İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ PROBİYOTİK

Transkript

T.C.
AHİ EVRAN ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ
PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
Selçuk ZORAL
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
KIRŞEHİR 2013
T.C.
AHİ EVRAN ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp. SUŞLARININ
PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
Selçuk ZORAL
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DANIŞMAN
Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ
KIRŞEHİR
EYLÜL 2013
Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü’ne
Bu çalışma jürimiz tarafından BİYOLOJİ Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS
TEZİ olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Doç. Dr. Kamil IŞIK…………..
Üye: Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ………….
Üye: Yrd. Doç. Dr. Belgin ERDEM…………
Onay
Yukarıdaki imzaların, adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım.
…/…/20..
Doç. Dr. Mahmut YILMAZ
Enstitü Müdürü
ÖZET
Bu çalışmada, Kırşehir Devlet Hastanesine belirli bir şikayetle başvurmuş 25-50
yaş arası sindirim sistemi problemi bulunmayan 48 hastanın gaitasından izole edilmiş
Lactobacillus spp. suşları kullanılmıştır. Toplam 25 adet olan bu suşların düşük pH
dirençlerinin belirlenmesi, yüksek safra tuzu (oxgall) konsantrasyonlarına karşı toleransı
ve safra tuzu (kolik asit) hidrolizi, bazı patojen mikroorganizmalara karşı inhibitör
etkileri, antimikrobiyal aktiviteleri ve kolesterol asimilasyonunun belirlenmesi
hedeflenmiştir. Değişik pH koşullarında (2.0, 2.5 ve 3.0) asitliğe en dirençli suşlar L.
fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25
olarak tespit edilmiştir. Yüksek safra tuzu konsantrasyonlarında (%0.3, %0.5, %1.0 ve %
1.5) L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L.
plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 suşları canlılığını
koruyabilmiştir. Ayıca safra tuzu (kolik asit) hidrolizi çalışmasında genel olarak iyi
sonuçlar elde edilmiş, en yüksek değerleri ise L. pentosus LS-2 suşunda
gözlemlenmiştir. Bu suşların antimikrobiyal aktivitelerinin tespiti için yapılan çalışmada
13 farklı antibiyogram diski denenmiş, suşların genelinin antibiyotiklere karşı duyarlı
oldukları gözlemlenmiştir. Lactobacillus suşlarının patojen mikroorganizmalar üzerine
inhibitör etkilerinin tespiti üzerine E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853),
K. pneumoniae (ATCC 25656), S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp.
patojenleri ile bir çalışma yapılmıştır. Lactobacillus suşları genel olarak patojenlere karşı
inhibitör etki göstermişlerdir. Ayrıca Lactobacillus suşlarının laktik asit dışında ürettiği
antimikrobiyal maddelerin inhibitör etkisinin belirlenmesi üzerine yapılan bir başka
çalışmada
ise
pH’sı
yükseltilmiş
süpernatantların
patojenler
üzerine
etkisi
gözlemlenmemiştir. Kolesterol asimilasyonunun belirlenmesi için yapılan çalışmada ise
düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik
etkiye sahip 5 suş L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L.
plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15 seçilmiş ve kolesterol
giderimi çalışılmıştır. Kültürler MRS sıvı besi yerinde 10-22 µg/ml, %0.3’lük yüksek
i
safra tuzlu MRS sıvı besi yerinde 14-50 µg/ml, %0.3’lük kolik asitli MRS sıvı besi
yerinde 8-13.5 µg/ml ve %0.3’lük taurocholic asit’li MRS sıvı besi yerinde 15-55 µg/ml
kolesterol asimilasyonu yapmıştır.
ii
ABSTRACT
Lactobacillus spp. strains isolated from the stool of 48 patients between the ages
of 25 and 50 who resorted to the Kırşehir state hospital with various complaints without
having a problem with their digestive system, were used in this study. The aim targeted
was the designation of the low pH resistance, the tolerance against concentrations of
high bile salt (oxgall) and the hydrolysis of bile salt (cholic acid), the inhibitory affects
on some pathogen microorganisms, the designation of antimicrobial activity and
cholesterol assimilation of all strains of which there were a total of 25. It has been found
that the most resistant strains towards acidity under various pH conditions were L.
fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 and L. fermentum2 LS25. Strains L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 were able to
maintain their vitality in high concentrations of bile salt. Furthermore pleasing results
were obtained from the bile salt hydrolysis study in general and the highest values were
observed in the L. pentosus LS-2 strain. In the study which was conducted in order to
estimate the antimicrobial activity of these strains, 13 different antibiogram disks were
tried and it was observed that overall the strains were sensitive to antibiotics. A study
was conducted with E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K.
pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) and Neisseria sp. pathogens
on the estimation of the inhibitory effects of Lactobacillus strains on pathogen
microorganisms. Overall the Lactobacillus strains displayed an inhibitory effect on the
pathogens. Furthermore the effect of supernatants with an increased pH on pathogens
was observed in a different study concerning the estimation of the inhibitory effects of
Lactobacillus strains on antimicrobial substances it produces other than lactic acid. And
in the study which was conducted in order to estimate the cholesterol assimilation 5
strains L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11,
L. plantarum1 LS-12 and L. fermentum2 LS-15 which have low acidity, are resistant to
high bile salt, have a high bile salt activity and have an antagositic effect were chosen
and removal of cholesterol was studied. The cultures made cholesterol assimilation of
iii
10-22 µg/ml in the MRS liquid feedlot, of 14-50 µg/ml in the MRS liquid feedlot with
0.3 %, of 8-13.5 µg/ml in the MRS liquid feed lot with 0.3 % cholic acid and of 15-55
µg/ml in the MRS liquid feedlot with 0.3 % taurocholic acid.
iv
TEŞEKKÜR
Çalışmam boyunca yardımlarını benden esirgemeyen değerli danışman hocam
Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ’a ve değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Belgin ERDEM’e,
laboratuvar çalışmalarımda bana her zaman yardımcı olan hocam Arş. Gör. Tayfun
KAYA ve hocam Dr. Şener TULUMOĞLU’na, örnek toplamamda bana her konuda
yardımcı olan Kırşehir Devlet Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı çalışanlarına, her
zaman yanımda olan dostluklarını ve yardımlarını benden esirgemeyen arkadaşlarıma,
hayatım boyunca beni yalnız bırakmayan maddi-manevi destekleyen ve moral veren
aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
v
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET...................................................................................................................................i
ABSTRACT..................................................................................................................... iii
TEŞEKKÜR.......................................................................................................................v
İÇİNDEKİLER .................................................................................................................vi
TABLOLAR DİZİNİ ........................................................................................................ix
ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................................x
RESİMLER DİZİNİ..........................................................................................................xi
SİMGELER VE KISALTMALAR................................................................................. xii
1. GİRİŞ .............................................................................................................................1
2. TEORİK ALT YAPI ......................................................................................................4
2.1. PROBİYOTİKLER .................................................................................................4
2.1.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi ................................................................4
2.1.2. Probiyotik Olarak Kullanılan Mikroorganizmalar ...........................................5
2.1.3. Probiyotik Mikroorganizmalarda Aranan Özellikleri ......................................6
2.1.4. Probiyotiklerin Etki Mekanizması ...................................................................7
2.1.5. Probiyotiklerin Sağlık Üzerine Etkileri............................................................8
2.1.6. Probiyotiklerin Yan Etkileri ...........................................................................10
2.1.7. Probiyotik Ürünler ve Ticari Önemleri ..........................................................11
2.2. PREBİYOTİKLER ve SİNBİYOTİKLER............................................................11
2.2.1. Prebiyotikler...................................................................................................11
2.2.2. Sinbiyotikler...................................................................................................12
2.3. Lactobacillus CİNSİNE AİT BAKTERİLERİN ÖZELLİKLERİ ........................12
2.3.1 Lactobacillus Türlerinin Ürettikleri Antimikrobiyal Maddeler ......................15
2.3.1.1. Laktik asit................................................................................................15
vi
2.3.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2) ........................................................................17
2.3.1.3. Bakteriosin ..............................................................................................17
2.4. BAĞIRSAK MİKROFLORASI............................................................................18
2.5. ANTAGONOSTİK ETKİDE KULLANİLAN MİKROORGANİZMALAR ......19
2.5.1. Escherichia coli..............................................................................................20
2.5.2. Staphylococcus epidermidis ...........................................................................20
2.5.3. Neisseria sp. ...................................................................................................21
2.5.4. Klebsiella pneumoniae ...................................................................................21
2.5.5. Pseudomonas aeruginosa ..............................................................................22
3. MATERYAL VE METOD ..........................................................................................23
3.1. MATERYAL.........................................................................................................23
3.1.1. Materyal Örnekleri .........................................................................................23
3.1.2. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları......................................23
3.1.3. Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri ..............................................................24
3.2.METOD..................................................................................................................28
3.2.1. İzolatların İzolasyonu ve İdendifikasyonu .....................................................28
3.2.2. Lactobacillus spp. Suşlarının Muhafazası......................................................28
3.2.3. Patojen Suşların Aktifleştirilmesi ve Muhafazası ..........................................29
3.2.4. Asit Dirençliliğinin Belirlenmesi ...................................................................29
3.2.5. Yüksek Safra Tuzu (Oxgall) Konsantrasyonlarına Dirençliliğin Belirlenmesi
..................................................................................................................................29
3.2.6. Safra Tuzu (Kolik Asit) Hidrolizinin Belirlenmesi........................................30
3.2.7. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi ......................................................30
3.2.8. Bazı Patojen Mikroorganizmalara Karşı Antagonostik Etkilerin Belirlenmesi
..................................................................................................................................31
vii
3.2.9. Lactobacillus spp. Suşları Tarafından Üretilen Bakteriosin veya Bakteriosin
Benzeri Maddelerin İnhibitör Etkisinin Belirlenmesi ..............................................31
3.2.10. Lactobacillus spp. Suşlarının Kolesterol Giderimi ......................................32
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ....................................................................................34
4.1. İZOLATLARIN İDENDİFİKASYONU ..............................................................34
4.2. Lactobacillus spp. SUŞLARIN ASİT DİRENÇLİLİĞİ........................................37
4.3. Lactobacillus spp. SUŞLARIN YÜKSEK SAFRA TUZU (OXGALL)
KONSANTRASYONLARINDA DİRENÇLİLİĞİ.....................................................39
4.4 Lactobacillus spp. SUŞLARININ SAFRA TUZU (KOLİK ASİT) HİDROLİZİ .41
4.5. Lactobacillus spp. SUŞLARININ ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ ........44
4.6. Lactobacillus spp. SUŞLARIN BAZI PATOJEN MİKROORGANİZMALARA
KARŞI ANTAGONİSTİK ETKİLERİ ........................................................................47
4.7. Lactobacillus spp. SUŞLARI TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİOSİN
VEYA BAKTERİOSİN BENZERİ MADDELERİN İNHİBİTÖR ETKİLERİ..........50
4.8. Lactobacillus spp. SUŞLARININ KOLESTEROL GİDERİMİ...........................50
5. SONUÇ VE ÖNERİLER .............................................................................................54
6. KAYNAKÇA...............................................................................................................60
viii
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 1. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar ....................................................6
Tablo 2. Gaitadan izole edilerek tanımlanan suşların adları ve kodları ...........................36
Tablo 3. Lactobacillus suşlarının düşük pH (2.0, 2.5 ve 3.0) derecelerine toleransı. (24
saat sonra).........................................................................................................................37
Tablo 4. Lactobacillus spp. suşlarının değişik düzeyde (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5)
safra tuzu (oxgall) toleransı..............................................................................................40
Tablo 5. Lactobacillus spp. suşlarının safra tuzu hidroliz (kolik asit) aktivitesi. ............42
Tablo 6. Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı
duyarlılık sonuçları (mm).................................................................................................45
Tablo 7. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık
sonuçları. ..........................................................................................................................46
Tablo 8. Lactobacillus spp. suşlarının değişik patojen bakterilerine karşı oluşturdukları
antagonistik etkileri (mm). ...............................................................................................49
Tablo 9: Bazı Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besiyerinde ve değişik safra tuzu ( %
0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) besiyerinde kolesterol giderimi (µg/ml). ........51
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1. Gastrointestinal sistemin değişik kısımlarında yer alan mikroorganizmalar . ....19
Şekil 2. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık
oranları. ............................................................................................................................47
Şekil 3. L. delbrueckii ssp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L.
plantarum LS-12 ve L.fermentum LS-15 suşlarının kolesterol giderim miktarları (µg/ml).
..........................................................................................................................................52
x
RESİMLER DİZİNİ
Resim 1: MRS Agar üzerinde 48 saat inkbasyona bırakılmış L. salivarius LS-22 suşunun
Samsung S760 fotoğraf makinesi ile çekilmiş görüntüsü. ...............................................34
Resim 2: L. pentosus LS-2 suşunun Olympus, CH-2 CHT model ışık mikroskobunda
100x10 büyütmede görünümü .........................................................................................35
Resim 3: Hidroliz edilmemiş kolik asit kristali. Novax AP-5 50920 binoküler
mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü. .................................................................43
Resim 4: L. pentosus LS-2 suşunun gerçekleştirdiği safra tuzu (kolik asit) hidrolizi.
Kolik asit kristallerinin parçalanmış hali. Novax AP-5 50920 binoküler mikroskobunda
20X büyütmedeki görüntüsü. ...........................................................................................43
xi
SİMGELER VE KISALTMALAR
KISALTMALAR
ATCC
Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu
BSH
Safta Tuzu hidrolizi
BKZ
Bakınız
FAO
Gıda ve Tarım Örgütü
GDO
Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar
GRAS
Genellikle güvenli olarak tanınan
KOB
Koloni Oluşturma Birimi
LAB
Laktik Asit Bakterileri
MRS
Man Ragosa and Sharpe
NCCLS
Klinik Laboratuar Standartları Ulusal Komitesi
RPM
Devir Sayısı
Spp.
Species Plural
Subsp.
Subspecies
WHO
Dünya Sağlık Örgütü
SİMGELER
mm
Milimetre
nm
Nanometre
°C
Santigrad
µ
Mikron
µL
Mikrolitre
ml
Mililitre
w/v
Weight/Volume
µg
Mikrogram
µm
Mikrometre
xii
dl
Desilitre
mg
Miligram
g
Gram
L
Litre
xiii
1. GİRİŞ
Mikroorganizmalara karşı insanlarda olumsuz bir ön yargı vardır. Genel kanı
mikroorganizmaların zararlı olduğu yönündedir. Bu ön yargılı yaklaşımla
mikroorganizmalardan korkan insanlar günlük yaşantılarında mikroorganizmaları
‘mikrop’ olarak adlandırmakta ve korunmaya çalışmaktadırlar.
Bu önyargılı yaklaşıma rağmen, İnsan vücudu, sahip olduğu ısı ve besin
maddeleri sayesinde çeşitli mikroorganizmalar için son derece elverişli bir ortam
oluşturmaktadır. Bu ortamda yararlı ve zararlı mikroorganizmalar bir rekabet
içindedirler. Genel olarak sağlıklı bir insanda yararlı mikroorganizmalar daha baskın
ve vücut hücreleri ile birlikte uyumlu bir şekilde çalışmaktadırlar 1-4.
Son yıllarda insan vücudunda yaşayan mikroorganizmalar birçok bilim
insanının dikkatini çekmiştir. Bu mikroorganizmalar inceleme altına alınmış, yeni
projeler ve çalışmalar başlatılmıştır. Bu alanda yürütülen projeye ‘mikrobiyom
projesi’ denilmektedir. Henüz yeni bir proje olmasına karşın ulaşılan bilgiler son
derece önemlidir 5,6.
Yeni doğmuş bir bebek steril durumdadır. Doğum anından itibaren çevrede
bulunan mikroorganizmalar bebeğin vücuduna yerleşmeye başlar, 1-2 gün içinde bu
mikroorganizmaların sayısı 109 -1010’u bulur. Bebeğin vücuduna yerleşen
mikroorganizmaların tür ve sayısı bebeğin bulunduğu ortama, beslenme şekline ve
doğum şekline bağlı olarak değişim gösterir. Bebekte anne sütü kesildiğinde, yetişkin
floranın oluşumu başlar 7-10.
Yetişkin bir insan vücudu yaklaşık 1013 hücreden oluşmakla birlikte bunun 10
katı kadarda zararlı ve yararlı, 500 farklı türde mikroorganizmaya ev sahipliği
yapmaktadır. Bir başka ifade ile vücudun değişik sistemlerinde, sistemin işlevine
göre belirli miktarlarda mikroorganizmalar yer alır. Örneğin; deride 200 gr, ağız
boşluğunda 20 gr, akciğerlerde 20’şer gr, burunda 10 gr, gözde 1 gr ve
gastrointestinal sistemde 1-2 kg mikroorganizma vardır 11-17.
1
Sindirim sistemi çok geniş bir alana sahiptir ve işlevsel olarak çok fazla
miktarlarda besin maddesi içermektedir. Bu sistemin yüzey alanı yaklaşık 400
m2’den oluşmaktadır ve bunun 200 m2’de bağırsak mukozası yer alır. Yaşam için
gerekli olan enerji ve yapısal madde taşları dışarıdan beslenerek temin edilir.
Dışarıdan alınan bu besinler sindirim sisteminden geçerek işlevsel hale getirilir. Bir
insanın ömrü boyunca sindirim kanalından ortalama 60 ton yiyeceğin geçtiği
hesaplanmıştır. Sağlıklı bir yaşam için sindirim sisteminin çok düzenli bir şekilde
çalışması gerekmektedir. Bu sistemin önemini Hipokrat şöyle ifade etmiştir. “Bütün
hastalıklar bağırsaktan başlar. Bağırsak hasta ise vücudun geri kısmı da hastadır” 7, 13,
15-20
.
Bu kadar geniş yüzeye sahip ve bu kadar işlevsel bir sistemin elbette bir
yardımcıya
ihtiyacı
vardır.
Gastrointestinal
sistemde
yaşayan
yararlı
mikroorganizmalar, içinde bulunduğu sistem için çok önemli reaksiyonlar
gerçekleştirerek
bu
sistemin
düzenli
çalışmasına
büyük
ölçüde
katkı
sağlamaktadırlar. Bu mikroorganizmalar genel olarak probiyotiklerdir.
Probiyotikler, ağız yolu ile alındığında konakçıya belirgin bir yarar sağlayan,
düşük pH’da dayanıklı, bağırsak epiteline tutunabilen, patojen olmayan canlı
mikroorganizmalardır. Probiyotik kelime olarak Yunanca ‘pro’ ve ‘biota’
kelimelerinden türetilmiştir. ‘Yaşam için’ anlamına gelen probiyotik, antibiyotik
kelimesi ile zıt anlamlıdır 21-24.
İnsanlar probiyotikleri
doğal
yollarla almaktadırlar. Eski
insanların
diyetlerine bakıldığında günümüz insanlarından kat kat daha fazla fermente süt
ürünleri tükettikleri görülmektedir. Günümüzde ise insanların diyetlerinde rafine
edilmiş, işlenmiş gıdalar yer almaktadır. Ayrıca hareketsiz yaşam, stres, antibiyotik
kullanımı, sigara ve alkol kullanımı gibi etkenler sağlıklı bir yaşam için olumsuz
etkiler oluşturmaktadır. Bu durumdan bağırsak florası da olumsuz etkilenmektedir ve
sayıları azalmaktadır. Bu nedenlerden dolayı bağırsak florasını uygun sayıda
tutabilmek için ekstradan probiyotik takviyeleri yapma gereği doğmuştur 4,9,18,25.
2
Bu çalışmanın amacı; Kırşehir Devlet Hastanesine belirli bir şikayetle
başvurmuş 25-50 yaş arası sindirim sistemi problemi bulunmayan 48 hastanın
gaitasından izole edilerek tanımlanan Lactobacillus türlerinin, düşük pH ve yüksek
safra konsantrasyonlarında dayanıklılıklarının, safra tuzu hidrolizinin, antimikrobiyal
aktivitelerinin
belirlenmesi,
serum
kolesterol
giderimi
ve
bazı
patojen
mikroorganizmalara karşı antagonistik etkilerinin ortaya çıkarılması hedeflenmiştir.
Böylelikle günlük hayatta normal beslenen kişilerin bağırsak florasında probiyotik
tür varlığı belirlenmiş olacağı düşünülmüştür.
3
2. TEORİK ALT YAPI
2.1. PROBİYOTİKLER
2.1.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi
Probiyotik, Yunanca iki kelime ‘pro’ ve ‘biota’ dan türetilmiştir ve ‘yaşam
için’, ‘yaşamsal’ anlamlarına gelmektedir
anlamlıdır
çıkmıştır
28
29
12,26,27
. Antibiyotik kelimesiyle zıt
. Probiyotik kavram olarak ilk kez 19. yüzyılın sonlarına doğru ortaya
ve günümüze değin birçok bilim insanı tarafından tanımlandırılmaya
çalışılmıştır.
Bu kavramı ilk kez 1908 yılında Nobel ödüllü Rus bilim adamı Élie
Metchnikoff tanıtmıştır. Yaşlanma üzerine bir takım çalışmalar yapan Metchnikoff,
Kafkas ve Bulgar köylülerinin uzun ömürlü olduklarını fark etmiş ve bu durumu
köylülerin çok fazla miktarda fermente süt ürünlerini tüketmelerine bağlamıştır.
Metchnikoff fermente süt tüketimi ile bağırsak florasının olumsuz etkilerinin ortadan
kaldırılabileceği ve böylece insanların daha uzun süre yaşayabileceklerini bildirmiştir
18,30-32
.
Probiyotik terim olarak ise ilk kez 1954 yılında Ferdinand Vergin tarafından
kullanılmıştır. Vergin ‘Anti und probiotika’ adlı makalesinde probiyotiklerin
antibiyotik ve antimikrobiyal maddelerin tersine yaşam için yararlı olduğunu göstermiştir 33,34. Bu çalışmadan 11 yıl sonra Lilly ve Stillwell yaptıkları çalışmalarında bir
protoza tarafından salgılanan bir maddenin başka bir protozanın gelişimini teşvik
ettiğini gözlemlemişler ve probiyotikler tarafından üretilen maddelerin diğer
mikroorganizmaların gelişmesini teşvik edici olduklarını göstermişlerdir 33,35.
Probiyotiklerin günümüzde en çok kabul gören tanımı 1989 yılında Roy
Fuller tarafında yapılmıştır. Fuller’e göre Probiyotik, “tüketicinin intestinal florasını
koruyup gelişmesine yardımcı olan canlı mikrobiyal gıda katkılarıdır.” şeklindedir 36.
4
Avrupa Birliğinin girişimleri ile 1995’te Brüksel’de yapılan probiyotik
konulu uzmanlar toplantısında probiyotikler için şu tanım yapılmıştır; sağlığa
koruyucu etki gösteren, sindirim, üreme ve solunum sistemleri üzerinde yararlı
etkileri olan, canlı, bir ya da birkaç belirli mikroorganizma tarafından oluşan
kültürler olarak tanımlanmıştır 37.
2.1.2. Probiyotik Olarak Kullanılan Mikroorganizmalar
Kullanılmasıyla birlikte tüketicinin intestinal florasını düzelterek yararlı bir
şekilde etkileyen canlı mikroorganizmalar olan probiyotikler genel olarak LAB
(Laktik Asit Bakterileri) grubundadır. Yoğurt yapımında kullanılan Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus dışındaki tüm laktik
asit bakterileri bağırsak florası elemanlarıdır. Bununla birlikte bazı küf ve maya
türlerinin de probiyotik özelliğe sahip olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir
23
.
Tropikal bir meyvenin kabuğundan izole edilen Saccharomyces boulardii’nin
probiyotik özelliğinin keşfedilmesi buna bir örnektir 12.
Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar tablo 1’de verilmiştir.
5
Tablo 1. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar 38-41.
BAKTERİLER
Lactobacillus
L. bulgaricus
L. rhamnosus
L. cellebiosus
L. delbrueckii
L. lactis
L. acidophilus
L. reuteri
L. brevis
L. casei
L. curvatus
L. fermentum
L. plantarum
L. johsonli
L. helveticus
L. salivarius
L. gasse
L. sporogenes
Bifidobacterium
B. adolescentis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. longum
B. thermophilum
Propionibacterium
P. shermanii
P. freudenreichii
Bacteriodes
B. capillus
B. suis
B. ruminicola
B. amylophilus
Leuconostoc
L. mesenteroides
KÜF VE MAYALAR
Pediococcus
P. cerevisiae
P. acidilactici
P. pentosaceus
Streptococcus
S. cremoris
S. intermedius
S. lactis
S. diacetilactis
Bacillus
B. subtilis
B. pumilus
B. lentus
B. licheniformis
B. coagulans
Aspergillus
A. niger
A. oryzae
Saccharomyces
S. cerevisiae
S.boulardii
Candida
C. torulopsis
2.1.3. Probiyotik Mikroorganizmalarda Aranan Özellikleri
Bir mikroorganizmanın probiyotik olarak insanlar tarafından kullanılabilmesi
için öncelikli olarak deneysel ve klinik çalışmalarla o mikroorganizmanın probiyotik
özelliklerinin kanıtlanması gerekmektedir. Bu çalışmaların iki temel amacı vardır.
Birinci amaç probiyotik türlerin belirlenmesi ve bu türlerin sahip olduğu özelliklerin
gösterilmesidir. Burada gösterilmek istenen probiyotik özelliklerin türe özgü
olmasıdır. İkinci amaç ise seçilen probiyotik türlerin etki mekanizmalarının
gösterilmesidir 42.
Probiyotik mikroorganizmalarda aranan özellikler aşağıda sıralanmıştır 4, 43-45.
 Sindirim sırasında meydana gelen olaylardan etkilenmeden canlılıklarının
sürdürebilmelidirler,
 Özellikle
asit
ve
safra
yoğunluğu
gösterebilmelidirler,
6
yüksek
ortamlarda
faaliyet
 Bağırsak epiteline tutunabilme özelliği gösterebilmelidirler,
 Sindirim sistemi mikroflorasının dengede tutulmasını sağlamalı, patojenlerin
gelişimini
engellemeli,
tüketilen
gıdaların
yararlanma
derecesini
artırmalıdırlar,
 Antibakteriyel direnci patojen mikroorganizmalara nakletmemelidirler,
 İlave edildiği gıdanın kalitesini düşürmemelidirler,
 Patojenler üzerine inhibitör etki yapmalıdırlar,
 Metabolik aktiviteyi düzenlemelidirler,
 Gıda allerjilerine ve patojenlere karşı immun sistemi güçlendirebilmelidirler,
 Konakçının gıdalardan daha fazla yararlanmasını sağlamalıdırlar,
 Patojen ve toksijenik olmamalıdırlar,
 Mikroorganizmanın adaptasyonunu kolaylaştırmak için insan orijinli suşlar
seçilmelidir,
 Depolama ve kullanma süresince canlı kalmalıdırlar.
2.1.4. Probiyotiklerin Etki Mekanizması
Probiyotik mikroorganizmalar, bağırsak sisteminin mikrobiyal dengesini
düzenleyerek yararlı etkiler göstermektedirler. Probiyotiklerin bu yararlı etkileri 3
mekanizma üzerinden gerçekleşmektedir 23.
1. Patojen mikroorganizmaların sayılarını azaltmak
 Antimikrobiyal bileşikler üretmeleri,
 Besin maddeleri için rekabet etmeleri,
 Kolonizasyon bölgeleri için rekabet etmeleri.
2. Mikrobiyal metabolizmayı (enzimatik aktiviteyi) değiştirmek
 Sindirim sistemini düzenleyen enzimlerin üretimi,
 Amonyak, amin veya toksik enzimlerin üretiminin azalması,
 Bağırsak duvarının fonksiyonlarının iyileştirilmesi.
7
3. Bağışıklık sistemini iyileştirmek
 Antikor düzeyinin artması,
 Makrofaj aktivitesinin artması.
2.1.5. Probiyotiklerin Sağlık Üzerine Etkileri
Metchnikoff köylülerin daha uzun ve sağlıklı bir ömür sürdüklerini
gözlemlemiş ve bunu köylülerin fermente süt tüketmeleriyle ilişkilendirmiştir.
Metchnikoff’a göre insan yaşamının kalitesi ile bağırsak fonksiyonlarının bir
bağlantısı vardır ve fermente süt tüketimi de bağırsaklarda yararlı etki yaparak
bağırsak fonksiyonlarının daha iyi olmasını sağlamaktadır 30.
Teknolojik
gelişmelerle
birlikte
yapılan
tıbbi
çalışmalar
bugün
göstermektedir ki probiyotiklerin doğrudan ve dolaylı olarak vücut için yararlı
etkileri vardır. Probiyotiklerin deneysel verilerle kanıtlanmış yararlı etkileri şunlardır
23
:
Bağırsak epitelinin koruyucu görevi;
•Epiteller arası direnci arttır,
•Mukus üretimini arttır,
•Epitel glikolizasyonunu yönlendirir,
•Epitel hücre iskeletini ve sıkı bağlantı bütünlüğünü sağlamlaştırır,
•Epitel onarımını destekler,
•Epitel hücrelerin ölümünü (apoptoz) önler
•Antioksidan etki gösterir.
Bağışıklık sisteminin yönlendirilmesi;
•Lokal ve toplam IgA üretimini arttırır,
•T hücresi yanıtını azaltır,
•Fagositik etkinliği arttırır,
•Bağışıklık hücrelerinin apoptozunu arttırır,
•Sitokin profillerini değiştirir,
8
Bağırsak mikroflorasının doğrudan değişimi;
•Patojenin bağırsak duvarına tutunması ile yarışır (yarışmacı dışlama),
•Bakteriyosin üretimini arttırır,
•Bağırsak lümeninin pH’ını organik asitlerin üretimi yolu ile düşürür.
Yapılan
çalışmalarla
yararlı
etkileri
kanıtlanan
probiyotik
mikroorganizmaların bazı klinik uygulamaları aşağıda sıralanmıştır.
Akut ishal tedavisinde;
Dünyada her 15 saniyede bir çocuk ishal nedeni ile ölmektedir
46
. Yapılan
kontrollü çalışmalarda Lactobacillus rhamnosus GG verilen çocuklarda akut
ishallerinin sürelerinin kısaldığı gözlemlenmiştir. Rotavirüs etkenli akut ishallerde
bazı probiyotik türlerin etkinliği gözlemlenmiştir. Bu türlere L. rhamnosus GG, L.
reuteri, L. casei ve Bifidobacterium lactis örnek verilebilir 47, 48
Antibiyotik kullanımına bağlı ishal tedavisinde;
Antibiyotik kullanılması ile birlikte bağırsak florası sayı ve tür açısından
değişim gösterir. Antibiyotik kullanımı ile karşılaşılan ishallerde genellikle
Clostridium difficile’nin sayısal olarak artması sorumludur. Antibiyotik kullanılması
ile meydana gelen ishallerin tedavisinde Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L.
casei ve Saccharomyces boulardii kullanılmaktadır. S. boulardii, C. difficile’in
toksinlerini bağlayarak etkili olmaktadır 49, 50.
Helicobacter pylori enfeksiyonunda;
H. pylori gastrit, ülser ve mide kanserine yol açan gram negatif bir patojendir.
Yapılan laboratuar çalışmaları bazı Lactobacillus türlerinin H. pylori’ye karşı
antagonistik etkisinin olduğunu göstermiştir
18
. Ancak bu konuda kullanılacak
probiyotik türün tam olarak tespit edilmemesi, uygun miktar ve zamanın
belirlenememesi
nedeniyle probiyotiklerin tedavi
edilmemektedir 51,52.
9
amaçlı
kullanımı
tavsiye
Kolorektal kanser tedavisinde;
Probiyotiklerin
insanlarda,
prokarsinojenlerin
aktif
karsinojenlere
dönüşümünü engelledikleri, mutajenik bileşikleri bağlayıp inaktive ettikleri,
antimutajenik madde salgıladıkları, prokarsinojen bakterileri inhibe ettikleri,
mutajenlerin bağırsaklardan emilimini azaltarak immün sistemi güçlendirdikleri
bilinmektedir. Probiyotikler bu özellikleri sayesinde kolorektal kanser gelişimini
önlediği bildirilmiştir
45,53
. Ayrıca büyük çapta yapılan araştırmalar da fermente süt
ürünlerinin tüketimi ile kolon ve meme kanseri gelişimi arasında ters bir ilişki
gözlemlenmiştir 54.
Serum kolesterol seviyesinin düşürülmesinde;
Probiyotiklerin kan serum düzeyini düşürücü etki gösterdikleri bazı klinik
çalışmalarla kanıtlanmıştır. Vücutta sentezlenen ya da dışarıdan alınan kolesterol
safra asitlerine dönüşmektedir. Bazı probiyotik türler, örneğin; L. acidophilus, bu
safra asitlerini konjuge edebilme özelliğine sahiptirler. Konjuge edilen safra asitleri
lipitlere göre daha kolay emilir. Bu sayede serum kolesterol seviyesinde düşme
meydana gelir. Bu konuda yapılan bir çalışmada hiperlipidemik hastalara 3 ay
süreyle L. sporogenes verildiğinde serum kolesterol düzeyinin % 32 oranında
azaldığı gözlemlenmiştir 4, 55-57.
2.1.6. Probiyotiklerin Yan Etkileri
Probiyotikler patojen olmayan mikroorganizmalar olsalar da bağışıklık
sistemi iyice zayıflamış kişiler için tehlikeli olabilmektedirler. Bağışıklık sistemi
zayıflamış kişilerde probiyotiklerin sistemik enfeksiyonlara yol açtığı bildirilmiştir.
Bunun yanı sıra probiyotiklerin olası diğer yan etkileri metabolizma değişikliği ve
gen transferidir
47,58,59
. Probiyotiklerle ilgili olarak insanların bir diğer endişesi de
kullanılan preparatların GDO (genetik yapısı değiştirilmiş organizmalar) olup
olmadığı konusudur 43.
10
2.1.7. Probiyotik Ürünler ve Ticari Önemleri
Probiyotik ürünler, vücut için yararlı olduğu kanıtlanmış probiyotik
mikroorganizmaların eklenerek tüketicilere sunulan ürünlerdir. Bu ürünlerin en
başında yoğurt, kefir ve peynir gibi fermente süt ürünleri gelmektedir. Gelecekte
probiyotik et ürünlerinin de üretilmesi planlanmaktadır 60.
Probiyotik mikroorganizmalar belirli bir araştırma sonucu yararlı oldukları
anlaşılan canlılardır. Probiyotikler üzerine yapılan çalışmalar her ne kadar gün
geçtikçe artmış olsa da bazı nedenlerden dolayı sınırlı kalmıştır 61.
Bu nedenler, çok fazla sayıda probiyotik tür ve suşun bulunması, bu canlılara
ait özelliklerin tam olarak bilinmemesi, farklı muhafaza koşullarının bu canlıları nasıl
etkileyeceğinin tam olarak bilinmemesi, tek suşun bile bireylerde farklılık göstermesi
ve detaylı klinik uygulamaların maliyetinin yüksek olmasıdır 61.
Probiyotik ürünlere karşı olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Bu durum
üreticilerin dikkatini çekmekte ve bu yönde ürün pazarlamaktadırlar. Tüketicilerin bu
konuda çok dikkatli olmaları gerekmektedir. Ürün alımında markalı ve patentli
ürünleri tercih edilmelidir 42, 61.
2.2. PREBİYOTİKLER ve SİNBİYOTİKLER
2.2.1. Prebiyotikler
Kolon bakterilerinin çoğalmalarını sağlayan, aktivitelerini artıran, kolonize
olmalarını kolaylaştıran ve fermente olabilen gıda katkılarıdır. Probiyotiklerin ihtiyaç
duydukları besin maddeleri olan prebiyotikler sindirilmeyen karbonhidratlardır 62-64.
11
Disakkaritlerden olan laktuloz, inülin en çok bilinen prebiyotiklerdir.
Bunların dışında oligosakkaritleden maltoz, ksiloz ve galaktooligosakkaritlerden
oligofruktoz, galaktoz diğer prebiyotik besinsel kaynaklardır 65.
Hindiba ve enginar en fazla prebiyotik içeren besinlerdir. Bunların dışında
arpa, buğday, çavdar, soğan, sarımsak, muz, kuş konmaz ve pırasa da prebiyotik
ihtiva eden besin kaynaklarıdır 64.
Bir besin kaynağının prebiyotik olarak kullanılabilmesi için şu özellikleri
taşıması beklenir 62,66.
 Sindirime dirençli olmalı,
 Kolon mikroflora bakterileri tarafından hidrolize edilmeli,
 Bir veya kısıtlı sayıda olmak üzere daha çok bakterinin çoğalmasını
stimüle etmeli,
 Konakçının sağlığı üzerinde olumlu etkileri olmalı
2.2.2. Sinbiyotikler
Sinbiyotikler,
probiyotiklerle
birlikte
prebiyotiklerin
karıştırılarak
hazırlanmasıyla oluşan besin ve destek amaçlı ürünlerdir. Probiyotiklerin besin
maddesi olan prebiyotiklerle birlikte verilmesi ile onların daha uzun süre canlı
kalabilecekleri düşünülmektedir. Böylece sinbiyotiklerin sağlığa olumlu etkileri
probiyotik ve prebiyotiklerin ayrı ayrı uygulanmalarına göre daha fazla olacağı ön
görülmektedir
67,68
. Lactobacillus türleri ile Lactitol’un birlikte verilmesi buna bir
19
örnektir .
2.3. Lactobacillus CİNSİNE AİT BAKTERİLERİN ÖZELLİKLERİ
Lactobacillus cinsi bakteriler Lactobacillaceae familyasına ait olup LAB
(Laktik Asit Bakterileri) grubundandır. Lactobacillus türleri gram pozitif, katalaz
12
negatif, spor oluşturamayan, genelde hareketsiz, fakültatif anaeorob veya
mikroaerofilik mikroorganizmalardır. Çoğu basil olmakla birlikte bazı türler kokobasildir 69-71.
Lactobacillus türlerinin gelişebilmeleri için aminoasit, peptit, nükleik asit
türevi vitamin, tuz, yağ asidi veya yağ asidi esterleri ile fermente edebilecekleri besin
maddelerine ihtiyaç duyarlar
72
. Ayrıca gelişebildikleri optimum sıcaklık 30-40°C
arasıdır. Bu mikroorganizmalar fermentasyon sonucu laktik asit ürettikleri için
ortamı pH’sını 3.2-3.5’e kadar düşürürler. Bu nedenle de aside dayanıklıdırlar 73.
Elektron mikroskobuyla yapılan incelemelerde Lactobacillus cinsi bakteriler
5 ana kısımdan oluştuğu gösterilmiştir. Bunlar hücre duvarı, sitoplazmik membran,
ribozomlar ve nükleer (kromozomlar ve plazmidler) elementlerdir 74.
Hücre duvarı; Lactobacillus cinsi bakterilerde 20-40 nm kalınlığında, mineral
maddeler (tuz vb.), su ve metabolitleri geçirebilen peptidoglikan (murein) bir
tabakaya sahiptirler Peptidoglikan, N-asetilglikozamin ve N-asetilmurminik asit
monomerlerinden oluşurlar. Hücre çeperinde bu monomerlerin dışında teikoik asit,
şekerler, proteinler ve nötr polisakkaritler de bulunur. Teikoik asit hücre duvarının
negatif yükünden ve antijenik karakterinden sorumludur. Teikoik asit, ribitol fosfat
veya gliserol fosfat polimerlerinden oluşurlar. Bakterilerin hücre duvarı, çoğalma ve
azotlu maddelerin parçalanmasında rol alan proteaz enzimlerine sahiptirler 74.
Probiyotiklerin en önemli karakteristik özelliklerinden bir tanesi bağırsak
adhezyon yeteneğine sahip olmalarıdır. Bu yeteneğinde hücre duvarında bulunan
teikoik asit ve lektin benzeri maddelerden kaynaklandığı belirtilmiştir 75.
Sitoplazmik membran; Laktik asit bakterilerinin proteinleri kullanabileceği
büyüklüğe getirilmesi için gerekli olan enzimler burada bulunmaktadır. Aynı
zamanda bu reaksiyon sitoplazmik membranda gerçekleştirilmektedir. Bunun
yanında sitoplazmik membranda fosfotransferaz enzimleriyle aktif taşımada
13
yapılmaktadır. Peptidoglikanların ekstrasellüler polimerizasyonu için gereken
enzimler de sitoplazmik membranda bulunmaktadır 74.
Ribozomlar: LAB ribozomları 70S tipindedir. 70S, 50S büyük ve 30S küçük
olmak üzere iki alt üniteden oluşur. 50S’lik büyük alt birim 5S r-RNA ve 23S r-RNA
ile yaklaşık 35 çeşit protein; 30S’lik küçük alt birim ise 16S r-RNA ve 25 farklı
protein içerir. Laktik asit bakterilerinin birbirlerinden ayırımında 16S r-RNA’nın
özelliklerinden yararlanılmakta ve 16S r-RNA’nın değişen ve değişmeyen kısımlar
bulunur. Değişen kısımlar yakın akrabalıkları, değişmeyen kısımlar ise uzak
akrabalıkların tespitinde kullanılmaktadır 74.
Plazmid: Laktik asit bakterilerinin çoğu en az bir adet plazmid içerir.
Plazmidler, ekzopolisakkarit ve antimikrobiyal madde sentezi gibi koruma görevi
üstlenmiştir 74.
Laktik asit bakterileri, glikozu laktik asit veya bunun yanında diğer ürünlere
fermente etme özelliklerine göre homofermantatif ve heterofermantatif laktik asit
bakterileri olarak iki ana gruba ayrılmaktadır. Bu ayırım şekerlerin temel yıkım
yollarındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır 76.
Homofermantatif laktik asit bakterileri glukozu, Fruktoz Di Fosfat (FDP)
yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 99 oranında laktik asit, % 1 oranında
diğer bileşikleri meydana getirirler 76-79.
Homofermantatif yol:
C6H12O6
2 CH3-CHOH-COOH (Laktik Asit)
C6H12O6
CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2-OH + CO2
14
Heterofermantatif laktik asit bakterileri, glikozu Hegzos Mono Fosfat (HMF)
yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 70 laktik asit üretilir. % 30 oranında da
diğer bileşikleri, özellikle asetik asit, etil alkol ve karbondioksiti oluştururlar 77-79.
Heterofermantatif yol:
C6H12O6
CH3-CHOH-COOH + CH3-COOH + CO2
Lactobacillus türleri tarafından fermantasyon sonucu üretilen laktik asidin
fermente ürünleri koruyucu etki göstermesinden dolayı, bu mikroorganizmalar
yıllardır gıda endüstrisinde kullanılmaktadırlar. Ayrıca bakteriosin ve diğer
antimikrobiyal madde üretimleri ve GRAS (Genellikle güvenli olarak tanınan)
statüsünde yer almaları nedeniyle, doğal ve teknolojik uygulamalarla üretilen ve bu
bakterileri içeren gıdalar insan sağlığını hiçbir şekilde olumsuz olarak etkilemezler
70
.
2.3.1 Lactobacillus Türlerinin Ürettikleri Antimikrobiyal Maddeler
Laktik asit bakterileri, insan sağlığına faydalı olmaları ve fermantasyon
yapabilmelerinden dolayı, gıdalarda uzun yıllardan beri güvenli bir şekilde
kullanılmaktadırlar. Bu nedenle gıda endüstrisinde büyük öneme sahiptirler. Ayrıca
bu bakterilerin gıdaların biyokontrolünde de ayrı bir önemi vardır. Patojen olan
bakterilerin birçoğu Laktik asit bakterileri tarafından son ürün olarak üretilen bazı
maddelere
karşı
hassastırlar.
Laktik
asit
bakterilerinin
antagonistik
etki
mekanizmaları içerisinde son yıllarda üzerinde en fazla durulan maddeler Laktik asit,
Hidrojen peroksit (H2O2) ve Bakteriosindir 80-83.
2.3.1.1. Laktik asit
Laktik asitler, laktik asit bakterileri tarafından laktozun yıkımı sonucu oluşan
maddelerden biridir. Ekşi tatta ve kokusuz bir organik asittir. Laktik asit
15
bakterilerinin
söylenebilir
inhibisyon
80,81
etkisinin
çoğunlukla
laktik
asitten
kaynaklandığı
.
Laktik asit oluşumu, iki basamaklı reaksiyon sonucu meydana gelir. İlk
olarak laktozun, laktik asit bakterileri tarafından oluşturulan laktaz (β-galaktosidaz)
enziminin etkisiyle, glikoz ve galaktoza parçalanması gerçekleşir. Bunun ardından da
glikoz laktik aside dönüşür 82.
Laktaz
(β-Galaktosidaz)
Laktoz + H2O
Glikoz + Galaktoz
2C6H12O6
4CH3CHOHCOOH
Laktik asit
Bu değişim, homofermantatif laktik asit bakterilerinin, Embden-MeyerhofParnas’ın belirttiği fruktoz-1,6 difosfat metabolik yolunu izleyerek, glikoz
molekülünü, 3C’lu piruvata ve ardından laktik aside dönüştürmesiyle gerçekleşir.
Ancak ortamda heterofermantatif laktik asit bakterileri varsa bu bakteriler, glikozun
yıkımını Embden-Meyerhof-Parnas yolu yerine fosfoketolaz glikolitik yolu
kullanılır. Sonuçta laktik asidin yanı sıra asetik asit, etil alkol, ve CO2 gibi
maddelerde açığa çıkar 82.
Laktozun fermantasyonu sonucunda, D (-) ve L (+) laktik asit olmak üzere iki
laktik asit izomeri meydana gelir. L (+) laktik asit, insan organizmasında daha hızlı
ve kalıntı kalmayacak şekilde metabolize olur. D (-) laktik asit ise çok yavaş bir
şekilde yıkıma uğrar. Bu nedenle vücuda fazla miktarda D (-) laktik asidi alınımı
istenmez. WHO (Dünya sağlık örgütü) ile FAO (Dünya gıda örgütü) tarafından,
günlük D (-) laktik asit alınımı 60 mg/kg vücut ağırlığı ile sınırlandırılmıştır 82.
Laktik asit, tabiatta çok yaygın olarak bulunan asitlerden birisidir ve geniş
şekilde gıda koruyucusu olarak kullanılmaktadır. Laktik asit insanlar tarafından
peynir, tereyağı, bira, ekmek hamuru, süttozu içeren gıdalar, sığır, koyun ve kanatlı
karkaslarında koruyucu olarak kullanılmaktadır 83.
16
2.3.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2)
Bazı laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal etkileri H2O2 üretimlerine
dayandırılmaktadır.
H2O2
laktik
asit
bakterileri
gibi
katalaz
negatif
mikroorganizmalar tarafından aerobik şartlarda üretilmektedir. Ksantin oksidaz,
glukoz oksidaz, askorbik asit, sulfidril oksidaz, piruvat oksidaz, NADH oksidaz ve αgliserofosfat oksidaz veya laktat oksidaz gibi enzimlerin varlığında gerçekleşen
reaksiyonlarda atmosferik oksijenin doğrudan indirgenmesi ile meydana gelmektedir
83, 84
.
D-glikoz + H2O + O2
D-glukonik asit + H2O2
H2O2’nin üretimi 5 °C ve 7 °C’de en yüksek seviyeye ulaşmaktadır ki bu
durum asit üretimi ile zıtlık göstermektedir 85.
Hidrojen peroksit termodinamik açıdan kararsız bir bileşiktir. Ortama da
katalaz varlığında su ve oksijene ayrılır 86.
Katalaz
2 H2O2
2H2O+O2
2.3.1.3. Bakteriosin
Bakteriosinler, çeşitli laktik asit bakterileri tarafından üretilen, protein veya
peptid yapıda, hassas hücrelerdeki reseptörlere bağlanabilen antimikrobiyal
maddelerdir. Üretimleri büyük oranda plazmid DNA tarafından kodlanmaktadır.
Laktik asit bakterilerinin tüm cinslerinde bakteriosin üretimi belirlenmiştir. Özellikle,
Streptococcus ve Lactobacillus cinslerinde bu metabolitin üretimi oldukça yaygındır.
Bu cinsler içerisinde sınıflanan türlerin, bakteriosin üretim sıklıkları da birbirinden
farklılık göstermektedir 83.
17
Protein veya peptitlerden oluşan ve diğer mikroorganizmalara karşı
antogonistik etki gösteren bakteriosinlerin proteolitik enzimlerle inhibe edilebileceği
açıklanmıştır 87.
2.4. BAĞIRSAK MİKROFLORASI
Metchnikoff sağlıklı bir yaşam için bağırsakların çok önemli bir organ
olduğunu düşünmekteydi. Yaşamı boyunca bağırsaklarda gerçekleşen olayları
çözmeye çalışmış ve bu organın önemini vurgulamıştır. Bu konudaki düşüncelerini
hastalandığı sırada arkadaşına şöyle ifade etmiştir. “Otopsimi yapacak mısın?
Bağırsaklarıma dikkatli bak, orada bir şeyler olduğunu düşünüyorum 30.”
Gastrointestinal sistem insan vücudunda 400m2’lik bir alana sahiptir. Bu
sistemin 200m2’sini oluşturan bağırsaklar emici yüzeyi ile gıdaların sindirildiği,
bileşenlerin absorbe edildiği, posa kısımların dışkı olarak atıldığı bir organdır.
Bunların yanı sıra insan vücudununki en büyük diffüz lenfoid bir doku özelliğinde
olan mukozası ile mükemmel bir bağışıklık sistemi organıdır 19,88,89.
Bir insanın yaşamı boyunca yaklaşık 60 ton yiyeceğin gastrointestinal
sisteminden geçtiği hesaplanmıştır
19
. Bu sistem, çok geniş bir yüzey alanına sahip
olması, besin maddelerinin burada sindirilmesi ve insan vücudunun sahip olduğu ısı
sayesinde mikroorganizmalar için son derece uygun bir ortam oluşturmaktadır.
Yeni doğmuş bir bebek steril durumdadır. Doğumdan hemen sonra
çevresindeki mikroorganizmalarla kontamine olur. İlk olarak E. coli ve
Streptococcus
türleri
baskındır.
Bebek
anne
sütü
ile
beslendikçe
bu
mikroorganizmaların yerini Bifidobacterium türleri alır. Anne sütü kesildiğinde
yetişkin florası oluşmaya başlar. Yetişkin bir insanın bağırsaklarında yaklaşık 500
farklı türde mikroorganizma gelişebilir. Bu mikroorganizmalar kütlece 1-2 kg’a
kadar ulaşabilmektedirler 18.
18
Gastrointestinal sistemi oluşturan kısımlar mikroorganizmalar için farklı
ortamlar sağlarlar. Bu nedenle her kısımda farklı türde mikroorganizmalara
rastlanmaktadır. Gastrointestinal sistemde yer alan mikroorganizmalar ve yerleri
Şekil 1’de gösterilmiştir.
Şekil 1. Gastrointestinal sistemin değişik kısımlarında yer alan mikroorganizmalar 18.
2.5.
ANTAGONOSTİK
ETKİDE
KULLANILAN
MİKROORGANİZMALAR
Patojen mikroorganizmalara karşı mücadelede kullanılan yöntemler önemli
bir konudur. Hem ekonomik açıdan hem de kullanılan ilaçların yan etkisi
bakımından en ideal olan seçilmelidir. Probiyotik bakterilerin vücut savunmasına
yardımcı olduğu bilinmediktedir. Bu amaçla çalışmamızda kullanılan Lactobacillus
19
suşlarının günümüzde en yaygın olan patojenlere karşı antogonistik etkileri
araştırılmıştır. Çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalar aşağıda verilmiştir
2.5.1. Escherichia coli
Sınıflandırmada Enterobacteriaceae familyasında yer alan E. coli; gram
negatif, çubuk şeklinde, fakültatif anaerob, peritrik kirpikli ve kapsüler yapıda olan
bir bakteridir. Boyutları 1-2 µm uzunluğunda ve 0.1-0.5 µm çapındadır. E. coli
laktozu fermente edebilme özelliğine sahiptir 70, 90.
E. coli bakterilerinin doğal yaşam ortamları insan ve hayvanların
bağırsaklarıdır. Bu özelliklerinden dolayı su ve besinlerde fekal kirlenmenin
göstergesidir. E. coli fırsatçı bir patojendir. İnsanlarda bakteri enfeksiyonlarında en
sık rastlanan etkendir. Aslında bağırsak mukozasına yerleştiklerinde diğer
patojenlerle rekabet halindedirler. Ancak normal flora üyesi olarak bulundukları
yerden başka yerlere ulaşırlarsa ve burada üremeleri için elverişli koşullar varsa
bağırsak dışı enfeksiyonlar neden olmaktadırlar 90.
2.5.2. Staphylococcus epidermidis
S. epidermidis, Micrococcaceae familyasından olup gram pozitif ve kok
şeklinde fakültatif anaerob bir bakteri türüdür. Katalaz pozitif ve koagülaz negatif
özelliktedir. Zaman zaman insan ve hayvan cildinin mukoz membranlarında görülür
90,91
.
S.
epidermidis
klasik
fırsatçı
patojenlerdendir.
Yabancı
cisimlerin
yüzeylerinde biyofilm oluşturma yetenekleri nedeniyle yabancı cisimlerle ilişkili
enfeksiyonlara neden olur. Bu açıdan immün sistemi yetersiz çalışan hastalar ve
sürekli kateter takılı olan hastalar için büyük bir risktir 90, 91.
20
2.5.3. Neisseria sp.
Neisseria, gram negatif, aerob, hareketsiz, sporsuz, bazen kapsüllü, oksidaz
pozitif, katalaz pozitif, 0.6-1.0 µm çapındadır. İkili kokobasil ve kısa zincirler halinde
görülebilir. Neisseria’lar genelde kok şeklinde olduklarından iki dik boyutta bölünerek
diplokok (mikroskopla bakıldığında kahve tanesine benzer bir yapıda) görülebilirler.
İnsan vücudu dışında kısa sürede ölen tipik mukaza parazitleridir 90, 92.
İnsanlarda patojen olan türler asıl olarak N. gonorrhoeae ve N. meningitidis
olup, N. flavescens, N. subflava, N. mucosa, N. sicca, N. cinerea, N. lactamica, N.
denitrificans, N. elongata, N. weaveri patojen özellik göstermeyip nazofarinks
mukozasında flora elamanı olarak bulunur 90.
2.5.4. Klebsiella pneumoniae
K. pneumoniae; hareketsiz, sporsuz, 1-2 µm boyunda ve 0.5-0.8 µm eninde
ikişerli ya da kısa zincir halinde basillerdir. Gram negatif, polisakkarid yapıda
kapsüllü, aerop ve fakültatif anaerop özellik gösterebilen, 37 °C ve pH 7’de iyi
üreyen bakterilerdir 93.
E. coli gibi Enterobacteriaceae familyasında yer alan K. pneumoniae, sağlıklı
insanlarda üst solunum yolu ve dışkı florasının % 5-10’unu oluşturan bir bakteri
olduğu için patojenliği uygunsuz koşullar karşısında fırsatçı patojen olarak ortaya
çıkar. Bu nedenle hastane enfeksiyonlarından sorumlu bir bakteridir 93, 94.
K. pneumoniae, pnömoninin yanı sıra idrar yolları enfeksiyonuna, yara
enfeksiyonuna ve bakteriyemiye neden olmaktadır 93.
21
2.5.5. Pseudomonas aeruginosa
Gram negatif, zorunlu aerobik, basil veya kokobasil şeklinde, 0.5-0.8 µm
eninde 1.5-3.0 µm boyunda, sporsuz ve polar flagellası ile hareket edebilen, katalaz
pozitif, sitrat pozitif, metil kırmızısı negatif, Voges Proskauer negatif, bir bakteri
olan P. aeruginosa, insan patojenidir. En iyi 37 °C’de üremekte olup 42 °C’de de
üreyebildikleri rapor edilmektedir 93, 95.
Genç kültürler, üzerinde büyüyebildiği ortamlarda genellikle mavi-yeşil bir
pigment çıkarır. Aerobik olmaları nedeni ile gıdaların yüzeyinde hızlı gelişebilmeleri
sonucu okside ürünler ve mukoz madde oluştururlar 93.
22
3. MATERYAL VE METOD
3.1. MATERYAL
3.1.1. Materyal Örnekleri
Bu çalışmada kullanılan 25 adet Lactobacillus cinsine ait bakteriler, belirli bir
şikayet üzerine Kırşehir Devlet Hastanesine başvuran 25-50 yaş arası 48 hastanın
gaitasından izole edilmiştir. Örneklerin alımında hastalarda bağırsak problemlerinin
olmamasına dikkat edilmiştir.
Lactobacillus spp. suşlarının antagonistik etkilerinin tespiti için kullanılan E.
coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S.
epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp. İzmir Behçet Uz Çocuk Hastanesi kültür
kolleksiyonundan temin edilmiştir.
3.1.2. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları
Çalışmada kullanılan tüm test bakterileri uygun sıvı besiyeri ve sıcaklıkta 2448 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Lactobacillus türleri için MRS (Man
Ragosa and Sharpe) broth ve agarı (Merck) kullanılmıştır. Ayrıca Lactobacillus
suşlarının antimikrobiyal analizi için sisteinli MRS agar kullanılmıştır. Lactobacillus
suşlarını inhibitör etkilerinin tespiti için kullanılan E. coli (ATCC 25922), S.
epidermidis (ATCC 12228), Neisseria sp., K. pneumoniae (ATCC 25656) ve P.
aeruginosa (ATCC 27853), aktifleştirilmesi ve stoklanması için Nutrient sıvı ve katı
besiyeri (Merck), inhibitör etki çalışmasında ise Muller Hinton katı besiyeri (Merck)
kullanılmıştır.
23
3.1.3. Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri
MRS (Man Ragosa and Sharpe) Sıvı Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
10.0
Beef Ekstrakt
10.0
Yeast Ekstrakt
5.0
Glikoz
20.0
Tween 80
1.08 mL
K2HPO4
2.0
Sodyum Asetat.3H2O
5.0
Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat
2.0
MgSO4.7H2O
0.2
MnSO4.4H2O
0.05
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Besiyerinin pH’sı 0.01 N HCl
ve 0.01 N NaOH kullanılarak 6.2 ± 0.2’ye ayarlanmıştır. Amaca uygun olacak
şekilde besiyerine %1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır.
Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir
96
.
Nutrient Sıvı Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
5.0
Beef Ekstrakt
1.0
Yeast Ekstrakt
2.0
Sodyum Klorür
5.0
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Besiyerinin pH’sı 0.01 N HCl
ve 0.01 N NaOH kullanılarak 6.2 ± 0.2’ye ayarlanmıştır. Amaca uygun olacak
şekilde besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır.
24
Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir
97
.
Sisteinli MRS Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
10.0
Beef Ekstrakt
10.0
Yeast Ekstrakt
5.0
Glikoz
20.0
Tween 80
1.08 mL
K2HPO4
2.0
Sodyum Asetat.3H2O
5.0
2.0
MgSO4.7H2O
0.2
MnSO4.4H2O
0.05
L-Sistein
2.0
Na2HPO4
2.0
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Amaca uygun olacak şekilde
besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan
bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 98.
Muller Hinton Besiyeri
Maddeler
g/L
Meat infusion
2.0
Casein hydrolysate
17.5
Starch
1.5
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Amaca uygun olacak şekilde
besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan
bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 99.
25
Düşük Asitli (pH 2.0, 2.5 ve 3.0) MRS Sıvı Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
10.0
Beef Ekstrakt
10.0
Yeast Ekstrakt
5.0
Glikoz
20.0
Tween 80
1.08 mL
K2HPO4
2.0
Sodyum Asetat.3H2O
5.0
2.0
MgSO4.7H2O
0.2
MnSO4.4H2O
0.05
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. MRS sıvı besiyeri 3 N HCl
ile pH 2.0, 2.5 ve 3.0 ayarlanmış ve 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda
sterilizasyon yapılmıştır 100.
Yüksek Konsantrasyonlu Safra Tuzlu (%0.3, %0.5, %1.0 ve %1.5 Oxgall)
MRS Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
10.0
Beef Ekstrakt
10.0
Yeast Ekstrakt
5.0
Glikoz
20.0
Tween 80
1.08 mL
K2HPO4
2.0
Sodyum Asetat.3H2O
5.0
2.0
MgSO4.7H2O
0.2
MnSO4.4H2O
0.05
26
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Sıvı MRS besiyerine % 0.3,
% 0.5, % 1.0 ve % 1.5 (w/v) oranlarda safra tuzu (oxgall) ilave edilmiştir. Besiyerleri
121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 101.
Safra Tuzu Hidroliz Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
10.0
Beef Ekstrakt
10.0
Yeast Ekstrakt
5.0
Glikoz
20.0
Tween 80
1.08 mL
K2HPO4
2.0
Sodyum Asetat.3H2O
5.0
2.0
MgSO4.7H2O
0.2
MnSO4.4H2O
0.05
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Safra tuzu,% 0.5 kolik asit, %
0.37g/L CaCl2 ilave edilmiştir. Hazırlanan besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle
otoklavda steril edilmiştir 102.
Antagonistik (% 0.2’lik glikozlu) MRS Sıvı Besiyeri
Maddeler
g/L
Pepton
10.0
Beef Ekstrakt
10.0
Yeast Ekstrakt
5.0
Glikoz
0.20
Tween 80
1.08 mL
K2HPO4
2.0
Sodyum Asetat.3H2O
5.0
2.0
MgSO4.7H2O
0.2
MnSO4.4H2O
0.05
27
Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Hazırlanan besiyeri 121
°C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 103.
3.2.METOD
3.2.1. İzolatların İzolasyonu ve İdendifikasyonu
Kırşehir Devlet hastanesine başvurmuş 25-50 yaş arası 48 hastadan alınan
gaitalar steril serum fizyolojik ile seyreltilerek MRS agar üzerine çizgi ekim
yapılmış, anaerob jarda 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda
petrilerde oluşan kirli beyaz, beyaz ve opak koloniler alınmış, faz-kontrast
mikroskopta Gram özelliği incelenerek, Gram pozitif, basil bakteriler seçilerek
numaralandırılmıştır
104
. Numaralandırılan suşların idendifikasyonu API 50 CHL
Medium (Bio Mérieux La Bali Grottes, France) kullanılarak yapılmıştır.
API 50 CH mikroorganizmaların karbonhidrat metabolizmasının çalışmasını
sağlayan 50 biyokimyasal testten oluşan bir sistemdir. API 50 CH, Lactobacillus ve
ilgili türlerin tanımlanması için API 50 CHL Medium ile kullanılır. API 50 CH stribi,
karbonhidrat ailesi ve onun türevlerine ait olan substratların fermantasyonunu
kullanan 50 mikro tüp içermektedir. Fermantasyon testleri substratları sulandıran
API 50 CHL Medium ile eklenir. İnkübasyon sırasında, fermantasyon asidin
anaerobik üretimi ile ve seçilen besiyerinde bulunan pH indikatörü tarafından
saptanan tüpte renk değişimi olarak ortaya çıkar.
3.2.2. Lactobacillus spp. Suşlarının Muhafazası
Eppendorflar, içerisine yaklaşık 300 µL gliserol (Merck) dağıtılarak, 121
°C’de 15 dakika süreyle steril edilmiştir. Gaitadan izole edilen suşlar MRS broth
besiyerinde 37 °C’de 24 saat süreyle anearob ortamda ard arda iki kez
aktifleştirilmiş, aktif kültürlerden 600 µL alınarak gliserol içeren steril eppendorflara
28
paralelli olarak aktarılmıştır. Derin dondurucuda -20 °C’de depolanarak muhafaza
edilmiştir 81.
3.2.3. Patojen Suşların Aktifleştirilmesi ve Muhafazası
Lactobacillus suşlarının patojen mikroorganizmalar üzerine antagonostik
etkilerinin tespiti amaçlı kullanılan E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC
27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria
sp. bakterileri Nutrient Broth besiyerinde 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılarak
aktifleştirilmiş olup yatık Nutrient Agar besi yerinde + 4 °C’de buz dolabında
muhafaza edilmiştir 105.
3.2.4. Asit Dirençliliğinin Belirlenmesi
16 saatlik durgun fazdaki aktif Lactobacillus spp. suşları, HCl (3.0 M) ile
farklı pH değerlerine ayarlanan (2, 2.5 ve 3) taze MRS broth besi yerine inoküle
edilmiştir. Daha sonra örnekler 37 °C’de 3 saat inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyon sonrası alınan örneklerin ortalama asitliğini nötralize etmek için,
hazırlanan PBS (Fosfat solüsyonu) çözeltisinde (0.01M ve pH 6.2 şeklinde
ayarlanmış) seri dilüsyonlar (10-1 10-7) yapılmış, seyreltilen kültürlerden 100 µL
alınarak MRS katı besiyeri üzerine drigalski spatülü yardımı ile yayma ekim
yapılmıştır. 37 °C’de 24 saatlik inkübasyon sonrası petri yüzeyindeki canlı
mikroorganizma sayısı tespit edilmiştir 100.
3.2.5. Yüksek Safra Tuzu (Oxgall) Konsantrasyonlarına Dirençliliğin
Belirlenmesi
İzole edilmiş türlerin safra tuzu varlığında canlılığını koruyabilirliği, Dunne
ve ark.(2001) metoduna göre yapılmıştır. İçerisine % 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5
(w/v) oranlarda oxgall (sigma) ilave edilmiş MRS broth besiyerine, 16 saatlik durgun
fazdaki Lactobacillus spp. suşları inoküle edilerek, 37 °C’de 3 saat inkübasyona
29
bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda her kültürden 5 log10 CFU (105 CFU) fizyolojik su
içerisinde dilisyon yapılmıştır. Seyreltilen kültürlerden 100 µL alınarak MRS katı
besiyeri (pH 6.2) üzerine yayma ekim yapılarak 37 °C’de 24 saat inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası plak üzerinde canlı koloni sayımı yapılmıştır 106, 107.
3.2.6. Safra Tuzu (Kolik Asit) Hidrolizinin Belirlenmesi
Lactobacillus spp. suşlarının Safra tuzu (kolik asit) hidrolizinin belirlenmesi
amacı ile hazırlanan MRS agar besiyerine % 0.5 kolik asit, % 0.37 g/L CaCl2 ilave
edilmiştir. Hazırlanan bu besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril
edilmiştir. Sterilizasyon sonrası petrilere dökülen besiyerleri soğumaya bırakılmış
soğuyan besi yerine 16 saatlik taze kültürlerden 10 µL alınarak yayma ekim
yapılmıştır. 24 saat 37 °C’de inkübasyona bırakılan suşların safra hidroliz aktivitesi,
inkübasyon sonrasında opak tanecikli beyaz kolonilerin etraflarında zon oluşturma ve
oluşturmama özelliklerine göre değerlendirilmiştir 102, 108.
3.2.7. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi
Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının ampisilin (10 µg),
basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg)
penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg),
teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg),
antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları test edilmiştir.
İzole edilmiş Lactobacillus spp. suşları 37 °C’de ard arda iki kez MRS sıvı
besiyerinde aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 100 µL alınarak sisteinli MRS katı
besiyeri içeren petrilere aktarılmış, steril drigalski spatülü ile yayma ekim
yapılmıştır. İçerisinde besiyeri ve bakteri içeren bu petriler üzerine denenecek olan
antibiyotik diskler steril bir şekilde yerleştirilmiş ve 37 °C’de 24 saat inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda antibiyotik disk çevresinde oluşan zonların
30
çapları kumpas ile milimetrik olarak ölçülmüştür. Sonuçlar NCCLS (Klinik
Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi) kriterlerine göre değerlendirilmiştir 109-112.
3.2.8. Bazı Patojen Mikroorganizmalara Karşı Antagonostik Etkilerin
Belirlenmesi
İzole edilen Lactobacillus suşları 37 °C’de ard arda iki defa MRS sıvı besi
yerinde aktifleştirilmiştir. Aktif kültürler 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir.
Santrifüj sonunda elde edilen süpernatant steril şartlarda alınıp 0.45 µm’lik
disposable filtreden geçirilerek mikrofiltrasyon yolu ile steril edilmiştir 109.
Çalışmada patojen olarak seçilen E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa
(ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve
Neisseria sp. Nutrient sıvı besiyerinde uygun sıcaklıkta inkübe edilerek
aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 50 µL alınarak içerisinde 50 °C’de 20 mL
Muller Hinton (Merck) agar steril besiyeri bulanan petrilere aktarılmıştır. Besiyeri ve
bakterilerin homojen bir şekilde karışımı sağlanmış ve besiyeri donana kadar oda
sıcaklığında beklenmiştir. Besiyeri donduğunda üzerine 8 mm kalınlığında steril
çubukla kuyucuklar açılmıştır ve kuyucukların tabanı steril agarla sıvanmıştır.
Başlangıçta Lactobacillus suşlarından elde edilen steril süpernatantlardan 100 µL
alınarak, açılan kuyucuklara aktarılmıştır. Petriler 37 °C’de 24 saat inkübasyona
bırakılmıştır. 24 saat sonunda kuyucuk çevresinde oluşan zon çapları kumpas
yardımı ile milimetrik olarak ölçülmüştür 113-116.
3.2.9. Lactobacillus spp. Suşları Tarafından Üretilen Bakteriosin veya
Bakteriosin Benzeri Maddelerin İnhibitör Etkisinin Belirlenmesi
Lactobacillus suşlarının bakteriosin üretimleri anaerobik (jar ve CO2 kiti
kullanılarak) şartlarda belirlenmiştir. Bu amaçla 16 saatlik aktif kültürlerden alınarak
% 0.2 oranında glikoz içeren MRS sıvı besiyerine inokülasyon yapılarak 37 °C’de 48
saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda, laktik asidin inhibisyon etkisini
31
gidermek için kültürlü MRS Broth’un pH’sı 1 N NaOH ile 6.5’ e ayarlanıp 5000
rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjle elde edilen süpernatant 0.45 μm’lik
membran filtreden geçirilerek mikrofiltrasyon yolu ile steril edilmiştir 117.
Patojen bakteriler, Nutrient Broth besiyerinde uygun sıcaklıkta inkübe
edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 50 µL alınarak içerisinde 50 °C’de 20
mL Muller Hinton agar steril besiyeri bulanan petrilere aktarılmıştır. Besiyeri ve
bakterilerin homojen bir şekilde karışımı sağlanmış ve besiyeri donana kadar oda
sıcaklığında beklenmiştir. Besiyeri donduğunda üzerine 8 mm kalınlığında steril
çubukla kuyucuklar açılmıştır ve kuyucukların tabanı steril agarla sıvanmıştır.
Başlangıçta Lactobacillus suşlarından elde edilen ve pH 6.5’e ayarlanmış steril
süpernatantlardan 100 µL alınarak, açılan kuyucuklara aktarılmıştır. Petriler 37
°C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonunda kuyucuk çevresinde oluşan
zon çapları kumpas yardımı ile milimetrik olarak ölçülmüştür 118.
3.2.10. Lactobacillus spp. Suşlarının Kolesterol Giderimi
Çalışmada düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu
aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L.
pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15
suşları seçilerek kolesterol giderimi çalışılmıştır. Çalışmada önceden MRS sıvı
besiyeri içersine % 0.3’lük oxgall, kolik asit ve taurocholic asit ilave edilerek 121
°C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir. Kolesterolü yüksek olan
hastalardan alınan kan (500 mg/dl) 10000 rpm de 10 dakika santrifüj yapılarak üstte
kalan sıvı kısımdan (serum) besiyerlerine (1/4 v/w) oranlarında eklenmiştir. Elde
edilen karışımdan 10’ar mL alınarak steril tüplere dağıtılmıştır. Deneyler bir birinden
bağımsız 2’şer paralel olarak yürütülmüştür. Daha önce hazırlanan Lactobacillus
kültürlerinden 5 log10 CFU (105 CFU) dilisyondan 100 µL alınarak besi yerlerine
inoküle edilmiş ve kültürler 37 °C’de 24 saat süreyle anaerob ortamda inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında tüpler 10000 rpm 10 dakika santrifüj edilmiş,
santrifüj sonunda elde edilen süpernatant ile kolesterol miktarı enzimatik yöntemle
SYNCHRON® Systems (Beckman Caulter, USA) kiti ile Unicel DxC800 model
32
otoanalizatör (Beckman Caulter, USA) cihazında saptanmıştır. Sonuçlar mg/dl’den
µg/ml’ye çevrilmiştir 119.
33
4. BULGULAR VE TARTIŞMA
4.1. İZOLATLARIN İDENDİFİKASYONU
Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı gibi gaitalardan elde edilen örnekler inkübe
edilmiş, inkübasyon sonucunda ilk olarak koloni morfolojilerine göre bir elemine
yapılmıştır. Resim. 1’de L. salivarius LS-22 suşunun 24 saatlik inkübasyon
sonrasında petri kabında oluşan koloni görünümlerinin fotoğrafları verilmiştir.
Resim 1: MRS Agar üzerinde 48 saat inkbasyona bırakılmış L. salivarius LS-22
suşunun Samsung S760 fotoğraf makinesi ile çekilmiş görüntüsü.
Resim 1’de görüldüğü üzere kirli beyaz, beyaz ve opak koloniler alınmış, fazkontrast mikroskopta gram özelliği incelenerek, gram pozitif, basil bakteriler
seçilerek numaralandırılmıştır. Resim 2’de L. pentosus LS-2 suşunun mikroskop
görüntüsü verilmiştir.
34
Resim 2: L. pentosus LS-2 suşunun Olympus, CH-2 CHT model ışık mikroskobunda
100x10 büyütmede görünümü
Numaralandırılan suşların idendifikasyonu API 50 CHL medium (Bio
Mérieux La Bali Grottes, France) kullanılarak yapılmıştır. Yaptığımız bu çalışmada,
25 adet Lactobacillus spp. suşu izole edilmiş ve 8 farklı Lactobacillus spp.
tanımlanmıştır. Gaitadan izole edilen suşların türlere göre dağılımı 11 adet L.
plantarum1 (% 44), 6 adet L. fermentum2 (% 20), 3 adet L. pentosus (% 12), 1 adet
L. delbrueckii subsp. delbrueckii (% 4), 1 adet L. paracasei subsp. paracasei (% 4), 1
adet L. lactis subsp lactis (% 4), 1 adet L. curvatus (% 4) ve 1 adet L. salivarius (%
4) olarak tespit edilmiştir. Suşların isim ve numaraları Tablo. 2’ de verilmiştir.
Jacobsen ve ark. (1999)
120
tarafından yapılan bir çalışmada sağlıklı yetişkin
ve çocuklardan alınan feçeslerde L. paracasei subsp. paracasei, L. plantarum, suşları
izole edilmiştir. Moser ve Savage (2001)’ nın 121 yaptıkları bir çalışmada yetişkin ve
bebek feçeslerinden L. fermentum, L. paracasei subsp. paracasei suşlarının izole
edildiği bildirilmiştir. Martin ve ark. (2006)
122
tarafından yapılan başka bir
çalışmada ise 1 aylık bebek feçeslerinden L. salivarius suşu izole edilmiştir. Klare ve
ark. (2007)
123
tarafından yapılan insan kaynaklı Lactobacillus spp. suşlarının izole
35
edilmeye çalışıldığı bir araştırmada ise L. fermentum, L. plantarum ve L. salivarius
bakterilerinin izole edildiği rapor edilmektedir.
Tablo 2. Gaitadan izole edilerek tanımlanan suşların adları ve kodları
SUŞ ADI
SUŞ NO
L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1
L. pentosus
LS-2
L. pentosus
LS-3
L. plantarum1
LS-4
L. fermentum2
LS-5
L. plantarum1
LS-6
L. paracasei subsp. paracasei
LS-7
L. plantarum1
LS-8
L. lactis subsp. lactis
LS-9
L. plantarum1
LS-10
L. plantarum1
LS-11
L. plantarum1
LS-12
L. pentosus
LS-13
L. plantarum1
LS-14
L. fermentum2
LS-15
L. fermentum2
LS-16
L. curvatus
LS-17
L. plantarum1
LS-18
L. fermentum2
LS-19
L. plantarum1
LS-20
L. plantarum1
LS-21
L. salivarius
LS-22
L. plantarum1
LS-23
L. fermentum2
LS-24
L. fermentum2
LS-25
36
4.2. Lactobacillus spp. SUŞLARIN ASİT DİRENÇLİLİĞİ
Lactobacillus spp. suşlarının asit dirençlilikleri Bölüm 3.2.3’te anlatıldığı
şekilde tespit edilmiştir. Sonuçlar Tablo 3’te verilmiştir.
Tablo 3. Lactobacillus suşlarının düşük pH (2.0, 2.5 ve 3.0) derecelerine
toleransı. (24 saat sonra)
Farklı pH değerleri
İzolatlar
2.0
2.5
3.0
Canlı mikroorganizma sayısı (cfu/ml)
6x107
24x107
30x107
L. pentosus LS-2
6x107
18x107
30x107
L. pentosus LS-3
18x107
30x107
30x107
L. plantarum1 LS-4
12x107
24x107
30x107
L. fermentum1 LS-5
24x107
24x107
30x107
L. plantarum1 LS-6
18x107
30x107
30x107
L. paracasei subsp. paracasei LS-7
12x107
30x107
30x107
L. plantarum1 LS-8
12x107
30x107
30x107
L. lactis subsp. lactis LS-9
12x107
30x107
30x107
L. plantarum1 LS-10
6x107
30x107
30x107
L. plantarum1 LS-11
6x107
24x107
30x107
L. plantarum1 LS-12
18x107
24x107
30x107
L. pentosus LS-13
12x107
24x107
30x107
L. plantarum1 LS-14
18x107
24x107
24x107
L. fermentum2 LS-15
30x107
34x107
30x107
L. fermentum2 LS-16
12x107
30x107
30x107
L. curvatus LS-17
12x107
18x107
30x107
L. plantarum1 LS-18
12x107
30x107
30x107
L. fermentum2 LS-19
6x107
30x107
30x107
L. plantarum1 LS-20
30x107
30x10
30x107
L. plantarum1 LS-21
18x107
30x107
30x107
L. salivarius LS-22
15x107
24x107
30x107
L. plantarum1 LS-23
6x107
24x107
30x107
L. fermentum2 LS-24
6x107
18x107
30x107
L. fermentum2 LS-25
30x107
18x107
30x107
37
Düşük pH’ya dirençlilik probiyotik mikroorganizmalar için çok önemli bir
kriterdir. Probiyotik mikroorganizmaların ince bağırsağa gelene kadar mide asitliğine
yakın pH değerlerine (< 3.0) dayanabilmeleri gerekmektedir 124.
Tablo 3’te de görüldüğü gibi pH değeri yükseldikçe hücrelerin canlı kalma
sayılarında bir artış gözlenmektedir. Genel olarak pH 3.0 seviyesinde bütün
mikroorganizmaların canlılıklarını korudukları gözlenmektedir.
Yaptığımız çalışmada Lactobacillus suşlarının asit dirençleri ile ilgili elde
ettiğimiz sonuçlara benzer sonuçları Prasad ve ark.’larıda (1999)
125
bulmuştur.
Yapılan bu çalışmada insanlardan, süt ve süt ürünlerinden izole ettikleri
Lactobacillus suşlarını pH 3.0’te 3 saat canlılıkları incelenmiştir. Sonuçta bu suşların
% 80 oranında canlılıklarını koruduklarını gözlemlemişlerdir. Xanthopoulus ve
ark.’nın (2000)
126
yapmış olduğu başka bir çalışmada ise, bebek feçeslerinden izole
edilmiş L. acidophlus, L. gasseri, L. reuteri, ve L. rhamnosus türlerinden oluşan 20
suşun pH 3.0 de canlılıklarını %0.1-73.3 oranında korudukları belirtilmiştir.
Asit dirençliliği çalışmamızda pH 2.0 değerinde ise canlı kalabilme
oranlarında pH 3.0’e göre bir düşüş gözlenmektedir L. fermentum1 LS-5, L.
fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarının
canlılıklarını diğer suşlara göre daha iyi korudukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii
subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-10, L. plantarum1 LS11, L. fermentum2 LS-19, L. plantarum1 LS-23 ve L. fermentum2 LS-24 suşlarının
ise düşük pH değerlerine dirençlerinin daha zayıf olduğu tespit edilmiştir.
Pereira ve Gibson (2002)
127
, insan feçesinden izole ettikleri L. fermentum
KC5b suşunun pH 2’de 2 saat canlılığını sürdürebilmesi ile aside toleranslı suş
olarak belirlemişlerdir. Haller ve ark. (2001)
128
tarafından yapılan bir çalışmada
çeşitli kaynaklardan izole edilen Lactobacillus suşlarının pH 2.0 de canlılıkları % 093 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmaya göre farklı türlerin hatta aynı suşa ait
türlerin, pH dirençlerinin farklı olmasının sebebi bakterilerin üreme fazındaki
farklılıktan kaynaklandığı belirtilmiştir.
38
4.3. Lactobacillus spp. SUŞLARIN YÜKSEK SAFRA TUZU (OXGALL)
KONSANTRASYONLARINDA DİRENÇLİLİĞİ
Probiyotik mikroorganizmalar için bir diğer önemli kriter ise safra tuzlarına
karşı dirençliliktir. Çünkü insan sindirim sistemine giren bakteriler midenin asit
ortamından geçtikten sonra bağırsaklarda safra asitleri ve tuzları ile karşılaşırlar. Bu
bakterilerin canlı kalabilmeleri açısından safra tuzu toleranslarının yüksek olması
gerekmektedir 125.
Değişik safra konsatrasyonlarında (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) 3 saatlik
inkübasyona bırakılan Lactobacillus suşlarının safra tuzu dirençliliği Tablo 4’te
gösterilmiştir.
39
Tablo 4. Lactobacillus spp. suşlarının değişik düzeyde (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) safra tuzu (oxgall) toleransı
Farklı safra tuzu (oxgall) konsantrasyonları (%)
İzolatlar
40
L. pentosus LS-2
L. pentosus LS-3
L. plantarum1 LS-4
L. fermentum1 LS-5
L. plantarum1 LS-6
L. plantarum1 LS-8
L. plantarum1 LS-10
L. plantarum1 LS-11
L. plantarum1 LS-12
L. pentosus LS-13
L. plantarum1 LS-14
L. fermentum2 LS-15
L. fermentum2 LS-16
L. curvatus LS-17
L. plantarum1 LS-18
L. fermentum2 LS-19
L. plantarum1 LS-20
L. plantarum1 LS-21
L. salivarius LS-22
L. plantarum1 LS-23
L. fermentum2 LS-24
L. fermentum2 LS-25
Canlı kalma oranı
0.3
1320x106
600x106
120x106
360x106
60x106
280x106
240x106
180 x106
120 x106
180 x106
180 x106
300 x106
420 x106
180 x106
720 x106
120 x106
360x106
120 x106
180 x106
%76
0.5
1.0
Canlı mikroorganizma sayısı (24 saat sonra) (cfu/ml)
420x106
240x106
6
300x10
160x106
240x106
60 x106
180 x106
120 x106
120 x106
100 x106
260 x106
200 x106
300 x106
60 x106
240 x106
60 x106
%40
%24
1.5
120x106
100x106
120x106
60 x106
160 x106
%20
Tablo 4’te de görüldüğü üzere safra tuzuna dayanıklılık açısından suşlar
arasında farklılıklar bulunmaktadır. Lactobacillus suşlarının % 0.3 safra tuzu içeren
ortamda canlı kalabilme oranı % 76 olmuştur. Bu oran % 0.5 safra tuzu içeren
ortamda %40, %1 safra tuzu içeren ortamda % 24 ve % 1.5 safra tuzu içeren ortamda
ise %20’ye düşmüştür. Bu çalışmada safra tuzuna karşı toleransı en iyi olan suşlar L.
delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L.
plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 olduğu
gözlemlenmiştir.
Papamanoli ve ark’nın (2003)
129
% 3.0 safra konsantrasyonunun L. sakei, L.
curvatus, ve L. plantarum türlerine ait suşlar üzerinde inhibe edici etkisini
araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda L. sakei suşları % 100, L. curvatus suşları %
42 ve L. plantarum suşları % 0 oranında inhibe edilmiştir. Yapılan bir diğer
çalışmada ise L. oris AS17 ve L. fermentum AS83 suşlarının %3.0 safra tuzu içeren
ortamda 4 saat süreyle safra tuzu toleransı incelenmiş, bu iki suşun % 3.0’lık safra
tuzuna konsantrasyonunda canlılıklarını koruyabildikleri belirtilmiştir. Bir başka
çalışmada ise, Gilliland ve Walker (1990)
130
12 adet L. acidophilus bakterisinin
safra toleransını incelemiş, kültürler arasında safra toleransı bakımından önemli
farklılıklar tespit etmiştir. Usman ve Hosono (1999)
131
yaptıkları çalışmada L.
gasseri bakterisinin suşları arasında safra tuzları toleransı bakımından farklılıklar
olduğunu belirtmişlerdir.
4.4 Lactobacillus spp. SUŞLARININ SAFRA TUZU (KOLİK ASİT)
HİDROLİZİ
Dekonjuge safra asitleri bağırsak florası ile sekonder safra asitlerine
dönüştürülmektedir. Böylece serum kolesterol düzeyi düşemektedir. 132, 133.
Bölüm 3.2.5’te safra tuzu hidrolizinin belirlenmesi üzerine yapılan araştırma
sonucu elde edilen veriler Tablo 5’de sunulmuştur.
41
Tablo 5. Lactobacillus spp. suşlarının safra tuzu hidroliz (kolik asit) aktivitesi.
SUŞLAR
Sonuç*
L. delbrueckii subsp delbrueckii LS-1
L. pentosus LS-2
L. pentosus LS-3
L. plantarum1 LS-4
L. fermentum1 LS-5
L. plantarum1 LS-6
L. plantarum1 LS-8
L. plantarum1 LS-10
L. plantarum1 LS-11
L. plantarum1 LS-12
L. pentosus LS-13
L. plantarum1 LS-14
L. fermentum2 LS-15
L. fermentum2 LS-16
L. curvatus LS-17
L. plantarum1 LS-18
L. fermentum2 LS-19
L. plantarum1 LS-20
L. plantarum1 LS-21
L. salivarius LS-22
L. plantarum1 LS-23
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
+++
+
+++
+++
+++
-
L. fermentum2 LS-24
L. fermentum2 LS-25
++
+
*Safra tuzu hidroliz aktivitesi
**(-): Negatif, (+): Zayıf, (++): Orta, (+++): Yüksek.
Tablo 5’de görüldüğü gibi suşların genelinin safra tuzunu dekonjuge
edebildiği görülmektedir. Sadece suşların altı tanesi safra tuzunu hidroliz
edememişlerdir. L. fermentum2 LS-15 ve L. fermentum2 LS-25 suşları ise belirli bir
miktarda kolik asit hidrolizini gerçekleştirmişlerdir. Resim 3’ de hidroliz edilmemiş
kolik asit kristali gösterilmiştir. Bu çalışmada en iyi sonuç veren suşlardan L.
pentosus LS-2’nın gerçekleştirmiş olduğu kolik asit hidrolizi görüntüsü ise Resim
4’te verilmiştir.
42
Resim 3: Hidroliz edilmemiş kolik asit kristali. Novax AP-5 50920 binoküler
mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü.
Resim 4: L. pentosus LS-2 suşunun gerçekleştirdiği safra tuzu (kolik asit) hidrolizi.
Kolik asit kristallerinin parçalanmış hali. Novax AP-5 50920 binoküler
mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü.
Moser ve Savage (2001)121, 30 tanesi insan kaynaklı, 15 tanesi süt
ürünlerinden, 4 tanesi farklı kaynaklardan izole edilmiş Lactobacillus suşunun BSH
43
(Bile salt hydrolyzed) aktivitelerinin incelendiği bir çalışma yapmışlardır. Yapılan bu
çalışmada suşların % 55.1 pozitif sonuç verirken, diğer %44.9 BSH aktivitelerinin
negatif olduğu tespit edilmiştir.
4.5.
Lactobacillus
spp.
SUŞLARININ
ANTİMİKROBİYAL
AKTİVİTELERİ
Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının ampisilin (10 µg),
basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg)
penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg),
antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları NCCLS kriterlerine göre değerlendirilmiştir.
Test sonuçları Tablo 6 da verilmiştir. Ayrıca %’de duyarlılık oranları Tablo 7 ve
Şekil 2’de gösteriliştir.
44
Tablo 6. Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı duyarlılık sonuçları (mm).
Antibiyotikler*
Lactobacillus spp.
45
L. pentosus LS-2
L. pentosus LS-3
L. plantarum1 LS-4
L. fermentum1 LS-5
L. plantarum1 LS-6
L. plantarum1 LS-8
L. plantarum1 LS-10
L. plantarum1 LS-11
L. plantarum1 LS-12
L. pentosus LS-13
L. plantarum1 LS-14
L. fermentum2 LS-15
L. fermentum2 LS-16
L. curvatus LS-17
L. plantarum1 LS-18
L. fermentum2 LS-19
L. plantarum1 LS-20
L. plantarum1 LS-21
L. salivarius LS-22
L. plantarum1 LS-23
L. fermentum2 LS-24
L. fermentum2 LS-25
*
PIP
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
B
R
R
S
S
R
I
I
S
R
R
R
S
I
R
S
R
I
S
R
I
S
S
S
R
R
CAZ
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
RA
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
TE
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
S
S
S
E
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
AM
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
TEC
R
R
S
S
S
S
S
S
R
R
R
R
S
S
R
R
S
S
R
S
R
S
R
I
S
GM
I
I
S
I
R
S
I
I
R
I
I
I
I
I
I
I
I
S
I
I
I
I
I
I
I
VA
R
R
S
S
S
S
S
R
R
R
R
R
S
S
S
R
S
S
R
S
I
S
R
R
S
TMP
R
R
S
S
R
S
R
S
S
S
S
R
R
R
R
I
R
S
I
R
R
I
R
R
R
P
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
R
R
S
S
S
I
S
MEM**
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S=duyarlı R=dirençli I=orta duyarlı
**
PIP: ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg),
Tablo 7. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık
sonuçları.
Antibiyotik
Ampisilin
Basitrasin
Eritromisin
Gentamisin
Meropenem
Penisilin
Piperasilin
Rifampin
Seftazidim
Teikoplanin
Tetrasiklin
Trimetoprim
Vankomisin
Duyarlı
100
36
96
12
96
76
100
92
92
52
92
32
52
Dirençli
44
8
4
20
44
56
44
Orta Duyarlı
20
4
80
4
8
8
4
8
12
4
Bu çalışmada Lactobacillus suşlarının genel olarak antibiyotiklere karşı
duyarlı oldukları gözlenmiştir. Özellikle piperasilin ve ampisilin de tüm suşların
duyarlı oldukları tespit edilmiştir. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan
gentamisin, trimetoprim ve vankomisin antibiyotiklerine karşı daha dirençli oldukları
görülmüştür. Lactobacillus suşlarından L. pentosus LS-3 ve L. plantarum1 LS-18
tüm antibiyotiklere duyarlı oldukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp.
delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L.
fermentum2 LS-16, L. fermentum2 LS-24 suşlarının antibiyotiklere karşı çalışmadaki
diğer suşlardan daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir.
46
% Duyarlılık Oranları
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Duyarlı
Dirençli
Orta
Dirençli
Antibiyotikler
Şekil 2. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık
oranları.
Temmerman ve ark. (2003)
134
tarafından yapılan bir çalışmada çeşitli
probiyotik ürünlerden izole edilmiş laktik asit bakterilerinin disk difüzyon yöntemi
ile antibiyotik duyarlılıkları test edilmiştir. Araştırmacılar çalışma sonucunda suşların
tetrasiklin ve eritromisine duyarlı olduklarını tespit etmişlerdir. Arıcı ve ark.’nın
(2004) 135 probiyotik özelliğe sahip 21 Lactobacillus suşu üzerinde yapığı çalışmada,
suşların tetrasikline karşı duyarlı oldukları belirtilmiştir.
4.6.
Lactobacillus
spp.
SUŞLARIN
BAZI
PATOJEN
MİKROORGANİZMALARA KARŞI ANTAGONİSTİK ETKİLERİ
Lactobacillus suşlarının bu çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalara
karşı genel olarak inhibisyon etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Elde edilen
sonuçlar Tablo 8’de gösterilmiştir. Lactobacillus suşları genel olarak patojenlere
karşı inhibitör etki gösterirlerken sadece L. plantarum1 LS-18 suşunun hiçbir
47
patojende zon çapı oluşturmadığı tespit edilmiştir. Patojenler karşı inhibitör etkileri
en iyi düzeyde olan suşlar ise L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS2 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2
LS-15 L. fermentum2 LS-16, L. salivarius LS-22 olarak tespit edilmiştir.
48
Tablo 8. Lactobacillus spp. suşlarının değişik patojen bakterilerine karşı oluşturdukları antagonistik etkileri (mm).
Patojen mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonları (mm)
Lactobacillus spp.
49
L. pentosus LS-2
L. pentosus LS-3
L. plantarum1 LS-4
L. fermentum1 LS-5
L. plantarum1 LS-6
L. plantarum1 LS-8
L. plantarum1 LS-10
L. plantarum1 LS-11
L. plantarum1 LS-12
L. pentosus LS-13
L. plantarum1 LS-14
L. fermentum2 LS-15
L. fermentum2 LS-16
L. curvatus LS-17
L. plantarum1 LS-18
L. fermentum2 LS-19
L. plantarum1 LS-20
L. plantarum1 LS-21
L. salivarius LS-22
L. plantarum1 LS-23
L. fermentum2 LS-24
L. fermentum2 LS-25
S. epidermidis
P. aeruginosa
K. pneumoniae
E. coli
Neisseria sp.
13±0.1
16±0.5
12±0.2
10±0.1
13±0.1
19±0.2
14±0.2
18±0.3
12±0.2
20±0.3
18±0.2
18±0.1
16±0.2
11±0.1
18±0.2
17±0.4
13±0.0
15±0.0
16±0.0
20±0.2
15±0.0
11±0.2
-
13±0.1
19±0.2
10±0.0
12±0.3
20±0.5
16±0.5
16±0.5
22±0.5
20±0.2
18±0.2
19±0.2
17±0.1
19±0.4
16±0.1
13±0.1
12±0.4
19±0.2
20±0.1
19±0.4
16±0.1
16±0.3
12±0.0
11±0.2
12±0.1
15±0.0
11±0.0
11±0.4
11±0.1
14±0.0
13±0.1
13±0.3
12±0.4
13±0.1
12±0.0
13±0.3
12±0.0
12±0.2
-
10±0.0
12±0.1
12±0.2
16±0.1
10±0.4
15±0.2
16±0.2
15±0.2
15±0.3
13±0.4
11±0.0
12±0.2
13±0.1
14±0.0
12±0.0
14±0.0
14±0.1
-
17±0.3
17±0.2
22±0.4
14±0.1
17±0.1
16±0.3
22±0.5
20±0.2
16±0.4
17±0.3
17±0.3
18±0.2
11±0.0
18±0.0
16±0.2
16±0.0
-
4.7.
Lactobacillus
BAKTERİOSİN
spp.
VEYA
SUŞLARI
TARAFINDAN
BAKTERİOSİN
BENZERİ
ÜRETİLEN
MADDELERİN
İNHİBİTÖR ETKİLERİ
Lactobacillus suşlarının ürettikleri laktik asit dışındaki diğer metabolitlerinin
inhibitör etkilerinin belirlenmesi üzerine Bölüm 3.2.9’da anlatıldığı gibi yapılmıştır.
% 0.2 glikozlu MRS sıvı besiyerinde geliştirilen Lactobacillus spp. izolatları patojen
bakterilere karşı hiçbir inhibisyon etki göstermemiştir. Bu durum bize indikatör
bakterilere karşı inhibisyon etkinin laktik asit bakterilerin ürettiği organik asitlerden
ileri geldiğini göstermektedir.
4.8. Lactobacillus spp. SUŞLARININ KOLESTEROL GİDERİMİ
Yüksek kolesterol damarları tıkayıp kalp krizlerine ve ölümlere neden
olmaktadır. Laktik asit bakterilerinin kolesterolü asimile ederek serum kolesterol
seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Araştırmada düşük asitliğe ve yüksek safra
tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip 5 suş seçilmiş
ve kolesterol giderimi çalışılmıştır. Tablo 9’de ve Şekil 3’de L. delbrueckii subsp.
delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L.
fermentum2 LS-15 suşlarının insan plazma serumunda kolesterol giderimi
görülmektedir. Besiyeri olarak MRS sıvı besi yerinde değişik safra tuzu (% 0.3
oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) ortamlarında çalışma yapılmıştır. Çalışmamızda
kültürler MRS sıvı besi yerinde 10-22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall’lı MRS sıvı besi
yerinde 14-50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit’li MRS sıvı besi yerinde 8-13.5 µg/ml ve
% 0.3’lük taurocholic asit’li MRS sıvı besi yerinde 15-55 µg/ml kolesterol
asimilasyonu yapmıştır.
50
Tablo 9: Bazı Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besiyerinde ve değişik safra tuzu ( % 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) besiyerinde
kolesterol giderimi (µg/ml).
Lactobacillus spp.
MRS +
Kollesterol
MRS+
MRS +
MRS +
% 0.3 Oxgall +
% 0.3 Kolik Asit +
% 0.3 Taurocholic Asit +
Kollesterol
Kollesterol
Kollesterol
51
10
17
9
15
L. pentosus LS-2
13
14
8
43
L. plantarum LS-11
15.5
37.5
10.5
57
L. plantarum LS-12
22
50
13.5
60
L.fermentum LS-15
21
25.5
10
55
70
60
50
MRS
40
MRS+%0,3 Oxgall
MRS+%0,3 Kolik asit
30
MRS+%0,3 Taurochili asit
20
10
0
LS-1
LS-2
LS-11
LS-12
LS-15
Şekil 3. L. delbrueckii ssp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11,
L. plantarum LS-12 ve L.fermentum LS-15 suşlarının kolesterol giderim miktarları
(µg/ml).
Gilliland ve ark. (1985)
136
çalışmalarında L. acidophilus suşlarının % 0.5
oxgall ilaveli MRS sıvı besi yerinde, ortamın plazma serum kolesterolünü 18.8-63.0
µg/ml değerinde asimilasyon yaptığını saptamışlardır. Buck ve Gilliland (1994)
137
bir çalışmada insan kaynaklı L. acidophilus suşlarının 20.5-83.3 µg/ml kolesterol
asimilasyonu yaptığını göstermişlerdir. Brashears ve ark.’na (1998)
138
göre L. casei
suşları MRS sıvı besi yerinde 16.9-74.3 µg/ml kolesterol asimilasyonu yapmıştır.
Loing ve Shah (2005)
139
çalışmalarında Lactobacillus’ların MRS sıvı besiyerinde
10.00-21.61 µg/ml ve % 0.30 oxgall ilaveli MRS sıvı besi yerinde 12.03-32.25 µg/ml
kolesterol asimile ettiğini belirlemişler. 2010 yılında yapılan başka bir çalışmada Lye
ve arkadaşları Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besi yerinde 14.22-27.89 µg/ml ve
% 0.30 oxgall’lı MRS sıvı besi yerinde 11.17-62.42 µg/ml kolesterol asimile
ettiklerini belirlemişlerdir 140.
Araştırmamız da diğer çalışmalarla paralellik arz etmektedir. L. plantarum
LS-11 MRS besi yerinde 15.5 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde da 37.5
µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi
52
yerinde 57 µg/ml, L. plantarum LS-12 suşu MRS besi yerinde 22 µg/ml, % 0.3’lük
oxgall MRS besi yerinde 50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 13.5 µg/ml ve % 0.3’lük
taurocholic asit MRS besi yerinde 60 µg/ml ve L. fermentum LS15 suşu MRS besi
yerinde 21 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde de 25.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik
asit 10 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 55 µg/ml kolesterol
giderimi yapmıştır. Yaptığımız çalışmadan da anlaşıldığı gibi MRS sıvı besiyeri ve
% 0.3’lük kolik asit katkılı MRS sıvı besi yerinde, bakterilerin kolesterol giderimi %
0.3’lük oxgall ve taurocholic asit MRS sıvı besi yerinden daha yüksek olduğu
gözlenmektedir. Bu üç suşun kolesterol gideriminde kullanılabileceği belirlenmiştir.
53
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
İnsan
vücudu
milyarlarca
mikroorganizmaya
konakçılık
eden
bir
ekosistemdir. Bu ekosistemde zararlı ve yararlı mikroorganizmalar bir rekabet
halinde olup, sağlıklı insanlarda yararlı mikroorganizmalar baskın mikroflorayı
oluşturmaktadır. İnsan vücudunda mikrofloranın en geniş olduğu yer ise sindirim
sistemidir. Özellikle bağırsaklar yapısı ve işlevi gereği birçok mikroorganizmayı
barındırmaktadır. Bağırsakların fonksiyonu insanların uzun ömürlü ve sağlıklı
yaşaması için çok önemlidir. Filogenetik süreçte yararlı mikroorganizmalarla
insanlar arasında mutualist bir yaşam başlamış, bu mikroorganizmalar bağırsaklara
yerleşerek, bağırsak fonksiyonlarını olumlu yönde etkilemişlerdir 1-4, 15.
Eski çağlarda yaşamış insanların diyetlerini göz önüne getirdiğimizde
günümüz insanına göre çok daha fazla miktarda süt ürünleri ve lifli besin tükettiği
görülmektedir. Bu beslenme tarzı sayesinde bağırsak mikroflorasında yararlı türler
gelişmekte ve bağırsak fonksiyonları daha düzenli olmaktaydı. Dolayısıyla insanlar
daha sağlıklı ve daha uzun ömürlüydüler 4, 9, 18, 25.
Bu bağlamda günümüz insanının stresli yaşam tarzı, fazla miktarda rafine
gıdaların tüketimi ve dengesiz beslenme, düzensiz antibiyotik kullanımı, alkol ve
sigara gibi alışkanlıklar insan vücudunu olumsuz etkilediği gibi vücuda yararlı olan
mikroorganizmalarında sayısını önemli ölçüde azaltmaktadır. Böylece insanlar hem
direk hem de dolaylı olarak ciddi sağlık sorunlarıyla karşılaşmaktadırlar
18, 25
.
Starchan tarafından ileri sürülen ‘Hijyen hipotezi’ günümüz insanının yaşadığı
mikrobiyal problemlere verilebilecek güzel bir örnektir. Starchan’a göre çok steril
ortamda yetiştirilen bireylerde alerjik rinit insidansının daha sık görüldüğü tespit
edilmiştir. Bu hipoteze göre insanların aşırı mikrobiyol kontrolu, eskiye göre daha az
insanlarla temas halinde olması (daha az kardeş sayısı ve arkadaş sayısı gibi) ve
hijyen kontrollerinin iyileştirilmesi
gibi etkenler insanların gastrointestinal
sisteminde yerleşecek olan yararlı mikroorganizmaların gelişimini engellemektedir
141
.
Bu
nedenle
gastointestinal
sistemde
azalan
mikroorganizma
sayısını
düzenleyebilmek için probiyotik ve prebiyotik takviyeler tavsiye edilmektedir 9.
54
Yüz yılı aşkın bir süredir bazı bilim insanlarının ilgisini çeken bağırsak
mikroflorası üzerine gün geçtikçe yeni araştırmalar yapılmış ve yapılmaktadır. Bu
konuyla ilgili olarak en çok araştırma yapılan konu başlığı probiyotiklerdir.
Günümüzde doğal ürünlere tekrar dönmeye başlayan insanlarında ilgisini çekmeyi
başlamış olan probiyotikler, gastrointestinal sistem üzerinde yaşayan ve konakçıya
belirgin bir yarar sağlayan mikrobiyolojik canlılardır23,30,36.
Probiyotikler insan ve hayvan sağlığı üzerinde büyük faydalar sağlayan
mikroorganizmalardır. Probiyotik bakteriler üzerinde son 30 yılda çok sayıda
araştırmalar yapılmakta ve ülkemizde 2000’li yıllardan sonra üzerinde araştırmalar
yapılmaya başlanmıştır. Ülkemizde yetişkin insanlardan izole edilen Lactobacillus
bakterileri üzerinde yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Aynı zamanda insan
plazma serumu ile in vitro olarak kolesterol giderimi çalışması da yapılmamıştır.
Bu çalışmada, yaşları 25-50 arasında değişen sağlıklı insanların intestinal
sistemine ait 25 adet Lactobacillus spp. suşları üzerinden yürütülmüştür. Suşların
düşük asit ve yüksek safra tuzu (oxgall) tölarensları, safra tuzu (kolik asit) hidroliz
aktiviteleri, antibiyotik dirençleri, antagonistik etkileri, ve bu suşlar tarafından
üretilen bakteriosin veya bakteriosin benzeri ürünlerin inhibitör etkileri gibi
probiyotik özellikler yönünden değerlendirilmiştir. Ayrıca L. delbrueckii subsp.
delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. Plantarum1 LS-11, L. Plantarum1 LS-12 ve
L. Fermentum2 LS-15 suşları seçilerek kolesterol giderimlerine bakılmıştır.
Probiyotik mikroorganizmalar bağırsaklarda lokalize olduklarına göre doğal
olarak gastrointestinal sistemin şartlarına uyum sağlamaları gerekmektedir. Bu
nedenle öncelikli olarak yüksek asitli ortamlara dirençli olmaları gerekmektedir.
Yapmış olduğumuz üç değişik düşük pH çalışmasında; pH 3 değerinde bütün
suşlarımızın canlılığını korudukları gözlemlenmiştir. pH 2.0 değerinde ise canlı
kalabilme oranlarında pH 3.0’e göre bir düşüş gözlenmektedir L. fermentum1 LS-5,
L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarının
canlılıklarını diğer suşlara göre daha iyi korudukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii
subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-10, L. plantarum1 LS11, L. fermentum2 LS-19, L. plantarum1 LS-23 ve L. fermentum2 LS-24 suşlarının
55
ise düşük pH değerlerine dirençlerinin daha zayıf olduğu tespit edilmiştir (Bkz.
Tablo 3).
Gastrointestilal sistemin ağır şartlarından, düşük pH’ın yanı sıra, bir diğer
faktörde
bilindiği
üzere
yüksek
safra
tuzu
yoğunluğudur.
Probiyotik
mikroorganizmalarda aranan özelliklerden başlıcalarıdan olan safra tuzu dirençliliği
ile
ilgili
olarak
suşlarımızla
yapmış
olduğumuz
değişik
safra
tuzu
konsantrasyonlardaki (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) çalışmalarımızda, doğal olarak
tuz
yoğunluğu
yükseldikçe
canlı
kalma
oranlarında
azalma
olduğu
gözlemlenmektedir (% 0.3 safra tuzunda % 76 iken % 1.5 safra tuzunda % 20).
Sonuç olarak safra tuzuna karşı toleransı en iyi olan suşlar L. delbrueckii subsp.
delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L.
fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 olduğu gözlemlenmiştir (Bkz. Tablo 4).
Safra tuzu toleransı ile ilgili olarak bir diğer çalışmamız olan, safra tuzu
hidrolizinde elde ettiğimiz sonuçlar da ise suşlarımızın genelinin safra tuzunu
dekonjuge edebildiği görülmektedir. Dekonjuge safra asitleri bağırsak florası ile
sekonder safra asitlerine dönüştürülmektedir. Böylece serum kolesterol düzeyi
düşemektedir.
Serum
kolesterol
seviyesini
düşürme
özelliğinin
bulunması
Probiyotiklerin yararları konusunda aranan bir özelliktir. Bu çalışmamızda, sadece
altı suşumuz safra tuzunun hidrolizini gerçekleştirememiştir. L. fermentum2 LS-15
ve L. fermentum2 LS-25 suşlarımız ise belirli bir miktarda kolik asit hidrolizini
gerçekleştirmişlerdir. Çalışmada en iyi sonuç veren suşumuz L. pentosus LS-2’dir
(Bkz. Tablo 5 ve Resim 4).
Probiyotik mikroorganizmalar gastrointestinal sistemin şartlarına dirençli
olmalarının yanı sıra dışarıdan gelebilecek etkenlere karşıda dirençli olmaları
gerekmektedir. Bu konuyla ilgili olarak yaptığımız antimikrobiyal aktivite
çalışmasında; suşlarımızın, ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15
µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg),
rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg), teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg),
trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg), antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları
araştırılmış, genel olarak suşlarımızın bu antibiyotiklere karşı duyarlı oldukları
gözlemlenmiştir. Özellikle piperasilin ve ampisilin de tüm suşların duyarlı oldukları
56
tespit edilmiştir. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan gentamisin, trimetoprim
ve vankomisin antibiyotiklerine karşı daha dirençli oldukları görülmüştür.
Suşlarımızdan L. pentosus LS-3 ve L. plantarum1 LS-18 tüm antibiyotiklere duyarlı
oldukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2,
L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-16, L. fermentum2
LS-24 suşlarımız, diğer suşlarımıza göre daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir.
Probiyotik
mikroorganizmalar
gastrointestinal
sistemde
patojen
mikroorganizmalarla rekabet içindedirler. Burada yaşayabilmeleri için patojen
mikroorganizmalara karşı antagonistik etki özelliklerinin olması gerekmektedir. Bu
özellikten yola çıkarak suşlarımız üzerinde yaptığımız çalışmada, 5 adet patojen
mikroorganizma kullanılmıştır. Bunlar: E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa
(ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve
Neisseria sp.’dir. Suşlarımızın bu çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalara
karşı genel olarak inhibisyon etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Sadece L.
plantarum1 LS-18 suşumuz hiçbir patojende zon çapı oluşturmadığı tespit edilmiştir.
Patojenlere karşı inhibitör etkileri en iyi düzeyde olan suşlarımız ise L. delbrueckii
subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS11 L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16, L. salivarius
LS-22 olarak tespit edilmiştir.
Bu çalışmaya paralel olarak yürüttüğümüz bakteriosin veya bakteriosin
benzeri maddelerin inhibitör etkilerinin tespiti amacıyla yaptığımız çalışmada,
suşlarımızın ürettikleri laktik asit dışındaki diğer metabolitlerinin inhibitör etkilerinin
belirlenmesi üzerine % 0.2 glikozlu MRS sıvı besiyerinde geliştirilen suşlarımızdan
elde edilen supernatantlar, patojen bakterilere karşı hiçbir inhibisyon etki
göstermemiştir. Bu durum bize indikatör bakterilere karşı inhibisyon etkinin laktik
asit bakterilerin ürettiği organik asitlerden ileri geldiğini göstermektedir.
Yaptığımız bu çalışmaların sonuçlarından yola çıkarak probiyotik özellikleri
bakımından iyi sonuç veren düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra
tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip, L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L. plantarum LS-12 ve L. fermentum LS-15
suşlarımız alınarak, kolesterol giderimleri araştırılmıştır. Daha önceki bölümlerde de
57
bahsedildiği gibi kolesterol giderimi probiyotikler içinde aranan bir özellik olmuştur.
Yüksek kolesterol damarları tıkayıp kalp krizlerine ve ölümlere neden olmaktadır.
Laktik asit bakterilerinin kolesterolü asimile ederek serum kolesterol seviyesini
düşürdüğü bilinmektedir. Besiyeri olarak MRS sıvı besi yerinde değişik safra tuzu
(% 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) ortamlarında çalışma yapılmıştır.
En yüksek kolesterol giderimini L. plantarum LS-12 suşu MRS besi yerinde
22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 13.5
µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 60 µg/ml olarak vermiştir. L.
plantarum LS-11 MRS besi yerinde 15.5 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi
ortamında 37.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit
MRS besi yerinde 57 µg/ml ve L. fermentum LS15 suşu MRS besi yerinde 21 µg/ml,
% 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 25.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10 µg/ml ve
% 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 55 µg/ml kolesterol giderimi yapmıştır.
Kolesterol giderimi yüksek olan bu üç suşun potansiyel probiyotik olabileceklerine
karar verilmiştir. Bu suşlar başka araştırmalarda kullanılmak üzere muhafazaya
alınmıştır.
Sonuç olarak, sağlıklı bir yaşam için gastrointestinal sistemin düzenli
çalışması elzemdir. Bu sistemin düzenli bir şekilde çalışabilmesi için probiyotikler en
iyi
yardımcılardır.
İnsan doğumundan itibaren bağırsak florası
oluşmaya
başlamaktadır. Doğumdan sonraki dönem anne sütü kullanımı, bebeğin bulunduğu
ortam gibi etkenler bağırsak mikroflorasını belirlemektedir. İnsanlığın başlangıcında
her şey doğaldı ve kendiliğinden gerçekleşmekteydi. Günümüze baktığımızda
insanoğlunun hemen her şeyde müdahalesinin olduğunu görmekteyiz. Örneğin
doğumun sezaryan olması, doğumdan sonra anne sütünün kullanılmaması ve bebeğin
aşırı steril ortamda yetiştirilmesi, bireyin gastointestinal mikroflorasının daha
temelden olumsuz bir şekilde teşekkül etmesine neden olur. Birey büyüdükçe
günümüz şartlarında var olan dengesiz beslenme, gereksiz antibiyotik kullanımı,
sigara ve alkol kullanımı, rafine gıdaların tüketimi ve stresli yaşam tarzı, başlangıçta
oturmamış olan gastrointestinal florayı daha da olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle
günümüzde de şahit olduğumuz bir takım doğrudan ve dolaylı birçok hastalıkla
muhatap olmaktayız. Bu nedenlerle sağlıklı bir yaşam ve hastalıkların tedavisinde
58
probiyotik mikroorganizmaların yeri tartışılmaz hale gelmektedir. Probiyotiklerle
ilgili yapılan çalışmalara bakıldığında birçok hastalıktan korunmada ve tedavisinde
kullanıldığı görülmektedir. Ancak sadece probiyotik takviyesi almak, gastrointestinal
sistem için yeterli olmayacaktır. Sağlıklı yaşam için en baştan duyarlı olunması
gerekmektedir ve öncelikli olarak bireylerin normal doğumla dünyaya gelmesi ve
sonrasında anne sütü kullanımı teşvik edilmelidir. Sonrasında bireyler günlük
yaşamlarında diyetlerine dikkat etmeli rafine gıdalardan uzak durmalıdırlar. Gereksiz
antibiyotik kullanımı ve zararlı alışkanlıklardan kaçınmalıdırlar. Gasrointestinal
floradaki probiyotikler için diyetlerinde mutlaka prebiyotik içeren besinleri
tüketmeleri gerekmektedir. Günümüzde bunları yapmak zor olsa da herhangi bir
hastalık karşısında harcanan maddi güç ve zaman göz önüne alındığında daha kolay
olduğu aşikardır.
59
6. KAYNAKÇA
1. Klaenhammer, R. T. ; Kullen, J.M. Int. J. of Food Microbiol, 1999, 50, 45-57.
2. Rolfe, R. D. J. of Nutrition, 2000, 130, 3965-4025.
3. Çakır, İ. Lactobacillus Ve Bifidobacterlerde Bazı Probiyotik Özelliklerin
İncelenmesi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Ankara,
2003.
4. Can, Ö. P. Doğu Anadolu Bölgesi Araştırmaları, 2007, 107-110.
5. Karaçay, B. Bilim Ve Teknik Dergisi, 2010, 514, 36-43.
6. Peter, J. T. ; Ruth, E. L. ; Michael, A. M. ; Vincent, M. ; Elaine, R. M. ; Jeffrey,
I. G. Nature Publishing Group, 2006, 1027-1031.
7. Young, R. J. ; Huffman, S. J. Pediatr Health Care, 2003, 17, 277-283.
8. Guarner, F. ; Malagelada J. R. Lancet, 2003, 360, 512-519.
9. İnanç, N. ; Şahin, H. ; Çiçek, B. Erciyes Tıp Dergisi, 2005, 27 (3), 122-127.
10. Morelli, L. J. Nutr. 2008, 138,1791-1795.
11. Caicedo, R. A. ; Schanler, R.J. ; Li, N. ; Neu, J. Pediatr Res, 2005, 58, 625–628.
12. Gültekin, M. Ankem Dergisi, 2004, 18 (Ek 2), 87-89.
13. Yan, F. ; Polk, D. B. Curr Opin Gastroenterol, 2004, 20, 565–571.
14. Gill, H. S. ; Guarner, F. Postgrad Med J, 2004, 80, 516–526.
15. Coşkun T. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 2006, 49, 128-148.
16.
Quigley, E. M. M. Pharmacological Research, 2010, 61, 213-218.
17.
Thomas, D. W. ;Greer, F. R. Pediadrics, 2010, 126, 1217-1231.
18. Özden, A. Güncel Gastroloji, 2005, 9/3, 124-133.
19. Maukonen, J. ; Mattö, J. ; Suihko M-L. ; Saarela, M. Journal of Medical
Microbiology, 2008, 57, 1560–1568.
20. Gibson, G. R. ; Roberfroid, M. B. J Nutr, 1995, 125, 1401-1412.
21. Can, Ö. P. Doğu Anadolu Bölgesi Araştırmaları, 2007, 194-196.
22. Yaşar, B. ; Kurdaş, O. Ö. Güncel Gastroloji, 2009, 13/1, 23-28.
23. Gürsoy, O. ; Kınık, Ö. Mühendislik Bilimleri Dergisi, 2006, 12, 105-116.
24. Bengmark, S. Gastroenterol Clin North Am, 2005, 34, 413-436.
60
25. Parracho, H. ; McCartney, A. L. ; Gibson, G. R. Proceedings of the Nutrition
Society, 2007, 66, 405–411.
26. Sinkiewicz, G. Lactobacillus reuteri in health and disease, Doktora Tezi,
Malmö University Faculty of Health and Society Department of Biomedical
Laboratory Sciences, Holmbergs, Malmö, 2010.
27. Soccol, C. R. ; Vandenberghe, S. L. P. ; Spier, M. R. ; Medeiros, A. B. P. ;
Yamaguishi, C. T. ; Lindner, J. D. ; Pandey, A. ; Soccol, V. T. Food Technol.
Biotechnol, 2010. 48 (4) 413–434.
28. Rosenberg, I. Z. ; Rosenberg, E. J. Microbial Biochem Technol, 2011, S1.
29. Özden, A. Güncel Gastroenteroloji, 2006, 10/3, 273-278.
30. Sullivan A. ; Nord, C. E. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 50,
625–627.
31. Probiotics: Review and Outlook, 3rd International Convention, Paris, 2nd and 3rd
December 2004.
32. Özen, M. Probiyotikler: anlatılmayan Tarihçe Nobel tıp kitap evleri, 2011, 1-15
33. Gürsoy, O. ; Kınık, Ö. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 2006, 43(1), 181-188.
34. Rusch, V. Probiotics: Bacteria And Bacterial Fragments As Immunomodulatory
Agents, 2001 Old Herborn University Seminar No. 15, 2002.
35. Fuller, R. Journal of Applied Bacteriology, 1989, 66, 365-378.
36. Gürbüz, H. İnsan Kaynaklı Lactobacillus spp. Suşlarında Agregasyonun
Probiyotik Önemi, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstirüsü, Ankara, 2004.
37. Kopp-Hoolihan, L. J Am Diet Assoc, 2001; 101: 229-238.
38. Doron, S. ; Snydman, D. R. ; Gorbach, S. L. Gastroenterol Clin North Am, 2005,
34: 483-498.
39. Gionchetti, P. ; Lammers, K. M. ; Rizzello, F. ; Campieri, M. Gastroenterol Clin
North Am, 2005, 34: 499-513.
40. Çelen, E. ; Hız, I. ; Vural, T. Güncel Gastroloji Dergisi, 1999; 403-405.
41. Önal, D. Bazı laktik asit bakterilerinin probiyotik özelliklerinin araştırılması.
Yüksek lisans tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstirüsü, Ankara, 2005.
42. Gülmez, M. ; Güven, A. Kafkas üniv. Vet. Fak. Derg., 2002, 8(1): 83-89.
61
43. Donnet-Hughes, A. ; Rochat, F. ; Serrant, P. ; Aeschlimann, J. M. ; Schıffrın, J. J
Dairy Sci, 1999, 82, 863–869.
44. Gibson, G. R. ; Fuller, R. American Society for Nutritional Sciences, 2000, 391395.
45. Uncello, M. ;Malaguarena G, Basile. F. , BMC Surg. 2012, 12 1, 35.
46. Senok, A. C. ; Ismaeel, A. Y. ; Botta, G. A. Clin Microbiol Infect, 2005, 11,
958-966.
47. Hill, H. S. ; Guarner, F. Postgrad Med J, 2004, 80, 516-526.
48. Penner, R. ; Fedorak, R. N. ; Madsen, K. L. Curr Opin Pharmacol, 2005, 5, 1-8.
49. Hoyos, A. B. Int. J. Infect Dis., 1999, 3, 197-202.
50. Erdeve, O. ; Tiras, U. ; Dallar, Y. ; Savaş, S. Aliment Pharmacol Ther, 2005, 21,
1508-1509.
51. Felley, C. ; Michetti, P. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2003, 17, 785-91.
52. Hamilton-Miller, J. M. Int J. Antimicrob Agents, 2003, 22, 360-366.
53. Commane, D. ; Hughes, R. ; Shortt, C. ; Rowland, I. Mutation Res., 2005, 591,
276-289.
54. Kampman, E. ; Goldbohm, R. A. ; Van Den Brandt, P. A. Cancer Res., 1994, 54,
3186-3190.
55. Mohan, J. C. ; Arora, R. ; Khalilullah, M. Indian Heart J. 1990, 42, 361-364.
56. Belviso, S. ; Giordano, M. ; Dolci, P. ; Zeppa, G. Dairy Sci. Technol., 2009, 89,
169–176.
57. Isolauri, E.at all Am. J. Clin. Nutr.2001, 73 (suppl), 444-450.
58. Vanderhoof, J. A. ; Young, R. J. Ann Allergy Asthma Immunol, 2004, 93, (Suppl
3), 33-37.
59. Penra, F. J. ; Filho, L. A. ; Calsada, A. C. ; Junior, H. ; Nicloi, J. R. J. Pediatr,
2000, 76, (Suppl 2), 209.
60. Roberfroid, M. B. Am. J. Clin. Nutr., 2000, 71, (supp l), 1682–1687.
61. Klaenhammer, R. T. J. Nutr., 2000, 130, 415-416.
62. Gibson, G. R. Clin Nutr., 2004, 1, (Supp l), 25-31.
63. Langlands, S. J. ; Hopkins, M. J. ; Coleman, N. ; Cummings, J. H. Gut, 2004, 53,
1610-1616.
62
64. Brannon, C. Prebiotics: feeding friendly bacteria. Today’s Dietitian September
2003.
65. Yağcı, R. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 2002, 45(4), 337-344.
66. Manning, T. S. ; Gibson, G. R. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol, 2004, 18,
287-298.
67. Rastall, R. A. ; Maitin, V. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13, 490-496.
68. Peitsudou,K. ; karantanos, T. ; Theodoropoulos, G.E. Dig Sung. 2012, 29(5),
426-428.
69. Daeschel, M. A. Food Technol., 1989, 164-167.
70. Tunail, N. Mikrobiyoloji, Pelin ofset, Ankara, 2009.
71. Tunail, N. ; Köşker, Ö. Süt Mikrobiyolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1989.
72. Yetişmeyen, A. Süt Teknolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1995.
73. Arda, M. Genel Bakteriyoloji, A. Ü. Vet. Fak., Ankara, 1985.
74. Sneath, P. H. A. ; Mair, N. S. ; Sharpe, M. E. ; Holt, J.G. Bergey’s Manuel of
Systematic Bacteriology, Williams&Wilkins, London, 1986.
75. Ambrosini, V. M. ; Gonzales, S. ; Holgado, A. P. R. ; Oliver, G. J. Food Prot.,
1998, 61 (5), 557-562.
76. Drinan, D. F. ; Tobin, S. ; Cogan, T. M. Applied And Environmental
Microbiology, 1976, 481-486.
77. Prescott, C. S. ; Dunn, G. C., Industrial Microbiology, Published on
Distributors, Delhi, India, 1987.
78. Tekinşen, O. C. ; Atasever, M. Süt Ürünleri Üretiminde Starter Kültür, Selçuk
Ü. Vet. Fak. Yayınları, Konya, 1994.
79. Halkman, K. Tarım Mikrobiyolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1991.
80. Aslım, B. ; Beyatlı, Y. ; Halkman, K. Türk J. Biol., 2000, 24, 65–78.
81. Çetin, E. T. Endüstriyel Mikrobiyoloji, İ. Tıp Fak. Yayınları, İstanbul, 1983.
82. Üçüncü, M. Süt Ve Mamulleri Teknolojisi, İzmir, 2005.
83. Con, A. ; Gökalp, H.Y., Türk Mikrobiyol. Cem Derg., 2000, 30, 180-190.
84. Evren, M. ; Albayram, C. ; Apan, M. Laktik Asit Bakterilerinin Oluşturduğu
Antimikrobiyel Maddeler, Türkiye 9. Gıda Kongresi; 24-26 Mayıs 2006, Bolu,
977-980.
85. Dahiya, R. S. ; Speck, M. L. J. Dairy Sci. 1968, (51), 1568.
63
86. Juven, B. J. ; Schved, F. ; Lindner, P. Journal of Food Protection, 1992, 55, (3),
157-161.
87. Carminati, D. ; Giraffa, G. ; Bossi, M. G. J. Food Protect, 1988, 52, (9), 614617.
88. Kognoff, M. F. Gastroenterology, 1993, (105), 1275.
89. Rautava, S. ;Walker, W. A. Curr. Gastroenterol rep., 2007, 9, 385-392.
90. Kayser, F. H. ; Bienz, K. A. ; Eckert, J. ; Zinkernagel, R. M. Tıbbi Mikrobiyoloji,
Nobel Tıp Kitap Evi, 2002.
91. Erkmen, O. Gıda Mikrobiyolojisi, Efil Yayın Evi, Ankara, 2010.
92. Demirbağ, Z. Genel Mikrobiyoloji, Karadeniz Tek. Üni. Fen Edb. Fak. Biyoloji
Bölümü, Trabzon, 2006.
93. Ustaçelebi, Ş. Temel Ve Klinik Mikrobiyoloji, Güneş Kitap Evi. 1999.
94. Özden, S. Klinik Örneklerden İzole Edilen Klebsiella Pneumoniae Türlerinde
Genişletilmiş Spektrumlu Beta-Laktamaz Varlığının Moleküler Tekniklerle
Araştırılması, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,
Ankara, 2007.
95. Kulacaoğlu, N. Klinik Örneklerden İzole Edilen Pseudomonas Aeruginosa
Suşlarında Hücre Yoğunluğunun Farklı Yüzeylere Tutunmadaki Etkisi, Yüksek
Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 2006.
96. Man, J. C. ; Ragosa, M. ; Sharpe, M. E. A. J. Appl. Bact., 1960, 23, 130-138.
97. Cruikshank, R. Med. Microbiol, 11th Edition Livingstone, London, 1972.
98. Ronald, M. ; Lawrence, A. ; Park, C. Handbook of Microbiology, 2th Edition,
CRC Press, New York, 1997.
99. Swenson, J. M. ; Facklam, R. R. ; Thornsberry, C. Antimicrobial Agents And
Chemotherapy, 1990, 543-549.
100.Hyronimus, B. ; Le Marrec, C. ; Sassi A. H. ; Deschamps, A. International
Journal of Food Microbiology, 2000, (61), 193–197.
101.Iyer, C. ; Kailasapathy, K. Journal of Food Science, 2005, 70, (1), 18-23.
102.Begley, M. ; Hill, C. ; Gahan, C. G. M. Applied And Environmental
Microbiology, 2006, 1729–1738.
103.Felten, A. ; Bareau, C. ; Bizet, C. ; Lagrange, P. H. ; Philippon A. J. Clin.
Microbiol. 1999, 37, 729-733.
64
104.Yun, J. H. ; Yim, D. S. ; Kang, J.Y. ; Kang, B. Y. ; Shin, E. A. ; Chung, M. J. ;
Kim, S. D. ; Baek, D. H. ; Kim, K. ; Ha, N. J. Arch Pharm Res., 2005, 28(6),
660-666.
105.Moroni, O. ; Kheadr, E. ; Boutin, Y. ; Lacroix, C. ; Fliss, I. Appl. Environ.
Microb., 2006, 72, 6894-6901.
106.Chou, L. ; Weimer, B. J. Dairy Sci., 1999, 82, 23–31.
107.Liong, M. T. ; Shah, N. P. J. Dairy Sci., 2005, 88, 55–66.
108.Pereira, D. I. A. ; Mccartney, A. L. ; Gibson, G. R. Applied And Environmental
Microbiology, 2003, 4743–4752.
109.Şimşek, Ö. ; Çon, A. H. ; Tulumoğlu, Ş. Food Control, 2006, 17, 263-270.
110.Salminen, M. K. ; Rautelin, H. ; Tynkkynen, S. ; Poussa, T. ; Saxelin, M. ;
Valtonen V. ; Järvinen, A. Clin. Infect. Dis., 2006, 42:35-44.
111.Charteris, W. P. ; Kelly, P. M. ; Morelli, L. ; Collins, J. K.. J. Food Protect,
1998, 61, 1636-1643.
112. Avonts, L. ; De-Vuyst, L. Gent., 2001, 66, 543-545.
113. Ashraf, M. ; Arshad, M. ; Siddique M. ; Muhammad, G. Pakistan Vet. J., 2009,
29, (4), 186-190.
114.Harris, C. J. ; Deschell, M. A. ; Stiles, M. E. ; Klaenhammer, T. R. J. Food.
Protect., 1989, 52: 384-387.
115.Forestier, C. ; De Champs, C. ; Vatoux, C ; Joly, B. Res. Microbiol., 2001, 152,
167-173.
116.Kaur, I. P. ; Chopra, K. ; Saini, A. Eur. J. Pharma Sci., 2002, 15, 1-9.
117. Stewart, L. ; Pellegrini, C. A. ; Way, L.W. Surg. Forum, 1986, 37, 157-159.
118.Klayraung, S. ; Okonogi, S. Brazilian Journal of Microbiology, 2009, 40, 757766.
119.Ziarno, M. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment., 2007, 6(2), 29-40.
120.Jacobsen, C. N. ; Nielsen V. R. ; Hayford, A. E. ; Moller, P. L. ; Michaelsen, K.
F. ; Pærregaard, A. ; Sandström, B. ; Tvede, M. ; Jakobsen, M. Applied And
Environmental Microbiology, 1999, 4949–4956.
121.Moser, S. A. ; Savage, D. C. Applied And Environmental Microbiology, 2001,
3476–3480.
65
122.Martín, R. ; Jiménez, E. ; Olivares, M. ; Marín, M. L. ; Fernández, L. ; Xaus, J. ;
Rodríguez, J. M. International Journal of Food Microbiology, 2006, 112, 35-43.
123.Klare, I. ; Konstabel, C. ; Werner, G. ; Huys, G. ; Vankerckhoven, V. ;
Kahlmeter, G. ; Hildebrandt, B. ; Müller-Bertling, S. ; Witte, W. ; Goossens, H.
Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 59, 900–912.
124.Tuomola, E. ; Crittenden, R. ; Playne, M. ; Erika, I. ; Salminen, S. Am. J. Clin.
Nutr., 2001, 73, 393–39S.
125.Prasad, J. ; Gill, H. ; Smart, J. ; Gopal, P. K. İnt. Dairy Journal, 1998, 993–
1002.
126.Xanthopoulos, V. ; Petridis D. ; Tzanetakis, Food Microbiology and Safety,
2001, 66(5), 747-752.
127.Pereira, D. I. A. ; Gibson, G. R. Applied And Environmental Microbiology,.
2002, 4689–4693.
128.Haller, D. ; Colbus, H. ; Gänzle, M. G. ; Scherenbacher, P. ; Bode, C. ; Hammes
W. P. Systematic and Applied Microbiology, 2001, 218–226.
129.Papamanoli, E. ; Tzanetakis, N. ; Litopoulou-Tzanetaki, E. ; Kotzekidou, P.
Meat Science, 2003, 859–867.
130.Gilliland, S. E. ; Walker, D. K. Journal of Dairy Science, 1990, 905–911.
131.Usman, U. ; Hosono A. J. Dairy Sci., 1999, 82, 243–248.
132.Sanders, M. E. Journal of Nutrition, 2000, 130, 384–390.
133.Bongaerts, G. ; Bakkeren, J. ; Severijnen, R. ; Sperl, W. ; Willems, H. ; Naber,
T. ; Wevers, R. ; Van Meurs, A. ; Tolboom, J. J. Pediatr Gastroenterol
Nutr., 2000, 30(3), 288-93.
134.Temmerman, R. ; Scheirlinck, I. ; Huys, G. ; Swings, J. Applied And
Environmental Microbiology, 2003, 220–226.
135.Arıcı, M. ; Bilgin, B. ; Sağdıç, O. ; Özdemir, C. Food Microbiology, 2004, 21,
19-24.
136.Gilliland, S. E. ; Nelson, C. R. ; Maxwell, C. Appl. Environ. Microbiol., 1985,
49, 377-381.
137.Buck, L. M. ; Gilliland, S. E. Journal of Dairy Science, 1994, 77 (10) 29252933.
66
138.Brashears, M. M. ; Gilliland, S. E. ; Buck, L. M. Journal of Dairy Science, 1998,
81(8), 2103-2110.
139.Liong, M. T. ; Shah, N. P. J. Dairy Sci., 2005, 88, 55-66.
140.Lye, H. S. ; Ali, G. R. R. ; Liong, M. T. International Dairy Journal, 2010, 20,
169-175.
141.Starchan, D.P. Thorax 2000 55(1), 2-10.
67

İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ PROBİYOTİK

Transkript

Benzer belgeler

Sağlıkta, Hastalıkta ve Gebelikte PROBİYOTİKLER

Bileşik Formülü Yazma Kimyasal Tepkimeler 1.Yanma Tepkimeleri 2

Kolesistektomi Sonrasında Gelişen Bronkobiliyer Fistül

Sabriye Bilgin

fonksiyonel gıdalar ders notları

boza teknolojisi

PDF ( 0 ) - Yunus Araştırma Bülteni

Probiyotikler ve Kullanım Alanları Probiotics and Their Use