KOLON KROMATOGRAFİSİ

KOLON KROMATOGRAFİSİ
Giriş:
Çeşitli kaynaklardan alınan protein, karbohidrat, nükleik asit ve lipitleri ayrıştırmak için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir.
Temel prensibi, ayrıştırılacak moleküllerin, hareketli bir faz içinde, hareketsiz (durgun) faz üzerindeki akışına dayanır. Hareketli
faz ise bir tampon ya da elektrolit çözeltisidir. Durgun fazın kimyasal ve fiziksel özelliği ayrışmayı sağlar. Başlıca kolon
kromatografisi tipleri şunlardır:
1. Jel Elemesi
Proteinleri büyüklük ve bir ölçüde biçimlerine göre ayırır. Jel kovalent bağlar ile birleştirilmiş polisakkarit zincirlerinden
yapılmış küreciklerden oluşan inaktif bir polimerdir. Durgun fazı (jeli) oluşturan moleküller için genellikle dekstranın epiklorhidrin
ile çaprazlaştırılmış polimerleri olan klorohidroksipropil dekstran (Sephadex) kullanılır. Jel şiştiğinde içi labirent şeklinde ve belli
genişlikte kanallardan oluşan kürecikler halini alır. Kürelerin çapı 0.1mm’den küçüktür. Kürecik içinde çapraz bağlanma sonucu
oluşan kanallar filtre görevini üstlenir. Çapraz bağlanmanın derecesi kanal boyutlarını değiştirir. Jellerin tipleri ve ayrıştırma
kapasitesi bu kürelerin çapına ve içlerindeki kanalların genişliğine bağlıdır. Küreciklere girebilecek büyüklükteki moleküller,
giremeyen büyük moleküllere göre kolondan daha geç çıkarlar. Böylece jel fitrasyon kolonuna uygulanan karışımdaki
moleküllerden büyük olanlar kolondan daha önce çıkarlar. Belli bir kolona uygulanan proteinlerin elüsyon (çıkış) hacmi ile
molekül ağırlığı arasında logaritmik bir ilişki vardır. Jel elemesinde kullanılan sephadex-G jellerin globüler protein resolusyon
aralıkları aşağıda verilmiştir.
Sephadex G-serisi
Ayrıştırma Kapasitesi (Dalton)
G-10
200-2.500
G-25
1.000-5.000
G-50
1.500-30.000
G-75
3.000-70.000
G-100
4.000-100.000
G-150
5.000-150.000
G-200
5.000-250.000
www.hasanunal.net
2. Affinite Kromatografisi
Çok kompleks bir karışım içinde bulunan bazı proteinler affinite kromatografisi sayesinde tek basamakta oldukça saf halde elde
edilirler. Affinite kromatografisi için polisakkarit yapısındaki agaroz taneciklerine kimyasal bir reaksiyon ile bir enzimin koenzimi
bağlanır. Üzerine koenzim bağlanmış olan agaroz tanecikleri kolon dolgu maddesi olarak kullanılır. Proetin karışımı bu kolona
uygulandığı zaman yalnız ilgilendiğimiz enzim proteinleri koenzimin serbest ucuna spesifik olarak bağlanmaktadır. Bu bağlanma
kovalent bir bağlanma değildir. Diğer proteinler koenzimin serbest ucuna bağlanma özelliğine sahip olmadıkları için kolondan
ayrılırlar. Daha sonra serbest koenzim içeren çözelti kolona ilave edildiğinde, agaroz taneciklerine bağlı koenzime bağlanmış olan
enzim molekülleri bu defa rekabetten dolayı çözelti ile birlikte gelen serbest koenzime bağlanarak kolondan çıkar. Böylece
koenzime spesifik olarak enzim proteini diğer yüzlerce proteinden affinite kromatografisi ile tek basamakta saflaştırılmış
olmaktadır.
3. İyon Değiştirici Kromatografisi
Bu teknikte proteinler ya da amino asit karışımları belirli bir pH’da taşıdıkları yüke göre birbirlerinden ayrılırlar. Matriks,
jel elemesinde olduğu gibi nötral olmayıp, iyonize olabilen fonksiyonel gruplarla donanmıştır. Protein izolasyonunda kullanılan
iyon değiştiriciler, jel kromatografisinde kullanılan matrikslere dietilaminoetil (DEAE) ya da karboksimetil (CM) gruplarının
eklenmesi ile elde edilir. DEAE,tipi iyon değiştiriciler (+) yük taşırlar ve anyon değiştirici görevi görürler; CM-tipi
iyon değiştiriciler, pH 4’ün üzerinde, (-) yük taşırlar ve katyon değiştirici görevi görürler. Örnek bir protein karışımı
belirli bir pH’da iyon değiştiriciye uygulandığında, matriksle aynı tür yük taşıyan bileşikler, iyon değiştiriciye tutunamayarak ilk
başta kolondan çıkarlar. Matriks yüküne karşıt yük taşıyan proteinler ise, elektrostatik etkileşimle matrikse bağlanırlar. Bunlar
sonradan elüsyon şartları değiştirilerek kolondan sökülürler. Bir proteinin matrikse ne derece sıkı bir şekilde bağlanacağı,
öncelikle proteinin üzerindeki yük miktarına bağlıdır. Bir katyon değiştiriciyi ele alırsak, belirli bir pH’da bu matrikse uygulanan
protein karışımında en sıkı bağlanan bileşen, en fazla (+) yük taşıyan (izoelektrik noktası en yüksek olan) bileşendir. Bu protein
aynı zamanda matriksten en güç sökülebilen protein olacaktır.
www.hasanunal.net
Elüsyon iki şekilde gerçekleştirilebilir;
1.
Tuz yıkamasıyla: Bu yöntemle örnek düşük iyonik kuvvette bir tamponla dengelenmiş kolona uygulandıktan sonra,
yıkama tamponuna kademeli olarak ya da düzgün bir gradient teşkil edecek şekilde, sodyum veya potasyum klorür gibi
basit bir tuz eklenerek, iyonik kuvvet yükseltilir. Eklenen tuzun iyonları reçinedeki fonksiyonel gruplar ile proteinler arasıdaki
etkileşimi zayıflatarak proteinlerin kolondan sökülmesini sağlar. Protein ne kadar sıkı bir şekilde bağlanmış olursa kolondan
yıkanması için o kadar yüksek iyonik kuvvette tampon gerekir.
2.
Elüsyon pH’sı değiştirilerek: Anyon değiştiricilerde tampon pH’sı düşürülerek, katyon değiştiricilerde ise tampon pH’sı
yükseltilerek, ilk başta kolona bağlanan proteinlerin yükü matriks yüküne benzetilir; elektrostatik itiş ile proteinler kolondan
sökülür.
Her protein için net yükün (-) den (+) ya, (+) den (-) ye geçtiği pH değişiktir ve proteinlerin izoelektrik noktasına
bağlıdır. Proteinler izoelektrik noktanın üzerindeki pH’larda (-), altındaki pH’larda ise (+) yük kazanırlar.
Jel ve Jelin Hazırlanması
Jel genellikle toz halinde bir polisakkarittir ve kullanmadan önce hareketli faz içinde şişirilir. Şişme, jelin tipine ve sıcaklığa
göre, süre ve hacim olarak farklılık gösterir. Sıcaklık arttıkça, şişme süresi azalır. 1 gr jelin şiştiği zaman ulaştığı hacime,
“jelin yatak hacmi” denir. Böylece belli hacimdeki kolonu doldurmak için kaç gr jel kullanılacağı hesaplanabilir. Jeller,
genellikle otoklavda, 1200C’de 20 dakikada sterilize edilebilir. Şişen jeller, uygulamanın yapılacağı sıcaklıkta saklanır. Jel, ani ısı
değişikliklerinden ve direkt güneş ışığından korunmalıdır. Uygulama sonunda, jeller iyice yıkanarak, %0.3 toluen ilavesi ile
saklanabilir ve 2-3 yıl güvenle tekrar tekrar kullanılabilir.
Kolon ve Kolonun Doldurulması
Kolon cam ya da benzeri bir maddeden yapılmış, silindirik bir borudur. Kolonun boyutları, seçilen jelin tipine ve miktarına
göre belirlenir. Bir beher içinde şişen jelin üzerindeki tampon dikkatlice alınır, kolon çıkışı kapatılarak bir kerede ve yavaşça
kolona doldurulur.
www.hasanunal.net
Jel kolona doldurulduktan sonra, kolon hacminin en az 5 katı tampon ile yıkanarak dengelenir. Dengeleme işlemi
bittikten sonra kolonun “voit hacim”i saptanır. Bu, kolona uygulanan moleküllerin kolondan çıkması için gereken tampon
miktarıdır ve bu işlem için genellikle molekül ağırlığı 2.000.000 dalton olan blue dekstran kullanılır. Ardından da kolonun akış hızı
saptanır. “Akış hızı” çıkış tüpünden dakikada akan tampon miktarıdır. Dikkat edilmesi gereken en önemli noktalar, kolonu
hareket ettirmemek, yüzeyini kurutmamak ve direk güneş ışığından korumaktır.
Örneğin Hazırlanması ve Uygulanması
Örnek konsantre bir çözelti halinde hazırlanmalıdır. Örnek uygulamada kolaylık oluşturması açısından %5 glukoz ya da
sukroz ile yoğunlaştırılabilir.
Örnek uygulanmadan önce, çıkış tüpü kapatılır. Jel yüzeyindeki tamponun fazlası Pasteur pipeti ile alınır. Bu işlem
esnasında jel yüzeyinin bozulmamasına ve kurumamasına dikkat edilmelidir.
Örnek Pasteur pipeti ile kolonun iç kenarında süzdürülerek tüm jel yüzeyine homojen bir şekilde uygulanır ve çıkış tüpü
açılarak örneğin jelin içine girmesi sağlanır. Jel yüzeyinin kurumamasına dikkat edilmelidir. Örnek jelin içine girdikten sonra
Pateur pipeti ile jel yüzeyinden 4-5cm yukarıya kadar tampon doldurulur. Tampon rezervi bağlanarak uygulama başlatılır. Bir
fraksiyon toplayıcısı yardımıyla, 3-4ml’lik fraksiyonlar toplanır ve fraksiyonlarda örnek analizi yapılır.
Deney :
Katyon Değiştirici Kromatografi Yöntemi ile Prolin ve Arjinin Amino Asitlerinin Ayrılması
Yapılacak deneyde katyon değiştirici dolgu maddesi olarak Dowex 50-SO3 sülfonik asit kullanılarak hazırlanacak kolona
Arg (pI= 10.7) ve Pro (pI= 6.3) amino asitlerinden oluşan karışım uygulanacak ve karışımdaki amino asitlerin birbirinden
ayrılması sağlanacaktır.
Deneyde İzlenecek Yöntem
1. Kolon dolgu materyali şişirilmiş olarak size verilen Dowex 50 kolonu yaklaşık 5-6 ml sitrat tamponu (pH=3,3) ile yıkayınız.
2. Yıkama sonunda elinizdeki 2 ml amino asit karışımını yavaşça kolona boşaltın. Örnek kolona tam olarak girdikten sonra bir
sonraki aşamaya geçin.
3. Kolonu 7-8 ml sitrat tamponu (pH= 3.3) ile yıkamaya devam edin (bu aşamada her iki amino asitte kolona bağlanacaktır). Bu
esnada kolondan çıkan elüsyonun ilk 2-3 ml’sini atık kabına geri kalan kısmını ise 2 tüpe (2-3ml olacak şekilde) alın. Kolonun
üzerinde tampon kalmayıncaya kadar elüsyona devam edin. İki
elüsyon tüpüne 2 ml sitrat tamponu ekleyerek %0.9’luk
o
ninhidrin ekleyin. 80-90 C’lik sıcak su banyosunda renk oluşana kadar bekleyin.
4. Kolonu pH=7.5 fosfat tamponu ile yıkamaya başlayın. Her tüpe yaklaşık 2-3 ml olacak elüsyon yapın. Alınan her elüsyon tüpü
üzerine 2 ml sitrat tamponu ekleyerek %0.9’luk ninhidrin ekleyin. 80-90oC’lik sıcak su banyosunda renk oluşana kadar bekleyin.
Elüsyona prolinin tamamı kolondan sökülene kadar devam edin.
5. Kolonu son olarak pH=11 Karbonat tamponu ile yıkamaya başlayın. Her tüpe yaklaşık 2-3 ml olacak elüsyon yapın. Alınan her
elüsyon tüpü üzerine 2 ml sitrat tamponu ekleyerek %0.9’luk ninhidrin ekleyin. 80-90oC’lik sıcak su banyosunda renk oluşana
kadar bekleyin. Elüsyona arjininin tamamı kolondan sökülene kadar devam edin.
6. Tüm elüsyonlar bittikten sonra kolon materyali kurumayacak şekilde karbonat tamponu ile doldurup kolonun ağzını kapatın.
7. Isıtma sonrası 5-10 dakika rengin sabitlenmesi için bekleyin.
8. Her aşamayı ayrı ayrı beklentilerinize göre yorumlayınız.
www.hasanunal.net