
>0.5
>0.5
C. glabrata
>0.5
>0.5
>0.12
C. parapsilosis
>4
>4
>4
Hangi durumlarda yapılmalı?
İdentifikasyon çok daha önemli!
Steril bölgelerden soyutlanan Candida spp.
( özellikle non-albicans türler) için
Direnç görülebilme olasılığı olan türler nedeniyle
(örn; C. glabrata - flukonazol)
Standart sağaltıma yanıt vermeyen tablolarda
(örn. Mukozal kandidoz)
Klinik yanıtsızlık durumlarında
Epidemiyolojik amaçlarla
Türkiye - Çalışmalar
Kuzucu Ç,
2007 (İnönü Ü)
Sancak B, 2007
(HÜ)
Efe-İris N,
2008 (Ok
Meydanı)
Saraçlı MA,
2009 (GATA)
Aydın F, 2010
(KTÜ )
Kiraz N, 2011
(OGÜ)
Metin DY, 2011
(EÜ)
Yöntem
Köken
sayısı
AMB
FLU
İTRA
VORİ
EKİNO
M27A2
23
0
4
31
-
-
M27A2
134 (CG)
-
0
3 (SDD)
6
73.1 (SDD)
-
-
ATB
Fungus 2
37
0
19
19
0
-
95
0
2
0
7 (SDD)
0
15 (KF)
M44A
Etest
166
1.8
2.4
-
0
-
Etest
2068
0.3
5
13.3
-
-
M27A2
400
3.8
0.5
1.3
13.5
10.5 (SDD)
0 / 0.5
M27A2
Doğanay-Oflazoğlu B, Metin DY
EÜTF, 2008-2010
Kan kültürü kökenleri
C. albicans (96), C. parapsilosis (88), C. tropicalis (18), C.glabrata (18),C. krusei (4),
C. guilliermondii (3), C. keyfr(2), C. lusitaniae (2), C. sake (2), C. famata (1), C. globosa (1),
C. dubliniensis (1)
Candida
türleri
(236)
AMB
FLU
İTRA
VORİ
CF
AF
24 saat
S
SDD
236(100)
233(98.7)
3 (1.3)
197(83.5) 37 (15.7)
236(100)
236(100)
236(100)
-
R
2 (0.8)
-
48 saat
S
SDD
235 (99.6)
231 (97.9)
5 (2.1)
169 (71.6) 58 (24.6)
236 (100)
236 (100)
236 (100)
-
R
1 (0.4)
9 (3.8)
-
Antifungal Duyarlılık Profilleri
C. albicans
Amfoterisin B
Flukonazol
İtrakonazol
Vorikonazol
Ekinokandinler
C. tropicalis
C. glabrata
C. parapsilosis
C. krusei
Sonuç olarak;
• Gelecekte yeni in vitro tanı yöntemleri umut verici değil
– Uygun örnek ?
• Yeni tanı yöntemleri in vivo planlanabilir
– Spesifik mantar belirleyicileri ile etiketlenmiş ürünler (etiketli
antifungal molekül, hücre duvarına karşı antikor veya yalnızca mantara
bağlanan etiketli şeker molekülü) infüzyon yolu ile verildikten sonra
görüntüleme yöntemleri ile infeksiyon bölgesinin saptanması
Klutts JS, Robinson-Dunn B. A Critical Appraisal of the Role of the Clinical Microbiology
Laboratory in Diagnosis of Invasive Fungal Infections J Clin Microbiol 2011; 49 (Suppl): 39-42.
Moleküler
Tanı
DM
Kültür
Kültür dışı
yöntemler
Laboratuvar-klinik işbirliği
Çok önemli !!!