Full Text - Journal of the Turkish German Gynecological

Full Text - Journal of the Turkish German Gynecological

CLINICAL STUDY
Astenozoospermi Olgular›nda Semende Canl›l›k Testinin
De¤erlendirilmesinde Eozin ve HOS Testlerinin Karfl›laflt›r›lmas›
Elvan OK1, Do¤an ÖZYURT2, Bülent GÜLEKL‹3
1Department
of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Zonguldak Karaelmas University, Zonguldak, Turkey
of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University, ‹zmir, Turkey
3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University, ‹zmir, Turkey
2Department
Received 04 June 2008; received in revised form 28 July 2008; accepted 29 July 2008;
published online 18 November 2008
Abstract
Comparison of Eosin and HOS Test Methods in Assessment of Sperm Viability
in Asthenozoospermia Cases
Objective: This study investigated whether one of the two viability tests is superior to the other in cases with
asthenozoospermia (reduced sperm motility) in which the rate of immotile spermatozoa exceeded 50%.
Materials and Methods: A total of 21 male patients who visited the IVF (in vitro fertilization) unit of the Department of Obstetrics
and Gynecology of Dokuz Eylül University Medical Faculty were included in the study. Semen samples were subjected to both
macroscopic and microscopic examinations. Makler counting chamber was used for the sperm motility and concentration analyses.
All semen samples were subjected to eosin viability test and HOS (hypo-osmolar swelling) test. The result of the eosin test was
accepted as normal in the case of presence of 75% or more unstainable spermatozoa in a semen sample. The result of the HOS test
was accepted as normal if swelling behavior were observed in more than 60% of the spermatozoa tails in a semen sample.
Results: Both tests yielded normal results in 10 cases, while the test results were found to be abnormal in 4 of the cases. In
7 cases, the HOS test yielded abnormal results, while the results of the eosin test were found to be normal. The binomial
(sign test) statistical evaluation revealed that the two tests have no superiority over one another (p>0.05).
Discussion: The fact that the HOS test as a viability test yielded very similar results when compared to the eosin test
demonstrates the significance of the HOS test in the sense that it is economic.
Keywords: asthenozoospermia, eosin test, HOS test, sperm motility
Özet
Amaç: Bu çal›flmada, immotil spermatozoa say›s› %50’yi geçen astenozoospermi (sperm motilite düflüklü¤ü) olgular›nda iki
canl›l›k testinin birbirine üstünlü¤ü olup olmad›¤› araflt›r›ld›.
Materyal ve Metot: Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi, Kad›n Hastal›klar› ve Do¤um Anabilim Dal› Tüp Bebek Merkezi’ne baflvuran toplam 21 erkek çal›flma kapsam›na al›nd›. Semen örne¤i makroskopik ve mikroskopik olarak de¤erlendirildi.
Sperm motilite ve konsantrasyon de¤erlendirmesi için Makler say›m kameras› kullan›ld›. Tüm semen örneklerine eozin
canl›l›k testi ve HOS testi (hypo-osmolar swelling test) birlikte uyguland›. Bir semen örne¤inde %75 ya da daha fazla boya
almayan sperm varl›¤›nda, eozin testi normal olarak de¤erlendirildi. Bir semen örne¤inde spermlerin %60’›ndan fazlas›nda
kuyruklar›nda fliflme görüldü¤ünde ise HOS testi normal olarak kabul edildi.
Sonuçlar: On olguda her iki testte de normal sonuç al›n›rken, 4 olguda ise anormal sonuç elde edildi. Yedi olguda ise HOS
testi anormal sonuç verirken, eozin testi normal olarak saptand›. Yap›lan binomial (sign test) istatistiksel de¤erlendirmede
testlerin birbirlerine üstünlü¤ünün olmad›¤› görüldü (p>0.05).
Tart›flma: Canl›l›k testi olarak HOS testinin, eozin testinden çok farkl› sonuçlar vermemesi bu testin ekonomik olmas›
aç›s›ndan de¤er tafl›maktad›r.
Anahtar sözcükler: astenozoospermi, eozin testi, HOS testi, sperm motilitesi
Corresponding Author: Dr. Elvan Ok
Zonguldak Karaelmas Üniversitesi T›p Fakültesi,
Histoloji ve Embriyoloji AD, Kozlu 67600 Zonguldak, Türkiye
Phone : +90 372 261 32 29
GSM : +90 532 303 81 61
E-mail : [email protected]
186
Ok E, Özyurt D, Gülekli B, Comparison of Eosin and HOS Test Methods in Assessment of Sperm Viability in Asthenozoospermia Cases,
J Turkish-German Gynecol Assoc, Vol. 9(4); 2008:186-189
J Turkish-German Gynecol Assoc, Vol. 9(4); 2008
Girifl
Sperm motilite bozukluklar› (astenozoospermi) erkek infertilitesi nedenleri aras›nda önemli bir yer tutmaktad›r (1-4).
Sperm motilitesi yeterli miktarda ATP, fonksiyonel aksonemal dinein ATPazlar› ve aksonemlerin içinde yüzdükleri
normal bir iyon ortam› gibi hücre içi faktörlerin karfl›l›kl› etkileflimi sonucu ortaya ç›kmaktad›r. Hareketlili¤in bafllat›lmas› ve sürdürülmesinde bu faktörler temel gereksinimdir.
Bu temel gereksinimi etkileyebilecek herhangi bir d›fl faktör
hareketlili¤i bozmaktad›r (1).
Sperm hareket bozukluklar›na pek çok faktör neden olabilmektedir. Enfeksiyon, bakteri ve bakteri ürünleri, sitokinler, anormal spermotozoa gibi faktörler sperm hareketlili¤ini olumsuz
olarak etkileyebilmektedir (1). Ancak semen analizinde immotil olarak de¤erlendirilen spermlerin tümünün ölü oldu¤u düflünülmemelidir. Bu nedenle, yüksek oranda immotil sperm içeren
örneklerde boyama teknikleri ya da hipoozmatik fliflme testi uygulanarak canl› sperm oran› saptanmaktad›r (5).
HOS testi ile sperm hücre membran›n›n ifllevsel bütünlü¤ü
hakk›nda fikir sahibi olunabilmektedir. Spermatozoa, hipoozmatik bir çözelti ile kar›flt›r›ld›¤›nda sperm kuyru¤unda
fliflme fleklinde bir reaksiyon gözlenir (6). Eozin testinde ise
ölü hücreler, hücre zar› geçirgenli¤i özelli¤ini kaybettiklerinden eozin boyas›n› hücre içine alarak k›rm›z› renge boyan›r.
Canl› hücreler ise boya almazlar (7).
‹mmotil spermatozoa say›s› %50’yi geçerse canl›l›k testlerinin yap›lmas› önerilmektedir. Canl›, ancak immotil olan hücrelerin büyük oranda varl›¤›, kuyruktaki yap›sal defektlerin
göstergesi olabilmektedir (3,4). Bu da tedaviye yaklafl›m aç›s›ndan önemlidir.
santrasyonu ve motil sperm yüzdesi DSÖ (Dünya Sa¤l›k Örgütü) kriterlerine göre belirlendi (3,4). Her semen örne¤inde
200 sperm say›ld›. Her bir spermin motilitesi 4 kategoride
skorland›: a) H›zl› ileri hareketli, b) Yavafl ileri hareketli, c)
Yerinde hareketli, d) Hareketsiz (immotil).
Mikroskop alan›n› lineer motilite ile geçen spermler ileri hareketli olarak de¤erlendirildi. Lineer motilitesi olmayan
spermlerle, lineer motilitesi olan spermlerin toplam yüzdesi
ise toplam hareketlilik olarak belirlendi. Ejakülasyondan
sonra 60 dakika içinde %50 ve daha fazla ileri motilitesi
(h›zl› ileri hareketli + yavafl ileri hareketli) ya da %25’ten
fazla h›zl› ileri motilitesi olan örnekler sperm hareketlili¤i
aç›s›ndan normal kabul edildi.
Semende canl› sperm yüzdesini saptamak için özel testler
mevcuttur (4,5). Bu çal›flmada canl›l›k testleri olarak eozin
testi (Vital Screen-Fertipro, Beernem, Belgium) ile HOS testi (HOST test-Fertipro, Beernem, Belgium) kullan›ld›.
Eozin testi boyama prosedürü
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Materyal ve Metot
Çal›flman›n tipi, kontrollü prospektif çal›flmad›r ve olgular
Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Kad›n Hastal›klar› ve
Do¤um AD Tüp Bebek Merkezi’ne baflvuranlardan al›nm›fl
immotil spermatozoa say›s› %50’yi geçen toplam 21 semen
örne¤i çal›flma kapsam›na al›nd›.
Semen analizi
Semen örnekleri mastürbasyon yöntemi ile 4 günlük ideal
cinsel perhiz sonras› elde edildi. Mastürbasyonla elde edilen semen örne¤i steril ve genifl a¤›zl› bir kapta topland›.
Semenin likefaksiyonu için 30 dakika beklendi. Tüm olgulara makroskopik de¤erlendirme yap›ld›ktan sonra mikroskopik de¤erlendirme ile sperm say›s› ve motilitesi de¤erlendirildi. Mikroskopik de¤erlendirme faz kontrast mikroskobu ile yap›ld›.
Sperm hareketlili¤i ve konsantrasyon de¤erlendirmesi için
Makler say›m kameras› kullan›ld› Semen örnekleri 37°C’de
bekletildi ve hareketlilik de¤erlendirmesi ejakülasyondan
sonra 1 saat içinde oda s›cakl›¤›nda yap›ld›. Sperm kon-
50 µl semen ile 2 damla A boyas› steril test tüpünde kar›flt›r›ld›.
30 sn sonra bu kar›fl›ma 3 damla B boyas› eklenerek
tekrar kar›flt›r›ld›.
B boyas›n›n eklenmesini izleyen 30 saniye içinde semen
boya kar›fl›m›ndan 1 damla bir lama kondu ve ince bir
smear olarak yay›ld›.
Yay›ld›ktan sonra üzerine lamel kapat›ld›.
Mikroskopta x400 veya x600 büyüterek incelendi.
100 sperm say›ld›.
K›rm›z› ya da total olarak beyaz görünmeyen hücreler ölü
olarak kabul edildi.
Sonuçlar canl› (beyaz) spermlerin yüzdesi olarak verildi.
Bir semen örne¤inde %75 veya daha fazla boya almayan
sperm varl›¤›nda test normal olarak de¤erlendirildi (8,9).
HOS testi
•
•
•
•
•
•
•
Prosedür:
1 ml HOS solüsyonu ›l›nd›r›ld› (37°C’de 5 dakika)
Bu solüsyona 1 ml likefiye semen eklenerek pipetle kar›flt›r›ld›.
30 dakika 37°C’de tutuldu.
Mikroskopta bak›ld›.
100 sperm say›ld›.
Kuyruk k›vr›lmas› olan spermler ölü; kuyruk k›vr›lmas›
olmayan spermler canl› kabul edildi. Bir semen örne¤inde spermlerin %60’›ndan fazlas›nda kuyruklar›nda fliflme
görüldü¤ünde HOS testi normal kabul edildi (8).
Çal›flma,
Helsinki
deklarasyonu
prensiplerine
(http://www.wma.net/e/policy/b3.htm) uygun olarak yap›lm›fl olup bu çal›flman›n etik kurul onay› bulunmaktad›r.
Eozin canl›l›k testi ile HOS testinin karfl›laflt›r›lmas›nda
binomial (sign test) kullan›lm›flt›r.
187
Ok et al.
J Turkish-German Gynecol Assoc, Vol. 9(4); 2008
Tablo 1. ‹ncelenen semen örneklerinde HOS ve eozin testlerinin karfl›laflt›r›lmas›
Canl›l›k testi bak›lan semen örne¤i
Test sonucu normal
Say›
(%)
Test sonucu anormal
Say›
(%)
Toplam
Say›
(%)
Her iki canl›l›k
testi ile paralel
sonuç al›nanlar
Eozin testi
HOS testi
10
10
71.42
71.42
4
4
28.58
28.58
14
14
100
100
Sonuçlar›n
uyumsuz oldu¤u
olgular
Eozin testi
HOS testi
Say›
7
0
(%)
100
0
Say›
0
7
(%)
0
100
Say›
7
7
(%)
100
100
Resim 1. Eozin testi ile boyanm›fl semen örne¤inde 2 ölü sperm
(x400).
Resim 3. Eozin testi ile boyanm›fl semen örne¤inde ölü spermler
(x400).
edildi. Yedi olguda ise HOS testi sonucu negatifken, eozin
testi pozitif olarak saptand› (Tablo 1, Resim 1-3).
Yap›lan binomial (sign test) istatistiksel de¤erlendirmede
testlerin birbirlerine üstünlü¤ü olmad›¤› saptand›.
Tart›flma
Sperm canl›l›k testi de¤erlendirmesi, özellikle tüp bebek
merkezlerinde olgunun ICSI (intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu) için yönlendirilmesinde oldukça önemlidir. Yap›lan
bir çal›flmada, kullan›lan iki testten biri olan HOS testinin
astenozoospermi olgular›nda sperm canl›l›¤›n› gösterebilen
bir test oldu¤u sonucuna var›lm›flt›r (10).
Resim 2. Eozin testi ile boyanm›fl semen örne¤inde 2 ölü ve okla
gösterilen 1 canl› sperm (x400).
Sonuçlar
Canl›l›k testlerinin karfl›laflt›r›lmas›nda 21 olguya HOS ve
eozin testleri birlikte uyguland›. On olguda her iki testte
de pozitif sonuç al›n›rken, 4 olguda negatif sonuç elde
188
Tartagni ve arkadafllar›n›n 2002 y›l›nda yay›mlanan bir çal›flmas›nda, normal semen parametreleri olan, ancak subnormal
HOS testi skorlar›na sahip erkeklerin efllerinde çok düflük
oranda gebelik oldu¤u görülmüfltür (11).
Domuz ve bo¤a spermleri üzerinde yap›lan di¤er bir çal›flmada, nükleik asit boyalar› propium iodide ve Hoechst 33258
ile eozin karfl›laflt›r›lm›fl ve anlaml› farkl›l›k bulunmufltur.
Propium iodide di¤er boyalara göre daha fazla say›da boyal›
yani ölü hücre göstermifltir (12).
J Turkish-German Gynecol Assoc, Vol. 9(4); 2008
Canl›l›k testleri ejakülatta, epididimis ve testisten al›nan dokularda ya da dondurulup çözülmüfl örneklerlerde canl› spermi
belirlemede önemli testlerdir. Ancak Eozin-Y spermi öldürdü¤ü için ICSI sikluslar›nda kullan›m› uygun de¤ildir (13).
Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Tüp Bebek Merkezi
çal›flanlar›na teflekkür ederiz.
Kaynaklar
1.
Salam ve arkadafllar›n›n, erkek partnerlerde non-obstrüktif
azospermi saptanan 79 çift üzerinde yapt›klar› bir çal›flmada 44 erke¤e modifiye HOS testi (%50 kültür mediumu +
%50 distile su) uygulanm›fl, 35 erke¤e ise HOS testi uygulamadan sadece spermin morfolojisine bak›larak ICSI yap›lm›flt›r. ‹mmotil testiküler spermler aras›nda canl› sperm
seçimi ile modifiye HOS testi uygulanan grupta fertilizasyon, gebe kalma ve devam eden gebelik oranlar› daha yüksek bulunmufltur (14). Semen analizinde çok önemi olmayan, ancak, özellikle ICSI uygulanacak olgularda hücreye
daha az zarar vermesi aç›s›ndan modifiye HOS testinin tercih edilmesi söz konusudur.
Bizim çal›flmam›zda da, sperm canl›l›¤›n› de¤erlendirmede
HOS ve eozin testlerinin birbirine üstünlü¤ü saptanmam›flt›r.
Canl›l›k testleri olan eozin ve HOS testlerinin istatistiksel
olarak paralel sonuçlar vermeleri özellikle daha ucuz ve daha güvenli olan HOS testinin tercihini gündeme getirmelidir.
Canl›l›k testlerinden ticari olarak sat›lan HOS testinin, eozin
testinden çok farkl› sonuçlar vermemesi, HOS testinin ekonomik olmas› aç›s›ndan de¤er tafl›maktad›r.
Teflekkür
Bu çal›flma, Dokuz Eylül Üniversitesi Araflt›rma Fon Saymanl›¤› taraf›ndan 99.3456.23 say›l› proje ile desteklenmifltir.
Makalenin istatistiksel de¤erlendirilmesinde katk›da bulunan
Illinois State Üniversitesi’nden Doç. Olcay Akman’a ve
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
http://www.androloji.info/motilite_bozukluklar›_d›sfaktörler.php (son
eriflim tarihi: 03.06.2008)
www.androloji.org.tr/images/file/‹nfertil%20hastaya%20tan›sal%20
yaklafl›m.doc – (son eriflim tarihi: 03.06.2008)
WHO Laboratory manuel for the examination on human semen and spermcervical mucus interaction. 4th ed. Cambridge: Cambridge University Press;
1999;76:4-33.
Günalp S (Çev Ed). WHO laboratuvar el kitab› insan semeni ve spermservikal mukus etkileflimi de¤erlendirilmesi. Ankara: T›p Teknik Kitabevi;
2002;76:4-33.
Enginsu E. Erkek infertilitesinde tan›ya yönelik testler ve sperm haz›rlama
protokollar›. Delilbafl› L, editör. In vitro fertilizasyon laboratuar yöntemleri.
Ankara: Günefl T›p Kitapevleri 2008:66-71.
Y›ld›r›m A. ‹nfertil erkekte laboratuar incelemeleri ve IVF ve ICSI için
sperm haz›rl›¤›. Hassa H, editör. ‹nfertil olgularda klinik yaklafl›m ve
IVF laboratuvar uygulamalar›. Eskiflehir: Osmangazi Üniversitesi
Bas›mevi 2003:155.
Vicdan K, Ifl›k AZ. In vitro fetilizasyon ve mikromanipülasyon
uygulamalar›nda laboratuvar. Ankara: Ça¤dafl Medikal Kitabevi 1999.
http://www.aksuvar.com/frameset.htm (son eriflim tarihi: 03.06.2008)
Günalp S, Orhon Esat, Özgür K, Seçkin B, Tarcan T. Türk Androloji
Rehberi 2004.
Buckett WM. Predictive value of hypo-osmotic swelling test to identify
viable non-motile sperm. Asian J Androl 2003;5(3):209-12.
Tartagni M, Schonauer MM, Cicinelli E et al. Subnormal hypo-osmotic
swelling test scores as an important cause of cryptic infertility. Journal
of Andrology 2002;23(4):498-502.
Pintado B, de la Fuente J, Roldan ERS. Permeability of boar and bull
spermatozoa to the nucleic acid stains propidium iodide or Hoechst
33258, or to eozin: accuracy in the assessment of cell viability. Journal
of Reproduction and Fertility 2000;118:145-52.
Khalili MA, Mir-Rokni F, Kalantar SM. Application of vitality tests on
asthenozoospermic semen from infertile men. Iran Biomed J 1999;3:7781.
Salam HN, Farrag A, Agameya AF, El-Garem Y, Ezeldin F. The use of
the modified hypo-osmotic swelling test for the selection of immotile
testicular spermatozoa in patients treated with ICSI: a randomized
controlled study. Hum Reprod 2005;20(12):3435-40.
189