sitogenetik - Düzen Laboratuvarlar Grubu

Transkript

SİTOGENETİK
Düzen Laboratuvarlar Grubu
Sitogenetik Birimi
Dr. Zuhal Candemir, MD
Tıbbi Genetik Uzmanı
SİTOGENETİK
Tıbbi Genetik; Sitogenetik, Moleküler
sitogenetik, Moleküler genetik ve Klinik
genetik şeklinde alt birimlere ayrılmış bir
bilim dalıdır.
İnsan kromozomlarını inceleyen dalına
SİTOGENETİK adı verilmektedir.

TARİHÇE
İnsan kromozomları ilk olarak 1879’da
Arnold tarafından tümör hücrelerinden elde
edilmiştir. 1882’de ilk olarak Flemming
tarafından fotoğraflanmıştır.
Bundan sonra yapılan çalışmalar daha
yavaş ilerlemiş, total kromozom sayısı ve
cinsiyet kromozomları açısından birbirinden
çok farklı sonuçlar elde edilmiştir.

TARİHÇE
• 1923’de Painter tarafından insanda
diploid sayıda 48 kromozom olduğu ileri
sürülmüştür.
• 1949’da Murray Barr dişi kedi interfaz
nükleuslarında X-kromatinini, diğer
adıyla Barr cisimciğini keşfetmiştir.
• Bundan 10 yıl sonra Klinefelter, Turner
sendromu ve diğer sex kromozom
anöploidileri tanımlanmış, 20 yıl sonra
ise Y kromatini keşfedilmiştir.
TARİHÇE

Kanser hücreleri üzerinde yaptığı
çalışmaları ile patolojik bozuklukların
kromozom sayısı ve yapısındaki anomaliler
nedeniyle oluşabileceği teorisi ilk olarak
1914’de Theodor Boveri tarafından ortaya
atılmış, 46 yıl sonra 1960’da Novel ve
Hungerford tarafından malignite ile birlikte
görülen ilk spesifik kromozom anomalisi Ph
kromozomu tanımlanmıştır.
TARİHÇE

1932’de Waardenburg ilk olarak Down
Sendromunun sayısal bir kromozomal
anomali olabileceğini ileri sürmüş, 1958’de
aynı sendromda Lejeune ve arkadaşları
tarafından en küçük kromozomlardan
birindeki trizomi keşfedilmiştir.
TARİHÇE
1950’lerde üç yeni tekniğin -hipotonik
solüsyonu, fitohemagglutinin ve
kolsemidin- keşfi ve kullanılmaya
başlanması ile beraber sitogenetik
çalışmalar hız kazanmıştır.
1956’da ise Tjio ve Levan tarafından insan
kromozom sayısının 48 değil 46 olduğu
kesin olarak saptanmıştır.

TARİHÇE
• 1960’larda kromozomlar, uzunluk, sentromer
lokalizasyonu, heterokromatin bölge
içermeleri ve DNA replikasyon paterni gibi
özelliklerine göre ayrı ayrı tanımlanmıştır.
• 1970 yılında ise Pardue ve Gall, in situ
hibridizasyon ve C-bantlama tekniklerini
geliştirerek modern sitogenetik analiz için
önemli adımlar atmıştır.
TARİHÇE

Sitogenetik tekniklerde son 40 yılda
meydana gelen gelişmeler ile kromozomlar
üzerindeki daha küçük çapta anomalilerin
belirlenebilmesi mümkün hale gelmiş bu
nedenle kromozom analizi endikasyonları
zamanla artış göstermiştir.
SİTOGENETİK ANALİZİN
BAŞLICA ENDİKASYONLARI

1- Bilinen kromozom sendromlarının kesin
tanısı veya ekarte edilmesi
2- Dismorfik özellikler ile birlikte olan ya
da tek başına görülen psikomotor
retardasyon.
3- Seksüel değişim ve gelişim anomalileri.
4- İnfertilite
5- Tekrarlayan abortus ya da ölü doğum
hikayesi.
SİTOGENETİK ANALİZİN
BAŞLICA ENDİKASYONLARI
6- Mental retardasyon ve/veya dismorfik
özellikler ile birlikte görülen monogenik
hastalıklar.
7- Maternal serum tarama testleri ya da
ultrasonografide anöploidi riski olan
gebelikler.
8- Tanı ve takibinde belirleyici kromozomal
bozuklukların görüldüğü malign hastalıklar,
özellikle hematolojik maligniteler.

Sitogenetik analiz için hazırlanan
kromozomlar bölünen hücrelerden elde
edilirler. Kemik iliği, testis, korionik villus,
neoplazi gibi bazı dokulardan direkt elde
edilebileceği gibi cilt, kan, amniotik sıvı
gibi diğer canlı dokulardan uzun süreli
kültürler yoluyla da elde edilebilirler.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG

Sitogenetik analiz için genetik
laboratuvarına materyal gönderilmesi
istendiğinde kültür açısından uyulması
gereken bazı şartlar vardır.
DOKULARIN GÖNDERİLME
KOŞULLARI
1- Steril şartlarda alınması,
2- Formaldehit, alkol gibi fiksatifler içinde
olmaması,
3- Kanın belirli oranda heparin içeren,
amniotik sıvı veya diğer dokuların gerekirse
besiyeri içeren uygun tüp ya da enjektörler
içerisinde gönderilmesi,
4- Canlı hücre kaybını en aza indirmek için
mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak
24 saat içerisinde, laboratuvara ulaştırılması
gereklidir.

DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG

İlk olarak; laboratuvara ulaşan materyallerin
doku kültürü amacına yönelik medium
denilen özel besiyerlerine ekimleri yapılır.
Kan için hazırlanan mediumlar içerisinde
fetal calf serumu, mitotik stimülan olarak
fitohemagglutinin ve antibiyotik bulunur.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG

Değişik amaçlara yönelik çalışmalar
yapılacaksa kan kültürünün belirli
dönemlerinde, örneğin prometafazkromozomları elde etmek, frajil
bölgeleri indüklemek, kromozom kırıkları
ile giden sendromları belirlemek için farklı
ajanlar ilave edilebilmektedir.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG

Kültür aşamasında kan lenfosit hücreleri
için konik tabanlı steril falcon tüpleri,
fibroblast hücreleri için genellikle tabanı 25
cm2 olan steril kültür flaskları
kullanılmaktadır.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG
• Kan lenfosit hücreleri için kültür süresi genellikle
72 saattir. Fibroblast kültür süresi hücrelerin
canlılık oranına, sayısına ve aktivasyonuna bağlı
olarak değişmekte ortalama 10-12 gün veya daha
uzun sürebilmektedir. Kan lenfosit kültürü için
37°C’lik etüv, fibroblast kültürleri için 37°C, %5
CO2’li etüv ortamına gerek vardır.
• Kültürün son 2 saatinde hücreleri mitoz
aşamasında durdurmak için kültürlere kolsemid
ilavesi yapılır.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG
• Fibroblast kültürlerinde hücrelerin flask tabanında
tutunarak çoğalmaları beklenir.
• Hücre kolonileri belirli bir yoğunluğa ulaşana kadar
kontrol edilir ve medium değişimleri yapılır.
• Yeterli hücre elde edileceğine karar verildiğinde
harvest işlemi başlatılır.
• Kolsemid ilavesinden sonra hücreleri flask
tabanından kaldırmak için tripsin-EDTA kullanılır.
Hücreler toplanıp bir tüpe aktarılır. Bundan sonraki
işlemler diğer kültürler için yapılanlar ile aynıdır.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG
• Harvest işlemi için hücreler santrifüjden sonra
yaklaşık 10-15 dakika hipotonik solüsyonu
(potasyum klorür veya sodyum sitrat) ile muamele
edilir. Bu işlem hücrelerin şişmesi ve dolayısıyla
kromozomların birbirinden ayrılmasını sağlar.
• Hipotonik işleminden hemen sonra hücreler 1:3
oranında hazırlanmış soğuk glasiel
asetikasit:metanol solüsyonu ile 2-3 kez muamele
edilerek fikse olması sağlanır.
DOKU KÜLTÜRÜ VE
HARVESTİNG
Hazırlanmış hücre süspansiyonları temiz
lamlar üzerine damlatılır, havada ya da kısa
sürede yüksek sıcaklıkta kurutularak
eskitme işlemi gerçekleştirilir.
Eskitilen preparatların rutin analiz için
Tripsin ve Giemsa ile bantlama ve boyama
işlemleri yapılır.

Rutin analizde kullanılan konvansiyonel
G-Bantlama dışında gerektiği durumlarda
uygulanabilecek farklı bantlama yöntemleri
de vardır;
En sık başvurulanı C-Bantlama yöntemidir.
Tüm kromozomlardaki heterokromatin
bölgeleri koyu renkte boyanır, ökromatin
bölgeleri açık renkli olarak kalır. Bu
yöntemle heterokromatin bölgelerindeki
miktar ve yer değişiklikleri belirlenmiş olur.

Reverse Bantlama ile G-Bantlama
paterninin tersi elde edilir yani koyu renk
bölgeler açık, açık renk bölgeler ise koyu
renk boyanır.
Ag-NOR Bantlama ile akrosentrik
kromozomların satellit bölgeleri Ag Nitrat
ile koyu olarak boyanır.
Q-Bantlamada floresan boyama ile GBantlama paterni elde edilir, özellikle Y
heterokromatin bölgesi ve satellit
bölgelerine yönelik olarak kullanılır.

KROMOZOM ANOMALİLERİ
Karyotipleme; kromozomların yapısal
olarak incelenmesi, anomalilerinin
belirlenebilmesi için yapılan işlemdir.
Günümüzde bu işlem özel bilgisayar
programları yardımı ile daha kolay ve kısa
sürede yapılabilir hale gelmiştir.

Karyotiplemede kromozomlar, X
kromozomu hariç, büyükten küçüğe doğru
homolog çiftler halinde sıralanırlar.
Homolog kromozomların yanyana olması
aralarındaki bant farklılıklarının daha kolay
belirlenebilmesi için gereklidir.

Kromozom anomalileri başlıca 2 gruba
ayrılır:
- Sayısal Anomaliler
- Yapısal Anomaliler

Sayısal Anomaliler:
• Poliploidiler : Normal diploid sayının dışında,
haploid sayı olan 23’ün katları şeklinde
kromozom artışlarıdır. Triploidi (69), Tetraploidi
(92) gibi. Hücrede bölünme hatası ya da
yumurtanın multiple fertilizasyonu nedeniyle
görülür.
• Anöploidi : Diploid sayıdaki artış ya da
eksilmelerdir. Hücre bölünmesi sırasında
ayrılamama veya kromozom kayıpları nedeniyle
ortaya çıkar.
Sayısal Anomaliler:
• Trizomiler (Down Sendromu, Patau Sendromu,
Edwards Sendromu)
• Monozomi X (Turner Sendromu)
• Klinefelter Sendromu (XXY)
• XYY, Triple X, Tetra X, Penta X Sendromu
gibi örnekler verilebilir.
Yapısal Anomaliler :

Translokasyonlar
Delesyonlar
İnversiyonlar
İzokromozom
Ring kromozom
TRANSLOKASYONLAR
DELESYONLAR
İNVERSİYONLAR
İZOKROMOZOMLAR
RİNG KROMOZOMLAR
LABORATUVARIMIZDA
YAPILAN SİTOGENETİK
ÇALIŞMALAR

Postnatal tanı testleri:
• Periferik kandan kromozom analizi
• Cilt biyopsi materyalinden kromozom analizi

Prenatal tanı testleri
• Koriyon villus biyopsi materyalinden
kromozom analizi
• Amniyon sıvısından kromozom analizi
• Kord kanından kromozom analizi
Prenatal tanı materyallerinin bir kısmı
kültür işlemi başlatılmadan önce steril
koşullarda ayrılarak moleküler genetik
laboratuvarına gönderilmektedir.
Burada QF-PCR ile yapılan erken Trizomi
Tanı Testi ile kısa sürede 13,18,21,X ve Y
kromozomlarına özgü bir ön bilgi
edinilebilmektedir.
Kesin bilgi kültür sonrasında yapılacak, 46
kromozomu içine alan karyotipleme
sonucuna göre verilmektedir.

Sitogenetik Laboratuvarı
İstatistik Değerlendirmeleri
Prenatal Tanı
Rapor edilen olgu sayısı: 122
Belirlenen karyotip anomali sayısı: 7

Prenatal Tanı Anomali
Bulgularımız
Hasta no: AS005
Endikasyon: İleri maternal yaş
QF-PCR sonucu: 13., 18., 21. Kromozomlar
açısından normal / cinsiyet kromozomları
açısından XXY
Sitogenetik sonuç: 47,XXY

Prenatal Tanı Bulgularımız
Hasta no: AS028
Endikasyon: Üçlü testte yüksek risk, trizomi
21 riski: 1/78
QF-PCR sonucu: 13., 18.ve cinsiyet
kromozomları açısından normal / 21.
kromozom açısından trizomi
Sitogenetik sonuç: 47,XY,+21

Hasta no: AS044
kromozom açısından bilgi verici değil
Sitogenetik sonuç: 46,XX; 47,XX,+mar[5]
Aynı hastaya kordosentez yapıldı,
Sonuç: 46,XX; 47,XX,+mar[7]

Hasta no: AS045
QF-PCR sonucu: İncelenen kromozomlar
açısından normal
Sitogenetik sonuç: 92,XXYY; 46,XY
İki farklı kültürde de aynı sonuca
ulaşıldığından kordosenteze yönlendirildi,
Hasta onaylamadığı için yaptırılmadı.
Hasta no: AS082
Endikasyon: Üçlü testte yüksek risk
kromozom açısından trizomi
Sitogenetik sonuç: 47,XY,+21

Hasta no: AS084
Endikasyon: Üçlü testte yüksek risk
QF-PCR sonucu: 13. ve 21. Kromozom
açısından normal, 18 ve cinsiyet
kromozomları bilgi verici değil.
Sitogenetik sonuç: 45,XX,der(13;14)
Aileye kromozom analizi yapılması
önerildi.

Hasta no: AS101
Endikasyon: Önceki çocukta kromozom
anomalisi
QF-PCR sonucu: İncelenen kromozomlar
açısından normal
Sitogenetik sonuç: 46,XX,t(13,20)(q10,p10)
Aileye kromozom analizi yapılması
önerildi, anne de aynı translokasyon
gözlendi.
Sitogenetik Laboratuvarı
İstatistik Değerlendirmeleri
Postnatal Tanı
Rapor edilen olgu sayısı: 107
Belirlenen karyotip anomali sayısı: 15

Amniotik Sıvı Kültür Başarısını
ve Süresini Etkileyen Faktörler

Amniotik sıvının görünümü
Amniotik sıvının miktarı
Transport şartları ve süresi
Fetal anomaliler
Kültür mediumları
Kontaminasyon
Analiz Sırasında Karşılaşılan
Sorunlar
Mozaizm
Marker Kromozom