Klinik Biyokimyada Önem Kazanan Antioksidan ve Prooksidan Testleri

Klinik Biyokimyada Önem Kazanan Antioksidan ve Prooksidan Testleri

KLİNİK BİYOKİMYADA ÖNEM KAZANAN
ANTİOKSİDAN ve PROOKSİDAN TESTLERİ ve
CUPRAC YÖNTEMİ
Reşat APAK* ve Sema D. ÇEKİÇ
İstanbul Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü
Analitik Kimya Anabilim Dalı, 34320 Avcılar – İstanbul
* İstanbul Üniversitesi ve Türkiye Bilimler Akademisi (TÜBA)
XXVII. ULUSAL BİYOKİMYA KONGRESİ 3-6 Kasım 2015 Antalya
Prof. Dr. Aziz Sancar (Kimya 2015 Nobel
Ödülü)
• Tıp Nobel’i mi, Kimya
Nobel’i mi?
• Hücresel DNA’nın onarım
mekanizmaları
• Kanser tedavisinde ‘ritmik
saat’
•
•
Yale Üniv’de bakteriyel DNA’ya UV
hasarını belirleyen ve hatalı jenetik
kodu kesen fotolaz ve benzeri
enzimlerin keşfi;
Chapel Hill’deki North Carolina
Univ’de insanda gerçekleşen eşdeğer
onarım mekanizmalarının keşfi.
Şekil 1. Reaktif türlerin ve antioksidanların canlı vücudundaki dengesi
İç ve dış antioksidanların birlikte katkıda bulunduğu vücuttaki
antioksidan savunma ağının görevi reaktif türleri tümüyle yok
etmek değil oksidatif hasarı en aza indirirken bu türlerin bilinen
yararlı fonksiyonlarını sürdürmelerine izin vermektir.
Serumda AOA ölçümünün önemini vurgulayan hastalık
örnekleri: 120 sağlıklı, 80 hasta (40 akut miyokard enfarktüsü (AMI)
hastası ve 40 kronik lenfotik lösemi (CLL) hastası) birey için antioksidan
aktivite (AOA) ölçülmüştür. Aşağıdaki 120 sağlıklı bireye kıyasla (ortalama
AOA 2.04 mmol/litre; standart sapma değeri 0,2) hem AMI hem CLL
hastalarının AOA değerlerinin önemli ölçüde düşük olduğu saptanmıştır (t >
8.3; p < 0.0001).
Şekil 2. Sağlıklı ve hasta bireylere ait serum örneklerinde ölçülen AOA
değerleri
Kaynak: D. Koracevic, G. Koracevic, V. Djordjevic, S. Andrejevic, V. Cosic, J Clin Pathol, 54 (2001) 356-361.
İnsanlarda yaşlanma sürecinde Eritrosit sialik asit düzeyleri: Oksidatif
stres belirteçleri ile ilişkisi
Sialik asidler esas olarak glikoprotein ve gangliosidlerde bulunan bir
monosakarid olan neuraminic asidin N- or O-sübstitue türevleridir.
Yaşlanmanın bir fonksiyonu olarak kırmızı kan hücresi membranlarında
sialik asit miktarının dikkate değer ölçüde azaldığı (r=-0.901) gösterilmiştir.
Hidroperoksit formunda ölçülen lipid peroksidasyonu plazmada ve kırmızı
kan hücresi membranlarında yaşlanmaya bağlı olarak artarken toplam
antioksidan kapasitenin (TEAC) önemli ölçüde azaldığı görülmüştür.
Sonuçta yaşlanma ile artan oksidatif stresin membran bileşimini değiştirerek
sialik asidin bozunmasına yol açabileceği öne sürülmüştür.
Yaşlılık süreci ve ölümü izlenen 2932 denekli (popülasyon medyan
yaşı=70), sonuçları yeni açıklanan bir araştırmaya göre reaktif oksijen
metabolitleri (d-ROM) ve redox kontrol vasıtası olarak toplam tiyol düzeyleri
(TTL) izlenen popülasyonda her iki parametrenin de yaşlılıkta ölüm ile ilişkili
olduğu bulunmuştur. Bu bulgular, yaşlanmanın oksidatif stres/serbest
radikaller ile ilişkisini gösteren hipoteze destek vermektedir. (B. Schöttker et
al., J. Gerontology: MEDICAL SCIENCES, 2014)
Antioksidan kapasite nedir?
Nasıl ölçülür?
• Toplam antioksidan kapasite (TAC), antioksidanlarla reaktif
türler arasındaki reaksiyonun termodinamiğini (verimini);
antioksidan aktivite (AOA) ise aynı reaksiyonun kinetiğini
(hızını) ölçer.
• Antioksidan etkinlik (TAC/AOA) testleri genelde enzimatik
olmayan antioksidanları hedef alır ve doğrudan veya dolaylı
olarak yürütülür.
• Doğrudan testlerde biyolojik olarak önemli reaktif türler
(ROS/RNS), prob ile reaksiyona girerek onu dönüştürür.
Antioksidanlar reaktif türlerle yarışmalı bir reaksiyona
girerek probun daha az dönüşmesini sağlarlar:
Doğrudan ve dolaylı AOA testleri
• Prob + (ROS/RNS) → Dönüşmüş prob + inaktif O,N-türleri
… (1)
• AOX + (ROS/RNS) → Yükseltgenmiş AOX + inaktif O,N-türleri
… (2)
• (1) ve (2) reaksiyonları birbiriyle yarışır ve AOX’lar varlığında
prob daha az dönüşüme uğrayacağından probun başlangıç ve
son hallerine ait spektroskopik sinyaller farklılaşır. Fark,
TAC/AOA ölçüsüdür.
• Dolaylı testlerde ise biyolojik antioksidan etkinliği
laboratuvar ortamında simüle edilir (yarışmasız reaksiyon):
• Prob + AOX → İndirgenmiş prob + Yükseltgenmiş AOX
• Yine aynı şekilde probun başlangıç ve son halleri
spektroskopik olarak farklı olup fark, TAC/AOA ölçüsüdür.
OKSİDATİF STRES BİOMARKERLERİ: Antioxidant capacity:
Which capacity and how to assess it? Etsuo Niki, Journal of Berry
Research 1 (2011) 169–176
OKSİDATİF STRES BELİRTECİ OLARAK PROTEİN
KARBONİL (C=O) GRUPLARININ
DEĞERLENDİRİLMESİ
Protein CO gruplarının yüksek seviyeleriyle oksidatif stres ve hastalıklar
arasındaki ilişki tam olarak açıklanamamış olmakla birlikte oksidatif stres
belirteci olarak sıklıkla kullanılır. Yaygın karbonil tayin yönteminde CO,
2,4-dinitrofenil hidrazin (DNPH) ile türevlendirilerek hidrazon türevleri
oluşturulur.
Şekil 3. Aldehit ve ketonların DNPH ile reaksiyonları sonucu DNPH oluşumu
Bu türler spektrofotometrik, enzim-bağlantılı iminosorbent tayini (ELISA), tek
boyutlu veya çift boyutlu elektroforezin ardından Western blot yöntemleri
kullanılarak belirlenebilir.
DNA OKSİDATİF HASARININ BELİRLENMESİ
DNA’ya serbest radikal, özellikle hidroksil radikali (•OH) saldırısı sonucu en
kolay yükseltgenen DNA bazı olan guanin’den oluşan çeşitli (birincil ve ikincil)
ürünler, oksidatif DNA hasarının belirlenmesinde kullanılır. Bu amaçla yaygın
olarak kullanılan analitik teknikler GC/MS, LC/tandem MS’dir.
Şekil 4. •OH radikali saldırısı sonucunda guaninin C8-pozisyonuna radikal katılmasıyla oluşan
C8-OH katılma ürünleri
COMET ANALİZİ
“Tek hücre jel elektroforezi (SCGE) yöntemi” DNA sarmal kırıklarının
belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem “Mikrojel
Elektroforetik Yöntem” yada “Comet Assay” olarak da adlandırılır. Uygun
şekilde süspande edilen hücreler önce lizing işlemine ardından da
elektroforeze tabi tutularak akridin oranj gibi DNA bağlayıcı floresan boyayla
boyanırlar. Kırık içeren örneklerde bu hasarlı fragmanlar nedeniyle elektrik
yükü kazanan DNA, çekirdekten anoda doğru göç ederken aldığı ‘kuyruklu
yıldız’ benzeri görünümünden ötürü hasarlı hücreler COMET olarak
adlandırılır.
Şekil 5. COMET testinin uygulanışı (http://www.trevigen.com/cat/1/3/0/CometAssay_/)
Kaynak: O. Ostling ve K.J. Johanson , Biochemical and Biophysical Research Communications, (1984), 123,
291-298
TBARS YÖNTEMİ
Düşük maliyeti ile en yaygın dolaylı prooksidan tayin
yöntemlerinden birisi de TBARS Yöntemi olarak adlandırılan
“Tiyobarbitürik aside reaktif maddeler” yöntemidir.
Ancak sonuçlar çok çeşitli enterferanslardan etkilenmekte olup verilerin
yorumlanması sırasında çok dikkatli olunması gerektiği bilinmektedir.
TBARS Parameter™ Kit for Measuring Oxidative Stress R&D SYSTEMS a Biotechne Brands
Şekil 6. TBARS Yöntemi, tiyobarbitürik asit (TBA) ve deoksiribozdan gelen malondialdehit (MDA)
arasındaki reaksiyon sonucu oluşan pembe kromojenin absorbansının 532 nm de (veya
floresansının 553 nm de) okunmasına dayanır. Bu kromojen butan 1-ol’e ekstrakte edilebilir.
TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ
Literatürde toplam antioksidan kapasitenin (TAC) ölçülmesi amacıyla
sıklıkla kullanılan yöntemler çok keskin sınırlarla ayrılmamakla beraber
mekanizmalarına göre, elektron transferi (ET) veya hidrojen atomu transferi
(HAT) esaslı tayinler olarak iki sınıfta toplanabilir. Çok yaygın olarak
kullanılan ABTS/TEAC ve DPPH Yöntemleri ise ET/HAT karma
mekanizmasıyla çalışır.
Elektron Transferi (ET) esaslı spektrofotometrik yöntemler antioksidan
kapasitesini indirgendiğinde renk değiştiren bir kromojenik bir yükseltgenin
renk şiddetinin ölçülmesi esasına dayanır. Renk şiddetindeki değişim
örnekteki antioksidanın miktarı ile doğru orantılıdır.
Prob(n) + e (antioksidan kaynaklı: AH)  Prob(n-1) + AH+
(ET) esaslı yöntemlere örnek olarak, ferrisiyanür, FRAP, ve CUPRAC ve
CERAC Yöntemleri verilebilir.
Kaynak: R. Apak, K. Güçlü, B. Demirata, M. Özyürek, S. E. Çelik, B. Bektaşoğlu, K. I. Berker, D. Özyurt,
Molecules, 12 (2007) 1496-1547.
ABTS/TEAC YÖNTEMİ
. (Şekil Boligon et al., Med chem 2014, 4(7), 517-522 den alınmıştır)
Şekil 7. ABTS Yöntemi
ABTS/TEAC: ABTS + K2S2O8 → ABTS•+ (λmax=734 nm)
ABTS•+ + ArOH → ABTS + ArO• + H+
ABTS: 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonik asit)
TEAC: Trolox ekivalent antioksidan kapasite
Literatürde ABTS/TEAC Yönteminde kullanıldığı bildirilen diğer dalgaboyları 415 ve
645 nm olmasına rağmen en yaygın kullanım bulan bitki pigmentlerinden gelen
enterferansın daha düşük olduğu λ= 734 nm dir.
Kaynak : Re, R,; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M. Free Radical Biol Med.
(1999) 26, 1231-1237.
DPPH YÖNTEMİ
Şekil 8. DPPH• radikali ve antioksidan (AO-H) tarafından indirgenmesi (Şekil Boligon et al.,
Med chem 2014, 4(7), 517-522 den alınmıştır)
DPPH• + ArOH → DPPH + ArO• + H+
DPPH •: Stabil [2,2-diphenyl-1-picryl-hidrazil] radikali λmax=515 nm.
Kaynak : Bondet, V.; Brand-Williams, W.; Berset, C. Food Sci. Technol. 30 (1997) 609-615.
FRAP YÖNTEMİ
FRAP (Demir(III) İndirgeme Antioksidan Gücü) tayini, elektron
transfer reaksiyonlarının avantajlarına sahip, göreli basit ve ucuz
bir yöntemdir. Burada yükseltgen, bir demir(III) kompleks tuzu
olan Fe(III)(TPTZ)2Cl3 (TPTZ : 2,4,6-tripiridil-s-triazin)’dir.
Şekil 9. FRAP Yöntemi ve kromoforu [Fe(II)(TPTZ)2]
Kaynak: F.F., Benzie, J.J., Strain, Anal. Biochem., 239 (1996) 70-76.
FERRİSİYANÜR (HEKZASİYANOFERRAT(III)-PRUSYA MAVİSİ) YÖNTEMİ
1986’dan
beri
bilinen
ferrisiyanür
yöntem,
başlangıçta
(Fe(III)+SDS) eklenmesiyle ve pH=1.6 olacak şekilde modifiye
edilmiştir. Prusya mavisi Fe[Fe(CN)6]- oluşumuyla λmax =750 nm
ye çıkartılmıştır: “ferrik-ferrisiyanür yöntemi” Böylece potansiyel
0.36 V’un üzerine çıkarılır.
Fe3+ + ArOH → Fe2+ + ArO• + H+
Fe2+ + Fe(CN)63− + K+ → KFe[Fe(CN)6] λmax=750 nm.
Kaynak: K. I. Berker, K. Güçlü,. I. Tor, B. Demirata Öztürk, R. Apak, Food Anal.
Methods, 3 (2010) 154-168. ve K. I. Berker, B. Demirata, R. Apak,, Food Anal.
Methods,5 (2012) 1150-1158.
CUPRAC YÖNTEMİ
Açık mavi CUPRAC reaktifi
Sarı renkli ürün
Şekil 10. CUPRAC reaksiyonu ve kromoforu: Bis(neokuproin) bakır(I) kelat katyonu (Reaksiyon
sırasında açığa çıkan protonlar NH4Ac tamponu tarafından nötralleştirilir).
Elektronik konfigürasyonu d10 yapısında olan Cu(I) ile Nc arasında oluşan
kompleks, Cu(II)-d9 konfigürasyonuna nazaran daha tetraedral bir yapı
kazanarak moleküler gerginliği azaltır ve Cu(I)’i stabilize eder (ML2 için Logβ2
kümülatif oluşum sabitleri Cu(I) ve Cu(II) için 19 ve 12).
Şekil 11. Farklı konsantrasyonlardaki kuersetinin
CUPRAC reaksiyonu sonucunda oluşan Cu(I)-Nc
spektrumu
Kaynak: R. Apak, K. Güçlü, M. Özyürek, S. E. Karademir, J. Agric. Food Chem., 52 (2004) 7970-7981.
CUPRAC
Yöntemi
metil-β-siklodekstrin
(Me-β-CD)
içeren
çözeltilerde lipofilik ve hidrofilik antioksidanların bir arada tayinine
olanak sağlamaktadır.
Şekil 12. Antioksidan bileşikler ile Metil-β-CD arasındaki Konak-konuk (Host–guest)
etkileşimini takiben inklüzyon kompleksinin TAC içeriği CUPRAC Yöntemi ile tayin edilir.
CUPRAC Yöntemi uygun şekilde modifiye edilerek H2O2, süperoksit
ve hidroksil radikallerinin dolaylı olarak ölçülmesinde kullanılabilir.
POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİN HİDROKSİL RADİKALİ
SÜPÜRME ANTİOKSİDAN AKTİVİTESİ
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH. + OH- (t=10 dakika)
+ katalaz
H2O2
H2O + O2
(Fenton reaksiyonunun
durdurulması)
Kaynak: M. Özyürek, B. Bektaşoğlu, K. Güçlü, R. Apak, Anal. Chim. Acta, 616 (2008) 196-206.
Şekil 13. Salisilik asit probuna hidroksil radikali saldırısının ardından oluşan temel
hidroksilasyon ürünleri
Kaynak: B. Bektaşoğlu, M. Özyürek, K. Güçlü, R. Apak, Talanta, 77 (2008) 90-97.
POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİN KSANTİN/KSANTİN OKSİDAZ
INHİBİSYON AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜLMESİ
Ürik asidin CUPRAC absorbansı vardır
(TEAC katsayısı = 1)
İnkübasyon çözeltisinin Cu(II)neokuproinin
ksantin
–
ksantinoksidaz sistemininden
oluşan ürünler ile indirgenmesi
sonucu
oluşan
CUPRAC
absorbansının
polifenolikler
varlığındaki azalır, absorbans
farkı test edilen bileşiklerin
ksantinoksidaz
inhibisyon
aktivitesi ile orantılıdır.
% İnhibisyon = 100 [(Ao-A)/Ao]
A ve A0 sırasıyla inhibitör varlığındsa ve yokluğundaki CUPRAC
absorbanslarıdır.
Kaynak: M. Özyürek, B. Bektaşoğlu, K. Güçlü, R. Apak, Anal. Chim. Acta, 636 (2009) 42-50.
POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİN (Cu(II)-katalizörlüğünde)
HİDROJEN PEROKSİT SÜPÜRME AKTİVİTESİNİN
BELİRLENMESİ
+ CuCl2
Ar(OH)n +
H2O2
CUPRAC yöntemi uygulanır
(37 oC de inkübasyon
t = 30 dak.)
% H2O2 süpürülmesi = 100 [Ao-(A1-A2)/Ao]
A0= H2O2 çözeltisinin CUPRAC Absorbansı
A1= (H2O2 + süpürücü) karışım çözeltisinin katalaz yokluğundaki CUPRAC Absorbansı
A2= (H2O2 + süpürücü) karışım çözeltisinin katalaz varlığındaki CUPRAC Absorbansı
Kaynak: M. Özyürek, B. Bektaşoğlu, K. Güçlü, N. Güngör, R. Apak, J. Food Comp. Anal., 23 (2010) 689-698.
HİDROJEN PEROKSİT TAYİNİ YOLUYLA KATALAZ
AKTİVİTESİNİN DOLAYLI OLARAK TAYİNİ
CUPRAC Kolorimetrik sensörü
CUPRAC antioksidan sensörü
Cu(II)-Nc
Nafyon membran
Nafyon-Cu(II)-Nc
Nafyon-Cu(I)-Nc
Rotatörde 30 dak. karıştırılır
Antioksidan örneği
Ölçülen absorbans
(450 nm)
Referans: M. Bener, M. Özyürek, K. Güçlü, R. Apak, “Development of a Low-Cost Optical Sensor for CUPRAC
(Cupric Reducing Antioxidant Capacity) Measurement of Food Extracts”, Anal. Chem., 82 (2010) 4252-4258.
25
BİYOLOJİK ÖRNEKLERİN SÜPEROKSİT RADİKAL
SÜPÜRME AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ
Şekil 14. PMS-NADH sisteminde üretilen O2•- TBHQ nin TBBQ ye yükseltgenmesi
İnhibisyon (%) = 100 [(Ao-A)/Ao]
İnkübasyon karışım çözeltisinin süpürücü varlığında ve yokluğundaki
absorbansları sırasıyla Ao ve A olarak ifade edilmiştir.
Kaynak: B. Bekdeşer, M. Özyürek, K. Güçlü, R. Apak, Anal. Chem., 83 (2011) 5652-5660.
İSKEMİ-REPERFÜZYON UYGULAMASINDA CUPRAC’IN
BAŞARISI: Teorik olarak, oksidan saldırısı arttıkça antioksidan
stokunun azalması beklenir. Çeşitli araştırmacılar prooksidanlar ile
toplam antioksidan kapasite arasındaki bu ters orantıyı göstermiştir.
Örneğin, Bean ve ekibi kısmen tıkanmış olan tavşan mesanesinde
iskemi-reperfüzyon sonucunda reaktif oksijen (ve/veya azot) türleri
oluşturmuşlardır. Bu şartlarda serbest radikallerdeki artış sonucu
koruyucu antioksidanların miktarında azalma olması beklenir. Bu
çalışmada elektron transferine dayanan iki farklı antioksidan
kapasite tayin yöntemi, CUPRAC ve FRAP kullanılarak tıkanmış
ve normal (kontrol) mesane dokularının antioksidan aktivitesi
incelenmiştir. FRAP’ın aksine CUPRAC ile tıkanmış mesane
dokusunun AOA’sinin kontrol amaçlı kullanılan mesanenin kas ve
mukozasına kıyasla daha düşük olduğu belirlenmiştir.
Şekil 15. Mesanedeki tıkanmanın kas ve
mukozadaki toplam antioksidan kapasite
üzerine etkisinin CUPRAC Yöntemi ile
incelenmesi.
Şekil 16. Mesanedeki tıkanmanın kas ve
mukozadaki toplam antioksidan kapasite
üzerine etkisinin FRAP Yöntemi ile
incelenmesi.
Grafikteki her bir bar dört farklı örneğe ait değerlerin ortalaması ve ortalamanın ±
standart hatasını temsil etmektedir.
Kaynak: H. Bean, F. Radu, E. De, C. Schuler, R.E. Leggett, R.M. LevinMol Cell Biochem 323
(2009) 139–142.
Soy metal nano-partiküllerin (NP) Yüzey Plasmon
Rezonans Absorpsiyonu
Sıfıra yakın dielektrik sabitli NP’lerin SPR absorpsiyonu, yerleşik yüzey plazmon
(LSPR) bandına yol açar. Au/Ag-NP’leri yüksek molar abs. katsayılarından ötürü
optik dedeksiyonda bilinen reaktiflerden daha yüksek duyarlılığa olanak verirler.
Yüzey plazmonların özellikleri ortamın kimyasal yapısına ve çözücüye, özellikle de
NP-kabuk kalınlığına bağlı olduğundan, Ag(I) iyonlarından sitrat ile elde edilen AgNP tohumlarının antioksidan katılmasıyla büyümesine dayalı bir AOX kapasite
yöntemi geliştirilmiştir.
LSPR-bandı, soy metalin küresel nanopartiküllerinin
iletkenlik
bandı
elektronlarının, gelen ışığın elektrik
alanıyla koherent titreşimi sonucu
ortaya çıkar.
Şekil 17: Küresel Au-kolloidler için serbest
elektronların kollektif titreşimi (şematik)
Referans: Xia, Y., Halas, N. J., 2005, Shape-controlled synthesis and surface plasmonic properties of metallic
nanostructures, MRS Bulletin, 30, 338-347.
Gümüş nano-parçaçık esaslı antioksidan kapasite (SNPAC) tayin yöntemi
2Ag+ + (CH COONa)–-C(OH)(COONa)—(CH COONa)
2Ag0 + (CH COONa)—CO—(CH COONa) + Na+ + H+ + CO2
nAg+ + Ar(OH)n
nAg0 + Ar(=O)n + nH+
Şekil 19. Gümüş nanoparçacıkların SEM görüntüsü
(a) trisodyum sitrat varlığında
(b) Gallik asit + trisodyum sitrat varlığında
Şekil 18. Gallik asit varlığında gümüş nanoparçacıkların
UV-vis spektrumu
Referans: M. Özyürek, N. Güngör, S. Baki, K. Güçlü, R. Apak, “Development of a Silver Nanoparticle-Based Method for the
30
Antioxidant Capacity Measurement of Polyphenols”, Anal. Chem., 84 (2010) 8052-8059.
Ellman reaktifi (RSSR’) ile türevlendirilmiş Au-NP’ler yardımıyla
biyo-tiyollerin (R-SH) kolorimetrik tayini
Trisodium citrate
+
Heating and
Reflux (5 min)
DTNB
Au-NP (Au0)
SEM image of Au-NPs synthesized with
trisodium citrate.
Equilibrated
(for 24 h)
DTNB-Au-NP
Au-NP + DTNB
mixture
Centrifuged and supernatant was
removed
Freeze-dried and
resuspended
Reference: Güçlü, K., Özyürek, M., Güngör, N., Baki, S., Apak, R., 2013, Selective optical sensing of biothiols with Ellman’s reagent: 5,5’-Dithio- 31
bis(2-nitrobenzoic acid)-modified gold nanoparticles, Analytica Chimica Acta, 794, 90– 98.
p-Aminotiyofenol ile türevlendirilmiş Au-NP’ler ile
kolorimetrik NİTRİT tayini
Şekil 20: 4-Aminotiyofenol ile modifiye edilmiş AuNP yüzeyinde nitrit sensörü (nitrit, nitropatlayıcıların hidrolizinden gelir)
Şekil 21: Türevlenmemiş AuNP (a), 4-aminotiyofenol ile
modifiye edilmiş AuNP (b) ve RDX hidrolizini takiben
oluşan ürünlerle renklenmiş AuNP spektrumları; RDX
derişimi: 20 (c) ve 50 (d) mg L-1.
32
Kombine oksidan-antioksidan kolorimetrik sensörü (DMPD yöntemi):
Anabilim Dalımızda yapılan bir çalışmada daha önce Bener ve çalışma
grubunun CUPRAC Sensörü geliştirmekte kullandıkları —O—(CF2)2SO3esaslı Nafyon membran üzerinde hem prooksidan hem antioksidan tayin
edebilen bir sensör geliştirilmiştir. Bu amaçla N,N-dimetil-p-fenilen-diamin
(DMPD) ile hidroksil (•OH) ve süperoksit (O2•-) radikalleri arasındaki
reaksiyon sonucunda oluşan katyonik yarı-kinon radikalleri (DMPDQ)
Nafyon membran üzerine tutturulmuştur. Membran üzerinde oluşan pembe
renk reaktif oksijen türlerinin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Nafyon üzerinde tutulan katyonik radikallerin oluşturduğu pembe renk
antioksidanlar varlığında azalır. Sensör üzerinde ölçülen absorbanstaki
azalma (ΔA) antioksidan konsantrasyonu ile orantılıdır.
Şekil 22. DMPD den oluşturulan katyonik DMPDQ yarıkinon türevleri
Kaynak: S. D. Çekiç, A. N. Avan, S. Uzunboy, R. Apak; Analytica
Chimica Acta 865 (2015) 60–70
Çalışmada hidroksil (•OH) ve süperoksit (O2•-) değişik kaynaklar kullanılarak
üretilmiştir; •OH hem Fenton sistemi ile hem de (UV+H2O2) kullanılarak elde edilirken
O2•-, ksantin/ksantin oksidaz reaksiyonuyla oluşturulmuştur.
Şekil 23. (a) Nafion membrane kesiti, (b) DMPDQ radikallerini sorplamış
olan Nafyon membran (Antioksidansız çözeltide Fenton sisteminden
eldilen hidroksil radikalleri varlığında), (c) 0.05 µmol kuersetin varlığında
ve (d) 0.10 µmol kuersetin varlığında çözeltide azalan hidroksil radikalleri
nafyon membran üzerinde oluşan renk şiddetinde azalmaya neden olur.
Örnek antioksidan olarak seçilen Epigallokateşin gallatın değişen miktarları ile
antioksidan varlığında ve yokluğunda nafyon membran üzerinde ölçülen absorbans
farkları arasındaki ilişki aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.
Şekil 24. (a) Fenton yöntemiyle üretilen •OH , (b) Ksantin/ksantin oksidazdan elde edilen O2•- (c) UV/H2O2
sisteminden üretilen •OH den kaynaklanan ve nafyon üzerinde ölçülen absorbansın antioksidan yokluğunda ve
varlığındaki absorbans farkları ile EGCG konsantrasyonu rasındaki ilişki
Teşekkür: 114Z089 no’lu proje ile verdikleri katkıdan ötürü TÜBİTAK ve İstanbul Üniversitesi
Gıda Antioksidanlari Ölçümü Uygulama ve Araştırma Merkezi (GAAM) Birimine teşekkür
ederiz.
Teşekkürler…
[email protected]
35