Makalenin Orjinal Adı: Identification of a novel gene set in human

Makalenin Orjinal Adı: Identification of a novel gene set in human

Makalenin Orjinal Adı: Identification of a novel gene set in human cumulus cells
predictive of an oocyte's pregnancy potential
Yazarlar/Enstitü: Amy E. Iager, M.Sc.,a Arif M. Kocabas, Ph.D.,b Hasan H. Otu, Ph.D.,c,d
Patricia Ruppel, Ph.D.,e Anna Langerveld, Ph.D.,f Patricia Schnarr, B.Sc.,g Mariluz Suarez,
M.Sc.,h John C. Jarrett, M.D.,f Joe Conaghan, Ph.D.,i Guilherme J. M. Rosa, Ph.D.,j Emilio
Fern_andez, M.D.,k Richard G. Rawlins, Ph.D.,l Jose B. Cibelli, D.V.M., Ph.D.,a,m,n and Javier
A. Crosby, Ph.D.k
a
Gema Diagnostics, Ann Arbor, Michigan; b Laboratory of Developmental Neurobiology,
Rockefeller University, New York, New York; c Department of Medicine, BIDMC Genomics
Center, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts; d Department of Bioengineering,
Istanbul Bilgi University, Istanbul, Turkey; e Innovative Analytics, Kalamazoo, Michigan; f
Genemarkers, Kalamazoo, Michigan; g Jarrett Fertility Group, Carmel, Indiana; h Stanford
Fertility and Reproductive Medicine Center, Stanford Hospital, Palo Alto, California; i Pacific
Fertility Center, San Francisco, California; j Departments of Animal Sciences and
Biostatistics and Medical Informatics, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin; k
Unidad de Medicina Reproductiva, Clínica Las Condes, Santiago, Chile; lDepartment of
Obstetrics and Gynecology, Rush University Medical Center, Chicago, Illinois; mDepartments
of Physiology and Animal Science, Michigan State University, East Lansing, Michigan; and n
Laboratorio Andaluz de Reprogramaci_on Celular (LARCEL), Consejería de Salud, Junta de
Andalucía, Seville, Spain
Dergi: Fertil Steril, Vol. 99, No:3, pp:745–52, 2013.
Kısa Özet:
Amaç: Çoklu kliniklerde ıvf pratiğinin bir parçası olarak klinik ve hasta varyasyonu
hesaplanarak,kümülüs hücrelerinde (KH) gebelik sonuçlarının tahmininde kullanılabilecek
gen ekspresyonunun tanımlanması
Tasarım: Tek insan cumulus-oosit komplexinin kombine mikroarray ve kantitatif reverse
trankripsiyon poliferaz zinar reaksiyon uygulanarak retrospektif analizi
Yer:Çok sayıda özel IVF klinikleri
Hastalar:98 hasta 55 hastanın örneğine qrt-pcr analizi,yapıldı.27 hastanın gebeliği canlı
doğumla sonuçlanmıştır.
Müdahaleler:Gen expresyon analizi için kullanılacak Kh’leri oosit toplanmasından hemen
sonra ayrıldı.Gebelik tahmin analizi için ağırlıklı oylama ile birini dışarıda bırakma yöntemi
kullanıldı.
Ana Sonuç:58 hastadan, 101 örnekte 12 gen exprasyonunun kombinasyonu
Bulgular: KH’de exprese olan gebelik sonuçları tahmininde 12 gen bulundu.Bu gebelik
tahmin modelinin doğruluğu %78,sensitivitesi %72,spesifitesi %84,pozitif prediktif
değeri %81 ve negatif prediktif değeri %76 dır.Eğri altında kalan olan 0,763+/-0,079 olup
random tahmin olan 0,5’den anlamlı olarak büyüktür.
Sonuç: İnsan KH’nin gebelik sonuçlarını tahmin etmede etkili olabileceği düşünülen gen
ekspresyon analizi için IVF-ET’den edilen oositler kullanılmıştır.
Giriş: In vitro fertilizasyonun başarısını önündeki en büyük engel , sağlıklı tekil gebelik için
gereken oosit ve embriyo seçiminde kesin objektif bir metodun hala bilinmemesidir. Mevcut
olan seçim yöntemleri subjektiftir ve güvenilir olmayan morfolojik parametrelere
dayanmaktadır. Multipi embriyo transferi gebelik şansını arttırsada çogul gebeliklerde anne ve
fetüs için sayısız sağlık riskleri mevcuttur.Bu nedenle arastırmalar tek embriyo transferine
doğru kaymıştır. Yaşamla bağdaşan en iyi oosit ve embriyoyu seçebilecek non-invazif bir
yöntem ile gebelik oranları artırılırken, çoğul gebeliklere bağlı riskler de azaltılmış olacaktır.
“Omik”ler çağı başladığından beri moleküler alandaki bilgilerimiz insan üremesi
etrafında toplanmıştır ve infertilite tedavisini hedefleyen büyük adımlar atılmıştır. Özellikle
çoğu çalışma embriyo kalitesi belirteçlerini tanımlama ve proteomikler, metabolomikler ve
transkriptomikler aracılığı ile gebelik sonuçlarını belirlemeyi hedeflemiştir (2-6).
KH’leri oositin etrafında bulunan destek hücreleridir ve IVF proçeslerinde
toplanmışlardır. Oositin ovulasyon, fertlizasyona hazırlanmasında önemli rol oynarlar. KH ile
oosit arasındaki gap-junctionlarla iki yönlü iletişim vardır. Sinyal molekülleri, aminoasitler,
esansiyel metabolitler (7,8) ve muhtemelen mikro RNA’lar ile bu iletişim sağlanır (9).
Dahası KH’lerdeki gen ekspresyonu embriyo kalitesini belirlemede ve gebelik
sonuçlarını tahmin etmede non-invazif bir yöntem olabilir. Aslında bazı çalışmalarda
KH’lerdeki mRNA ekspresyonu ile oosit ve / veya embriyo kalitesi arasında bir ilişki olduğu
gösterilmiştir (10-18), ve başarılı gebelikle sonuçlanan ve sonuçlanmayan oositlerin KH’de
farklı ekspresyonlar saptanmıştır. Hamel ve ark. PGK1 ve RGS2 ekspresyonunun gebelik
tahmininde kullanulabileceğini hasta üzerinde göstermiştir. Ancak bu çalışmanın kısıtlılığı
hasta populasyonunun tümüne uygulanamamasıdır(23).
Bir diğer önemli konu, gen ekspresyon analizini tasarlarken sonuçların başka
faktörlerden de etkilenebileceğini göz önünde bulundurmak gerektiğidir. 2 yeni çalışmada
SDC4, VCAN, EFNB2 ve CAMK1D gibi 11 gen üzerine yoğunlaşılmıştır (24,25). Ancak bu
çalışmalarda hastalar sadece belli bir bölgeye aittir ve daha geniş hasta populasyonuna
uyarlanamayabilir. Ayrıca ICSI prosedürü de gebelik sonuçlarını etkileyebilir. Ayrıca bu
çalışmalarda 2 stimulasyon protokolü uygulanmıştır ve SDC4 ve VCAN ekspresyonunu
etkileyebilir (18,25). Otörlerin de belirttiği gibi daha geniş ve ilişkisiz genlerin taranması ile
ayrım gücü artacaktır. Bu çalışma insan KH’lerinde eksprese olan genler aracılığı ile oosit
viabilitesi ve gebelik üretebilme kapasitesi ile ilgili fikir veren biomarkerların tanınması
amaçlanmıştır. Mikroarray ve kantitatif reverse transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon
(qRT-PCR) metodu kombinasyonu kullanılmıştır. Bu çalışma gebelik sonuçlarını tahmin eden
12 yeni gen tanımlamıştır.
MATERYAL-METOD
Hasta seçimi, implantasyon ve gebelik
Şili’de bir ve US’de 2 klinikte IVF veya ICSI yapılan hastalardan retrospektif olarak
yapılmış bir çalışmadır. Her hastaya 1, 2 veya 3 embriyo transferi (ET) yapılmıştır ve ET 2., 3.
veya 5. günde yapılmıştır. Kliniğin programına göre ET’den 4-9 hafta sonra USG ile
gestasyonel kese ve fetal kalp atımı görülen gebelikler klinik gebelik olarak tanımlanmıştır.
Örnekler sadece transfer edilen embriyoların tümünden gebelik elde edilen (tam başarı:P) ve
transfer edilen hiçbir embriyodan gebelik elde edilemeyen (sıfır başarı:N) hastalardan
toplanmıştır. Sonrasında canlı doğum sonuçları da kaydedilmiştir. 35 yaş üstü hastalar, 4
cm’den büyük myomu olan hastalar, BMI>35 olan hastalar ve kemo-radyoterapi öyküsüolan
hastalar çalışmaya dahil edilmemiştir.ağır erkek faktörü nedeniyle infertil olan çiftler de
(toplam sperm sayısı <5 milyon ve testiler bx öyküsü olan)çalışmaya dahil edilmemiştir.
Hasta stimilasyonu
Hastalar için en uygun yöntem seçilmiştir fakat genellikle GnRH agonisti ve GnRH
antagonisti, spontan ovulasyonu baskılamak amacı ile kombine edilmiştir. Saf veya
rekombinat FSH kullanılmıştır. hMG veya luteal faz desteği kullanıulmış veya
kullanılmamıştır. Ovaryan cevap ve foliküler gelişim serum E2 düzeyi ölçümü ve TVS ile
yapılmıştır. Son foliküler maturasyon aşaması için hCG uygulanmıştır ve oositler 36 saat
sonra USG eşliğinde toplanmıştır.
İnsan KH toplanması
Kümülüs-oosit kompleksleri (KOK) kültür medyumlarında, kan, diğier hücreler ve
debristen tamamen temizlenerek hazırlandı. Her KOK’tan az sayıda KH, en dış en iç
tabakadan olmamasına dikkat edilerek mekanik olarak ayrıldı. Her KH örneği fosfatlı salin
solüsyon ile muamele edildi ve mikrosantrifüj tüplerinde 100 µl tampon özü ile tamponlandı
ve pipet ile nazikçe toplandı. 30 dakika 42 C’de inkübe edildi, santrifüj edildi ve sıvı nitrojen
ile donduruldu. Oositler de ET’ne kadar kültüre edildi.
RNA izolasyonu
Pipocure RNA izolasyon kitleri kullanıldı. Toplam RNA kalite ve kantitesi nanodrop
2000 spektrofotometre ile analiz edildi. Toplam RNA izolasyonu Michigan Üniversitesinde
yapıldı.
Mikroarray analizi
36 hastadan elde edilen 64 KH örneği analiz edildi. cDNA sentezi ve çoğaltılması
yapıldı. Affymetrix Gen Chip Mikroarray analiz Suite 5.0 ve Ekspreyon Console Software
kullanıldı.
Tahmin analizi
Ağırlıklı oylama için sinyal gürültü oranı (SNR) kullanıldı. P ve N örnek gruplarında
ideal genin komşuşuğundaki vektörler tanımlandı. SNR her grupta yüksek anormal
ekspresyonu engellemekteydi. Geniş pozitif SNR değerleri P grubu için iyi bir tahminci ve
geniş negatif SNR değerleri de N grubu için iyi bir tahminci olmuştur.
Tahmin modeli uygulandığında veri grubu deneme ve doğrulama grubu olarak ayrıldı.
Kantitatif real time PCR
cDNa sentezi için 8 ng total RNA ve yüksek kapasiteli cDNA reverse transkripsiyon
kiti kullanıldı. Termal dönüştürücü şartları; 10 dakika 95 C, ardından 15 saniye 14 siklus 95
C’de ve sonra 4 dakika 60 C’de. Endojen kontrol genleri 18S, GAPDH ve β-aktinrelatif
kantifikasyon ve transkripsiyon için kullanıldı. 64 KH örneğinden 49’u önceden mikroarrayde
kullanıldı. 37 yeni hastadan KH örneği toplanarak TLDA ( Taqman Low dansity array) ile
analiz edildi.
İstatistik
P ve N grupları arasındaki klinik karakteristikler için Mann-Whitney testi (28)
kullanı8ldı. İstatistiksel olarak anlamlı fark için α=.01 kabul edildi. qRT-PCR gen ekspresyon
verilerinin gebelik tahmin analizi için Fisher test kullanıldı. Gen ekspresyonundaki farkların
analizi için ANOVA kullanıldı.
SONUÇLAR
Hasta ve örnek klinik karakteristikleri
55 hastadan alınan, 101 KH örneğinin 86’sı qRT-PCR TLDA ile analiz edildi (şekil1tablo 1) tüm TLDA P örneklerinin gebelikleri klinik gebelik tanımına göre konfirme edildi.
86 örnekten 1 tanesi konfirme etmek, rafine etmek ve doğrulamak için kullanıldı. 25,
45 ve 16 örnek sırasıyla CLC, JFG ve PFC kliniklerinden sağlandı (Ek tablo-1). Örneklerin
çoğu (n=69) 2 embriyo transferi yapılan hastalardan, 8’i tek embriyo transferi yapılan
hastalardan ve 9’u 3 embriyo transferi yapılan hastalardan elde edilmişti. 47 örneğin ET’si 2.
veya 3. ve 39’u 5. günde yapılmıştı. ET günü ile P ve N grupları arasında istatistiksel olarak
anlamlı fark bulunmadı. Oosit yaşı, siklus sayısı açısından da P ve N grupları arasında fark
bulunmadı (Ek tablo 2). P grubunda metafaz II’deki oosit sayısı fazlaydı ve P grubu
fertilizasyon oranı az bulundu (Ek tablo 2). Gruplar arasındaki bu farklılıklar nedeniyle gen
ekspresyon analizinde klinik korelasyona gidildi.
Gebelik tahmin analizi
64 örneğin transkripsiyonal analizi için öncelikle mikroarray kullanıldı (35 N ve 29 P).
Bu grup deneme grubu ( 18 N ve 15 P) ve doğrulama grubu (17 N ve 14 P) olmak üzere
ayrıldı. Prediktif genlerin performansını test etmek için doğrulama grubu kullanıldı. Başarı ile
ilişkili genleri kullanabilmek için deneme grubu ( P vs. N) oluşturuldu. Tahmin sonuçları için
Fisher test, permutasyon testi ve randomizasyon testi kullanıldı (P<0,05).
Tahmin genlerinin qRT-PCR ile doğrulanması ve saflaştırılması
Gebelik sonuçlarını tahmin değeri olan 227 gen bulundu. Bunların 196’sı bizim TLDA
sağlamasında bulundu. En stabil ekspresyonu belirlemek için endojen kontrol genleri olan βaktin, GAPDH ve 18S kullanıldı. 18S en stabil olanı idi ve Ct değerleri bu genin ekspresyon
düzeyine göre normalize edildi.
Tahmin edici gen grubu konfirme etmek ve sonrasında saflaştırmak için mikroarrayde
kullanılan 64 örneğin dışında 49 örnek alt grup olarak kullanıldı ( 24 N ve 25 P, tablo 1).
18S’e göre normalize edilmesinin ardından, 84 gen TLDA’da mikroarrayde kullanılan 49
örnek ile uyumlu ekspresyon göstermekteydi. Bu 84 genin gebelik tahmin analizinde
kullanılması ile 12 genden oluşan tahmin grubu oluşturuldu. Bu 12 genine tahmin değerini
değerlendirmek için hastalardan elde edilen 37 yeni biyolojik örneğe TLDA yapıldı (19 N ve
18 P, tablo 1, şekil 1), mikroarray yapılmadı.
Şekil 1
Tablo 1
Gebelik sonuçları biyomarkerları olarak KH gen ekspresyonu
12 gen tahmin grubu qRT-PCR TLDA kullanılarak örnek grubu A’ (önceden
mikroarray ile tespit edilen 49 örnek), örnek grubu B ile doğrulandı (37 yeni biyolojik örnek,
mikroarray kullanılmayan). P örneklerinden N ile karşılaştırıldığında 7 gen up regüle edildi ve
5 gen down regüle edildi (Ek tablo 3). Doğrulama grubuna (B-37 örnek) uygulandığında
gebelik tahmin modelinin doğruluğu %78, sensitivitesi %72, spesifitesi %84, pozitif prediktif
değeri %81 ve negatif prediktif değeri %76 bulundu (tablo 2).
Tablo 2
Alıcı işletim karakteristik (ROC) analizi bir testin tanısal değerini belirlemede en
yaygın kullanılan yöntemdir (31,32). 12 genin başarılı tahmin değerini belirlemede 37 B
örneği ile doğrulanmıştır (Ek tablo 3). Eğri altında kalan alan (EAA) tahmin yeteneğini
gösterir. EAA 0,763 +/- 0,079 (p=.0009) bulunluştur ve bu 0,5 olan random tahmin şansı
değerinden anlamlı olarak büyüktür. Bu çalışmanın örnek genişliği ve ROC analizine göre
EAA, önceki IVF merkezlerinin tanısal raporlarına göre düşüş göstermektedir (33,34).
Tablo 3
Gen ekspresyonunun klinik korelasyonu
Hastaların klinik karakteristikleri, 12 gen ekspresyon tahmin değerleri korele edildi.
Artmış yanlış pozitif hata oranlarını yönetebilmek için α=.01 kullanıldı. Hiçbir tahmin değeri
ile korele olmayan sürekli değişkenler MII oosit sayısı ve fertlizasyon oranını (2PN/MII)
içermekteydi. MII oosit sayısı ve fertilizasyon oranı gebelik sonuçlarına göre değişiklik
göstermesine rağmen hiçbir değişken ekspresyonu ile korele değildi. Yani P ve N grupları
arasında farklı MII oosit sayısı ve farklı fertilizasyon oranları olmasına rağmen bu durum
gebeliğin başarısı ile ilşkisiz bulunmuştur. Sadece 2 değişkenin, gonadotropin ve ET katateri,
gen ekspresyonunu anlamlı olarak değiştirmediği bulundu (Ek tablo 5). Gonadotropin ile
ilişkili olarak sadece JFG, p FSH/hMG rejimi kullanmaktaydı (n=45); PFC, rFSH
kullanmaktaydı (n=16). Yani bölge ile gonadotropin arasında kafa karıştırıcı bir fark
bulunmaktaydı ve bu sonuçlar ile ilişkili sonuçlar da dikkatle yorumlanmalıdır. Benzer
şekilde ET katateri ile ilişkili sonuçlar da dikkatle yorumlanmalıdır. Çünkü farklı bölgelerde
farklı katater kullanımı sonucu da kafa karıştırıcı sonuçlar bulundu. Wallace katateri ile alınan
örnek sayısı çok azdı (n=5). Son olarak klinikler ile ilişkili olarak örneklerin çoğu CLC’den
toplandı. Burada örnekler daha erken alındı ve JFG’ye göre daha uzun süre saklandı.
TARTIŞMA
IVF sırasında canlı oositleri ve embriyoları seçebilme yeteneğinin medikal, sosyal ve
ekonomik yararları olacaktır. KH kullanılarak yapılacak tanısal bir analiz, morfoloji ile
birlikte bu amaca hizmet edecektir. Kritik soru, gelişmekte olan bir test hasta ve kliniklere
bağlı değişkenlerin üstesinden gelebilecek kadar güçlü olacak mıdır? Bu rapor, ilk kez, farklı
bölgelerden ve farklı klinik uygulamalardan elde edilen 12 genlik yeni bir grubu tanımlamıştır.
Bizim amacımız KH’de eksprese olan genlere dayanarak viabl oosit seçiminde non-invazif
destek yöntem bulmaktır.
Bu çalışmada gebelik tahmini için bulunan genler önceki bulunan genler ile
uyuşmamaktadır ancak bu şaşırtıcı değildir. Bu durum teknik uygulamalardaki farklılıklara
bağlı olabilir.
Tahmin grubundaki genler glukoz metabolizması, transkripsiyonel regülasyon,
gonadotropin regülasyonu ve apaptozis ile ilişkilidirler. Tüm bunlar KOK için önemli
genlerdir. Bazı gen ve gen ailelerinin bilinen fonksiyonları olsa da bu genlerin gebelik
tahmininde rol alıyor olmaları imkansız değildir. Örneğin FGF gen ailesi, hücre yaşamı
regülasyonunda önemli rol oynar ve FGF-12, bizim P grubunda N ile karşılaştırıldığında up
regüle bulunmuştur.
Glukoliz yolağında matabolize olan glukoz KOK için kritik bir metabolitti (4). Prüvat
ve laktat gibi glukoz KH için önemli besin kaynağıdır. Glukozun bu ara ürünlere dönüşmesi
daha da önemlidir. Granuloza hücreleri gelişmekte olan oositi desteklemede kritik rol alır. İlk
birkaç hücre bölünmesi için gereken enerji için maternal destek sağlar. SLC2A
kolaylaştırılmış taşıyıcı ailesinin bir üyesi olan SCL2A9 (GLUT9) glukoz homeostazında
önemli rol oynar (36). SCL2A9 özellike ürik asit ve glukoz gibi heksoz şekerleri taşır (37).
İnek modelinde matür KOK’ların immatürlere göre daha fazla glukoz ve bunun metabolit
ürünlerini kullandığı gösterilmiştir. Bu durum göz önünde bulundururlduğunda, SCL2A9’un
artmış ekspresyonu viabl oositlerin KH’lerinde daha dinamik bir glukoz taşınmasını ve
böylelikle daha fonksiyonel bir KOK olduğunu yansıtıyor olabilir.
NR2F6 da P örneklerinde up regüle bulunmuştur. Bu gen artık nükleer reseptördür,
nükleer reseptör süperailesinin bir subgrubudur. KH’lerindeki esas fonksiyonu bilinmese de,
reprodüktif proçeste bir çok rol oynar (39). LH reseptör (LHr) transkripsiyonunu inhibe ettiği
gösterilmiştir (40). KH yüzeyinde LHr formasyonu ovulasyonu indükleyen LH surge’ü
öncesi foliküler maturasyonda anahtar rol alır. LHr’nin aşırı ekspresyonu ovulatuar proçeste
ters etki yapar. Polikistik overi olan kadınların overlerinde bu reseptör yüksek bulunmuştur
(41). N grubunda NR2F6 ekspresyonu az bulunmuştur. Folikülün suboptimal matürasyonu ile
ilişkili olabilir.
P grubunda N’ ye göre up regüle olan diğer genler ; ARI D 1 B , FAM36 A ,GPR 137
B VE ZNF 132 ‘ dir.ARI D 1 B , SWI/ SNF kromatin yeniden düzenlenme komplexinin bir
parçasıdır ve hücre siklusu kontrolunde önemli rolo oynar.
Kromatin yeniden düzenlenme maturasyonunu da içeren foliküler hücreler ile oosit arasında
gap-junctionlar ile sağlanan iletişiminin önemi çalışmalarda gösterilmiştir.(42) .P grubunda
artmış ARID 1 B , gap-junction iletişimini kolaylaştıracak ve oosit iletişimini
artıracaktır.FAM 36 A ‘ nın fonksiyonu tam anlaşılmamıştır.Mitokondride ve iç membranda
bulunmaktadır.
GPR 137 B de yeterince karakterize edilememiştir, ancak bir iç membran proteini
olan protein ile birleşmiş reseptör ( GPCR) genini kodlar.Foliküler mikroçevrede GPR 137 B
sinayal mekanizmasını sağlar. ZNF 132 de hala karekterize edilememiş genlerdendir. Çinko
parmak protein ailesinin üyesidir. Transkrpsiyon faktörlerinin DNA bağlayan alt grubuna
direkt etki eder.
P grubunda N ile karşılaştırıldığında 5 gen down regüledir. DNAJC15 , RHBDL 2 ,
MTUS 1 , NVP 133 ve ZNF 93 . Bu genlerin spesifik işelevi ile ilgili çok az şey
bilinmektedir. . DNAJC15 mitondride membranlarda lokalizedir ve ısı – şok bağlayıcı
yapılarla ilişkili olduğu düşünülmektedir. RHBDL 2 intermembran proteazıdır. Yeni
çalışmalar intermembran proteazların gelişim ve metobolizma gibi hücre proçeslerini
düzenleyici rolu olduğu gösterilmiştir.(43). MTUS 1 ‘ in önceden overlerde diğer dokularda
daha fazla salgılandığı söylenmiştir (44) ancak overdeki temel görevi bilinmemektedir. NVP
133 , nükleostoplazmik taşıyıcı aktivitede rol alır ( glukoz transportu gibi) . Son olarak ZNF
93 , bir diğer çinko parmak genidir.Esas görevi hala bilinmesede diğer çinko parmak
proteinleri gibi transkripsiyon faktörlerinin DNA bağlayıcı kompenentinde direkt rol aldığı
düşünülmektedir.
Gebe olan ve olamyan hastalar arasında M II oosit sayısı ve fertilizasyon oranları
arasında anlamlı fark olsada , gen expresyon analizinin klinik korelasyonu , bu farkların gen
expresyon değerleri ile korele olmadığını göstermiştir. Dolayısı ile bizim prediktif gen
grubunun gücü ile ilişkisi yoktur.
Gonadotropin ve ET katater seçiminin gen ekspresyonuna etkisi tanımlanmıştır. Klinik
merkez ile ilişkili olarak, CLC ile JFG arasında farklar saptanmıştır. Örneklerin çoğu
CLC’den toplanmıştır. Daha erken toplandığından daha uzun süre saklanmıştır. Bu durum eş
değişkenler arasındaki farkı açıklamaktadır.
SONUÇ
Burada gebelik tahmininde rolü olan KH’de eksprese olan 12 yeni gen grubu
sunmaktayız. Bu veriler, farklı klinikler, farklı stimülasyon protokollerinden elde edilmiştir
ve %78 doğruluğa sahiptir. ROC analizi ile, bu testin prediktif gücü belirlenmiştir, EAA
0,763+/-0,079 olup random tahmin şansı olan 0,5’den anlamlı olarak yüksektir (p=.0009).
başarılı bir tanı testi olması umulmaktadır. Heterojen hasta profili ve farklı tedavi
protokollerine rağmen umut vericidir.
Bir sonraki basamak, bu gen analizlerini randomize kontrollü klinik çalışmalar ile
prospektif olarak bir çok merkezde, en yüksek gebelik potansiyeli olan embriyoyu transfer
etmek için gereken oositi seçmede tahmin değerini konfirme etmektir.
KAYNAKLAR
1. Fauser BC, Devroey P, Macklon NS. Multiple birth resulting from ovarian stimulation for
subfertility treatment. Lancet 2005;365:1807–16.
2. Huang Z, Wells D. The human oocyte and cumulus cells relationship: new
insights from the cumulus cell transcriptome. Mol Hum Reprod 2010;16:
715–25.
3. Nel-Themaat L, Nagy ZP. A review of the promises and pitfalls of oocyte and
embryo metabolomics. Placenta 2011;32S3:S257–63.
4. Leese HJ, Baumann CG, Brison DR, McEvoy TG, Sturmey RG. Metabolism of
the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod 2008;
14:667–72.
5. Sher G, Keskintepe L, Nouriani M, Roussev R, Batzofin J. Expression of sHLAG
in supernatants of individually cultured 46-h embryos: a potentially valuable
indicator of ‘‘embryo competency’’ and IVF outcome. Reprod Biomed
Online 2004;9:74–8.
6. Fragouli E, Bianchi V, Patrizio P, Obradors A, Huang Z, Borini A, et al. Transcriptomic
profiling of human oocytes: association of meiotic aneuploidy
and altered oocyte gene expression. Mol Hum Reprod 2010;16:570–82.
7. Buccione R, Schroeder AC, Eppig JJ. Interactions between somatic cells and
germ cells throughout mammalian oogenesis. Biol Reprod 1990;43:543–7.
8. Matzuk MM, Burns KH, Viveiros MM, Eppig JJ. Intercellular communication
in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science 2002;296:
2178–80.
9. Katakowski M, Buller B, Wang X, Rogers T, Chopp M. Functional microRNA
is transferred between glioma cells. Cancer Res 2010;70:8259–63.
10. McKenzie LJ, Pangas SA, Carson SA, Kovanci E, Cisneros P, Buster JE, et al.
Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization
and embryo selection in women undergoing IVF. Hum Reprod 2004;19:
2869–74.
11. Zhang X, Jafari N, Barnes RB, Confino E, Milad M, Kazer RR. Studies of gene
expression in human cumulus cells indicate pentraxin 3 as a possible marker
for oocyte quality. Fertil Steril 2005;83(Suppl 1):1169–79.
12. Hasegawa J, Yanaihara A, Iwasaki S, Mitsukawa K, Negishi M, Okai T. Reduction
of connexin 43 in human cumulus cells yields good embryo competence
during ICSI. J Assist Reprod Genet 2007;24:463–6.
13. Gasca S, Pellestor F, Assou S, Loup V, Anahory T, Dechaud H, et al. Identifying
new human oocyte marker genes: a microarray approach. Reprod Biomed
Online 2007;14:175–83.
14. Feuerstein P, Cadoret V, Dalbies-Tran R, Guerif F, Bidault R, Royere D. Gene
expression in human cumulus cells: one approach to oocyte competence.
Hum Reprod 2007;22:3069–77.
15. Cillo F, Brevini TAL, Antonini S, Paffoni A, Ragni G, Gandolfi F. Association
between human oocyte developmental competence and expression levels
of some cumulus genes. Reproduction 2007;134:645–50.
16. van Montfoort APA, Geraedts JPM, Dumoulin JCM, Stassen APM, Evers JLH,
Ayoubi TAY. Differential gene expression in cumulus cells as a prognostic indicator
of embryo viability: a microarray analysis. Mol Hum Reprod 2008;14:
157–68.
17. Anderson RA, Sciorio R, Kinnell H, Bayne RAL, Thong KJ, de Sousa PA, et al.
Cumulus gene expression as a predictor of human oocyte fertilisation, embryo
development and competence to establish a pregnancy. Reproduction
2009;138:629–37.
18. Adriaenssens T, Wathlet S, Segers I, Verheyen G, de Vos A, van der Elst J,
et al. Cumulus cell gene expression is associated with oocyte developmental
quality and influenced by patient and treatment characteristics. Hum Reprod
2010;25:1259–70.
19. Gebhardt KM, Feil DK, Dunning KR, Lane M, Russell DL. Human cumulus cell
gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo
transfer. Fertil Steril 2011;96:47–52.e2.
20. Assidi M, Montag M, Van der Ven K, Sirard MA. Biomarkers of human oocyte
developmental competence expressed in cumulus cells before ICSI:
a preliminary study. J Assist Reprod Genet 2011;28:173–88.
21. Assou S, Haouzi D, Mahmoud K, Aouacheria A, Guillemin Y, Pantesco V,
et al. A noninvasive test for assessing embryo potential by gene expression
profiles of human cumulus cells: a proof of concept study. Mol Hum Reprod
2008;14:711–9.
22. Hamel M, Dufort I, Robert C, Gravel C, Leveille MC, Leader A, et al. Identification
of differentially expressed markers in human follicular cells associated
with competent oocytes. Hum Reprod 2008;23:1118–27.
23. Hamel M, Dufort I, Robert C, Leveille M-C, Leader A, Sirard M-A. Genomic
assessment of follicular marker genes as pregnancy predictors for human
IVF. Mol Hum Reprod 2010;16:87–96.
24. Wathlet S, Adriaenssens T, Segers I, Verheyen G, Janssens R, Coucke W,
et al. New candidate genes to predict pregnancy outcome in single embryo
transfer cycles when using cumulus cell gene expression. Fertil Steril 2012;
98:432–9.e4.
25. Wathlet S, Adriaenssens T, Segers I, Verheyen G, van de Velde H, Coucke W,
et al. Cumulus cell gene expression predicts better cleavage-stage embryo or
blastocyst development and pregnancy for ICSI patients. Hum Reprod 2011;
26:1035–51.
26. Kocabas AM, Crosby J, Ross PJ, Otu HH, Beyhan Z, Can H, et al. The transcriptome
of human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:14027–32.
27. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, et al.
Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by
gene expression monitoring. Science 1999;286:531–7.
28. Zar JH. Biostatistical analysis. 5th ed. Upper Saddle River, NJ: Pearson PrenticeHall; 2010.
29. Nevins JR, Potti A. Mining gene expression profiles: expression signatures as
cancer phenotypes. Nat Rev Genet 2007;8:601–9.
30. Radmacher MD, McShane LM, Simon R. A paradigm for class prediction
using gene expression profiles. J Comput Biol 2002;9:505–11.
31. Zhou KH, O'Malley AJ, Mauri L. Receiver-operating characteristic analysis for
evaluating diagnostic tests andpredictivemodels.Circulation 2007;115:654–7.
32. Linden A. Measuring diagnostic and predictive accuracy in disease management:
an introduction to receiver operating characteristic (ROC) analysis.
J Eval Clin Pract 2006;12:132–9.
33. Esterhuizen AD, Franken DR, Lourens JGH, Prinsloo E, van Rooyen LH. Sperm
chromatin packaging as an indicator of in-vitro fertilization rates. Hum
Reprod 2000;15:657–61.
34. F_abregues F, Balasch J, Creus M, Carmona F, Puerto B, Quinto L, et al. Ovarian
Reserve test with human menopausal gonadotropin as a predictor of
in vitro fertilization outcome. J Assist Reprod Genet 2000;17:13–9.
35. Watson AJ. Oocyte cytoplasmic maturation: a key mediator of oocyte and
embryo developmental competence. J Anim Sci 2007;85:E1–3.
36. Sutton-McDowall ML, Gilchrist RB, Thompson JG. The pivotal role of glucose
metabolism in determining oocyte developmental competence. Reproduction
2010;139:685–95.
37. Augustin R, Carayannopoulos MO, Dowd LO, Phay JE, Moley JF, Moley KH.
Identification and characterization of human glucose transporter–like
protein-9 (GLUT9): alternative splicing alters trafficking. J Biol Chem 2004;
279:16229–36.
38. Sutton ML, Cetica PD, Beconi MT, Kind KL, Gilchrist RB, Thompson JG. Influence
of oocyte-secreted factors and culture duration on the metabolic activity
of bovine cumulus cell complexes. Reproduction 2003;126:27–34.
39. Bertolin K, Bellefleur A-M, Zhang C, Murphy BD. Orphan nuclear receptor
regulation of reproduction. Anim Reprod 2010;7:146–53.
40. Zhang Y, Dufau ML. Nuclear orphan receptors regulate transcription of the
gene for the human luteinizing hormone receptor. J Biol Chem 2000;275:
2763–70.
41. Jakimiuk AJ, Weitsman SR, Navab A, Magoffin DA. Luteinizing hormone
receptor, steroidogenesis acute regulatory protein, and steroidogenic
enzyme messenger ribonucleic acids are overexpressed in thecal and
granulosa cells from polycystic ovaries. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:
1318–23.
42. Luciano AM, Franciosi F, Modina SC, Lodde V. Gap junction–mediated communications
regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth
and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biol Reprod
2011;85:1252–9.
43. Erez E, Fass D, Bibi E. How intramembrane proteases bury hydrolytic reactions
in the membrane. Nature 2009;459:371–8.
44. Nagase T, Ishikawa K-i, Kikuno R, Hirosawa M, Nomura N, Ohara O. Prediction
of the coding sequences of unidentified human genes. XV. The complete
sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large
proteins in vitro. DNA Res 1999;6:337–45.
EK ŞEKİLLER VE TABLOLAR
EK ŞEKİL 1
EK TABLO 1
EK TABLO 2
EK TABLO 3
EK TABLO 4
EK TABLO 5