therascreen

Transkript

therascreen

Ağustos 2012
therascreen® BRAF RGQ PCR Kit
Kullanım Kılavuzu
24
Versiyon 1
in vitro diyagnostik kullanım için
Rotor-Gene® Q MDx 5plex HRM® ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazda
kullanım için
870211
QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House,
Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, UK
R1
1072802TR
Sample & Assay Technologies
QIAGEN Sample and Assay Technologies
QIAGEN, her türlü biyolojik örnek içeriğinin izolasyonunu ve deteksiyonununa
olanak tanıyan, yenilikçi örnek ve tahlil teknolojilerinde lider bir sağlayıcıdır.
Bizim gelişmiş, üstün kaliteli ürünlerimiz ve servislerimiz örnekten sonuca kadar
başarıyı garanti ederler.
QIAGEN şunlarda standartları belirler:

DNA, RNA ve proteinlerin purifikasyonu

Nükleik asit ve protein tahlilleri

microRNA araştırmaları ve RNAi

Örnek ve tahlil teknolojilerinin otomasyonu
Misyonumuz sizlerin önemli ve göze çarpan başarılar kazanmanıza olanak
sağlamak. Daha fazla bilgi için www.qiagen.com sitesini ziyaret ediniz.
İçindekiler
Kullanım Amacı
5
Özet ve Açıklama
5
İşlem Prensibi
6
Prosedür
Sağlanan Materyaller
Kit içeriği
Gereken ancak Sağlanmayan Materyaller
Uyarılar ve Önlemler
6
9
9
9
10
Güvenlik bilgisi
10
Genel önlemler
11
Ayıraç Depolama ve İşleme
12
Numunelerle Çalışma ve Depolama
12
Prosedür
13
DNA izolasyonu
13
Protokoller
 Numune değerlendirme
14
 BRAF mutasyon tespiti
20
 Rotor-Gene Q BRAF kurulumu
27
Sonuçların Açıklaması
33
Numune değerlendirme veri analizi
33
BRAF mutasyon tespiti veri analizi
34
Verilerin yorumlanması için notlar
41
Arıza giderme kılavuzu
45
Kalite Kontrol
46
Kısıtlamalar
46
Performans Karakteristikleri
47
Boş limiti (LOB), çalışma aralığı ve cutoff değerleri
47
Doğruluk: Analitik referans yöntemi ile karşılaştırma
47
∆CT değerleri üzerindeki girdi DNA etkisi
48
Çapraz-reaksiyon
49
Algılama limiti (LOD) değerleri
50
therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu 08/2012
3
Kit performansı üzerindeki melanin etkisi
50
Tekrarlanabilirlik
51
Çoğaltılabilirlik
51
Referanslar
52
Semboller
53
İletişim Bilgileri
53
Sipariş Bilgisi
54
4
Kullanım Amacı
therascreen BRAF RGQ PCR Kit BRAF geninde bulunan beş somatik
mutasyondun tespiti için bir in vitro diyagnostik testtir ve mutasyon durumunun
kalitatif bir değerlendirmesini sağlar. DNA, formalin-sabitlenmiş parafine
gömülü (FFPE) tümör dokusundan ekstrakte edilecek ve Rotor-Gene Q MDx
5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazda gerçek zamanlı polimeraz
zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak test edilecektir.
Tablo 1. Mutasyonlar ve COSMIC IDs listesi*
Mutasyon
Baz değişim
COSMIC ID
V600E
GTG>GAG
476
V600E complex
GTG>GA
475
V600D
GTG>GAT
473
V600K
GTG>AAG
474
V600R
GTG>AGG
477
* COSMIC ID’ler Catalog of Somatic Mutations in Cancer’ den alınmıştır
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic).
Özet ve Açıklama
therascreen BRAF RGQ PCR Kit, Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene
Q 5plex HRM cihazda gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak BRAF
geninde bulunan beş somatik mutasyonun tespiti için kullanıma hazır bir kittir.
ARMS® (Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi) ve Scorpions® teknolojilerini
kullanarak, therascreen BRAF RGQ PCR Kit BRAF onkojeninin 600 kodonundaki
aşağıdaki mutasyonların wild-type genomik DNA arka planına karşı tespit
edilmesini mümkün kılar.

V600E

V600Ec

V600D

V600K

V600R
Kullanılan yöntemler oldukça selektiftir ve toplam DNA varlığının miktarına
bağlı olarak wild-type genomik DNA arka planındaki düşük bir yüzdedeki
mutantın tespitine imkan tanır. Bu seçicilik ve algılama limitleri boya-terminatör
sekanslama gibi teknolojilerden üstündür.
5
İşlem Prensibi
therascreen BRAF RGQ PCR Kit gerçek zamanlı PCR’deki mutasyonların tespiti
için iki teknolojiyi kullanır — ARMS ve Scorpions.
ARMS
Alel –ya da mutasyon –spesifik amplifikasyon ARMS kullanılarak başarılır. Taq
DNA polimeraz (Taq) bir PCR primerinin 3' uzundaki uyumlu ve uyumsuz olanı
ayırt etmekte etkindir. Mutasyona uğramış spesifik sekanslar, sekansların
çoğunluğunun mutasyon taşımadığı numunelerde bile seçici olarak amplifiye
edilirler. Primer tamamen uyumlu olduğunda, amplifikasyon tam etkinlikte
gerçekleşir. 3' baz uyuşmadığında, yalnızca düşük seviyede geri planlı
amplifikasyon oluşur.
Scorpions
Amplifikasyonun tespiti Scorpions kullanılarak gerçekleştirilir. Scorpion’lar
kovalent olarak floresanlı olarak etiketlenmiş bir proba bağlı bir PCR primeri
içeren çift fonksiyonlu moleküllerdir. Bu prop içindeki florofor bir söndürücü ile
bağlantılıdır, ayrıca floresanı azaltan bir probun içine yerleşmiştir. PCR sırasında
prop amplikona bağlandığında, florofor ve söndürücü ayrılırlar. Bu reaksiyon
tüpündeki floresanda ölçülebilir bir artışa yol açar.
Kit formatı
therascreen BRAF RGQ PCR Kit içerisinde beş tahlil sağlanır.

Bir kontrol tahlili (Control Reaction Mix; CTRL)

Dört mutasyon tahlili (mutant reaksiyon karışımları; V600E/Ec, V600D,
V600K, V600R)
V600E/Ec tahlil hem V600E hem de V600Ec mutasyonlarını tespit eder ancak
bunlar arasında bir ayırım yapmaz.
Tüm reaksiyon karışımları dublekstir ve FAM™ olarak etiketlenmiş hedefleri ve
HEX™olarak etiketlenmiş bir dahili kontrolu tespit etmek için ayıraçlar içerir.
Dahili kontrol tahlili yanlış negatif sonuçlara yol açabilecek inhibitörlernin
varlığını kontrol eder.
Prosedür
therascreen BRAF RGQ PCR Kit iki aşamalı bir prosedür içerir. İlk aşamada,
kontrol tahlili numune içindeki amplifiye edilebilir toplam BRAF DNA
değerlendirmesi için gerçekleştirilir. İkinci aşamada, hem mutasyon hem da
kontrol tahlilleri mutant DNA’nın varlığı ya da yokluğunu belirlemek için yapılır.
6
Tahliller
Kontrol tahlili
FAM olarak etiketlenmiş kontrol tahlili bir numune içindeki amplifiye edilebilir
toplam BRAF DNA değerlendirmesi için kullanılır. Kontrol tahlili BRAF geninin
ekson 3 bölgesini amplifiye eder. Primerler ve Scorpion probu bilinen herhangi
bir BRAF polimorfizmini bağımsız olarak amplifiye etmek üzere tasarlanmıştır.
Mutasyon tahlilleri
Her bir mutasyon tahlili wild-type DNA ile spesifik bir mutant DNA arasındaki
ayırım için bir FAM-etiketli Scorpion ile bir ARMS primeri içerir.
Kontroller
Not: Deneysel çalışmaların tümü pozitif ve negatif kontroller içermelidirler.
Pozitif kontrol
Her bir çalışma 1-5 tüpleri içinde pozitif bir kontrol içermelidir. therascreen
BRAF RGQ PCR Kit pozitif kontrol reaksiyonunda şablon olarak kullanılmak
üzere BRAF Positive Control (PC) içerir. Pozitif kontrol sonuçları kitin beyan
edilen kabul kriterleri içine performans gösterdiğini garanti etmek üzere
değerlendirileceklerdir.
Negatif kontrol
Her bir çalışma 9-13 tüpleri içinde negatif bir kontrol (“no template control”)
bulundurmalıdır. therascreen BRAF RGQ PCR Kit şablon olmayan kontrol için
“template” olarak kullanılmak üzere Water for NTC (NTC) içerir. Şablon
olmayan kontrol çalışma sırasında herhangi bir potansiyel kontaminasyonu
değerlendirmek ve dahili kontrol reaksiyonunun performansını değerlendirmek
için kullanılır.
Dahili kontrol reaksiyon değerlendirmesi
Her bir reaksiyon karışımı hedef reaksiyona ilave olarak bir dahili kontrol içerir.
Bir başarısızlık ya yanlış bir sonuca neden olabilecek inhibitörlerin varlığını ya
da o tüp için bir operatör ayarı hatasının gerçekleşmiş olduğunu gösterir. Eğer
dahili kontrol başarısız olursa, “Numune analizi — Numune dahili kontrol
mutasyon tahlilleri HEX CT ” ne bakınız, sayfa 38.
Eğer dahili kontrol PCR inhibisyonu nedeniyle başarısız olursa, numunenin
seyreltilmesi inhibitörlerin etkisini azaltabilir ancak bunun aynı zamanda hedef
DNA’yı da seyrelteceği not edilmelidir. Kit içerisine bir tüp Water for Sample
Dilution (Dil) dahil edilmiştir.
Numune değerlendirme
Numune içindeki toplam amplifiye edilebilir BRAF DNA değerlendirmesi için
therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile birlikte verilen Control Reaction Mix (CTRL)
kullanılması şiddetle önerilir. Kontrol tahlili BRAF geninin ekzon 3’ünün bir
7
bölgesini amplifiye eder. Numunelerin yalnızca pozitif kontrol olarak BRAF
Positive Control (PC) ve şablon olmayan kontrol olarak Water for NTC (NTC)
kullanan kontrol tahlili ile hazırlanması önerilir.
Not: DNA değerlendirmesi PCR’ye bağlı olmalıdır ve absorban değerine
dayanan miktar belirlemesinden ayrılabilir. Değerlendirmenin kalitesini ve
therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile analiz öncesinde numune içindeki DNA
miktarını garanti etmek için ilave Control Reaction Mix (CTRL) sağlanır.
8
Sağlanan Materyaller
Kit içeriği
therascreen BRAF RGQ PCR Kit
(24)
Katalog no.
870211
Reaksiyon sayısı
Control Reaction Mix
24
Kırmızı
1 CTRL
2 x 720 µl
Mor
2 V600E/Ec
720 µl
V600D Reaction Mix
Portakal
3 V600D
720 µl
V600K Reaction Mix
Pembe
4 V600K
720 µl
V600R Reaction Mix
Yeşil
5 V600R
720 µl
BRAF Positive Control
Bej
PC
250 µl
Taq DNA Polymerase
Nane yeşili
Taq
138 µl
Water for NTC
Beyaz
NTC
1.9 ml
Water for Sample Dilution
Beyaz
Dil.
1.9 ml
V600E/Ec Reaction Mix
therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu (Türkçe)
1
Gereken ancak Sağlanmayan Materyaller
Kimyasallarla çalışırken her zaman uygun laboratuvar ceketi giyin, tek
kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlükler takın. Daha fazla bilgi için, ürün
tedarikçisinde mevcut uygun güvenlik veri sayfalarına (SDSs) bakınız.

QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, kat. no. 56404; ”DNA
izolasyonu” na bakınız, sayfa 13)

Xylene

Etanol (96–%100)*

1.5 ml ya da 2 ml mikro santrifüj tüpleri (liziz aşamaları için)

1.5 ml mikro santrifüj tüpleri (elüsyon aşamaları için) (Brinkmann [SafeLock, kat. no. 022363204], Eppendorf [Safe-Lock, kat. no. 0030 120.086]
ya da Sarstedt [Safety Cap, kat. no. 72.690] dan temin edilebilir)†
* Metanol ya da metiletilketon gibi diğer maddeleri içeren denatüre alkol kullanmayınız.
†
Bu tedarikçelerin tam bir listesi değildir.
9

Özel pipetler* (ayarlanabilir) numune preparasyonu için

Özel pipetler* (ayarlanabilir) PCR master karışım preparasyonu için

Özel pipetler* (ayarlanabilir) şablon DNA dağıtımı için

Filtreli steril pipet uçları (çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, aerosol
bariyerli pipet uçları öneririz)

Termomikser, ısıtıcılı orbital inkübatör, ısıtma bloğu ya 90°C’de inkübasyon
yapabilen su banyosu*

2 ml reaksiyon tüpleri için rotorlu tezgah üstü santrifüj*

Vortex*

Floresan kanallı Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex
HRM cihaz*, Cycling Green ve Cycling Yellow için (sırasıyla FAM ve HEX
tespiti için)

Rotor-Gene Q yazılım versiyonu 2.2.2.9 ya da üstü

0.1 ml Strip Tubes ve Caps, 72-hazneli rotor ile kullanım için
(QIAGEN, kat. no. 981103 ya da 981106)

Master karışımlar hazırlamak için steril mikrosantrifüj tüpler

Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes, tek kanallı bir pipet ile manüel reaksiyon
hazırlığı için alüminyum blok (QIAGEN, kat. no. 9018901)
Uyarılar ve Önlemler
In Vitro Diyagnostik Kullanım İçin
Güvenlik bilgisi
Kimyasallarla çalışırken her zaman uygun laboratuvar ceketi giyin, tek
kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlükler takın. QIAGEN bu ürün ile çalışırken
ya da dokunmaktan kaynaklanan zararların sorumluluğunu kabul etmez.
24-saat acil bilgi
İngilizce, Fransızca ve Almanca acil tıbbi bilgi günün 24 saatinde aşağıdaki
iletişim numarasından alınabilir:
Zehirlenme Bilgi Merkezi Mainz, Germany
Tel: +49-6131-19240
* Kullanmadan önce cihazların üreticinin önerileri doğrultusuna kontrol edilmiş ve kalibre
edilmiş olduğundan emin olun.
10
Genel önlemler
Kullanıcı her zaman aşağıdaki hususlara dikkat etmelidir.

Filtreli steril pipet uçları kullanın ve pipetlerin üreticinin talimatları
doğrultusunda kalibre edilmiş olduklarından emin olun.

Pozitif materyalleri (numuneler ve pozitif kontroller) tüm diğer ayıraçlardan
ayrı olarak depolayın ve ekstrakte edin ve bunları reaksiyon reaksiyon
karışımlarına özel olarak ayrılmış bir alanda ilave edin.

Bileşenlerin tümünü tahlile başlamadan önce oda sıcaklığında (15–25°C)
en 1 bir saat süreyle çözdürün.

Çözüldüklerinde, her bir tüpü 10 kez aşağı yukarı çevirerek ve kısaca
santrifüjleyerek bileşenleri karıştırın.
Not: PCR’lerin sentetik kontrol materyalleri ile kontaminasyonunu önlemek için
aşırı dikkat gösterin. Reaksiyon karışımlarının hazırlanması ve DNA şablonunun
ilave edilmesinde ayrı, özel pipetler kullanılmasını öneririz. Reaksiyon
karışımlarının hazırlanması ve dağıtılması ve şablon ilavesi ayrı bir alanda
gerçekleştirilmelidir. PCR çalışmasının tamamlanmasından sonra Rotor-Gene Q
tüpleri açılmamalıdır. Bu PCR sonrası ürünler ile laboratuvar kontaminasyonunu
önlemek içindir.
Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit ayıraçları optimal olarak seyreltilmişlerdir.
Ayıraçların daha fazla seyreltilmelerini önermeyiz zira bu performans kaybına
neden olabilir. 25 µl’den daha az volümde reaksiyon kullanımını önermeyiz
zira bu yanlış negatif riskini artıracaktır.
Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki ayıraçların tamamı optimal
performans için özel olarak formüle edilirler. therascreen BRAF RGQ PCR Kit
içinde sağlanan ayıraçların tümü yalnızca aynı therascreen BRAF RGQ PCR Kit
içindeki diğer ayıraçlar ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmışlardır. Eğer
optimal performans korunmak isteniyorsa kit içindeki ayıraçların yerine
başkaları kullanılmamalıdır.
Not: Yalnızca kit içinde sağlanan Taq DNA polimeraz (Taq) kullanın. Taq DNA
polimerazı aynı ya da diğer türdeki kitlerdekiler ile ya da diğer tedarikçilerden
sağlanan Taq DNA polimeraz ile değiştirmeyin.
Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki ayıraçların optimal kullanımını
sağlamak için, numuneler gruplandırılmalıdır. Eğer numuneler ayrı olarak tahlil
edilirlerse, bu daha fazla ayıraç tüketilmesine neden olacak ve therascreen
BRAF RGQ PCR Kit ile tahlil edilebilecek numene sayısını azaltacaktır.
Not: Doğru numune tahlili ve analizini sağlamak için, kullanıcının pipetlerken,
PCR şerit tüplerini 72-hazneli rotorun uygun pozisyonlarına yerleştirirken ve
numune adlarını girerken özel dikkat göstermesi gerekir.
11
Ayıraç Depolama ve İşleme
therascreen BRAF RGQ PCR Kit kuru buz üzerinde sevk edilir ve teslim
alındığında hala donmuş olmalıdır. Eğer therascreen BRAF RGQ PCR Kit teslim
alındığında donmamış ise, nakliye sırasında dış paketi açılmış ise ya da sevkiyat
bir paketleme notu, kullanım kılavuzu ya da ayıraçlar içermiyorsa, lütfen
QIAGEN Teknik Servis Departmanlarından birisi ile veya yerel distribütörler ile
iletişime geçiniz (arka kapağa bakın ya da www.qiagen.com sayfasını ziyaret
edin).
therascreen BRAF RGQ PCR Kit teslim alınmasının ardından derhal sabit ısılı bir
dondurucuda –15 ila –30°C arasında depolanmalı ve güneş ışığından
korunmalıdır. Belirtilen depolama koşulları altında orijinal paketi içinde
depolandığında, kit etiketi üzerine belirtilen son kullanım tarihine kadar
stabildir. Tekrarlanan dondurma ve çözme işleminden kaçınılmalıdır.
Maksimum 6 donma-çözme döngüsü aşılmamalıdır.
Not: Optimal aktivite ve performansı sağlamak için, Scorpionlar (tüm floresanlı
olarak etiketlenmiş moleküllerde olduğu gibi) foto beyazlamadan kaçınmak için
ışıktan korunmalıdırlar.
Numunelerle Çalışma ve Depolama
Not: Numunelerin tümü potansiyel olarak enfeksiyonlu materyaller olarak
muamele görmelidir.
Numune materyalleri formalin-sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokulardan
ekstrakte edilmiş insan genomik DNA’sı olmalıdır. Numunelerin kalitesini
korumak için numuneler standart patolojik yöntemlere göre nakledilmelidirler.
Tümör numuneleri homojen değillerdir ve bir tümör numunesinden alınan
veriler aynı tümörün diğer bölümlerinden alınanlar ile konkordant
olmayabilirler. Tümör numuneleri aynı zamanda tümör olmayan dokular da
içerebilirler. Tümör olmayan dokudan alınan DNA’nın therascreen BRAF RGQ
PCR Kit tarafından tespit edilen mutasyonları içermesi beklenmeyecektir.
12
Prosedür
DNA izolasyonu
DNA izolasyonu QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, kat. no. 56404)
kullanılarak gerçekleştirilmelidir.
Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit manuel ekstraksiyon tekniği ile QIAamp
DNA FFPE Tissue Kit kullanılarak geliştirilmiştir. Optimal performansı sağlamak
için, diğer ekstraksiyon ürünleri ve otomatik sistemler önerilmez.
DNA purifikasyonunu aşağıdaki değişikliklerle birlikte QIAamp DNA FFPE Tissue
Kullanım Kılavuzu’ndaki talimatlara göre gerçekleştirin.

FFPE bölümlerini cam slaytlar üzerinde toplayın.

Doku bölümlerinin etrafındaki fazla parafini yeni, steril bir bisturi
kullanarak kazıyın.

Doku bölümlerini ekstrakte edilecek her bir numune için yeni bir bisturi
kullanarak mikrosantrifüj içine sıyırın.

Arıtılmış genomik DNA 120–200 µl Buffer ATE içinde elüte edilmelidir.
(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit içinde sağlanmaktadır). Arıtılmış genomik
DNA’yı –15 ila –30°C arasında depolayın.
DNA değerlendirmesi therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile birlikte sağlanan
Control Reaction Mix (CTRL)’e dayanmalıdır ve absorban değerlerine dayanan
miktar belirlemesinden ayrılabilir. therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile analiz
öncesinde numuneler içindeki DNA’nın kalitesinin değerlendirilmesini ve miktar
belirlemesini sağlamak için ilave Control Reaction Mix (CTRL) sağlanır.
Not: Analiz için yeterli DNA sağlamak için, öncelikle minimum iki FFPE slaytın
birlikte ekstrakte edilmesi ve kontrol tahlili ile değerlendirilmesi önerilir. Eğer
PCR için yetersiz DNA elde edilirse, daha fazla slayt ekstrakte edilir ve DNA
Not: Analiz için yeterli DNA sağlamak için, FFPE bölümlerinin minimum 5 µm
kalınlıkta olması gerekir.
therascreen BRAF RGQ PCR Kit içindeki tüm tahliller kısa PCR ürünleri üretirler.
Ancak, therascreen BRAF RGQ PCR Kit fazla şekilde parçalanmış DNA ile
çalışmayacaktır.
13
Protokol: Numune değerlendirme
Bu protokol numuneler içindeki toplam amplifiye edilebilir DNA değerlendirmesi
için kullanılır.
Başlamadan önceki önemli hususlar

İşleme başlamadan önce “Genel önlemler” i okuyun, sayfa 11.

İşleme başlamadan önce Rotor-Gene Q hakkında bilgi sahibi olmak için
kendinize zaman ayırın. Cihazın kullanım kılavuzuna bakın.

Taq DNA polimeraz ya da Taq DNA polimeraz içeren her türlü karışımı
vortekslemeyin zira bu enzimi inaktive eder.

Taq DNA polimerazı, ucun fazla enzim ile kaplanmasından kaçınmak için
pipet ucunu sıvı yüzeyin tam altına dikkatlice yerleştirmek suretiyle pipetleyin.

Mevcut Control Reaction Mix (CTRL) kullanılarak 24 numune değerlendirilebilir.
Başlamadan önce yapılması gerekenler

Her bir kullanım öncesinde içeriği tüpün tabanında toplanmasını sağlamak
için, tüm ayıraçların oda sıcaklığında (15–25°C) minimum 1 saat süreyle
tamamen çözülmesi, 10 kez baş aşağı çevrilerek karıştırılması ve kısaca
santrifüjlenmesi gerekir.

Her bir kullanım öncesinde Taq DNA polimerazın (Taq) oda sıcaklığında
(15–25°C) olduğundan emin olun. Enzimi tüpün tabanına toplamak için
tüpü kısaca santrifüjleyin.
Prosedür
1. Control Reaction Mix (CTRL), Water for No Template Control (NTC)
ve Positive Control (PC)’yi oda sıcaklığında (15–25°C) minimum 1
saat süreyle tamamen çözdürün. Ayıraçlar çözüldüğünde, tuzların
lokal konsantrasyonlarından kaçınmak için her bir tüpü 10 kez baş
aşağı çevirmek suretiyle bunları karıştırın ve daha sonra içeriğin
tüpün tabanında toplanmasını sağlamak için kısaca santrifüjleyin.
14
2. Tablo 2’de verilen volümlere göre yeterli master karışımı (Control
Reaction Mix [CTRL] artı DNA numuneleri için Taq DNA polimeraz
[Taq]), bir pozitif kontrol reaksiyonu ve bir şablon olmayan kontrol
reaksiyonu hazırlayın. PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak
üzere 1 ekstra numune için ayıraç ilave edin.
Master karışım numune hariç PCR için gerekli tüm bileşenleri içerir.
Tablo 2. Kontrol tahlil master karışımının preparasyonu *
Bileşen
Volüm
Control Reaction Mix (CRL)
19.5 µl x (n+1)*
Taq DNA polymerase (Taq)
0.5 µl x (n+1)*
Toplam volüm
20.0 µl/reaksiyon
* n=reaksiyon sayısı (numuneler artı kontroller). PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak
üzere 1 ekstra numune (n+1) için ayıraç ilave edin. n değeri üzerinde olmamalıdır.
3. Aşağı ve yukarı 10 kez pipetlemek suretiyle master karışımı
tamamen karıştırın. Uygun sayıdaki şerit tüpü Şekil 1’deki yerleşim
düzenine göre yükleme bloğuna yerleştirin. Derhal 20 µl master
karışımı her bir PCR şerit tüpüne (sağlanmamıştır) ilave edin.
Kapaklar gerekinceye kadar plastik kaplar içinde kalmalıdır. Numune
değerlendirme için, kontrol tahlil master karışımı bir pozitif kontrol
haznesine, bir negatif kontrol haznesine ila ve edilmeli ve her bir numune
için bir hazne olmalıdır.
Tahlil
Control
1 (PC)
9
17
25
–
–
–
–
–
Control
2 (NTC)
10
18
26
–
–
–
–
–
Control
3
11
19
–
–
–
–
–
–
Control
4
12
20
–
–
–
–
–
–
Control
5
13
21
–
–
–
–
–
–
Control
6
14
22
–
–
–
–
–
–
Control
7
15
23
–
–
–
–
–
–
Control
8
16
24
–
–
–
–
–
–
Şekil 1.Yükleme bloğundaki numune değerlendirme tahlilleri yerleşim düzeni.
Sayılar yükleme bloğundaki pozisyonları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu gösterir.
15
4. Derhal 5 µl Water for No Template Control (NTC)’yi şablon olmayan
kontrol tüpüne (2 nolu PRC tüpü) ekleyin ve tüpün kapağını kapatın. Her
bir numuneden 5 µl’ü numune tüplerine (PCR tüp numaraları 3-36)
ekleyin ve tüplerin kapağını kapatın. 5 µl BRAF Positive Control (PC)’yi
pozitif kontrol tüpüne (PCR tüp no. 1) ekleyin ve tüpün kapağını kapatın.
Tüplerin Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM
cihazların içine yerleştirilme yönünü göstermek için tüp kapaklarını işaretleyin.
5. Tüm PCR tüpleri kapaklandıktan sonra, tüm tüplere numune ilave
edilmiş olduğundan emin olmak için numune tüp dolum seviyelerini
görsel olarak kontrol edin.
6. Numuneleri ve reaksiyon karışımlarını karıştırmak için tüm PCR
tüplerini evirtin (4 kez).
7. PCR şerit tüpleri 72-hazneli rotorun uygun pozisyonlarını yerleştirin
(Şekil 1). Eğer rotor tamamen dolu değilse, rotor üzerindeki tüm boş
pozisyonlar kapaklı, boş tüpler ile doldurulmalıdır.
8. Derhal 72-hazneli rotoru Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM veya RotorGene Q 5plex HRM cihaza yerleştirin. Çalışma sırasında tüpleri
güvenceye almak için kilitleme halkasının (Rotor-Gene Q cihaz
aksesuarı) rotorun üzerine yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
9. Uygun Rotor-Gene Q serisi yazılımını (2.2.2.9 ya da yüksek) ve
therascreen BRAF Assessment Run Template açın.
Şablonun nasıl indirileceği ve çalışma parametrelerinin kontrolü bilgileri için
“Protokol: Rotor-Gene Q BRAF “, sayfa 27’ye bakın.
10. Doğru rotorun seçilmiş olduğundan emin olun ve kilitleme halkasının
takılı olduğunu teyit için kutuyu işaretleyin. “Next” e tıklayın (Şekil 2).
1
2
3
Şekil 2. “New Run Wizard” iletişim kutusu.
16
11. Operatörün adını girin. Notları ekleyin ve reaksiyon volümünün 25
‘e ayarlanmış ve “Sample Layout” kutusunun “1, 2, 3...” olduğunu
kontrol edin. “Next” üzerine tıklayın (Şekil 3).
1
2
3
12. “Protokol: Rotor-Gene Q BRAF “, sayfa 27’deki talimatlara göre
çalışma parametrelerini kontrol edin. “Next” üzerine tıklayın (Şekil
4).
Döngü parametrelerini değiştirmeyin.
17
1
13. Özeti kontrol edin ve çalışma dosyasını kaydetmek ve çalışmayı
başlatmak için “Start Run” üzerine tıklayın (Şekil 5).
1
14. Çalışma başladıktan sonra yeni bir pencere görünür, buradan şimdi
yeni numune adlarını girebilir ya da “Finish” tıklayabilir daha sonra
18
bunları çalışma sırasında ya da çalışma tamamlandıktan sonra
“Sample” butonunu seçerek bunları girebilirsiniz.
“Finish and Lock Samples” tıklandığında numune adlarını değiştirmeniz
engellenir. Kullanıcının numune adlarını girerken doğru numune test ve
analizinin girilmesine özel dikkat göstermesi gerekir.
15. Çalışma tamamlandıktan sonra “BRAF ”ne göre verileri analiz edin,
sayfa 34.
16. Eğer miktar tayini raporları gerekiyorsa, Rotor-Gene Q çalışma
dosyasındaki araç çubuğunun “Reports” ikonuna tıklayın.
17. “Report browser” içinden “Report Categories” altındaki “Cycling A
Green (sayfa1)” üzerine tıklayın (Şekil 6).
1
Şekil 6. Report tarayıcısı.
18. “Templates” altından “Quantitation (Full Report) seçin (Şekil 7).
1
Şekil 7. Miktar tayini raporu (tam rapor).
19. Raporu oluşturmak için “Show” üzerine tıklayın.
20. Elektronik bir versiyonunu kaydetmek için “Save As” tıklayın.
21. “Cycling A Yellow (Page1)” için tekrarlayın.
19
Protokol: BRAF mutasyon tespiti
Bu protokol BRAF mutasyonlarının tespiti içindir. Bir numune numune
değerlendirmesini geçtiğinde, bu BRAF mutasyon tahlilleri kullanılarak test edilebilir.

İşleme başlamadan önce “Genel önlemler” i okuyun, sayfa 11.

İşleme başlamadan önce Rotor-Gene Q hakkında bilgi sahibi olmak için
kendinize zaman ayırın. Cihazın kullanım kılavuzuna bakın.

Taq DNA polimeraz ya da Taq DNA polimeraz içeren her türlü karışımı
vortekslemeyin zira bu enzimi inaktive eder.

therascreen BRAF RGQ PCR Kitin etkin kullanımı için, numuneler 6’dan
daha az olmamak üzere gruplar halinde gruplanmalıdır. Daha küçük grup
sayısı therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile daha az numunenin test
edilebileceği anlamına gelecektir

Taq DNA polimeraz ya da Taq DNA (Taq) polimeraz içeren her türlü
karışımı vortekslemeyin zira bu enzimi inaktive eder.

Her bir kullanım öncesinde içeriği tüpün tabanında toplanmasını sağlamak
için, tüm ayıraçların oda sıcaklığında (15–25°C) minimum 1 saat süreyle
tamamen çözülmesi, 10 kez baş aşağı çevrilerek karıştırılması ve kısaca
santrifüjlenmesi gerekir.

Her bir kullanım öncesinde Taq DNA polimerazın (Taq) oda sıcaklığında
(15–25°C) olduğundan emin olun. Enzimi tüpün tabanına toplamak için
tüpü kısaca santrifüjleyin
Prosedür
1. Reaksiyon karışımlarını, Water for No Template Control (NTC) ve
BRAF Positive Control (PC)’yi oda sıcaklığında (15–25°C) minimum 1
saat süreyle tamamen çözdürün. Ayıraçlar çözüldüğünde, tuzların
lokal konsantrasyonlarından kaçınmak için her bir tüpü 10 kez baş
aşağı çevirmek suretiyle bunları karıştırın ve daha sonra içeriğin
tüpün tabanında toplanmasını sağlamak için kısaca santrifüjleyin.
20
2. Tablo 3’de verilen volümlere göre yeterli master karışımı (reaksiyon
karışımı artı DNA numuneleri için Taq DNA polimeraz [Taq]), bir
pozitif kontrol reaksiyonu ve bir şablon olmayan kontrol reaksiyonu
hazırlayın. PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak üzere 1 ekstra
numune için ayıraç ilave edin.
Master karışım numune hariç PCR için gerekli tüm bileşenleri içerir
Tablo 3. Tahlil master karışımının preparasyonu*
Tahlil
Reaksiyon karışımı
volümü
Taq DNA polimeraz
(Taq) Volümü
Control
19.5 µl x (n+1)
0.5 µl x (n+1)
V600E/Ec
19.5 µl x (n+1)
0.5 µl x (n+1)
V600D
19.5 µl x (n+1)
0.5 µl x (n1)
V600K
19.5 µl x (+1)
0.5 µl x (n+1)
V600R
19.5 µl x (n+1)
05 µl x (n+1)
* n=reaksiyon sayısı (numuneler artı kontroller). PCR hazırlığı için yeterli fazlalık sağlamak
üzere 1 ekstra numune (n+1) için ayıraç ilave edin. n değeri üzerinde olmamalıdır.
21
3. Aşağı ve yukarı 10 kez pipetlemek suretiyle master karışımı
tamamen karıştırın. Uygun sayıdaki şerit tüpü Şekil 8’deki yerleşim
düzenine göre yükleme bloğuna yerleştirin. Derhal 20 µl master
karışımı her bir PCR şerit tüpüne (sağlanmamıştır) ilave edin.
Kapaklar gerekinceye kadar plastik kaplar içinde kalmalıdır.
Kontroller
Numune sayısı
Assay
PC
NTC
1
2
3
4
5
6
7
Control
1
9
17
25
33
41
49
57
65
V600E/Ec
2
10
18
26
34
42
50
58
66
V600D
3
11
19
27
35
43
51
59
67
V600K
4
12
20
28
36
44
52
60
68
V600R
5
13
21
29
37
45
53
61
69
–
6
14
22
30
38
46
54
62
70
–
7
15
23
31
39
47
55
63
71
–
8
16
24
32
40
48
56
64
72
Şekil 8. Yükleme bloğundaki numune değerlendirme tahlilleri yerleşim düzeni.
Sayılar yükleme bloğundaki pozisyonları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu gösterir.
4. Derhal 5 µl Water for No Template Control (NTC)’yi şablon olmayan
kontrol PCR şerit tüplerine (PCR tüp numaraları 9-13) ekleyin ve tüplerin
kapağını kapatın. Her bur numuneden 5 µl’ü numune tüplerine (PCR
tüp numaraları 17–21, 25–29, 33–37, 41–45, 49–53, 57–61 ve 65–69)
ekleyin ve tüplerin kapaklarını kapatın. 5 µl BRAF Positive Control
(PC)’yi pozitif kontrol tüplerine (PCR tüp numaraları 1-5) ekleyin ve
tüplerin kapağını kapatın. Her bir DNA numunesi hem kontrol hem de
tüm mutasyon tahlilleri ile test edilmelidir.
Tüplerin Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM
cihazların içine yerleştirilme yönünü göstermek için tüp kapaklarını işaretleyin.
5. Tüm PCR tüpleri kapaklandıktan sonra, tüm tüplere numune ilave
edilmiş olduğundan emin olmak için numune tüp dolum seviyelerini
görsel olarak kontrol edin.
6. Numuneleri ve reaksiyon karışımlarını karıştırmak için tüm PCR
tüplerini evirtin (4 kez).
7. PCR şerit tüpleri 72-hazneli rotorun uygun pozisyonlarını yerleştirin
(Şekil 8).
Her bir PCR çalışmasına en fazla 7 numune dahil edilebilir. Eğer rotor
tamamen dolu değilse, rotor üzerindeki tüm boş pozisyonlar kapaklı, boş
tüpler ile doldurulmalıdır.
22
8. Derhal 72-hazneli rotoru Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM veya RotorGene Q 5plex HRM cihaza yerleştirin. Çalışma sırasında tüpleri
güvenceye almak için kilitleme halkasının (Rotor-Gene Q cihaz
aksesuarı) rotorun üzerine yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
9. Uygun Rotor-Gene Q serisi yazılımını (2.2.2.9 ya da yüksek) ve
therascreen BRAF Assessment Run Template açın.
Şablonun nasıl indirileceği ve çalışma parametrelerinin kontrolü bilgileri için
“Protokol: Rotor-Gene Q BRAF “, sayfa 27’ye bakın.
10. Doğru rotorun seçilmiş olduğundan emin olun ve kilitleme halkasının
takılı olduğunu teyit için kutuyu işaretleyin. “Next” e tıklayın (Şekil 9)
1
2
3
23
1
2
3
12. “Protokol: Rotor-Gene Q BRAF “, sayfa 27’deki talimatlara göre
çalışma parametrelerini kontrol edin. “Next” üzerine tıklayın (Şekil
11).
24
1
13. Özeti kontrol edin ve çalışma dosyasını kaydetmek ve çalışmayı
başlatmak için “Start Run” üzerine tıklayın (Şekil 12).
1
yeni numune adı daha sonra bunları çalışma sırasında ya da çalışma
tamamlandıktan sonra “Sample” butonunu seçerek bunları
girebilirsiniz.
25
“Finish and Lock Samples” tıklandığında numune adlarını değiştirmeniz
engellenir. Kullanıcının numune adlarını girerken doğru numune test ve
analizinin girilmesine özel dikkat göstermesi gerekir.
15. Çalışma tamamlandıktan sonra “BRAF mutasyon tespiti veri analizi”
ne göre verileri analiz edin, sayfa 34.
16. Eğer miktar tayini raporları gerekiyorsa, Rotor-Gene Q çalışma
dosyasındaki araç çubuğunun “Reports” ikonuna tıklayın.
17. “Report browser” içinden “Report Categories” altındaki “Cycling A
Green (sayfa1)” üzerine tıklayın (Şekil 13).
1
Şekil 13. Rapor tarayıcısı.
18. “Templates” altından “Quantitation (Full Report)” seçin (Şekil 14).
1
Şekil 14. Miktar tayini raporu (tam rapor).
19. Raporu oluşturmak için “Show” üzerine tıklayın.
20. Elektronik bir versiyonunu kaydetmek için “Save As” tıklayın.
21. “Cycling A Yellow (Page1)” için tekrarlayın.
26
Protokol: Rotor-Gene Q BRAF kurulumu
Bu protokol “Protokol: Numune değerlendirme” (sayfa 14), ve “Protokol: BRAF
mutasyon tespiti” (sayfa 20) içinde refere edildi. İlgili şalonun sıcaklık profili
kullanım öncesinde aşağıdaki prosedüre göre kontrol edilmelidir.

therascreen BRAF Assessment Run Template (Şekil 15) ve therascreen BRAF
Mutation Analysis Template (Şekil 16) her zaman kullanılmalıdır.
Şekil 15. therascreen BRAF Assessment
Run Template ikonu.
Şekil 16. therascreen BRAF Mutation
Analysis Template ikonu.

therascreen BRAF Assessment Run Template ve therascreen BRAF Mutation
Analysis Template www.qiagen.com/BRAFtemplate sayfasından indirilebilir.
Dosya “therascreenBRAFtemplate” şifresi ile korunmaktadır. Şablon
dosyalarını Rotor-Gene Q serisi yazılım kurulum klasörü içindeki
“Templates” klasörünün bir alt dosyasına kopyalayın.
Prosedür
1. Aşağıdaki aşamamalara göre uygun şablonu kontrol edin.
Kilitleme halkasının takılı olduğunun teyidi
Şekil 17
Operatör adının ve reaksiyon karışımının girilmesi
Şekil 18
Genel tahlil parametrelerinin kontrolü
Çalışmayı başlatma
Şekiller 19–22
Şekil 23
27
Özetlemek için, döngü parametreleri aşağıdaki gibidir.
Tablo 4. Döngü parametreleri
Döngü
1
40
Sıcaklık
Süre
Veri kazanımı
95°C
15 dakika
Yok
95°C
30 saniye
Yok
60°C
60 saniye
Yeşil ve sarı
Özelliklerin tümü Rotor-Gene Q yazılım versiyonu 2.2.2.9’a işaret ederler.
Resimlerde, bu ayarlar kalın siyah içinde çerçevelenmişlerdir.
2. Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM
cihaza bağlı laptop masa üstündeki Rotor-Gene Q Series Software
2.2.2.9 yazılım ikonu üzerine çift tıklayın.
3. Rotor tipi olarak 72-Well Rotor seçin. Kilitleme halkasının takılı
olduğunu teyit edin ve Locking Ring Attached” kutusunu seçin.
“Next” üzerine tıklayın (Şekil 17).
1
2
3
Şekil 17. “New Run Wizard” iletişim kutusu
28
1
2
3
4
5
Şekil 18. Operatör adının ve reaksiyon volümlerinin girilmesi.
5. “New Run Wizard” iletişim kutusu içinden “Edit Profile” butonuna
tıklayın (Şekil 19) ve aşağıdaki aşamalara göre çalışma
parametrelerini kontrol edin.
29
1
Şekil 19. Profilin kontrol edilmesi.
6. Hold parametrelerinin doğru olup olmadığını kontrol edin (Şekil 20).
1
2
Şekil 20. Hold parametrelerinin kontrolü.
30
7. Döngü parametrelerinin doğru olup olmadığını kontrol edin (Şekil
21) ve “OK” üzerine tıklayın.
1
2
3
4
Şekil 21. Döngü parametrelerinin kontrolü.
8.
“Next” tıklayın. Summary kontrol edin (Şekil 22).
1
Şekil 22. Summary kontrolü.
31
9. Çalışma dosyasını kaydetmek ve çalışmaya başlatmak için “Start
Run” üzerine tıklayın (Şekil 23).
1
Şekil 23. Çalışmayı başlatma.
yeni numune adlarını girebilir ya da “Finish” tıklayabilir daha sonra
bunları çalışma sırasında ya da çalışma tamamlandıktan sonra
“Sample” butonunu seçerek bunları girebilirsiniz.
Çalışma tamamlandıktan sonra, mutasyon analizi protokolüne göre verileri
analiz edin (“BRAF ”ne bakınız, sayfa 34).
32
Sonuçların Açıklaması
Numune değerlendirme veri analizi
Çalışma tamamlandıktan sonra, aşağıdaki prosedüre göre veriyi analiz edin.
Yazılım analizi ayarları
1.
Rotor-Gene Q serisi yazılımı (2.2.2.9 ya da üstü) kullanarak uygun
dosyayı açın.
2. “Analysis” üzerine tıklayın. Analysis sayfası üzerinde HEX kanalına
görüntülemek için “Cycling A. Yellow” tıklayın.
3. “dynamic tube”ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin.
4. “Linear scale” seçilmiş olduğunu kontrol edin.
5. Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin.
6. “elimination of cycles”ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin.
7. HEX CT değerlerini kontrol edin.
8. Analysis sayfasından FAM kanalını görüntülemek için, “Cycling A.
Green” üzerine tıklayın.
9. “dynamic tube”ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin.
10. “Linear scale” seçilmiş olduğunu kontrol edin.
11. Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin.
12. “elimination of cycles”ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin
13. FAM CT değerlerini kontrol edin.
Çalışma tamamlandıktan sonra, aşağıdaki şekilde veriyi analiz edin.

Negatif kontrol: Şablon kontaminasyonunun olmadığından emin olmak
için, şablon olmayan kontrolün yeşil (FAM) kanalı içinde 40 altında bir CT
değeri oluşturması gerekir. Plakanın doğru şekilde hazırlanmış olmasını
sağlamak için, şablon olmayan kontrolün sarı (HEX) kanalında
32.53–38.16 aralığında amplifikasyon göstermesi gerekir. Belirlenen
değerler bu değerler içerisindedir ve bu değerleri içerirler.

Pozitif kontrol: BRAF Positive Control (PC) 27.82–33.85 aralığında bir
kontrol tahlili CT (FAM kanalı) vermelidir. Belirlenen değerler bu değerlerin
içindedirler ve onları da içerirler. Bu aralığın dışındaki bir değer bir
kurulum problemi dolayısıyla bir çalışma başarısızlığını gösterir.
Bu iki çalışma kontrolünden birisinin geçersiz olması durumunda numune verisi
kullanılmamalıdır.
Her iki çalışma kontrolünün de geçerli olması durumunda, her bir numune CT
değeri yeşil kanal içinde 20.95–33.00 aralığı içinde olmalıdır. Eğer numune bu
aralığın dışında ise, aşağıdaki rehber verilmektedir.
33

Numune kontrol tahlil CT <20.95: CT <20.95 değerindeki bir kontrole
sahip numune seyreltilmelidir zira bu onaylanmış tahlil aralığının düşük
ucunu temsil eder. Düşük bir seviyede her bir mutasyonu tespit etmek için,
aşırı konsantre numuneler, yarı yarıya seyreltinin CT’yi 1 derece artıracağı
temeline dayalı olarak yukarıdaki değer aralığı içine düşürmek için
seyreltilmelidir. Eğer numune 20.95’e yakın ise, numune testi (BRAF
mutasyon tespiti) çalışmasından bir sonuç elde etmek için seyrelti önerilir.
Numuneler kit içinde sağlanan su kullanılarak (Water for Dilution [Dil.])
seyreltilmelidir.

Numune kontrol tahlil CT >33.00: Numunenin yeniden ekstrakte
edilmesi önerilir zira tahlil için belirtilen cutoff değerlerinde tüm
mutasyonları tespit için yetersiz başlama DNA şablonu bulunacaktır.
BRAF mutasyon tespiti veri analizi
Çalışma tamamlandıktan sonra, aşağıdaki prosedüre göre veriyi analiz edin.
Yazılım analizi ayarları
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Rotor-Gene Q serisi yazılımı (2.2.2.9 ya da üstü) kullanarak uygun
dosyayı açın.
“Analysis” üzerine tıklayın. Analysis sayfası üzerinde HEX kanalına
görüntülemek için “Cycling A. Yellow” tıklayın.
“dynamic tube”ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin.
“Linear scale” seçilmiş olduğunu kontrol edin.
Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin.
“elimination of cycles”ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin.
HEX CT değerlerini kontrol edin.
Analysis sayfasından FAM kanalını görüntülemek için, “Cycling A.
Green” üzerine tıklayın.
“dynamic tube”ün belirlenmiş olduğunu kontrol edin.
“Linear scale” seçilmiş olduğunu kontrol edin.
Eşiğin 0.05 olarak ayarlanmış olduğunu kontrol edin.
“elimination of cycles”ın15 olarak ayarlandığını kontrol edin.
FAM CT değerlerini kontrol edin.
Çalışma kontrol analizi
Şekil 24’deki çalışma kontrol analizi akış tablosuna başvurun.
34
Şekil 24. Çalışma kontrol analizi akış grafiği. Çalışma kontrol analizi ile ilgili talimatlar
için, sayfa 34–36.’ya bakın.

Negatif kontrol: Reaksiyon karışımı kontaminasyonunun olmadığından
emin olmak için, şablon olmayan kontrolün yeşil kanal içinde 40 altında
bir CT değeri oluşturması gerekir. Plakanın doğru şekilde hazırlanmış
olmasını sağlamak için, şablon olmayan kontrolün sarı kanalında
32.53–38.16 aralığında amplifikasyon göstermesi gerekir. Belirlenen
değerler bu değerler içerisindedir ve bu değerleri içerirler.

Pozitif kontrol: BRAF Positive Control (PC) Her bir BRAF tahlili için yeşil
kanalda Tablo 5’de gösterildiği şekilde bir CT değeri vermelidir. Belirlenen
35
değerler bu değerlerin içindedirler ve onları da içerirler. Bu aralığın
dışındaki bir değer bir kurulum problemi dolayısıyla bir çalışma
başarısızlığını gösterir
Not: Bu iki çalışma kontrolünden birisinin geçersiz olması durumunda numune
verisi kullanılmamalıdır
Tablo 5. Reaksiyon kontrolleri için kabul edilebilir CT aralığı.
Reaksiyon
karışımı
Numune
Kanal
Control
PC
FAM
27.82–33.85
V600E/Ec
PC
FAM
27.49–33.51
V600D
PC
FAM
27.45–33.47
V600K
PC
FAM
27.28–33.28
V600R
PC
FAM
27.38–33.38
CT aralığı
Numune analizi — Numune kontrolü FAM CT değeri
Her iki çalışma kontrolünün de geçerli olması durumunda, her bir numune CT
değeri yeşil kanal içinde 20.95–33.00 aralığı içinde olmalıdır. Şekil 25’deki
numune analizi akış grafiğine bakınız.
Eğer numune bu aralığın dışında ise, aşağıdaki rehber verilmektedir

Numune kontrol tahlili CT <20.95: CT <20.95 mutasyon tahlilini aşırı
yükleyecektir ve seyreltilmelidir. Düşük bir seviyede her bir mutasyonu tespit
etmek için, aşırı konsantre numuneler, yarı yarıya seyreltinin CT’yi 1 derece
artıracağı temeline dayalı olarak yukarıdaki değer aralığı içine düşürmek
için seyreltilmelidir. Numuneler kit içinde sağlanan su kullanılarak (Water
for Dilution [Dil.]) seyreltilmelidir.

Numune kontrol tahlili CT >33.00: Çok düşük seviyedeki mutasyonlar
tespit edilemeyebileceğinden açıklama dikkatle yapılmalıdır.
36
Şekil 25. Numune analizi akış grafiği. Daha fazla bilgi için, sayfalar 36–40’a bakınız.
37
Numune analizi — Numune dahili kontrol mutasyon tahlilleri HEX CT
değeri
Şekil 25’deki numune analizine bakınız. Her bir numunenin tüm hazneleri
analiz edilmelidir. Her bir haznenin dahili kontrolden bir HEX sinyali üretmekte
olduğunu kontrol edin. Olası 3 sonuç vardır.

Eğer dahili kontrol CT belirlenen değer aralığı içine (32.53–38.16) düşerse,
HEX amplifikasyonu pozitiftir.

Eğer dahili kontrol CT belirlenen değer aralığı üzerinde ise (>38.16), HEX
amplifikasyonu negatiftir.

Eğer dahili kontrol CT belirlenen aralığın altında ise (>32.53), bu geçersizdir.
Eğer dahili kontrol PCR inhibisyonu nedeniyle başarısız olursa, numunenin
seyreltilmesi inhibitörlerin etkisini azaltabilir ancak bunun aynı zamanda hedef
DNA’yı da seyrelteceği not edilmelidir. Kit içerisine bir tüp Water for Sample
Dilution (Dil) dahil edilmiştir.
Numune analizi — Numune mutasyon tahlilleri FAM CT değeri
4 reaksiyon karışımının tümü için FAM değerleri Tablo 6’daki değerlere karşı
kontrol edilmelidir.
Tablo 6. Kabul edilebilir numune mutasyon reaksiyon değerleri (FAM)*
Kabul edilebilir CT aralığı
∆CT aralığı
V600E/Ec
15.00–40.00
≤7.0
V600D
15.00–40.00
≤6.9
V600K
15.00–40.00
≤6.0
V600R
15.00–40.00
≤7.0
Tahlil
* Kabul edilebilir değerler gösterilen değerler içindedirler ve onları içermektedir.

Eğer FAM CT değerleri belirlenen aralık içine düşürse, bu FAM
amplifikasyonu pozitiftir.

Eğer FAM CT değeri belirlenen aralığın üzerinde ise ya da amplifikasyon
yoksa bu FAM amplifikasyonu negatiftir.
FAM amplifikasyonu pozitif olan her bir mutasyon tüpü için aşağıdaki şekilde
∆CT değerini hesaplayın; mutasyon ve kontrol CT değerlerinin aynı numuneden
olduğundan emin olun.
∆CT = mutation CT – control CT
38
Söz konusu tahlil için (Tablo 6) numune ∆CT değerini cutoff noktası ile
karşılaştırın, her bir tahlili doğru cutoff noktası uygulandığından emin olun.
Cutoff noktası, üzerinde wild-type DNA’daki ARMS primerinin arka plan sinyali
nedeniyle potansiyel olarak pozitif bir sinyalin olabileceği bir noktadır. Eğer
numune ∆CT değeri cutoff noktasından büyük ise, bu negatif olarak ya da kit
algılama limiti üzerinde olarak sınıflandırılır.
Her bir numune için, her mutasyon reaksiyonu, aşağıdaki kriterleri kullanarak
mutasyon tespit edildi, mutasyon tespit edilmedi ya da geçersiz durumunu
verecektir.

Mutasyon tespit edildi:
FAM amplifikasyonu pozitif ve ∆CT değerleri cutoff değerinde ya da altında.
Eğer çoklu mutasyonlar tespit edilmiş ise, mutasyon durumları Tablo ‘ye
göre belirlenmelidir.
Tablo 7. Numune mutasyon durumlarının çağrılması

V600E/Ec
V600D
V600K
V600R
Mutasyon durumları
Pozitif
Negatif
Negatif
Negatif
V600E veya V600Ec pozitif
Pozitif
Negatif
Pozitif
Negatif
V600Ec veya V600K pozitif
Pozitif
Pozitif
Negatif
Negatif
V600D pozitif
Negatif
Pozitif
Negatif
Negatif
V600D Pozitif
Negatif
Negatif
Pozitif
Negatif
V600K Pozitif
Negatif
Negatif
Negatif
Pozitif
V600R Pozitif
Mutasyon tespit edildi:
FAM amplifikasyonu pozitif ve ∆CT değerleri cutoff değerinin üzerinde.
FAM amplifikasyonu negatif ve HEX (dahili kontrol) amplifikasyonu pozitif.

Geçersiz:
HEX (dahili kontrol) geçersiz.
FAM amplifikasyonu negatif ve HEX amplifikasyonu negatif.
Daha fazla açıklama için, akış grafiğine bakın (Şekil 25). Eğer bir numune HEX
amplifikasyonu bir tüp içerisinde negatif ancak FAM amplifikasyonu farklı bir
tüp içinde pozitif ise, bu durumda farklı tüp içerisinde bir “mutasyon detected”
sonucu hala geçerli olarak kabul edilebilir ancak tanımlanan belirli mutasyon
güvenilir şekilde atanmayabilir.
39
Eğer bir numune aynı tüp içinde HEX amplifikasyon negatif ve FAM
amplifikasyon pozitif ise, o zaman “mutation detected” sonucu geçerli olarak
kabul edilmelidir.
Eğer bir tüp HEX (dahili kontrol) geçerli ise, bu tüpün sonucu kullanılmamalıdır.
Numune analizi — Numune mutasyon durumları
Tüm mutasyon reaksiyon tüpleri değerlendirildiklerinde, numunenin mutasyon
durumları aşağıdaki şekilde belirlenir.

Mutasyon tespit edildi: Dört mutasyon reaksiyonunun birisi ya da daha
fazlası pozitiftir. Eğer çoklu mutasyonlar tespit edilirse, mutasyon Tablo
7’ye göre rapor edilir.

Mutasyon tespit edilmedi: Mutasyon reaksiyonlarının tümü negatiftir.

Geçerli: Pozitif mutasyon reaksiyonu yoktur ve bir ya da daha fazla
mutasyon reaksiyonu geçersizdir.
Not: therascreen BRAF RGQ PCR Kit bir DNA numunesi içindeki BRAF geni
mutasyonlarını tespit için tasarlanmıştır. Bir numune BRAF mutasyon tespit edildi
olarak adlandırıldığında, yalnızca bir spesifik mutasyon rapor edilmelidir. Eğer
çoklu mutasyonlar tespit edilirse, rapor edilen mutasyon Tablo 7’ye uygun
olmalıdır.
Mutasyon reaksiyonları arasında bazı çapraz reaksiyonlar oluşur. Örneğin, eğer
bir V600D mutasyonu varsa V600E/Ec tahlili pozitif bir sonuç verebilir, eğer bir
V600K mutasyonu mevcutsa V600E/Ec tahlili bir pozitif sonuç verebilir ve eğer
bir V600E kompleks mutasyonu mevcutsa V600K tahlili bir pozitif sonuç
verebilir. Bununla birlikte, Tablo 7 kullanılarak mutasyon durumları ayırt
edilebilir.
Çapraz reaksiyon birbirine benzer diğer mutasyonları tespit eden ARMS
primerleri nedeniyle oluşur. Eğer ikinci bir mutasyon tahlili pozitif bir sonuç
verirse, bunun çapraz reaksiyon olması olasıdır. Çok nadir olmalarına rağmen
çift mutantlar gözlemlenmiştir.
O nedenle, nadir vakalarda, pozitif sonuçların konbinasyonları tespit
edilmeyebilirler ki bunlar Tablo 7’de verilmemişlerdir. Numune hala BRAF
mutasyonu tespit edildi olarak adlandırılabilir. Ancak, çapraz reaksiyon
nedeniyle, belirli bir mutasyon ayırt dilemez. O nedenle, numune yalnızca BRAF
mutasyon tespit edildi olarak adlandırılır.
Eğer bir ya da daha fazla mutasyon reaksiyonu geçersiz ancak bir ya da daha
fazlası pozitif ise, numune hala BRAF mutasyon tespit edildi olarak
adlandırılabilir zira bir mutasyon vardır. Ancak, rapor edilen spesifik mutasyon
doğru olmayabilir ve çapraz reaksiyon sonucu olabilir. O nedenle, numune
yalnızca BRAF mutasyon tespit edildi olarak adlandırılmalıdır.
40
Verilerin yorumlanması için notlar
Lineer amplifikasyon
Tüm reaksiyonların Rotor-Gene Q grafikleri kontrol edilmelidir. Zaman zaman,
NTC, negatif numuneler ve boş tüplerin içerisindeki floresan sinyalinde bir artış
görülür. Eğer durum bu ise ve bir CT değeri elde edilmiş ise, kullanıcının NTC
içerisinde kontaminasyonu gösterecek olan doğru bir amplifikasyon olayı ile bir
floresan artifaktı nedeniyle yükselebilecek floresanda lineer bir artışı ayrıt
edebilmesi gerekir. Boş tüpler içindeki lineer amplifikasyon bir floresan artifaktı
yüzündendir. Boş tüplerin CT değeri o nedenle dikkate alınmamalıdır.
NTC analizi
Şekiller 26 ve 27 NTC numunelerinin iki davranışlarının iki örneğini gösterirler.
Şekil 26’da, numune kontaminasyonu nedeniyle lineer olmayan (doğru)
amplifikasyon görülür. Bu çalışma dikkate alınmamalı ve numuneler yeniden
test edilmelidir. Şekil 27’de, NTC içinde lineer bir amplifikasyon görülür. Bu
koşullar altında, ham floresan incelenmelidir. İlgili ham floresan grafiği şekil
28’de görülmektedir ve gerçek bir amplifikasyon vakasından ziyade floresanda
lineer bir artışı göstermektedir. Bu çalışmanın verileri ancak pozitif ve dahili
kontrollerin geçmesi durumunda kullanılabilir. Şekil 28 ile karşılaştırma için,
Şekil 29 doğru amplifikasyonun yer aldığı ham floresan verisini gösterir. bu
koşullar altında, veriler dikkate alınmamalı ve numuneler yeniden test
edilmelidirler zira bu kontaminasyonun varlığını gösterir.
Şekil 26. Analiz edilen bir çalışmada NTC içindeki kontaminasyon. Ok bir NTC tüpü
içindeki kontaminasyonu gösteren omplifikasyonu göstermektedir.
41
Şekil 27. Bir NTC tüpündeki floresanda lineer bir artış örneği. Ok bir NTC tüpü içinde
floresandaki lineer bir artışı göstermektedir.
Şekil 28. Şekil 27’nin ham floresanı. Ok bir NTC haznesindeki lineer amplifikasyonu
göstermektedir.
42
Şekil 29. Doğru bir amplifikasyon vakası bulunan bir NTC tüpünü gösteren ham
floresan verisi. Ok bir NTC haznesindeki kontaminasyonu göstermektedir. Tüm diğer
hazneler kontaminant bulunmadığını göstermektedir.
Numunelerin analizi
Şekiller 30 ve 31 bir numune reaksiyonundaki iki amplifikasyon örneğini
göstermektedir. Analiz edilen bir çalışmada bir numune tüpü içindeki gerçek bir
amplifikasyon örneği Şekil 30’da görülmektedir. Eğer bir çalışma bu tür sigmamsı
amplifikasyon eğrisi gösteriyorsa, bu gerçek bir amplifikasyondur ve bu çalışmanın
verileri ancak pozitif ve dahili kontrollerin geçmesi durumunda kullanılabilir.
Şekil 30. Analiz edilen bir çalışmada bir numune tüpündeki gerçek amplifikasyon. Ok
gerçek amplifikasyonu gösteren grafiği göstermektedir.
43
Bir numune reaksiyonundaki lineer bir amplifikasyon örneği Şekil 31’de
görülmektedir. Bu koşullar altında, ham floresan verisi incelenmelidir. İlgili ham
floresan grafiği (Şekil 32), Şekil 31’de gözlemlenen lineer artışın ham
floresanda lineer bir artışa karşılık geldiğini ve bunun gerçek bir amplifikasyon
olmadığını gösterir. Eğer dahili ve kontroller kontrolü geçmişlerse, bu
çalışmanın numune sonuçları dikkatli bir şekilde kullanılabilir ve bu gibi lineer
amplifikasyon “no CT” olarak adlandırılır.
Şekil 31. Bir tüp içindeki floresandaki lineer bir artış örneği. Üstteki ok gerçek
amplifikasyona işaret eden bir grafiği göstermektedir. Alttaki ok bir numune haznesindeki
floresandaki bir artışı gösterir.
Şekil 32. Şekil 31’in ham floresanı.
44
Arıza giderme kılavuzu
Bu arıza giderme kılavuzu doğabilecek her türlü sorunların çözülmesinde
yardımcı olabilirler. Daha fazla bilgi için, bizim Teknik Destek Merkezindeki
Sıkça Sorulan Sorulara da bakın: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx.
QIAGEN Teknik Servisindeki bilim adamları bu kitaptaki ya da örnek ve analiz
teknolojileri hakkındaki sormak istediğiniz her tülü soruları cevaplamaktan her
zaman mutluluk duyacaklardır (iletişim bilgileri için, arka kapağa bakın ya da
www.qiagen.com sayfasını ziyaret edin).
Açıklamalar ve öneriler
NTC yada negatif numunelerde floresan sinyalinde artış
Floresan artifaktı ya da
kontaminasyon
Floresan artifaktı nedeniyle
yükselebilecek olan floresandaki
lineer bir artış ile NTC içinde
kontaminasyonu gösterecek olan
gerçek bir amplifikasyon vakasını
ayırt etmek için e “Verilerin
yorumlanması için notlar”, sayfa 41’e
bakın.
Floresan kanalı Cycling Green içinde BRAF Positive Control (PC)’de
sinyal yok
a) PCR veri analizi için seçili floresan
kanalı protokol ile uyumlu değil
Veri analizi için, analitik BRAF PCR
için floresan kanalı Cycling Green ve
dahili kontrol PCR için floresan
Cycling Yellow seçin.
b) Kullanılan Rotor-Gene Q MDx
5plex HRM ya da Rotor-Gene Q
5plex HRM cihazda yanlış sıcaklık
profili
Sıcaklık profilini protokol ile
karşılaştırın. Eğer doğru ise, uygun
çalışma şablonunu tekrar indirin ve
çalışmayı tekrarlayın.
c) Yanlış PCR konfigürasyonu
Pipetleme planınızı kontrol edin ve
gerekiyorsa PCR’yi tekrarlayın.
d) Bir ya da daha fazla kit bileşeninin
depolama koşulları “Numunelerin
analizi (sayfa 43) de verilen
talimatlar ile uyumlu değil
Ayıraçların depolama koşullarını ve
son kullanma tarihlerini kontrol edin
(kit etiketine bakın) ve gerekiyorsa
yeni bir kit kullanın.
e) therascreen BRAF RGQ PCR Kitin
kullanım süresi dolmuş
Ayıraçların depolama koşullarını ve
son kullanma tarihlerini kontrol edin
(kit etiketine bakın) ve gerekiyorsa
yeni bir kit kullanın.
45
Açıklamalar ve öneriler
Analitik PCR’nin floresan kanalı Cycling Green içindeki negatif
kontrollerde sinyaller
PCR preparasyonu sırasında
kontaminasyon oluştu
PCR’yi yeni ayıraçlar ile kopyalar içinde
tekrarlayın. Eğer mümkünse, PCR
tüplerini test edilecek numunelerin
ilavesinin ardından hemen kapatın.
Çalışma alanının ve cihazların düzenli
aralıklarla dekontamine edildiklerinden
emin olun.
Kalite Kontrol
QIAGEN’in ISO-sertifikalı Kalite Yönetim Sistemini gereğince, therascreen BRAF
RGQ PCR Kitin her bir lotu, sürekli ürün kalitesini sağlamak amacıyla önceden
belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir
Kısıtlamalar
Ürünlerden elde edilen sonuçlar ilgili tüm klinik ve laboratuvar bulguları
kapsamı içinde yorumlanmalı, tanı amacıyla tek başlarına kullanılmamalıdır.
Bu ürün yalnızca in vitro diyagnostik prosedürleri ile Rotor-Gene Q MDx 5plex
HRM ya da Rotor-Gene Q 5plex HRM cihaz konusunda özel olarak
görevlendirilmiş ve eğitilmiş personel tarafından kullanılmalıdır.
Doğrulama çalışmaları formalin-sabitlenmiş parafine gömülü tümör
numunelerinden ekstrakte edilen insan DNA’sı ve bireysel çalışmalar için uygun
sentetik standartlar kullanılarak gerçekleştirildi.
Bu ürün QIAGEN’den QIAamp DNA FFPE Tissue Kit kullanılarak doğrulandı.
Bu ürün ya Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ya da Rotor-Gene Q gerçek zamanlı
PCR döngüleyici, 5plex HRM serisinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
Optimal sonuçlar için therascreen BRAF RGQ PCR Kit Kullanım Kılavuzu’na sıkı
şekilde uyulmalıdır. Bu kullanım kılavuzunda tanımlanan dışında ayıraçların
seyreltilmesi önerilmez ve performans kaybı ile sonuçlanacaktır.
Numuneler içindeki DNA miktarının ve kalitesinin therascreen BRAF RGQ PCR
Kit kullanarak numune analizinin gerçekleştirilmesi öncesinde değerlendirilmesi
önemlidir. CT değerinin tahlil için kabul edilebilir olduğunu belirlemek için ilave
kontrol karışımı sağlanmıştır. Absorban değerleri kullanılmamalıdır zira bunlar
parçalanmış DNA numuneleri içinde CT değerleri ile bağlantı kurmaz.
46
Tüm bileşenler için kutu ve etiketler üzerinde yazılı son kullanma tarihi ve
depolama koşullarına dikkat edilmelidir. Kullanım süresi dolmuş ya da yanlış
şekilde depolanmış bileşenleri kullanmayın.
Performans Karakteristikleri
Boş limiti (LOB), çalışma aralığı ve cutoff değerleri
Yüz kırk üç (143) numune her bir mutasyon tahlili için LOB ve cutoff değerlerini
belirlemek için NCCLS EP17-A (2004) yönergelerini izlemek suretiyle bir
çalışmada test edildi. İlave olarak, kontrol tahlili için çalışma aralığı belirlendi.
Cutoff değerleri yayınlandı ve aşağıda Tablo 8’de görülmektedir.
Tablo 8. Her bir mutasyon tahlili için yayınlanmış cutoff değerleri
Mutant analizi (∆CT)
Cutoff (∆CT)
V600E/Ec
V600D
V600K
V600R
≤7.0
≤6.9
≤6.0
≤7.0
Kontrol reaksiyon CT aralığı 20.95 ila 33.00 CT olarak belirlendi.
Tahlil cutoff değerleri ve çalışma aralığı standartlar ve başka bir (özgün) 117
FFPE numuneleri kullanılarak doğrulandı. Doğrulama sırasında cutofflar, her bir
tahlili yüksek girdili genomik DNA ve yüksek girdili mutasyon ile
değerlendirmek suretiyle wild-type DNA arka planındaki doğru mutasyonu ayırt
etme yeteneği açısından değerlendirildiler (“Çapraz-reaksiyon” a bakın, sayfa
49). Girdi DNA’nın mutasyon çağrıları üzerindeki etkisi de değerlendirildi ( “∆CT
değerleri üzerindeki girdi DNA etkisi” ne bakın, sayfa 48).
Doğruluk: Analitik referans yöntemi ile karşılaştırma
Bir çalışma iki-yönlü Sanger sekanslama ile ilişkili therascreen BRAF RGQ PCR
Kitin mutasyon durumlarındaki konkordansı gösterdi. Bu çalışmada, 139 FFPE
numunesi CLSI EP12-A2 Guidance (2008)’den anlaşma/anlaşmazlığın
istatistiksel ölçümleri kullanılarak test edildi. FFPE numunelerinin 117’si için hem
therascreen BRAF RGQ PCR Kit hem de iki-yönlü Sanger sekanslama için
geçerli sonuçlar alındı. Numune mutasyon durumu çağrılarının iki-yönlü Sanger
sekanslama ile therascreen BRAF RGQ PCR Kit arasında konkordant olmayan
mutasyon durumlarını teyit için Pyrosequencing® kullanıldı.
Tablo 9 therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile sekanslama arasındaki anlaşma
analizini göstermektedir.
47
Tablo 9. Anlaşma analizi
Anlaşma ölçümü
Skor
Frekans (%)
Genel anlaşma
94.02
Pozitif anlaşma
95.00
Negatif anlaşma
93.81
Negatif anlaşma frekansı therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile sekanslama ve
V600E/Ec mutasyon pozitif tarafından wild-type olarak adlandırılan 6
numunenin mutasyon tespiti nedeniyledir. Bu Scorpions ve ARMS teknolojilerinin
artan hassasiyetleri nedeniyledir.
∆CT değerleri üzerindeki girdi DNA etkisi
therascreen BRAF RGQ PCR Kit kullanarak mutasyon durumunun belirlenmesi
üzerindeki toplam girdi DNA seviyelerinin etkisi Test Cut Off Doğrulama ve
Çalışma Aralığı çalışmasının bir parçası olarak değerlendirildi. Bu, therascreen
BRAF RGQ PCR Kit tarafından oluşturulan mutasyon çağrılarının çalışma aralığı
boyunca farklı DNA girdi seviyelerinde tutarlı olduğunu doğrulamak içindi.
Wild-type DNA arka planında yüksek, orta ve düşük yüzdeli mutasyon içeren
mutasyon standartları (sırasıyla %100, %50 ve 3 x LOD %) yüksek, orta ve
düşük DNA girdi seviyelerinde hazırlandı. O nedenle, her bir mutasyon tahlili
için toplam 9 mutasyon standardı test edildi. Yüksek girdi DNA seviyesi çalışma
aralığının düşük limitine yakın 21.95 CT değerinde bir kontrol testi hedefledi.
Orta girdi DNA seviyesi 25.98 değerinde bir CT hedefledi ve düşük girdi DNA
seviyesi çalışma aralığının üst limitine yakın 30.00 değerinde bir CT hedefledi.
Tüm testlerin sonuçları Tablo 10’da görülmektedir.
Her bir çift DNA girdi seviyesi arasındaki mean ∆CT değerindeki tahmini farklar
lineer regresyon analizinden tahmin edildiği gibi, tamamı ±1 CT içinde idiler. 4
mutasyon tahlilinin tümü yüksek, orta ve düşük DNA girdi seviyelerinde denk
olarak kabul edildiler.
48
Tablo 10. DNA giriş seviyeleri arasındaki tahmin edilen farklar
Tahmini Fark
(∆CT)
%95 güven
aralığı
(düşük, yüksek)
Tahlil
Parametre (DNA
giriş seviyesi)
V600E (E)
High — Medium
0.57
0.29, 0.84
V600E (E)
Low — Medium
–0.16
–0.43, 0.12
V600E (Ec)
High — Medium
0.53
0.19, 0.86
V600E (Ec)
Low — Medium
0.12
–0.22, 0.46
V600D
High — Medium
–0.29
–0.53, 0.04
V600D
Low — Medium
–0.54
–0.78, –0.30
V600K
High — Medium
0.13
–0.07, 0.34
V600K
Low — Medium
–0.42
–0.62, –0.21
V600R
High — Medium
–0.10
–0.25, 0.06
V600R
Low — Medium
–0.66
–0.82, –0.51
Çapraz-reaksiyon
Yüksek giriş DNA standartları yüksek mutasyon içeriği (%1009 ile her bir tahlilin
potansiyel çapraz reaksiyonunu değerlendirmek üzere test edildi. Çapraz
reaksiyon sonuçları Tablo 11’de gösterildiği şekilde mutasyon durumu lojik
tablosunun derlemesine imkan sağlamıştır.
Tablo 11. Numune mutasyon durumlarının adlandırılması
V600E/Ec
V600D
V600K
V600R
Mutasyon durumları
Pozitif
Negatif
Negatif
Negatif
V600E veya V600Ec pozitif
Pozitif
Negatif
Pozitif
Negatif
V600Ec veya V600K pozitif
Pozitif
Pozitif
Negatif
Negatif
V600D Pozitif
Negatif
Pozitif
Negatif
Negatif
V600D Pozitif
Negatif
Negatif
Pozitif
Negatif
V600K Pozitif
Negatif
Negatif
Negatif
Pozitif
V600R Pozitif
49
Algılama limiti (LOD) değerleri
therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile ilişkili 4 mutasyon-spesifik reaksiyonun her
birinin LOD’unu belirlemek için bir çalışma gerçekleştirildi. Bu çalışmada, LOD,
test sonuçlarının %95’inde mutasyon-pozitif sonuçlar veren bir mutant
örneğindeki wild-type arka planı içindeki en düşük mutan DNA miktarı olarak
belirlendi (C95).
Her bir tahlil için LOD belirlemek için, farklı orandaki mutasyon standartları
orta girdi DNA konsantrasyonunda hazırlandı ve therascreen BRAF RGQ PCR
Kit ile test edildi. Her bir tahlil için LOD lojistik regresyon ile hesaplandı. Her bir
tahlilin LOD’unu doğrulamak için, belirlenen LOD’da mutasyon standartları
hazırlandı. Altmış kopya test edildi ve pozitif test oranı doğrulandı.
25.987’lik bir kontrol CT değeri veren orta girdi standart olarak belirlendi
(kontrol testi çalışma aralığı 20.95–33.00 CT dir). Orta girdi DNA
konsantrasyonunda doğrulanan LOD Tablo 12’de verilmektedir. Yüksek girdi
DNA konsantrasyonlarında, LOD değerlerinin Tablo 12’de belirtilen
değerlerden daha düşük olması beklenir.
Tablo 12. Her bir mutasyon tahlili için (orta girdi) LOD değerleri
Tahlil (mutasyon)*
Orta girdi DNA’da LOD C95 (Wild-type
DNA’daki mutant DNA yüzdesi)
V600E (E)
%1.82
V600E (Ec)
%4.31
V600D
%3.19
V600K
%4.34
V600R
%4.85
* V600E için algılama limiti hem V600E hem de V600Ec mutasyonları için hesaplandı.
Kit performansı üzerindeki melanin etkisi
Bu çalışmanın amacı, melanom numunelerde bulunan bilinen bir PCR
inhibitörü olan melaninin therascreen BRAF RGQ PCR Kit üzerindeki etkisini
değerlendirmekti. Bu çalışma bir dizi konsantrasyon boyunca (0-250
ng/reaksiyon) therascreen BRAF RGQ PCR Kit ile test öncesinde DNA
numuneleri içerisine doğrudan melanin serpmek ve ∆CT değerleri üzerindeki
etkilerini ve test numunelerinin mutasyon durumlarını değerlendirmek suretiyle
gerçekleştirildi.
50
Sonuçlar düşük melanin konsantrasyonunun ∆CT üzerinde bir etkisinin olmadığını ve
düşük seviyedeki melanin konsantrasyonunda ∆CT üzerinde minimal etkisinin
olduğunu gösterdi. O nedenle, düşük ve orta konsantrasyon seviyelerindeki melanin
tahlilin mutasyonu tespit etme yeteneğini etkilemedi. 180 ng/reaksiyonda dahili
kontrol inhibitörün varlığını göstererek başarısız oldu ve böylece mutasyon çağırma
öncesinde inhibitörlerin tespitinin etkinleştirilmesi etkilenmektedir.
Normal kullanımda karşılaşılması beklenilen melanin konsantrasyonları
therascreen BRAF RGQ PCR Kitin mutasyon-pozitif ve mutasyon negatif
numuneler arasında ayırım yapma yeteneğini etkilemez.
Sonuçların bir özeti Tablo 13’de görülmektedir.
Tablo 13. Her bir tahlilde test edilen melanin miktarı
Melanin konsantrasyonu
(ng/reaksiyon)
∆CT deki
değişim
Dahili kontrol durumu
(geçti/kaldı)
0
0
Geçti
50
0
Geçti
100
–0.39
Geçti
150
–0.79
Geçti
180
–1.52
Kaldı
Tekrarlanabilirlik
Operatörü, günü, plaka düzenini ve cihazı değiştirerek hem çalışma içerisinde hem
de çalışmalar arasında tahlilin doğruluğunu belirlemek için bir matris çalışması
tasarımı uygulandı. Mutasyon tahlili için düşük seviyedeki mutasyonda (3 x LOD)
tekrarlanabilirlik ve kontrol tahlili için düşük girdi wild-type gösterildi. Ayrıca, kendi
spesifik mutasyon standartları ile test edildiklerinde mutasyon-pozitif çağrıların
yüzdesi değerlendirildi. Her bir mutasyon tahlili %100 pozitif mutasyon çağrıları
verdi.
Hassasiyet değerleri Tablo 14’de verilmektedir.
Çoğaltılabilirlik
3 laboratuvar (alaların)da, therascreen BRAF RGQ PCR Kitin 3 lodu ile (her bir
alanda 2), her bir alanda 2 operatör kullanarak, her bir alanda 2 cihazda,
birbirini takip eden 4 gün üzerinden standartları test etmek suretiyle tahlilin
çoğaltılabilirliğini değerlendirmek üzere bir matris çalışması tasarımı uygulandı.
Mutasyon tahlili için düşük seviyedeki mutasyonda (3 x LOD) çoğaltılabilirlik ve
kontrol tahlili için düşük girdi wild-type gösterildi. Her bir tahlil için hassasiyet 3
alanın tümünde, %95 hassasiyet tahminleri ile birlikte hesaplandı (Tablo 15).
51
Tablo 14. Tekrarlanabilirlik hassasiyet tahminleri
Hassasiyet
(Çalışma
içi)
%95 güven
aralığı
(düşük,
yüksek)
0.16
0.13, 0.21
Assay
Hassasiyet
(çalışmalar
arası)
Control
0.26
%95 güven
aralığı
(düşük,
yüksek)
0.21, 0.33
V600E (E)
0.66
0.54, 0.84
0.49
0.40, 0.64
V600E
(Ec)
0.68
0.56, 0.87
0.65
0.53, 0.84
V600D
0.42
0.35, 054
0.41
0.33, 0.53
V600K
0.34
0.28, 0.44
0.35
0.28, 0.45
V600R
0.41
0.34, 0.52
0.41
0.33, 0.53
Tablo 15. Çoğaltılabilirlik hassasiyet tahminleri
Kesinlik
%95 güven aralığı
(düşük, yüksek)
Control
0.47
0.37, 0.66
V600E (E)
0.60
0.46, 0.85
V600E (Ec)
0.52
0.40, 0.73
V600D
0.64
0.50, 0.89
V600K
0.56
0.43, 0.78
V600R
0.56
0.43, 0.78
Tahlil
Referanslar
QIAGEN, QIAGEN ürünlerini daha yararlı hale getiren bilimsel yayınların
büyük, güncel bir çevrim içi veri tabanını hizmete sunmaktadır. Kapsamlı bir
araştırma opsiyonu size ihtiyaç duyduğunuz makaleleri ya basit bir klavye
araştırmasa ya da uygulamayı, araştırma alanını, başlığı, vb. belirleyerek
araştırma ve bulma imkanını verir.
Referansların komple bir listesi için, QIAGEN Referans Veri Tabanını çevrim içi
olarak www.qiagen.com/RefDB/search.asp sitesini ziyaret edin ya da QIAGEN
Teknik Servisleri ile ya da yerel distribütörünüz ile kontak kurun.
52
Semboller
<24 >
24 reaksiyon için yeterli ayıraç içerir
Son kullanma tarihi
In vitro diyagnostik tıbbi cihaz
Katalog numarası
Lot numarası
Materyal numarası
Bileşenler
İçerir
Numara
Sıcaklık sınırlamaları
Üretici
Kullanım kılavuzuna başvurun
Gün ışığından uzak tutun
Dikkat
İletişim Bilgileri
Teknik yardım ve daha fazla bilgi için, lütfen www.qiagen.com/Support
sayfasındaki Technical Support Center’e bakın, 00800-22-44-6000 numarasını
arayın QIAGEN Teknik Servis Departmanlarını veya yerel distribütörlerinizden
birisini arayın (arka kapağa bakın ya da www.qiagen.com sayfasını ziyaret
edin).
53
Sipariş Bilgisi
Ürün
İçeriği
therascreen BRAF RGQ 24 reaksiyon için: Control Assay,
PCR Kit (24)
4 Mutation Assays, Positive Control, Taq
DNA Polymerase, Water for NTC ve
Numune Seyreltisi için Su
Kat. no.
870211
Rotor-Gene Q ve diğer aksesuarlar
Rotor-Gene Q MDx
5plex HRM Platform
Real-time PCR döngüleyici ve 5 kanallı
(yeşil, sarı, portakal, kırmızı, kızıl) High
Resolution Melt analizör artı HRM kanalı,
laptop bilgisayar, yazılım, aksesuarlar,
1-yıl parça ve işçilik garantisi, kurulum
ve eğitim dahil değildir
9002032
Rotor-Gene Q MDx
5plex HRM System
9002033
Rotor-Gene Q 5plex
HRM System
9001650
Rotor-Gene Q 5plex
HRM Platform
9001580
Loading Block 72 x
0.1 ml Tubes
72 x 0.1 ml tüpler içindeki tek tekkanallı bir pipet ile manüel reaksiyon
kurulumu için alüminyum blok
9018901
Strip Tubes and Caps,
0.1 ml (250)
1000 reaksiyon için 250 şeritli 4 tüp ve
kapak
54
981103
Ürün
İçeriği
Kat. no.
Strip Tubes and Caps,
0.1 ml (2500)
10,000 reaksiyon için 10 x 250 şeritli 4
tüp ve kapak
981106
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit —Parafine gömülü genomik
DNA purifikasyonu için
QIAamp DNA FFPE
Tissue Kit (50)
50 DNA preps için: QIAamp MinElute®
Columns, Proteinase K, Buffer, ve
Collection Tubes (2 ml)
56404
Güncel lisanslama bilgileri ve ürüne özel feragatnameler için, ilgili QIAGEN kit
el kitabına ya da kullanım kılavuzuna bakın. QIAGEN kit el kitapları ve
kullanım kılavuzları www.qiagen.com sitesinde mevcuttur ya da QIAGEN
Teknik Servislerinizden ya da yerel distribütörünüzden talep edilebilir
55
Bu sayfa bilerek boş bırakılmıştır
56
57
58
Ticari markalar: QIAGEN®, QIAamp®, HRM®, MinElute®, Pyrosequencing®, Rotor-Gene®, Scorpions®, therascreen® (QIAGEN Group); ARMS®
(AstraZeneca Ltd.); FAM™, HEX™ (Life Technologies, Inc.).
Endomentiyöz Oluşumu Riskinin Belirlenmesinde Kullanım için Değildir
Sınırlı Lisans Anlaşması
Bu ürünün kullanılması, therascreen BRAF RGQ PCR KRAS Kit ürünlerini satın alan kişinin ya da kullanıcının aşağıdaki koşullarda bir anlaşması
anlamına gelir.
1.
therascreen BRAF RGQ PCR Kit yalnızca therascreen BRAF RGQ PCR KRAS Kit Kullanım Kılavuzu’na göre ve yalnızca Kit içinde içerilen
komponentlerle birlikte kullanılmak içindir. QIAGEN kendisinin her hangi bir fikri hakları altında bu Kitin içeriğindeki bileşenlerin Kit içerisinde
içerilmeyen her türlü komponentler ile birlikte kullanımı için bir lisans sunmaz, therascreen BRAF RGQ PCR KRAS Kit Kullanım Kılavuzu’nda
tanımlanmış olanlar bu hususların dışındadır ve ilave protokoller www.qiagen.com sitesinde mevcuttur.
2.
Açıkça ifade edilen lisansların dışında QIAGEN bu Kitin ve/veya onun kullanımının üçüncü kişilerin haklarının çiğnenmeyeceğini garanti
vermez.
3.
Bu therascreen BRAF RGQ PCR Kit ve komponentleri bir kez kullanım için lisanslanmıştır ve tekrar kullanılamaz, yenilenemez ve yeniden
satılamaz.
4.
QIAGEN belirli bir biçimde açıkça belirtilenler dışındaki diğer lisansları açıkça ya da ima yoluyla onaylamaz.
5.
Kitin satın alıcısı ya da kullanıcısı başka bir kişinin yukarıda yasaklanan her hangi bir kuralın hafifletilmesi yönünde bir adım atmasına izin
vermemek konusunda anlaşırlar. QIAGEN bu Sınırlı Lisans Anlaşmasının yasaklarını herhangi bir Mahkemede uygulatabilir ve avukat ücreti
dahil bu Sınırlı Lisans Anlaşması ya da Kit ve/veya bunun komponentleriyle ile ilgili tüm araştırma ve Mahkeme masraflarını talep edecektir
Güncel lisanslama koşulları için, see www.qiagen.com sayfasına bakın.
© 2012 QIAGEN, tüm hakları saklıdır.
www.qiagen.com
Australia  [email protected]
Austria  [email protected]
Belgium  [email protected]
Brazil  [email protected]
Canada  [email protected]
China  [email protected]
Denmark  [email protected]
Finland  [email protected]
France  [email protected]
Germany  [email protected]
Hong Kong  [email protected]
India  [email protected]
Ireland  [email protected]
Italy  [email protected]
Japan  [email protected]
Korea (South)  [email protected]
Luxembourg  [email protected]
Mexico  [email protected]
The Netherlands  [email protected]
Norway  [email protected]
Singapore  [email protected]
Sweden  [email protected]
Switzerland  [email protected]
UK  [email protected]
USA  [email protected]
1072802TR 142334775
Sample & Assay Technologies

therascreen

Transkript

Benzer belgeler

Biofortuna SSPGoTM HLA No Template Control Kit BF-40

Listeria Monocytogenes Real-time PCR Tespit Kiti

PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi

talep formu - Radix Analiz Laboratuvarı

SGS MRL-LIMS Auto Report Sending Application