RD-100i OSNA® – Meme kanserinde yeni nesil sentinel lenf nodu

RD-100i
OSNA® – Meme kanserinde
yeni nesil sentinel lenf nodu analizi
www.sysmex.com.tr
RD-100i
OSNA® – Meme kanserinde
yeni nesil sentinel lenf nodu analizi
Sentinel nod biyopsisi erken evre, klinik açıdan nod-negatif
meme kanseri hastaları için tercih edilen cerrahi prosedür
olarak hızla ön plana çıkmıştır. Sentinel lenf nodunun (SLN)
konvansiyonel intra-operatif analizi şimdiye kadar hızlı
H&E (hematoksilen ve eozin) boyalı touch imprint sitolojisi
veya frozen section yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Bu
histopatolojik yöntemlerin duyarlılığı düşüktür çünku lenf
nodu dokusunun yalnızca küçük bir kısmı intra-operatif
(ameliyat esnasında) koşullarda araştırılabilir. Bunun bir
sonucu olarak, yalnızca post-operatif (ameliyat sonrası)
yapılacak inceleme ile tanımlanabilen yalancı negatif
sonuçlar elde etme riski yüksektir.
OSNA® (Tek Adımlı Nükleik Asit Amplifikasyonu) ilk kez intraoperatif süreçte tüm lenf nodunun analizinin gerçekleştirilebildiği yeni ve yaygın olarak kullanılan tanı yöntemidir.
Eksiksiz bilgiye dayalı nihai bir klinik karar, ikinci bir cerrahi
prosedür veya doğrulayıcı bir histopatolojik analize gerek
kalmadan güvenle alınabilir.
Klinik validasyon çalışmaları ve sonuçları
275 – 300
250 – 275
225 – 250
200 – 225
175 – 200
150 – 175
125 – 150
% 96.7 100 – 125
Özgüllük
50 – 75
% 95.6 75 – 100
Duyarlılık
25 – 50
% 96.5 Sınır değeri
(Cut-off)
0 – 25
Konkordans oranı
Özgüllük çalışması sonuçları
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ND
Özet olarak, 2313 lenf nodu analiz edilmiş ve sonucunda
aşağıdaki performans verileri elde edilmiştir:
Bu özgüllük çalışmasında test edilen negatif lenf nodlarının
CK19 mRNA kopya sayısı, OSNA® tetkikinde tanımlanan
sınır (cut-off) değerinin önemli ölçüde altında kalmıştır. Bu
veriler, yalancı pozitif sonuç riskinin neredeyse tamamen
dışlanabileceğini göstermektedir (Şekil 4).
Lenf nodu sayısı
OSNA® yöntemi, farklı ülkelerde yapılan çok merkezli birçok
çalışmada değerlendirilmiştir [1–5]. OSNA® bu çalışmaların
tümünde, kapsamlı bir histopatolojik inceleme ile karşılaştırılmıştır. Lenf nodları özel bir kesme cihazı ile kesilerek
1 veya 2 mm genişliğinde 4 kesite ayrılmıştır. Birbirini takip
eden kesitlere ya OSNA® analizi uygulanmış ya da devamlı
kesitler çok düzeyli histoloji için kullanılmıştır. 100, 200
veya 250 μm'lik aralıklı şeritler ile 5 düzeyden kesitler
elde edilmiştir.
CK19 mRNA (kopya/μL)
Japonya'da yapılan bir çalışmanın parçası olarak, pN0
hastalarda (144 lenf nodunun analiz edildiği) OSNA®
özgüllüğünün % 100 olduğu gösterilmiştir (Tablo 1).
patolojik inceleme
n =144
OSNA®
pozitif
negatif
makro
mikro
–
(++)
0
0
0
(+)
0
0
0
(–)
0
0
144
Özgüllük: %100 (%95 GA: 0,935 ~ 0,993)
Şekil 4 60 pN0 hastadan elde edilen 144 lenf nodunun CK19 mRNA kopya
sayısının dağılımı.
Tüm klinik değerlendirmelerin sonuçları CK19 mRNA'sının
meme kanseri lenf nodu metastazlarının saptanmasında
mükemmel bir moleküler belirteç olduğunu göstermektedir.
Sonuç olarak, OSNA® tetkiki meme kanseri hastalarından
elde edilen sentinel nod biyopsi örneklerindeki metastazların hızlıca saptanmasını sağlayan bir tanı aracı olarak
uygulanabilir.
IVD ile tam uyumludur ve AB genelinde tanı amaçlı
kullanım için tam olarak onaylanmıştır.
Tablo 1 60 pN0 hastadan elde edilen 144 lenf nodunun analizi % 100 oranında
özgüllük göstermiştir
Yayın referansları
[1] Tsujimoto M et al. (2007): One-Step Nucleic Acid Amplification for
Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer
Patients. Clin Cancer Res 13(16). 4807.
[4] Tamaki Y et al. (2009): Molecular detection of lymph node metastases
in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step
nucleic acid amplification assay. Clin Can Res. 15 : 2879 – 84.
[2] Visser M et al. (2008): Intra-operative rapid diagnostic method based on
CK19 mRNA expression for the detection of lymph node metastases in
breast cancer. Int. J. Cancer. 122.2562.
[5]Snook KL et al. (2010): Multicentre evaluation of intraoperative
molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma.
Br J Surg, DOI: 10.1002/bjs.7347.
[3] Schem C et al. (2009): One Step Nucleic Acid Amplification – a molecular method for the detection of lymph node metastases in breast cancer patients; results of the German study group. Virchows Arch. 454.203.
[6] Frère-Belda MA et al. (2012): Diagnostic performance of one-step nucleic acid amplification for intraoperative sentinel node metastasis detection in breast cancer patients. Int J Cancer. 2012 May 15 : 130(10) : 2377 – 86.
İleri teknoloji
OSNA®, Sitokeratin 19 (CK19) mRNA ekspresyonunun
saptanmasına yönelik hızlı bir nükleik asit amplifikasyon
teknolojisinden (RT-LAMP*) yararlanan otomatize edilmiş
moleküler tanı yöntemidir. CK19 epitel hücre belirtecidir
ve normalde lenf nodu dokusunda mevcut değildir. CK19
mRNA ekspresyon miktarı, metastatik odakların büyüklüğü
ile korelasyon gösterir: Sistem, metastatik tümör yükünün
boyutuna işaret eder. Hasta sonucunun değerlendirilmesi
standart eğrinin üç farklı kalibratör ile karşılaştırılmasına
dayalıdır.
Belirteç seçimi
OSNA® yönteminin geliştirilmesi sırasında Sysmex, halka
açık insan gen ekspresyonu veritabanından 45 aday mRNA
belirteci seçmiştir. Seçim kriterleri, normal lenf nodu
dokusunda minimal düzeyde olan veya hiç gözlenmeyen
ekspresyon ile birlikte meme bezi dokularında yüksek
mRNA ekspresyon düzeyi olarak tanımlanmıştır. Bu mRNA
belirteçlerinin ekspresyon oranı histopatolojik olarak pozitif
ve negatif lenf nodları kullanılarak değerlendirilmiştir
(Şekil 1 a + b).
45 potansiyel belirteç gen testi
İkinci bir adımda, metastatik pozitif lenf nodlarında yüksek
mRNA ekspresyonu gösteren ve negatif lenf nodlarında
minimal ekspresyon sergileyen, en çok ümit vaat eden yedi
aday belirteç daha fazla sayıda lenf nodunda daha ayrıntılı
şekilde değerlendirilmiştir (Şekil 2).
Bunun sonucunda, CK19 mRNA'sının metastatik lenf
nodlarında yüksek ekspresyon seviyesi ve metastatik
olmayan lenf nodlarında düşük ekspresyon seviyesi
göstermesine ve dolayısıyla yüksek duyarlılık potansiyeli
ve metastatik lenf nodlarını metastatik olmayanlardan
ayırt edebilme kapasitesi sunmasına bağlı olarak en uygun
belirteç olarak tanımlanmıştır.
+–
+–
+–
+–
+–
+–
CK19FOXA1SPDEF CEA MGB1TACSTD2
+–
MUC1
FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (ETS transkripsiyon faktörü içeren SAM pointed domain),
CEA (karsinoembriyonik antijen), TACSTD2 (tümörle ilişkili kalsiyum sinyal transdüseri 2),
MGB1 (mammaglobin 1), MUC1 (musin 1)
Şekil 2 Histopatolojik olarak pozitif ve negatif lenf nodlarında mRNA
ekspresyonu
Şekil 1a Histopatolojik olarak pozitif ve negatif lenf nodları arasındaki mRNA
ekspresyonu oranı
Şekil 1b Histopatolojik olarak pozitif lenf nodlarında her mRNA belirtecinin
ekspresyonu
*RT-LAMP = Ters transkriptaz loop-aracılı izotermal amplifikasyon;
Eiken Chemical CO., LTD ile anlaşma uyarınca lisanslıdır.
RT-LAMP teknolojisi
Yenilikçi amplifikasyon teknolojisi RT-LAMP, konvansiyonel
PCR yöntemlerine göre çeşitli avantajlar sağlayan hızlı bir
izotermal prosedürdür. Amplifikasyon reaksiyonu 16 dakika
sürmekte ve öncesinde hiçbir RNA saflaştırması gerekmemektedir. Örnek hazırlama koşulları ve özel primer tasarımı,
yüksek spesifikliğin sağlanması ve yalancı pozitif sonuçların
bertaraf edilmesi amacıyla özel olarak ayarlanmaktadır.
Süreç, RD-100i otomatik amplifikasyon ve saptama
sisteminde gerçek zamanlı olarak izlenmektedir. Sonuçlar,
analiz edilen SLN sayısına bağlı olarak yaklaşık 30–45
dakika içinde elde edilmektedir (Şekil 3).
CK19 psödogenlerinin veya transkriptlerinin amplifikasyonunu engellemek ve buna ek olarak tetkikin reaksiyon hızını
arttırmak amacıyla özel olarak tasarlanmış RT-LAMP'ta altı
farklı primer kullanılmaktadır.
LAMP Primeri
Genomik DNA'nın istenmeyen amplifikasyonu örnek
hazırlama süreci boyunca düşük pH'de (3,5) ve 65 °C'de
izotermal reaksiyon sıcaklığında DNA presipitasyonu ile
engellenmektedir.
Şekil 3 Reaksiyonun gerçek zamanlı olarak izlenmesi
Tüm reaktifler kullanıma hazırdır.
B1
B2
5’
3’ Hedef RNA
3’
5’ cDNA
SLN'nin tanımlanması için kullanılan mavi boyalar veya
radyoizotop kolloidler OSNA® reaksiyonu ile etkileşmez.
F2
F1
L1
3’
5’
L2
n
65 °C'de izotermal prosedür
n
Yüksek hızda reaksiyon (16 dakika)
n
RNA saflaştırma gerekmez
İstenmeyen psödogen ve genomik
amplifikasyonu yoktur
n
n
F1: İleri Primer 1
F2: İleri Primer 2
B1: Geri Primer 1
B2:Geri Primer 2
L1: Loop Primer 1
L2: Loop Primer 2
veya :DNA domaini
veya :komplementer
domain
6 primer sayesinde yüksek spesifiklik
Teknik Özellikler
Araç
Gen Amplifikasyonu Saptama Sistemi
Yöntem
RD-100i OSNA® (Tek Adım Nükleik Asit Amplifikasyonu)
Parametre
CK19 mRNA
Teknoloji
RT-LAMP (ters transkriptaz loop-aracılı izotermal amplifikasyon)
Saptama
Reaksiyonun derecesine bağlı magnezyum pirofosfat presipitasyonundan
kaynaklanan yayılan ışık değişimi
Görüntülenen parametreler
CK19 Q (CK19 Kalitatif Sonucu)
CK19 (CK19 Yükselme Zamanı)
CK19 C (CK19 mRNA-konsantrasyonu)
Verim
seri başına 4 örnek
Örnek başına doku aralığı
50 – 600 mg
Örnek hacmi
2 μL
Reaktifler
homojenize edici reaktif LYNORHAG
amplifikasyon reaktifi LYNOAMP BC
tüm reaktifler kullanıma hazırdır
Veri depolama
2 000 örnek
Kalite kontrol
pozitif ve negatif kontrol
dosya başına 180 veri noktası
Arayüzler
ana bilgisayar bağlantısı (RS232, LAN)
yazıcı bağlantısı (USB)
Ağırlık
yaklaşık 66 kg
Boyutlar (g x y x d)
596 x 548 x 622 mm
Sysmex Servis Yetkilisi ve uzaktan erişim ile isteğe bağlı SNCS
Türkiye Distribütörü: Sysmex Turkey Diagnostik Sistemleri Ltd. Şti
© Copyright 2015 – Sysmex Europe GmbH
Rüzgarlıbahçe Mah. Şht. Yzb., Sinan Eroğlu Cad. No:6, Akel İş Merkezi A Blok Kat -5, Kavacık Beykoz, İstanbul, Türkiye · Telefon +90 216 681 66 00 · Fax +90 216 680 60 00
[email protected] · www.sysmex.com.tr
Yetkili temsilci: Sysmex Europe GmbH
Bornbarch 1, 22848 Norderstedt, Almanya · Telefon +49 40 52726-0 · Fax +49 40 52726-100 · [email protected] · www.sysmex-europe.com
Üretici: Sysmex Corporation
1-5-1 Wakinohama-Kaigandori, Chuo-ku, Kobe 651-0073, Japonya · Telefon +81 78 265-0500 · Fax +81 78 265-0524 · www.sysmex.co.jp
www.sysmex-europe.com/contacts adresi üzerinden yerel Sysmex temsilcinize ulaşabilirsiniz.
ZE000547.TR.N.12/15
Tasarım ve özellikler gelecekteki ürün gelişimlerine bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
Değişiklikler, yapıldıkları tarihe bağlı olarak yeni dökümanlarda yer almak suretiyle ve doğrulama yapılarak onaylanır.