PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi

Hafta V
PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları
PCR
Bir reaksiyonun kurulması ve
optimize edilmesi
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
F Đ Z Đ K Đ A L T Y A P I
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
I. Kalıp DNA
a) PCR degrade olmuş DNA ile de çalışma imkanı veren bir teknik olmakla
beraber özellikle hedef amplikonun boyu arttıkça kullanılacak DNA’nın
bütünlüğü önem kazanır.
b) Kullanılacak genomik DNA’nın A260/A280 oranının temizliğinin bir
göstergesi olarak 1.7-1.9 arasında olması gerekir.
c)
A260 Nükleik asitlerin maksimum absorbans,
d)
A280 Proteinlerin maksimum absorbans,
e) A230 ise fenolün maksimum absorbans verdiği dalga boyudur.
f) +4 (kısa-orta süreli) veya -20oC’de (uzun süreli) saklanmalı. Genomik DNA
esas itibariyle oda ısısında da stabil olmakla beraber daha güvenilir olan
ısı ayarlı soğuk ortamlarda saklanmalıdır.
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
II. Düz primer ve ters primer: Tasarım kriterlerine uygun olarak seçilmiş
primerler genellikle 18-24 bç arasında olan oligonükleotidlerdir. Primerler
üreticilerinden 3 farklı yöntemden biri ile saflaştırılmış olarak alınır.
Tuzdan arındırma (desalting)- En ucuz yöntemdir, ancak özellikle
primerler dizi analizi benzeri uygulamalarda kullanılacaksa bu yöntem tercih
edilmemelidir.
Kolon bazlı saflaştırma (OPC/HPSF benzeri)- Çok temiz sonuç veren
tuzdan arındırma yöntemine göre pahalı ancak HPLC’ye göre ekonomik olan bir
seçimdir.
HPLC- En başarılı saflaştırma yöntemi olmakla beraber maliyeti en
yüksek olan seçimdir.
Genellikle liyofilize halde gelen primerler steril ortamda 100 pmol/ul
olacak şekilde sulandırıldıktan sonra bu stoktan 10 pmol/ul’lik bir dilüsyon
hazırlanıp reaksiyonlarda kullanılabilir.
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
III. dNTP: Eşit konsantrasyondaki dATP, dGTP, dCTP ve dTTP’nin karışımıdır.
Karışım halinde veya ayrı ayrı olarak satın alınabilir. Genellikle 100 mM
konsantrasyonda satılan dNTP karışımlarının stok halinde 10 mM konsantrasyonda
olması tercih edilir.
Herhangi bir kontaminasyon riskine karşı kullanıma açılan dNTP miktarı
200-300 ul üzerinde olmamalıdır. Bu amaçla dNTP hazır olarak geldiğinde veya
laboratuvarda hazırlandığında küçük hacimlere bölünerek saklanmalıdır.
IV. MgCl2: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için gerekli
kofaktör olarak görev alan Mg iyonunu sağlar. Genellikle 25 veya 50 mM stok
konsantrasyonda gelir. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 0.8-3 mM arasında
değişir.
V. 10X buffer: Taq DNA polimeraz ile beraber gelen ve enzimin çalışması için
gerekli stabil pH şartlarını sağlar. Reaksiyondaki son konsantrasyonu 1X olacak
şekilde kullanılır.
P C R
Reaksiyonda kullanılanlar:
VI. Taq DNA Polimeraz: Thermus aquaticus adlı termofil bir bakteriden elde edilen
ve PCR reaksiyonlarında kullanılan bu DNA polimerazların hata oranı 1x10-4’dir.
Enzimler protein oldukları için denatüre olma riski taşırlar, ayrıca ortam
şartları aktiviteleri üzerine etki eder. Bu nedenle düşük ısıda saklanmaları gerekir.
Ancak düşük ısıda donacakları için denatüre olurlar. Bunu engellemek için enzim
stokları gliserol içinde gelir ve -20oC’de saklanır. -80oC’de gliserol de donacağı için
Taq pol’ın -80oC’de saklanması tercih edilmez.
Amplifiye edilecek bölge klonlanacaksa hatasız olması istenir. Bu nedenle
hata oranı daha az olan enzimler tercih edilir.
a. Pfu polimeraz Pyrococcus furiosus’tan izole edilmiştir hata oranı 1.5x10-6
b. Vent polimeraz Thermococcus litoralis’ten izole edilmiştir hata oranı Taq
ile Pfu arasında seyreder.
P C R
Örnek Reaksiyon (50 ul toplam hacim için)
Stok Konsantrasyon/Miktar
Son Konsantrasyon
Kalıp DNA
25-100 ng genomik DNA
0.5-2 ng/µl
Düz Primer
10 µM;10pmol/µl
0.2 pmol/µl
Ters Primer
10 mM;10pmol/µl
0.2 pmol/µl
dNTP
10 mM
200 µM
MgCl2
25 mM
0.8-3 mM
10X buffer
10X
1X
Taq DNA Polymeraz
5 U/ µl
0.3 µl
Toplam
50 µl (steril deionize su ile hacim tamamlanır)
P C R
Neredeyse hiçbir zaman tek bir reaksiyon kurulmadığı için muhakkak bir
reaksiyon karışımı hazırlayın.
Tampon, primerler, MgCl2, dNTP, Taq pol ve sudan oluşan
Pipetleme hatalarını engellemek üzere karışım olması gerekenin %10
fazlası olacak şekilde hazırlanır.
Negatif kontrol
Kalıp DNA olmayan bir tüp hazırlanır.
Örnekler arası kontaminasyonu kontrol etmek üzere
Pozitif kontrol
PCR’da kullanılan reaktiflerin dolayısıyla sistemin işlediğinden emin
olmak için çalıştığı bilinen bir DNA ve primer seti ile pozitif kontrol
reaksiyon setine dahil edilmelidir.
Genel Problemler
Bant yok veya zayıf.
Kontaminasyon var.
Primer dimer oluşumu var.
Özgün olmayan bant(lar) var.
Kontaminasyon
Pre ve post PCR alanları muhakkak birbirinden ayrılmalı.
Mümkünse PCR laminar akışlı kabin içinde kurulmalı.
Bütün reaksiyon setlerinde muhakkak negatif kontrol
bulunmalı
Reaktifler küçük hacimlere bölünüp saklanmalı. Problem
yaşandığı takdirde atılmaları mümkün olduğunca ekonomik
olmalı.
Filtreli uç kullanılmalı ki pipetler kontamine olmasın.
Bant yoksa veya zayıf ise…
Reaksiyona koymanı gereken bütün reaktifleri ilave ettiniz mi?
Lab defterinizi kontrol edin.
Reaksiyonu tekrarlayın.
Reaktiflerin konsantrasyonları doğru mu?
Kalıp
Primer
Primer
Taq
MgCl2
Hatalı primerler
Dizileri kontrol edin.
Yeni sentez veya yeni tasarım deneyin.
Bant yoksa veya zayıf ise…
Kötü kalıp
Agaroz jelde kalıp DNA’yı kontrol edin. DNA fazla degrade olabilir.
Kalıp DNA PCR inhibitörü içeriyor olabilir (fazla tuz, fenol gibi).
Optimal olmayan PCR şartları
Bağlanma ısısını düşürün.
MgCl2 konsantrasyonunu arttırın.
Özgün olmayan amplifikasyon var
ise…
Özgün olmayan amplifikasyonu saptamak için
Amplikonları agaroz jelde yürütün.
Ürünün hedeflenen boyda olup olmadığını kontrol edin.
Bunu saptamak için bir moleküler ağırlık standardı
kullanın (100 bç, 1 kb merdiven, λ/HindIII gibi)
Özgün olmayan amplifikasyonu ortadan kaldırmak için
Amplifikasyon şartlarını sıkılaştırın
Bağlanma ısısını arttırın
MgCl2 konsantrasyonunu düşürün
Termal döngü koşullarını değiştirin
Uzama sürelerini ayarlayın
Döngü sayısını azaltın
Farklı primerler deneyin
PCR optimize ederken…
PCR son derece hassas bir işlemdir.
Herbir primer çiftinin ayrı ayrı optimizasyonu gerekir.
Farklı PCR cihazlarının (marka ve/veya model) kullanımı PCR’ın sonucunu
etkiler.
Optimize edilmesi gerekenler:
Konsantrasyonlar
MgCl2 konsantrasyonu
Primer ve kalıp DNA konsantrasyonu
Fazla kalıp PCR’ı engelleyebilir. Kalıp gerekiyorsa
kullanılmalıdır.
Termal döngü şartları
Bağlanma ısısı
Primer çiftinin Tm derecesine göre ayarlanır.
Uzama süreleri
Amplikonun uzunluğu dikkate alınır.
seyreltilip
PCR optimize ederken…
Gradient PCR cihazları optimizasyon sürecini kolaylaştırır ve
kısaltır
Bu tip cihazlarda 96’lık veya 48’lik bloğun herbir 8’lik
kolonuna farklı bağlanma ısıları uygulamak mümkündür.
PCR optimize ederken…
Touch-down (Đnen) PCR
Özgün
olmayan
arttırılması
ve
amplikasyondan
MgCl2
yalnızca
konsantrasyonunun
bağlanma
ısısının
düşürülmesi
ile
kurtulunamıyorsa:
Touch-down PCR denenir.
Yüksek bağlanma ısısı ile başlanır. (mesela 70oC)
Az sayıda da olsa hedef dizinin amplifiye olması beklenir.
Bağlanma ısısı döngü sayısı ilerledikçe düşürülür.
Amplifiye olmaya başlayan hedef dizinin kalıp popülasyondaki oranı
arttığı için düşen ısıda artık yalnızca hedef dizi çoğalacaktır.
PCR Destek Kuvvetler…
DMSO
%2-10 Fazlası Taq aktivitesini düşürür. Kalıp
DNA’nın oluşturduğu ikincil yapıları çözer. Özellikle GC oranı
yüksek hedef bölgelerin çoğaltılması için kullanılabilir.
Betain
1-1.7 M DMSO ile aynı amaçla kullanılabilir.
Formamid
%1-5
Mümkün
olduğunca
az
kullanılmalı.
Đkincil yapıların önlenmesinde kullanılabilir.
Non iyonik deterjanlar (Tween 20-NonIdet P40- TritonX)
%0.1-1 arası kullanılabilir. %0.1 Taq’ı stabilize eder ancak
özgün olmayan amplifikasyonu teşvik edebilir. %0.5 kullanımı
daha garantilidir.
PCR optimize ederken…
7 deaza-2 deoksi guanozin. Stabil ikincil yapı oluşturan GC oranı
çok yüksek hedef bölgelerde amplifikasyonu dGTP ile 1:3
oranında ilave edilmek suretiyle verimli bir şekilde sağlar.
BSA (bovine serum albumin) Eski DNA materyellerinden yapılan
amplifikasyonlarında kullanılabilir. PCR inhibitörlerinin etkisini
azaltır.
Optimizasyon Örnekleri
Exon 1(1509 bç): Mg:2,2,5,3 mM, %5 DMSO, 60ºC
2mM
2,5mM 3mM
Ex 2(213 bç), Ex 1I(300bç), Ex 17I(300bç):Mg:1,1,5,2mM,50,55,60ºC
1,5 mM 2 mM 1 mM
1 mM
50
55 60
1 mM
55 60
50
55 60 50
55 60
1,5 mM 2 mM
50 55
60 50
55 60
50 55
1,5mM
60 50
55
2 mM
60 50
55
60
50
Ex 1I (300 bç): ilk 12 örnek 60-63 ºC,1,1,5,2 mM Mg
55 60
60 61 62 63 64 65
1mM
1,5m
M
63 65
2mM 2mM
Ex1(1509bç): Mg:3mM, %5 DMSO, 60ºC
Ex 1I(300 bç): Ex1 den 1/10 oranında sulandırılmış ve Mg: 2-3 mM,
50,55,60ºC
2m
M
2,5m
M
3m
M
50 55 60 50 55 60 50 55 60