+ + M.tuberculosis

TÜBERKÜLOZ TANI VE
TAKİBİNDE MİKROBİYOLOJİ
LABORATUARLARININ
YERİ,SORUMLULUĞU, BİRLİKTE
NELER YAPILABİLİR
Uzm Dr.Banu BAYRAKTAR
„ Dünyada en sık ölüme neden olan infeksiyonlardan biri
„ Dünya nüfusunun 1/3’ü infekte
„ Her yıl dünya nüfusunun %1’ i infekte
„ 2 milyon ölüm/yıl
Dünyada Tüberküloz
SAPTANAN
„ Tüm vakalar 4081754
„ Yayma (+) 1716333
„ İnsidans 66/100000
TAHMİN EDİLEN
„ Tüm vakalar 8797000
„ Yayma (+) 3887000
„ İnsidans 141/100000
Ülkemizde Tüberküloz 2004*
„ Tüm vakalar
„ İnsidans
„ Yayma (+) TB
19 944
28/100000
5870
*WHO Report 2004 .Global Tuberculosis Control
Tuberculosis (as of 22 March 2006) -> Estimated TB -> Estimated TB incidence --> TB
incidence, all forms (per 100 000 population per year),
Türkiye’de yıllara göre tüberküloz insidansı
(n/100 000)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Türkiye
1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002
82
87
56
60
56
61
60
58
52
49
44
44
44
37
32
40
39
34
27
25
WHO Report 2004. Global Tuberculosis Control 2004
26
TÜBERKÜLOZ LABORATUVARLARI
TB yayılımını önlemede ve kontrol altına alabilmede
„ Örnekte M.tuberculosis tespiti
„ İzolasyon
„ İdentifikasyon
„ Anti-tüberküloz ilaç duyarlılığı testleri ile katkı sağlar.
Tüberküloz Laboratuar Seviyeleri
„ CDC, Amerikan Toraks Derneği ve CAP tüberküloz
laboratuarlarını iş yükü,tecrübe ve maliyet-yarar ilişkisine
bağlı olarak basamaklandırmışlardır. Düzen Tüberküloz
laboratuarı bu sınıflamay göre III. Seviyede hizmet veren
bir laboratuardır.
SEVİYE
ARB boyama
Kültür
M.tuberculosis kompleks identifikasyonu
Bütün mikobakterilerin identifikasyonu
İlaç duyarlılığı
I
II
III
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tüberküloz laboratuarında yapılan testler
„ ARB boyama
„ Kültür
„ İdentifikasyon tetsleri
„ Moleküler yöntemlerle örnekte direkt
Mycobacterium tuberculosis complex
saptanması
„ Antimikobakteriyal duyarlılık testleri
ARB boyama
Mikobakteriler için başlıca iki boyama tekniği
kullanılmaktadır.
„
Karbolfuksin boyama
-Ziehl-Neelsen
-Kinyoun ( soğuk boyama)
„
Florokrom boyama
-auramine O,
-auramine-rhodamine
„
Florokrom boyama ile saptanan pozitifliklerin
Z-N ile doğrulanması gerekmektedir.
ARB boyama
Kültürle karşılaştırıldığında ARB boyamanın duyarlılığı
%22 - 78 olduğu bildirilmiştir.
&Aynı gün sonuç alınmakta
&Pozitif saptanabilmesi için örnekte 5000-10000 basil/ml bulunması gerekir.
ARB boyama
Görülen ARB miktarı
SONUÇ
Karbolfuksin boya
1000 X
Florokrom boya
250 X
450 X
Negatif
0
0
0
Şüpheli, tekrar
1-2/300 alan
1-2/30 alan
1-2/70 alan
1+
1-9/100 alan
1-9/10 alan
2-18/50 alan
2+
1-9/10 alan
1-9/1 alan
4-36/10 alan
3+
1-9/1 alan
10-90/1 alan
4-36/1 alan
4+
>9/1 alan
>90/1 alan
>36/1 alan
KÜLTÜR
Normal flora içeren klinik örnekler ile alınmaları ve
transport işlemleri sırasında sterilizasyon kurallarına
uyulmadığı düşünülen klinik örneklere; organik kalıntıları
sindirmek (digestion), kontaminasyona neden olan bakteri ve
mantarları elimine etmek amacıyla dekontaminasyon işlemi
uygulanır.
-NALC-NaOH yöntemi
-NaOH yöntemi
-Zephiran-trisodium phosphate yöntemi
-Oxalic asit yöntemi
-Cetylpyridinium chloride-sodium chloride yöntemi
-Sülfirik asit yöntemi
KÜLTÜR
„ 101-102 canlı basil/ml saptayabildiğinden yaymalara
göre daha duyarlıdır.
„ Kültür için katı besiyerleri ve sıvı besiyerleri
kullanılmaktadır. Sıvı besiyerlerinde basilin üreme
süresi daha kısadır.
„ Bakteri veya mantar kontaminasyonunun önüne
geçilebilmesi amacıyla antimikrobiyallerin katıldığı
selektif besiyerleri de mevcuttur.
KÜLTÜR
Katı Besiyerleri:
Yumurta temelli ve agar temelli besiyerleri mevcuttur.
Nonselektif Besiyerleri
-Löwenstein-Jensen (L-J)
-Petragnani
-American Thoracic Society
-Middlebrook 7H10
-Middlebrook 7H11
Selektif Besiyerleri
- L-J Gruft (penisilin,nalidiksik asit)
- Mycobactosel L-J (siklohekzimid,
linkomisin, nalidiksik asit)
- Mycobactosel Middlebrook 7H10
- Mitchison’s selektif 7H11
(karbenisilin,polimiksin B,trimetoprim laktat,
amfoterisin B)
KÜLTÜR
Bifazik besiyerleri:
Septi-Check (BD Biosciences)
„ Sıvı besiyeri (Middlebrook 7H9)
„ Üç tip katı besiyeri (L-J, Middlebrook 7H11,
çukulatamsı agar)
„ Kan dışındaki tüm klinik örnekler için uygun
„ Duyarlılığı BACTEC 460 TB ye benzer ancak üremeyi
saptama zamanı daha uzundur.
KÜLTÜR
Sıvı besiyerleri:
„ MGIT (BD, Biosciences)
„ MB Redox (Heipha Diagnostica Biotest)
* Düşük kapasite ile çalışan laboratuvarlarda tercih
edilir.
KÜLTÜR
Tam otomatize sistemler (Sıvı besiyerleri):
„ BACTEC 460 (BD Biosciences)
„ Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) 960 (BD
Biosciences)
„ Bactec 9000 MB (BD Biosciences)
„ ESP II (Trek Diagnostics)
„ MB/BacT ALERT 3D (BioMerieux)
KÜLTÜR
BACTEC 460 TB
„ Yarı otomatize, radyometrik
„ BACTEC 12B besiyeri 14C işaretli palmitik asit içerir
„
14C
işaretli palmitik asit kullanımı
↓
14CO
2
↓
Üreme İndeksi (GI)
KÜLTÜR
BACTEC 460 TB
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Duyarlılık
Özgüllük
PPD
NPD
&
%
%
%
%
83.3- 89.3
99.2-100
100
96.4-99.2
Ortalama sonuç alma süresi 4-15 gün
NTM <7 gün
J Clin Microbiol 1999 Jan; 37(1): 229 – 32
KÜLTÜR
„
„
„
„
MGIT 960
Tam otomatize, radyometrik olmayan
MGIT tüpünün dibindeki silikon içine floresan madde
gömülüdür.
Floresan madde sıvı besiyerindeki oksijen varlığına
duyarlıdır.
Üreyen mikobakterilerce oksijenin kullanılması sonucu
floresans oluşumu
KÜLTÜR
Tam otomatize sistemler :
„ Sistemler arasında izolasyon oranı açısından önemli bir
fark yok.
„ Mikobakterileri üretme süreleri, radyometrik BACTEC
460 TB ile hemen hemen aynıdır.
„ Kontaminasyon oranları açısından sistemler arasında
önemli bir fark yok ancak, bu sistemlerde oran BACTEC
460 TB ve katı besiyerlerine göre daha yüksek
„ CDC → Sıvı + katı besiyeri kombinasyonu
Mikobakterilerin izolasyon şansını arttırıyor.
2006 Yılı Düzen Laboratuvarı
BACTEC Kültür ve ARB Verileri
ARB
POZİTİF
BACTEC
NEGATİF
TOPLAM
POZİTİF
55
65
120
NEGATİF
1
992
993
TOPLAM
56
1057
1113
İdentifikasyon Yöntemleri
„ Konvansiyonel biokimyasal yöntemler
„ NAP (p-nitro-a- acetylamine-b- hydroxyprophonone)
(BACTEC)
„ Moleküler yöntemler
„
„
„
„
AcuProbe DNA hibridizasyon
PCR-RFLP
INNO-LiPA
DNA sekanslama
İdentifikasyon yöntemleri
Konvansiyonel biokimyasal yöntemler
„ Üreme hızı, üreme ısısı
„ TCH (Thiophene-2-
„ Pigment üretimi
„ Koloni ve mikrokoloni
„
„
„
„
görünümü, kord faktör
oluşumu
Niasin testi
Nitrat redüksiyonu testi
Katalaz testi
PNB (para-nitro benzoik asit)
içeren besiyerinde üreme
„
„
„
„
„
carboxylic acid hydrazide) ile
üremenin inhibe edilmesi
Pirazinamidaz testi
Tween 80 hidrolizi testi
Arilsülfataz testi
Tellurit redüksiyonu
Üreaz testi
İdentifikasyon yöntemleri
Kord oluşumu
„ Duyarlılık >%90
İdentifikasyon yöntemleri
Niasin birikimi;
Niasin NAD’a dönüşemeyip besiyerinde birikir
„ M. tuberculosis
„ M. simiae
niasin (+)
„ M. chelonae
„ M. bovis’in bazı suşları
„ LJ’de, 3 haftalık kültürler ile çalışılmalıdır
„ Kullanılan ayıraçlar toksiktir
İdentifikasyon yöntemleri
Nitrat redüksiyonu
Nitroredüktaz enzimi ile nitratların nitritlere
indirgenmesi
„ M. tuberculosis
M. kansasii
M. szulgai
nitroredüktaz üretir
„ Asitli ortama amin eklendiğinde kırmızı diazonium
boyası oluşur
İdentifikasyon yöntemleri
Katalaz aktivitesi
INH dirençli M. tuberculosis
M. bovis dışında bütün mikobakteriler
katalaz (+).
„ Semikantitatif katalaz testi
„ Isıya stabil katalaz testi
M. tuberculosis kompleks;
Katalaz aktivitesi düşük ve ısıya stabil değil
İdentifikasyon yöntemleri
„
„
„
„
TCH varlığında üreyebilme
Niasin (+) M. bovis’i M. tuberculosis’den ayırır.
M. bovis TCH’a duyarlıdır
Kontrole göre >%1 üreme varsa; TCH dirençli
Besiyeri karanlıkta saklanmalıdır
İdentifikasyon yöntemleri
M.tbc
Üreme sıcaklığı
Pigmentasyonu
Niasin
TCH üreme
Nitrat indirgenmesi
Semikantitatif katalaz
68 C katalaz
Tween hidrolizi
Tellurit indirgenmesi
%5 NaCl tolerans
Arilsülfataz (3gün)
Üreaz
Pirazinamidaz(4gün)
M.africanum
37 C
37C
Nonkromojen(100) N
+ (95)
V
+
V
+
V
< 45 mm (89)
< 45 mm
± (68)
± (36)
± (64)
+
+
-
M.bovis
37C
N(100)
-(4)
-(9)
< 45 mm (69)
-(21)
-(0)
-(0)
± (50)
-
İdentifikasyon yöntemleri
NAP ile inhibisyon-BACTEC
„ Duyarlılık>%95
„ M. kansasii, M. gastri, M. terrae kısmen inhibe olabilir
„ 4 günden önce değerlendirilmemeli
„ Biyokimyasal testler veya moleküler yöntemlerle
desteklenmeli
İdentifikasyon yöntemleri
İdentifikasyon yöntemleri
PCR-RFLP
„ Hsp 65 geni PCR ile çoğaltıldıktan sonra, BstE II ve
Hae III enzimleriyle kesilip poliakrilamid jelde
yürütüldüğü bir yöntem
„ En az 32 Mikobakteri türünü birbirinden ayırabiliyor.
„ M.tbc complex içinde tür ayrımı yapamıyor.
Moleküler yöntemler
„ Tüberküloz tanısında kullanılan moleküler testler, hızlı ve
özgüllükleri yüksek olmakla birlikte duyarlılıkları
kültürden düşüktür.
„ Kültürde üreyen mikroorganizmaların sulandırılması ile
yapılan çalışmalarda saptama sınırı 5-100 CFU arasında
değişirken, gerçek klinik örneklerde duyarlılıklar çok daha
düşük bulunmaktadır.
Moleküler yöntemler
„ Klinik örneklerde tüberkülozun saptanmasında geleneksel
‘in-house’ PCR yönteminin geçerliliği ve
tekrarlanabilirliğinin belirlenmesi amacıyla yapılan bir
çalışmada, basil miktarı standardize edilmiş örnekler aynı
hedef bölgenin çoğaltıldığı yedi laboratuarda test
edilmiştir. Bu çalışmada, duyarlılık ve özgüllüklerin %290, yalancı pozitifliklerin ise %3-77 oranında değiştiği
saptanmıştır.
„ Günümüzde klinik örnekte M.tuberculosis saptanmasında
standardize moleküler testler tercih edilmektedir.
Moleküler yöntemler
„ Amplicor MTB test (Roche Diagnostics)
„ AMTD (Gen-Probe) testi
„ SDA (BD ProbeTec ET)
„ LCx MTB (Abbott)
„ Real-time PCR
„ Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics)
Moleküler yöntemler
Amplicor MTB test (Roche Diagnostics)
¾ İlk ticari kit
¾ Yayma pozitif solunum yolu örneklerinde kullanılmak
üzere FDA onaylı
¾ 16S rRNA
¾ Cobas Amplicor MTB, bu testin otomotize versiyonudur.
¾ Test süresi yaklaşık 4 - 4.5 saat
Moleküler yöntemler
AMTD (Gen-Probe)
¾ FDA onaylı ilk amplifikasyon testidir.
¾ RNA temelli ve izotermal bir çoğaltma yöntemidir.
¾ TMA (transcription mediated amplification)
¾ Test süresi yaklaşık 3.5 saat
Düzen Laboratuarı 2001-2007 AMTD
Sonuçları
AMTD
POZİTİF
NEGATİF
TOPLAM
27
8
35
NEGATİF
18
979
997
TOPLAM
45
987
1032
BACTEC POZİTİF
¾ARB(+), AMTD(+) hasta sayısı:4
¾ARB(-), AMTD(-) hasta sayıs:41
Moleküler yöntemler
SDA (Strand Displacement Amplification) (BD ProbeTec ET)
¾ DNA polimeraz ve restriksiyon enzimlerinin birlikte yer aldığı
izotermal bir yöntemdir.
¾ M.tuberculosis komplekse özgül IS6110 ve tüm mikobakterilerde
bulunan 16S rRNA hedef dizileri birlikte çoğaltıldığından
M.tuberculosis tür tayini yapabilmektedir.
¾ Toplam test süresi yaklaşık 3 saat
Moleküler yöntemler
LCx MTB (Abbott)
¾ Prob molekülünün çoğaltıldığı ligaz zincir reaksiyonu
(LCR) yöntemi kullanılmaktadır.
¾ Çoğaltma termal cycler da yapılmaktadır.
¾ Test süresi yaklaşık 5 saat
Moleküler yöntemler
Real-time PCR
¾ Çoğaltma ile birlikte ve eş zamanlı olarak gerçekleşen
saptama, DNA ya bağlanan boyalar veya floresan veren
boyalar ve işaretli problar ile sağlanmaktadır.
¾ Yöntemin avantajları, PCR sonrası ürün saptama
basamaklarının olmaması, kısa sürede sonuçlanması,
kantitasyon yapılabilmesi ve kontaminasyon riskinin çok
düşük olmasıdır.
Moleküler yöntemler
Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics)
¾ Hibridizasyon yöntemidir.
¾ Klinik örneklerde M.tuberculosis kompleks ve rifampisin
direnci birlikte saptanabilmektedir.
Moleküler Tanı Sistemlerinin Performansı
(Solunum Örnekleri)
TİCARİ
SİSTEMLER
DUYARLILIK
%
ÖZGÜLLÜK
%
PPD
%
NPD
%
MTD
88.0 - 91.2
99.1 - 100
93.9 - 98.6
91.7 - 99.4
COBAS
AMPLICOR
78.3 - 96.1
99.7 - 100
90.9 - 100
97.5 - 99.8
LCx
85 - 100
99.3 - 100
98.7 - 100
98 - 100
SDA (BD Probe
Tec ET)
87.5 - 92.7
96.0 - 99.0
70.0 - 97.0
96.0 - 99.7
Moleküler yöntemler
„ Moleküler testlerin klinik örnekte tüberküloz varlığının
saptanmasında, ARB mikroskopisi ve kültür ile birlikte
uygulanması önerilmektedir.
„ Amplikor ve AMTD testleri, M.tuberculosis ile tüberküloz
dışı mikobakteri ayrımının yapılabildiği merkezlerde, son
bir yıl içinde tedavi almayan hastaların solunum yolu
örneklerinde kültür ile birlikte yapılması koşulu ile FDA
onayı almıştır.
CDC Morb Mortal Wkly Rep:2000;49:593-4
Moleküler yöntemler
Laboratuvar tanıda moleküler ticari sistemler;
„ TB şüpheli hastaların,özellikle yayma (+) solunum örneklerinde
„ Hastalığın eradikasyonu için mücadelede,
„ Tedavinin takibi ve yönlendirilmesinde, etkili görünmektedir.
„ Mevcut ticari ürünler asla tarama amaçlı kullanılmamalı,
„ Referans laboratuvarlarda kurulmasına önem verilmeli,
„ Konvansiyonel yöntemlerin altın standart olduğu unutulmamalı
Duyarlılık Testleri
CDC
Her hasta için kültürde izole edilen ilk M.tuberculosis
izolatına duyarlılık testi
Üç aylık tedaviden sonra,
kültür pozitifliği devam eden veya
„ klinik yanıtsızlığı olan her hastada testin tekrarı
„
Duyarlılık Testleri
CLSI’a göre
„
Primer İlaçlar
„
„
„
„
İzoniazid
Rifampisin
Etambutol
Pirazinamid
Ülkemizde
„ Primer İlaçlar
„
„
„
„
„
Sekonder ilaçlar
„
„
„
„
„
„
Streptomisin
Kapreomisin
Etionamid
Kanamisin
Ofloksasin
Rifabutin
İzoniazid
Rifampisin
Etambutol
Streptomisin
Duyarlılık Testleri
Agar Proporsiyon Yöntemi:
„ Referans yöntemdir.
„ 10-2, 10-4 dilüsyonlu inokulumlar kullanılır.
10-2
10-4
Duyarlılık Testleri
İlaçlı b.y. de üreyen koloni
sayısı
İlaçsız b.y. de üreyen koloni
sayısı
≥ %1 (KP) Î R
Duyarlılık Testleri
Proposiyon yöntemi
Direkt test
Dekontamine ve konsantre
edilmiş
ARB pozitif örnek kullanılır.
İndirekt test
Primer kültürde üremiş saf
bakteri kolonileri kullanılır.
Duyarlılık Testleri
„ CDC;
örnek kabul edildikten sonra 30 gün içinde primer ilaçlara
karşı duyarlılık sonuçları bildirilmelidir.
„ Bu amaçla CLSI;
FDA’in de onayladığı bazı hızlı, sıvı besiyerinde kültüre
dayalı ticari sistemlerin kullanılabileceğini kabul etmiştir.
„ BACTEC 460 TB,
„ MGIT 960,
„ ESP II
Duyarlılık Testleri
Duyarlılık Test Sonuçları
„ Geciktirilmeden bildirilmelidir.
„ Her bir ilacın adı ve sonucun yorumu mutlaka belirtilmelidir.
„ CLSI alt komitesi;
„
kullanılan yöntem ve besiyeri;
„
kullanılan konsantrasyonlar ve referans yönteme eşdeğer
karşılıkları,
„
direnç oranının belirtilmesini önermektedir.
Düzen laboratuarı, 1994-2006 yıllarına ait
majör ilaç direnç yüzde verileri
Major Duyarlılık Testi Sonuçları
70
60
%
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
YILLAR
8
9
10 11 12
Hepsi duyarlı
5 ilaca R
1 ilaca R
2 ilaca R
3 ilaca R
4 ilaca R
Birlikte neler yapabiliriz?
„ Tüberküloz şüpheli bir vakada EZN ve kültür çalışmasını mutlaka
birlikte yapılmasını sağlamalıyız. (idealinde 3 örnekte)
„ Her hastadan izole edilen ilk M.tuberculosis suşunun mutlak majör
ilaçlara direncine bakmalıyız.
„ Tedavinin üçüncü ayında hala kültür pozitifliği süren hastalarda direnç
gelişiminden şüphelenmeli, duyarlılık tetsini tekrarlamalı ve minör ilaç
dirençlerine bakmalıyız.
„ Hızlı tanı için moleküler testleri kullanmalı, ancak yanında altın
standart kültür tetslerini mutlaka istemeliyiz.