trombosit agregasyonu - Hacettepe Üniversitesi

TROMBOSİT
AGREGASYONU
BİO. ÜMİT AKMAN
PRİMER HEMOSTAZ
LABORATUVAR TESTLERİ
• TROMBOSİT SAYIMI
– CBC VE PERİFERİK YAYMA (TROMBOSİTOPENİ OLMADIĞINDAN
EMİN OLUNMALI)
• KANAMA ZAMANI
– IVY YÖNTEMİ
– IN VITRO KANAMA ZAMANI
(PFA-100 Platelet Function Analyzer)
• TROMBOSİT AGREGASYONU
• AKIM SİTOMETRİ
• ÖNEMLİ DİĞER TESTLER
–
–
–
–
–
FİBRİNOJEN
vWF:Ag
vWF:Ris.Co.
vWF:CB
vWF Multimer Analizi
TROMBOSİT AGREGASYON
YÖNTEMLERİ
• TURBİDİMETRİK (OPTİK) AGREGOMETRİ :
(BORN METHOD) BULANIKLIK FARKINA BAĞLI ÖLÇÜM
• İMPEDANS AGREGOMETRİ:
(ELEKTRİK RESİSTANSI, INGERMAN-WOJENSKI AND
SILVER METHOD) ELEKTRİK AKIMINA KARŞI OLUŞAN
DİRENCE BAĞLI ÖLÇÜM
• TROMBOSİT SAYIM YÖNTEMİ:
• FİBRİNOJEN BAĞLANMASININ TETKİK EDİLMESİ:
GP IIb/IIIa RESEPTÖRÜNÜN İŞARETLENMİŞ
FİBRİNOJEN İLE BAĞLANMASININ
RADIOIMMUNOASSAY YÖNTEMİ İLE ÖLÇÜLMESİ
GEREKLİ MALZEME VE
MATERYALLER
• CİHAZ:
– AGREGOMETRİ (Turbidimetrik Yöntem
ör.CHRONO-LOG)
– AÇILIR AYAKLI SANTRİFÜJ
• MİKRO PİPET
(ör.HAMILTON)
• KARIŞTIRICI BALIK (STIR BAR) (TROMBOSİTLERİN SÜSPANSİYON
HALİNDE KALMASINI SAĞLAR)
• KÜVET:
– SLİKONİZE CAM TÜP VEYA PLASTİK TÜP
• KAN ALIM İÇİN SODYUM SİTRATLI TÜP veya TROMBİN
İNHİBİTÖRLÜ TÜP
TÜP TÜRÜ
• SODYUM SİTRATLI TÜP
KANDAKİ Ca2+ TUTALARAK PIHTILAŞMANIN DOĞAL
OLARAK BAŞLAMASININ ÖNÜNE GEÇER
(SİLKONİZE CAM VEYA PLASTİK TÜP)
(4 ml)
• TROMBİN İNHİBİTÖRLÜ TÜP
HİRUDİN İÇERİR. TROMBİNİ BAĞLAR.
(3 ml)
a) KLİNİKLERDE ALINAN KANLARIN MAKUL SÜREDE LABORATUVARA ULAŞMASI,
b) KAN ALAN KİŞİLERİN TÜPLER ÜZERİNDEKİ İŞARET VE MİKTARLARA DİKKAT
ETMESİ,
c) KAN ALINDIKTAN SONRA TÜPLERİN ÇALKALAMADAN ALT ÜST EDİLMESİ “BİR
KAÇ KEZ”,
d) ÖZELLİKLE KLİNİKLERDEN GELEN KANLARDA PIHTI OLUP OLMADIĞINA DİKKAT
EDİLMESİ GEREKMEKTEDİR.
HASTANIN UYMASI GEREKEN
ŞARTLAR
• HASTA MÜMKÜNSE SON 10-14 GÜNDÜR HERHANGİ
BİR İLAÇ KULLANMAMIŞ OLMALIDIR.
İLAÇ KULLANIMINDA TEST İLAÇTAN ETKİLENEN
TROMBOSİTLERİN SİSTEMDEN TEMİZLENMESİ VE
YENİLERİNİN ÜRETİLMESİ İÇİN 10-14 GÜN ERTELENİR.
(TROMBOSİT ÖMRÜ ORTALAMA 7-10 GÜN OLUP
YAŞLANAN TROMBOSİTLER RETİKÜLOENDOTELYAL
SİSTEM TARAFINDAN DOLAŞIMDAN TEMİZLENİR. )
• SABAH AÇ KARNINA KAN VERMELİDİR.
YAĞLI GIDALAR (SÜT, KATI YAĞ vb) PLAZMANIN
LİPEMİK OLMASINA NEDEN OLABİLİR.
SANTRİFÜJ
• AÇILIR AYAKLI SANTRİFÜJ
KULLANILIR.
•PRP (TROMBOSİTTEN ZENGIN PLAZMA)
700 RCF’DE 7 DAKIKA SANTRİFÜJ EDİLİR.
PRP’DE PLATELET SAYISI <100 BİN OLMAMALI
•PPP (TROMBOSİTTEN FAKİR PLAZMA)
2500 g‘DE 7 DAKIKA SANTRİFÜJ EDİLİR
REFERANS PLAZMA PPP’DE PLATELET SAYISI <10 BİN
OLMALI
ÇALIŞMA
•
•
•
•
•
•
•
Cihaz çalışma yöntemine göre ayarlanır.
Trombositten fakir plazma (kör tüp) cihazın
referans kısmına yerleştirilir.
Her hastanın kendi fakir plazması (referans
plazması) kullanılmalıdır.
Trombositten zengin plazma örneği pipetle
sitratlı tüpten Buffy-coat’a en yakın bölümden
500 µl (her bir test için) alınır. (Alınan PRP içine
kırmızı küre kontaminasyonu olmamalı.) Alınan
örnek silikonize tüpe (küvet) konur.
Hasta silikonize tüpteki PRP örneği cihazın
inkübasyon alanında 3 dakika inkübe (37 0C)
edilir.
İnkübasyon sonunda silikonize tüpe karıştırıcı
(stirr-bar) konur.
Ölçüm alanına yerleştirilir.
Çalışmaya başlanır.
PRP
GÜÇLÜ
AGONİSTLER
ZAYIF
AGONİSTLER
HANGİ TESTLERİ ÇALIŞABİLİRİZ
TEST ADI
PİPETLENECEK
REAKTİFMİKTARI
PRP HACMİ
ADP
1 µl DÜŞÜK DOZ
3 µl YÜKSEK DOZ
500 µl 2 µ M
500 µl 6 µ M
EPİNEFRİN
0.5 µl
500 µl 10 µ M
COLLAGEN
0.5 µl
500 µl 1 µg/mL
FİNAL DERİŞİM
(KAYNAK AT TENDONU)
TROMBİN
50 µl
500 µl 1 Unit
ARACHIDONIC
ACID
5 µl
500 µl 0.5 mM
RİSTOSETİN
5 µl YÜKSEK DOZ
2 µl DÜŞÜK DOZ
500 µl 1.25 mg/mL
500 µl 0.5 mg/mL
Trombosit Fonksiyon Bozuklukları
• Trombosit adezyon bozuklukları:
Bernard Soulier sendromu,GP Ib/IX Eksikliği
• Trombosit aggregasyon bozuklukları:
Glanzmann trombastenisi (GPIIb-IIIa eksikliği)
• Sekresyon bozuklukları:
“Release” bozuklukları ve granül bozuklukları
Gri platelet sendromu
• Plazma faktör eksikliklerine bağlı trombosit işlev
bozuklukları:
von Willebrand Hastalığı, Afibrinojenemi
AGREGASYON
REAKTİF
ASPİRİN ETKİSİ
VON WILLEBRAND
BERNARD SOULIER
SEKRESYON
BOZUKLUĞU
GLANZMANN’S
THROMBASTHENIA
ADP
İKİNCİL DALGA
İZLENMEZ
NORMAL
İKİNCİL
DALGA
İZLENMEZ
İZLENMEZ
KOLLAJEN
NORMAL,
AZALMIŞ
NORMAL
NORMAL
AZALMIŞ
İZLENMEZ
EPINEFRIN
İKİNCİL DALGA
İZLENMEZ
NORMAL
NORMAL
İKİNCİL
DALGA
İZLENMEZ
İZLENMEZ
RISTOSETIN
NORMAL
AZALMIŞ
İZLENMEZ,
AZALMIŞ,
NORMAL HAFİF
ARTMIŞ TİP2B
PSEUDOvWH
NORMAL
AZALMIŞ,
NORMAL
TİP 2B VE PSEUDO vWH’DA RİSTOSETİNLE (DÜŞÜK DOZ) NORMAL VEYA YÜKSEK
AGREGASYON CEVABI VERİR
PSEUDO vWH’DA PLATELET YÜZEYİNDE GP I ANTİJENİ DEFEKTİ VARDIR. BU DEFEK
BAĞLANMAYI ARTIRIR
vWH TYPE 2B DE PLAZMADA BÜYÜK vWF MULTİMERLERİ YOKTUR.
TROMBOSİT FONKSİYON
BOZUKLUKLARI
Hermansky-Pudlak
sendromu
Dense Granül
ADP
ß-tromboglobulin
Platelet faktör 4
Platelet-derived Growth
Factor
α-granül
Gri platelet sendromu
Fibrinojen
Lizozom
ChédiakHigashi anomalisi
Faktör V
Hydrolase
Gri platelet sendromunda periferik yaymada trombositler hayalet gibi gri soluk renkte görülür.
TROMBOSİT AGREGASYON
vWF
Gp Ib
Dense Granül
Thrombasteni
IIb
IIIa
Release Defects
ADP IIb IIIa
D
D
ADP
D
IIb IIIa
E Fibrinojen
Afibrinojenemi
COLLAGEN İLE AGREGASYON
0
YÜZDE
Agregasyon
Trombositlerde
şekil değişikliği
c
Reaktif ekleme
Baseline
a
100
b
ZAMAN (Dak:sn)
a
b
c
Agonist ile uyarılmayı takiben ilk anda trombositler diskoid
yapıdan sferik forma dönüşür (şekil b). Bu sırada, agregometre
turbiditede hafif bir artış kaydeder. Bu transformasyon trombosit
agregasyonu için şart değildir. Örneğin, epinefrin kaydedilebilen
bir şekil değişikliğine neden olmadan agregasyon oluşturur
TROMBOSİT SFERIK
FORM AKTİVE HALİ
TROMBOSİT DISKOID FORM
İSTİRAHAT HALİ
FLOPODIAL UZANTILAR
YÜZDE
100
ADP İLE AGREGASYON
Agregasyonun ilk aşaması tersinebilirdir.
Sekonder Agregasyon
(İkincil dalga)
Trombosit aktivasyonunu başlatan agonistler zayıf ve güçlü
olarak sınıflanırlar. Güçlü agonistler (kollajen, trombin vb.)
agregasyonun engellendiği şartlarda dahi (örn. Glanzman
trombastenisi) granül sekresyonunu uyarabilirler. Zayıf agonistler
(ADP, epinefrin vb.) ise yalnız başlarına granül sekresyonunu
uyaramazlar; ancak agregasyonu uyarabilirler. Agregasyon
neticesinde sekresyon gerçekleşebilir.
Agregasyon plato
Trombositlerde
şekil değişikliği
Reaktif ekleme
Baseline
0
ZAMAN (Dak:sn)
RİSTOSETİN İLE AGREGASYON
YÜZDE
100
Reaktif ekleme
Baseline
0
ZAMAN (Dak:sn)
BİO. ÜMİT AKMAN
EPİNEFRİN İLE AGREGASYON
0
YÜZDE
Sekonder Agregasyon
(İkincil dalga)
Epinefrinle plateletlerde
kaydedilebilen bir şekil
değişikliğine neden
olmadan agregasyon
oluşur.
Agregasyon plato
Primer Agregasyon
(birincil dalga)
Reaktif ekleme
Baseline
100
BİO. ÜMİT AKMAN
ZAMAN
(Dak:sn)
ADP İLE AGREGASYON
YÜZDE
0
Disagregasyon
Reaktif ekleme
Baseline
100
SEKRESYON BOZUKLUĞU
Fibrinojen ile GPIIb/IIIa bağlanması başlangıçta
tersinebilir bir reaksiyondur. Divalan iyonların ya da
agonistlerin ortadan kalkması ile fibrinojen reseptöründen
ayrılabilir. Trombosit sekresyonunu uyaramayacak kadar
düşük konsantrasyonda ADP veya epinefrin kullanılarak
ya da sekresyon bozukluğu olan trombositlerle
agregasyon incelendiğinde küçük bir agregasyon dalgası
ortaya çıktığı, ancak agregasyonu amplifiye edecek
yoğun ve α granül içerikleri salınamadığından dolayı
trombositlerin
fibrinojen
moleküllerinden
ayrılarak
çözündükleri (= disagregasyon) izlenir.
NORMAL AGREGASYON
SEKRESYON BOZUKLUĞU
2 µM ADP İLE SEKONDER
AGREGASYON
İZLENMEMİŞTİR.
6 µM ADP İLE AGREGASYON
İZLENMİŞTİR.
‘Release Defects’
2 ve 6 µM ADP İLE
SEKONDER
AGREGASYON
İZLENMEMİŞTİR.
‘Storege Pool Deficiency’
RİSTOSETİNLE BOZUK AGREGASYON
(VON WILLEBRAND HASTALIĞI – BERNARD SOULIER SENDROMU)
VWF eksikliğine bağlı olarak gelişen vWH hem primer hem de sekonder hemostaz
bozukluğuna neden olur.
Bernard Soulier Sendromunda trombosit sayısı düşük, trombositler iri (MPV yüksek)
olur. Bernard Soulier: Flow sitometrik olarak cd42 (GP Ib/IX) özelliği saptanabilir.
BERNARD SOULIER ve vWH
MIX TESTİ
MİX HAZIRLAMA
HASTA
TROMBOSİT
NORMAL PLAZMA
VEYA
KRİYOPRESİPİTAT
HAZIRLANAN MIX PLAZMA RİSTESETİN
REAKTİFİYLE ÇALIŞILIR
RİSTOSEİNLE NORMAL AGREGASYON
İZLENİRSE vWH
RİSTOSETİNLE NORMAL AGREGAYON
İZLENMEZ İSE BERNARD SOULIER’DİR
PSEUDO vWH ve 2B vWH MIX TESTİ
MİX HAZIRLAMA
1
NORMAL
TROMBOSİT
HASTA
PLAZMA
DÜŞÜK DOZ (0,5 mg/ml)
RİSTOSETİNLE
AGREGASYON İZLENİR
TİP 2B
2
HASTA
TROMBOSİT
NORMAL
PLAZMA
DÜŞÜK DOZ RİSTOSETİNLE
AGREGASYON İZLENİR
Reaktif eklenmeden
Kriyoprespitat eklendiğinde
de agregasyon izlenir.
PSEUDO vWF
KOLLAJENLE UZAMIŞ LAG FAZI
KOLLAJENLE
60 SANİYEDEN UZUN LAG FAZI
KOLLAJENLE UZAMIŞ LAG FAZI TROMBOSİT FONKSİYON BOZUKLUĞUNU
İŞARET EDER
GLANZMANN TROMBASTENİSİ
GP IIb/IIIa eksik veya hatalıdır.Bu hastalıkta antikoagülansız yapılan periferik yaymada trombositlerin küme yapmadığı ve dağınık
durdukları gözlemlenir. Flow sitometride CD41 ve CD61 eksikliği saptanabilir.
ADP ve EPİNEFRİN İLE
AGREGASYON
2 – 6 µM ADP İLE
AGREGASYON
GLANZMANN TROMBASTENİSİ
RİSTOSETİN İLE
KOLLAJEN İLE
AGREGASYON
AGREGASYON
GP IIb / IIIa fibrinojen reseptörü eksikliğinde trombosit agregasyonu
gerçekleşmez. Glanzman trombastenisi ristosetinle agregasyon gözlenenir ki
aslında aglütinasyondur vWF köprüleri aracılığıyla trombositlerin yan yana
gelmeleridir.
GLANZMANN TROMBASTENİSİ
GP IIb/IIIa İNHİBİTÖR TESBİTİ
MİX HAZIRLAMA
KONTROL
HASTA
NORMAL
TROMBOSİT
HASTA
PLAZMA
NORMAL
TROMBOSİT
NORMAL
PLAZMA
•MIX HAZIRLANIR
•30 DAKİKA İNKÜBASYON
•HASTA VE KONTROL MIX TROMBİN VE/VEYA KOLLAJENLE ÖLÇÜM
GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ POZİTİF
NORMAL TROMBOSİT+
NORMAL PLAZMA
HASTA PLAZMA+
NORMAL TROMBOSİT
GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ POZİTİF
GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ NEGATİF
HASTA PLAZMA+
NORMAL TROMBOSİT
NORMAL TROMBOSİT+
NORMAL PLAZMA
2001-2005 YILLARI ARASINDA TOPLAM 617 HASTA ÇALIŞILMIŞTIR
HASTA SAYISI
YÜZDE (%)
SEKRESYON
BOZUKLUĞU
113
18,3
VON WILLEBRAND
HASTALIĞI
68
11
GLANZMANN’S
THROMBASTHENIA
48
7,8
BERNARD SOULIER
7
1,1
NORMAL
383
62
TOPLAM
617
100
DISTRIBUTION OF PLATELET AGGREGATION TESTS RESULTS IN A REFERENCE LABORATORY
1Yahya Büyükaşık, 2Zelal Adıbelli, 1Nihan Erarslan, 1Nilgün Sayınalp, 1Ebru Koca, 1Deniz Çetiner, 1Salih Aksu,
1Hakan Göker, 1İbrahim C. Haznedaroğlu, 1Şerafettin Kirazlı, 1Osman I. Özcebe1 Hacettepe University, Department
of Internal Medicine, Division of Hematology, 2 Hacettepe University, Department of Internal Medicine, Ankara,
TURKEY
DENEYSEL HATAYA SEBEP
OLAN NEDENLER
•
•
•
•
TROMBOSİT SAYISI
PRP >100 BİN OLMALI BU SEBEPTEN HASTA TROMBOSİT SAYISI >50
BİN OLMALI (TAM KAN SAYIMI VE PERİFERİK YAYMA)
KAN ALIM
KAN ANTİKOAGÜLAN OLARAK %3.2 - %3.8 LİK TRİSODYUM SİTRATLI
(9 KISIM KAN + 1 KISIM SİTRAT) TÜPLERE ALINMALI,
TÜP PLASTİK VEYA CAM TÜP İSE SİLİKONİZE OLMALI
PIHTILI, AŞIRI LİPEMİK VEYA AŞIRI HEMOLİZLİ OLMAMALI
LABORATUVARA ULAŞMA VE ÇALIŞMA ZAMANI
– TEST 30 DAKİKA İLE 3 SAAT İÇERİSİNDE ÇALIŞILMALI
– ALINAN KAN SOĞUK ORTAM İLE TEMAS ETMEMELİDİR.
KAN ALINDIKTAN SONRA KAPAĞI AÇILMADAN ODA SICAKLIĞINDA
(240-270C) BEKLETİLEBİLİR.
HASTAYA BAĞLI SEBEPLER
– İLAÇ KULLANIMI
TROMBOSİTLERİ ETKİLEYEN İLAÇLAR
ANTİBİYOTİKLER
Penicillins, cephalosporins, nitrofurantion,
miconazole
KEMOTERAPÖTİK AJANLAR
Mithramycin, daunorubicin, BCNU
THIENOPYRIDINES
Ticlopidine, cloidogrel (P2Y12 inhibe eder)
ÇEŞİTLİ İLAÇLAR
Serotonin antagonists, antihistamines,
radiographix contrast drugs,
GP IIb/IIIa ANTOGONİSTLERİ
Abciximab, tirofiban, eptifibatide
PSİKOTROPİK İLAÇLAR
Imiprimine, amitriptyline, nortrypaline,
chlorpromazine, flufenazine, trifluoperazine,
haloperidol
PLATELET cAMP SEVİYESİNİ DEĞİŞTİREN ANESTEZİK İLAÇLAR
İLAÇLAR
Dibucaine, tetracaine, metycaine, cyclaine,
Prostacyclin, iloprost, dipyridamole, Cilostazol butacaine, nepercaine, procaine, cocaine,
plaquenil, halothane
ANTİKOAGÜLANLAR ve FİBRİNOLİTİK
AJANLAR
Heparin, streptolinase, tissue plasminogen
activator,urokinase, e-aminocaproic acid
KARDİYOVASKÜLER İLAÇLAR
Nitroglycerin, isosorbide dinitrate, propranolol,
nitroprusside, nifedipine, verapamil, diltiazem,
quinidine
SUNUMA KATKILARIDAN DOLAYI
PROF. DR. YAHYA BÜYÜKAŞIK
HOCAMIZA TEŞEKÜRLERİMİ SUNUYORUM.
HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ HASTANELERİ
İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
HEMATOLOJİ BİLİM DALI
BİO. ÜMİT AKMAN