docDeneysel Astım Modelleri
download 
Şikayet Transkript
Deneysel Astım Modelleri
Deneysel Astım Modelleri Doç. Dr. Meral KARAMAN DEÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD. DEÜ SBE Laboratuar Hayvanları Bilimi AD. [email protected] Astımda deneysel hayvan modellerinin kullanım amaçları • • • • • Fonksiyonel ve yapısal değişikliklerin araştırılması Etyopatogenezin aydınlatılması Enflamatuar sürecin belirlenmesi Havayolu davranışlarındaki değişimlerin araştırılması Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi Russel ve Burch (1959) Deneysel çalışmalarda hayvan kullanımına ait 3R kuralı; • Replacement: Alternatif yöntemleri sorgulamak • Reduction: Kullanılacak hayvan sayısını azaltmak • Refinement: Deneylerin hayvana ağrı ve acı verilmeden yapılması • Responsibility :Hayvanlara karşı sorumlulukların bilinmesi Laboratuvar hayvanı modelleri • • • • • Spontan modeller İndüklenmiş modeller Negatif modeller Olası modeller Transgenetik modeller Astım modeli oluşturmada temel basamaklar • Uygun hayvan türünün seçimi (Anatomik, biyolojik, fizyolojik özellikler) • İnsandaki hastalığa en uygun model (Patogenezin taklit edilmesi) • Çalışmanın amacı, hipotezler • Modeli oluşturacak etken madde (Verilme yolu, konsantrasyonu, hacmi, süresi…) • Modelin oluşumuna ait kanıtlar (Fiziksel, biyokimyasal, mikrobiyolojik ya da histopatolojik) • Hayvan deneyleri yerel etik kurulu onayı • Hayvan Refah Birimi denetimi Astım çalışmalarında uygun hayvan türleri • • • • • • • • Fare (BALB/c, C57BL, A/J…) Sıçan (Wistar albino, Spraque dawley, Brown-Norway …) Kobay Köpek Koyun Kedi Maymun Domuz Astım Fare Modelleri AVANTAJLARI • • • • • • • Memeli hayvanlara en iyi örnektir. Genetik yapıları, anatomik ve biyolojik özellikleri iyi bilinmektedir. Genetik olarak bir örnek soylara ulaşmak kolaydır. Gebelik süresi kısa (21 gün), bir batında doğan yavru sayısı fazladır (8-12) Küçük boyutludurlar, çalışmada uygulama basamakları kolaydır. Üretilmeleri, yetiştirilmeleri ve barındırılmaları kolaydır. Ucuz ve kolay ulaşılır. Fare modellerinin avantajları • Kolaylıkla sensitize edilebilirler. (OVA, HDM, A. fumigatus ag.) • Yüksek düzeyde antijen spesifik IgE, eozinofil hakimiyeti olan enflamasyon ve Th2 sitokin (IL-4, IL-5, IL-13) yanıtı gösterirler. • Fare ile ilişkili genetik teknolojiler çok fazladır. • Ticari olarak fare spesifik kitlerin sayısı fazladır. • Literatür ışığında tartışmak kolaydır. Fare modellerinin dezavantajları • Nazal solunum yaparlar. • Model için yüksek dozda alerjen /antijene gereksinim duyulur. • Sistemik sensitizasyon doğal bir modelleme değildir. • Ovalbümin aeroalerjen değildir. • Havayolları aşırı duyarlılığı insan ile karşılaştırıldığında küçüktür. • Farelerde spontan astım modeli gelişmez. • Fare (Rodent) mast hücreleri serotonin salgılar. Fare modellerinin dezavantajları İNSAN FARE EPR; Early phase responses LPR; Late phase responses AHR; Airway hyperresponsiveness • İnhale alerjeni izleyen süreçte bronşlarda LPR gelişip gelişmediği tartışmalıdır. AHR kalıcı değildir. Fare modellerinin dezavantajları Postür farklılığı Akciğerin anatomik yapısı,bronş dallanmaları farklıdır. Zosky GR, Clin Exp Allergy 2007 Fare modellerinin dezavantajları • • • • • Kronik astım modeli? (Tekrarlayan inhale alerjene tolerans) Th2 yanıtı çok güçlüdür. (Modellemede bias?) Alerjik alveoliti de taklit edebilir. Eozinofil degranülasyonu düşük düzeydedir. Etik kaygılar (Merdiven altı üreticiler, ruhsatsız laboratuvarlar…) Specific IgE ++ ++ MC degranulation +++ ++ (serotonin) Early bronchoconstriction +++ + Late bronchoconstriction +/- (50%) - +++ + BAL eosinophils (%) 10-20% 20-80% EOs degranulation +++ + Th2 driven + +++ Goblet/mucus ++ ++ Fibrosis +++ ++ Basement membrane +++ + Smooth muscle hyperplasia +++ +/- Airway vascular remodeling ++ + AHR (vivo) Astım Sıçan Modelleri Farelerden farklı olarak AVANTAJLARI; • Daha büyük ve daha geniş hacimli oldukları için serum, BAL, organ ya da doku almak, manuplasyonlar daha kolaydır. • Sıçanda LPR gelişimi kullanılan protokole göre değişmektedir. Sıçan türleri arasında en uygun model sıçanı olarak tanımlanan Brown Norway sıçanlarda akut cevap hem EPR hem de LPR ile karekterizedir. Astım Sıçan Modelleri Farelerden farklı olarak DEZAVANTAJLARI; • Genetik teknolojilerin çeşitliliği daha azdır. • Sıçan spesifik kitlerin çeşitliliği daha azdır. İnhale alerjeni takiben akciğer fonksiyonları İnsan Sıçan Kobay Köpek • Sıçan, kobay ve köpekte LPR gelişimi kullanılan protokole göre değişmektedir. • Sıçan türleri arasında en uygun model sıçanı olarak tanımlanan Brown Norway sıçanlarda akut cevap hem EPR hem de LPR ile karekterizedir. Astım Kobay Modelleri AVANTAJLARI • Mesleksel astım ve atopik astım modellerinde tercih edilir. • Artmış hava yolu hiperreaktivitesi ve eozinofili ile karekterize yanıt verir. • Özellikle kimyasal irritanlara, proteinlere karşı kontakt hipersensitivite çalışmalarında tercih edilir. Astım Kobay Modelleri DEZAVANTAJLARI • İnbred soyları az bulunur. • Hassas laboratuvar hayvanlarıdır. • Bakım ve barındırma koşulları sorunludur. • Kobay spesifik kitlerin çeşitliliği azdır. • Metakolin, histamin ve alerjeni izleyen solunum yolu yanıtları insan ile aynı, lökotrien yanıtları ise farklıdır. • Diğer rodentlerde olduğu gibi serotonin bronkokonstriksiyona neden olur. Astım Büyük Hayvan Modelleri • Kedi, köpek, koyun, domuz, maymun kullanılabilir. • Köpekler alerjik solunum yolu hastalıklarından ziyade dermatit ya da konjuktivit de tercih edilir. • Geleneksel modellerle alerjen inhalasyonuna yanıtta akut fizyolojik konstruksiyon, eozinofili, artmış IgE düzeyleri ve AHR gibi belirteçler görülebilir. • Koyun ve köpeklerin solunum yollarında alerjik cevabı ortaya çıkarmak için Ascaris suum etkilidir. Astım Büyük Hayvan Modelleri • Koyunlar insan astım patogenezini taklit etmede en uygun model hayvandır. • Tıpkı insandaki gibi alerjen inhalasyonu takiben sırasıyla EPR, LPR ve AHR gözlenir. İNSAN KOYUN Eozinofil Astım Patogenezi IL-3, IL-5 GM-CSF Kronik Eozinofilik İnflamasyon ECP MBP NO IL-4 IL-5 IL-3 SCF Histamin LTC4 PGD2 Mast hücresi Th2 Lenfosit IgE IL-4 IL-13 B Lenfosit •Subepitelyal fibrozis •Düz kas hipertrofisi •Goblet hücre hiperplazisi •Revaskülarizasyon •Epitel yıkımı Akut İnflamatuar Ataklar •Bronkospazm •Vazodilatasyon •Permeabilite artışı •Ödem •Mukus sekresyonu Astımlı havayolundaki enflamatuar hücreler • • • • • • Mast hücreleri (mukozal, düz kas içi) Eozinofiller (remodeling) Th2 lenfositler (Reg T hüc , NK hüc ) Dendritik hücreler Makrofajlar Nötrofiller ( ağır astım, sigara içimi) GINA 2006 Farede Akut Astım Modelleri OVA;Ovalbümin, Blag 2;Blatella germanica(cockroach allergen), Derf 1;Dermatophagoides farinae 1 (House dust mite allergen), EAR;Early asthmatic response, LAR;Late astmatic response Nials AT, Dis Model Mech 2008 Farede Kronik Astım Modelleri (Nials AT, Dis Model Mech 2008) *Ev tozu akarları, koagüle yumurta beyazı implantı, hamam böceği antijenleri, Aspergillus fumigatus antijenleri kullanılabilir. FAREDE KRONİK ASTIM MODELİ OLUŞTURMA PROTOKOLÜ Temelkovski ve ark. Fare cinsi Alerjen Sensitizasyon Challenge Son alerjen uygulamasından sonraki yanıtlar BALB/c OVA OVA+AlOH3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde İnhale OVA 6-8 hafta 3 gün/ hafta 30 dk/gün •İntraepitelyal eozinofili, •Lamina propriada mononüklear hücre infiltrasyonu, •Remodeling, •TH2 sitokinlerin artışı Temelkovski et al. Thorax,1998 FAREDE KRONİK ASTIM MODELİ OLUŞTURMA PROTOKOLÜ Temelkovski ve ark. OVA+AlOH3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde FAREDE KRONİK ASTIM MODELİ OLUŞTURMA PROTOKOLÜ Henderson ve ark. Fare cinsi Alerjen Sensitizasyon Challenge Son alerjen uygulamasından sonraki yanıtlar BALB/c OVA OVA+AlOH3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde İntranazal OVA 14., 27., 28., 47., 61. ve 73-75. günlerde •Eozinofilik ve mononüklear hücre infiltrasyonu, •Goblet hücre hiperplazisi, •Subepitelyal kollajen •Remodeling,??? •TH2 sitokinlerin artışı??? Dis Model Mech. 2008 Diğer alerjenler Farelerde mesleksel astım modeli • Toluenediisocyanate • Trimelliticanhydride(TMA), solunum duyarlaştırıcısı(Daha fazla solunum cevabı) • 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(DNCB), dermal duyarlaştırıcı. Farede Astım Atak Modelleri • Kronik astım modeli oluşturulan farelerde nebulize ovalbumin uygulamasının 75. gününde metakolin inhalasyonu ile akut atak oluşturulabilir. • İnhale metakolin 6.25 – 12.5 ve 25 mg/ml yoğunluğunda 1’er saat ara ile 3 dk boyunca verilir. • Her metakolin dozundan önce 0.dakikada ve 5 dakika sonra O2 saturasyonu pulse oksimetre cihazı ile karın cildi traş edilmiş farelerin karın cildinden ölçülür. Sensitizasyon ve inhalasyon prosedürü OVA+AlOH3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde Nebulize OVA (%2.5) (21. günden başlayarak 74. güne kadar, 8 hafta boyunca, haftada 3 gün, günde 30 dakika) Astım Atak grupları 75. Gün Astım Atak prosedürü Kontrol grupları O2 saturasyonu ölç, 6.25mg/ml İnhale Metakolin 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O2 saturasyonu ölç, İnhale serum fizyolojik 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O2 saturasyonu ölç, 12.5 mg/ml İnhale Metakolin 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O2 saturasyonu ölç, İnhale serum fizyolojik 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O2 saturasyonu ölç 1 saat ara ver. O2 saturasyonu ölç, 25 mg/ml İnhale Metakolin 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O2 saturasyonu ölç O2 saturasyonu ölç, İnhale serum fizyolojik 3 dk süreyle ver. 5 dk sonra O2 saturasyonu ölç Temelkovski et al. Thorax,1998 Astım hayvan modellerinde laboratuvar incelemeleri Sensitizasyon ve inhalasyon prosedürü OVA+AlOH3 (intraperitoneal) 0 ve 14. günlerde Nebulize OVA (%2.5) (21. günden başlayarak 74. güne kadar, 8 hafta boyunca, haftada 3 gün, günde 30 dakika) Sağaltım prosedürü Günler 75 Yaşamı sonlandırma Yaklaşık 7-10 gün sonra Grup I- Sağlıklı kontrol Grup II- Astım + plasebo Grup III- Astım + Deksametazon Grup IV- Astım + Etken madde BAL örneği alma Kan örneği alma •Hücre sayımı •OVA spesifik IgE •Sitokin yanıtları •Sitokin yanıtları •NO düzeyi •NO düzeyi •Antioksidan yanıtları vb. •Antioksidan yanıtları vb. Doku-organ örneği alma (Akciğer dokusu, trakea vb.) •Sitokin •NO düzeyleri vb. Histopatolojik analizler Histopatolojik Yöntemler • Işık mikroskobu incelemeleri • Elektron mikroskobu incelemeleri * Havayolu epiteli bozulmuş Subepitelyal düz kas tabakası belirgin kalınlaşmış Peribronşial parankimal alanlarda mononükleer infiltrasyon Gc PAS (+) goblet hücreler SAĞLIKLI FARE AKCİĞERİ KRONİK ASTIMLI FARE AKCİĞERİ Av Av Sm Sm Bv Alv Av •Küçük çaplı hava yolları ve çevreleyen epitel sağlam ve olağan görünümde. •Hava yolunu çevreleyen düz kas tabakası (Sm) ince ve devamlı. •Kan damarları ve çevreleyen parankim normal, alveol yapıları düzenli olarak izlenmektedir (HE X 10). Ep •Hava yolunu çevreleyen uzun boylu epitel (Ep) •Kalınlaşmış olarak gözlenen düz kas (Sm) tabakası •Peribronşial mononükleer yangısal infiltrasyon Işık Mikroskobu (HE X 10) BAL Örneği Alma Teknikleri Kan Örneği Alma Teknikleri Hayvan modellerinde SFT? •Hava yolu obstrüksiyonu ve reverzibilitesi (FEV1 ,PEF) Body Plethysmograph Sonuç olarak; • Günümüzde mevcut astım modelleri insan astımını tam olarak yansıtamamakla birlikte gerek hastalığın patogenezi gerekse etkili tedavi arayışları konusunda değerli veriler sunmaktadır. • Ancak hayvan modellerinde; hayvan türü seçiminin, oluşturulacak modelin protokolünün ve elde edilen sonuçların dikkatli yorumlanmasının önemli olduğu unutulmamalıdır. Teşekkürler.
